KR20080039917A - Ｃａ6 항원-특이적인 세포독성 컨쥬게이트 및 이를사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포결합인자 및 세포독성인자를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트, 이러한 컨쥬게이트를 포함하는 치료제 조성물, 세포생장억제 및 질병치료에서 상기 컨쥬게이트를 사용하는 방법, 및 상기 세포독성 컨쥬게이트를 포함하는 키트를 포함하며, 이들은 본 발명의 실시예에 개시되어 있다. 특히, 세포결합인자는 CA 글리코토프를 인지하고 결합하는 단일클론항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이다. 또한, 본 발명은 인간화된 또는 표면개질된 DS6, 항-CA6 쥐의 단일클론항체 및 이것의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다.

세포독성 컨쥬게이트, DS6 항체, 세포독성인자, 단일클론항체, 인간화된 DS6 항체-세포독성인자 컨쥬게이트

Description

ＣＡ6 항원-특이적인 세포독성 컨쥬게이트 및 이를 사용하는 방법 {A CA6 ANTIGEN-SPECIFIC CYTOTOXIC CONJUGATE AND METHODS OF USING THE SAME}

본 발명은 쥐의 항-CA6 글리코토프(glycotope) 단일 클론 항체 및 이것의 인간화된 변형물 또는 표면개질된 변형물(resurfaced version)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항-CA6 글리코토프 단일 클론 항체의 에피토프(epitope) 결합 단편과, 항-CA6 글리코토프 단일 클론 항체에 있어서 인간화된 변형물 또는 표면개질된 변형물의 에피토프 결합 단편에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 세포 결합 인자(cell binding agent) 및 세포독성 인자를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 치료제 조성물, 세포 생장의 방해 및 질병 치료에 있어서 상기 컨쥬게이트를 사용하는 방법, 및 상기 세포독성 컨쥬게이트를 포함하는 키트에 관한 것이다. 특히, 세포 결합 인자는 상기 CA6 글리코토프, 또는 이것의 인간화된 또는 표면개질된 변형물을 인지하는 단일 클론 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이다.

암세포 주위의 비-암세포 및 조직에 해를 가하지 않으면서 타겟이 되는 암세포를 특이적으로 파괴하는 항암 치료제를 개발하는 수많은 시도들이 있어 왔다. 이러한 치료제들은 환자의 암 치료를 획기적으로 개선하는 잠재력을 갖고 있다.

하나의 가능성 있는 접근법은 단일 클론 항체와 같은 세포 결합 인자를 세포독성 약제와 연계하는 것이다 [Sela et al, in Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al, in Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, in Antibody mediated delivery systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, in Antibody mediated delivery systems 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol et al, in Antibody mediated delivery systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988)]. 세포 결합 인자의 선택에 따라, 세포독성 컨쥬게이트는 특정 타입의 암세포를 인지하여 결합하도록 설계될 수 있는데, 이는 결합대상이 되는 세포의 표면 상에 발현되는 분자의 발현 양상에 기초하여 이루어진다.

메토트렉사트(methotrexate), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C) 및 클로람부실(chlorambucil)과 같은 세포독성 약제들은 다양한 쥐의 단일 클론 항체에 연결된 세포독성 컨쥬게이트로서 사용되었다. 몇몇의 경우, 약제 분자들은 혈청 알부민과 같은 매개 담체 분자(intermediary carrier molecules)를 통해 항체 분자에 연결되었다 [Garnett et al, 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa et al 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al, 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)), dextran (Hurwitz et al, 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al, 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al, 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986); Shoval et al , 85 Proc. Natl. Acad. Sci. 8276-8280 (1988)), or polyglutamic acid (Tsukada et al, 73 J. Natl. Cane. Inst. 721-729 (1984); Kato et al 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984); Tsukada et al, 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985)].

약간의 가능성을 갖는 하나의 특이적 컨쥬게이트의 예로서 C242 항체와 메이탄신 유도체 DM1 (maytansine derivative DM1)의 컨쥬게이트가 있는데, 이는 직장암 및 췌장암 종양 상에 발현된 항원인 CanAg에 관한 것이다(Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93: 8618-8623 (1996)). 이러한 컨쥬게이트에 대한 시험관내 평가에서 세포 표면 상에 발현된 CanAg를 향한 결합 친화도는 K_d 명시값이 3 ×10^-11M로서 높고, CanAg 양성 세포에 대한 세포독성 효능 역시 IC₅₀이 6 × 10^-11M로서 높은 것을 나타내었다. 이러한 세포독성도는 항원 의존적인데 이는 컨쥬게이션되지 않은 과량의 항체에 의해 세포독성 효과가 차단되고 항원 음성 세포들이 컨쥬게이트에 대해 100배 이상 덜 민감하기 때문이다. 각각의 타겟 세포에 대한 높은 친화도와 항원-선택적인 세포독성을 갖는 항체-DM1 컨쥬게이트의 다른 예로서, 인간 CD56에 대한 인간화된 항체인 huN901, 인간 CD33에 대한 인간화된 항체인 huMy9-6, CanAg Muc1 에피토프에 대한 인간화된 항체인 huC242, PSMA에 대한 면역약화된 항체(deimmunized antibody)인 huJ591, Her2/neu에 대한 인간화된 항체인 트라스투주맙(trastuzumab), 및 CD44v6에 대한 인간화된 항체인 비바투주맙(bivatuzumab) 등이 있다.

특정 타입의 암세포를 특이적으로 인지하는 세포독성 컨쥬게이트의 추가 개발은 암환자를 치료하기 위해 사용되는 치료방법의 계속적인 개선에 있어서 중요하다.

이를 위해, 본 발명은 암세포의 표면 상에 발현된 분자/수용체를 인지하여 결합하는 항체의 개발, 항체와 같은 세포 결합 인자를 포함하는 새로운 세포독성 컨쥬게이트의 개발, 그리고 암세포의 표면 상에 발현된 분자/수용체를 특이적으로 목표물로 하는 세포독성 인자를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 암세포에 의해 발현된 Muc1 뮤신 수용체(mucin receptor) 상의 새로운 CA6 시알로글리코토프(sialoglycotope)의 특성화, 그리고 이러한 Muc1 뮤신 수용체의 새로운 CA6 시알로글리코토프를 인지하고, 세포독성인자와 함께 CA6 글리코토프를 발현하는 세포의 생장을 저해하는데 사용될 수 있는 항체, 바람직하게는 인간화된 항체에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 Muc1 뮤신 수용체의 새로운 CA6 시알로글리코토프를 특이적으로 인지하고 결합하는 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 상기 Muc1 뮤신 수용체의 새로운 CA6 시알로글리코토프 ("CA6 글리코토프")를 인지하는 인간화된 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 포함한다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 쥐의 항-CA6 단일 클론 항체 DS6("DS6 항체") 및 이것의 인간화된 또는 표면개질된 변형물을 포함하고, 상기 항체의 표면 노출 잔기 또는 이의 에피토프-결합 단편은 L사슬 및 H사슬 모두가 알려진 인간의 항체 표면과 매우 닮도록 치환되어 있다. 본 발명의 인간화된 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 인간에게 투여되었을 때 완전한 쥐 원형의 경우 보다 훨씬 덜 면역원성 (또는 완전히 비-면역원성)인 점에서 개선된 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 인간에게 면역원성이 아니면서도 Muc1 뮤신 수용체의 새로운 CA6 시알로글리코토프, 즉 CA6 글리코토프를 특이적으로 인지한다. 상기 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 메이탄시노이드(maytansinoid)와 같은 약제와 접합되어, 항원 발현 세포에 대해 특이적인 세포독성(약제를 Muc1 CA6 시알로글리코토프에 대해 표적화함)을 갖는 프로드러그(prodrug)를 형성할 수 있다. 따라서, 이러한 항체 및 작고 독성이 강한 약제 (예를 들어, 메이탄시노이드, 탁산(taxanes) 및 CC-1065 유사체)를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트는 유방암 및 난소암과 같은 종양의 치료를 위한 치료제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 인간화된 DS6 항체는 본 명세서에서 완전히 특성화되는데, L사슬 및 H사슬 가변영역 각각의 아미노산 서열, 상기 L사슬 및 H사슬 가변영역의 유전자 DNA 서열, CDRs의 동정, 표면 아미노산의 동정 및 재조합 형태에서 발현 수단의 개시 등이 서술된다.

일실시예에서, 하기의 서열번호 1-3에 의해 표현되는 아미노산 서열을 갖는 CDRs을 포함하는 H사슬과, 하기의 서열번호 4-6에 의해 표현되는 아미노산 서열을 갖는 CDRs을 포함하는 L사슬을 갖는 인간화된 DS6 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

SYNMH (서열번호 1);

YIYPGNGATNYNQKFKG (서열번호 2);

GDSVPFAY (서열번호 3);

SAHSSVSFMH (서열번호 4);

STSSLAS (서열번호 5);

QQRSSFPLT (서열번호 6).

또한, 하기의 서열번호 7 또는 서열번호 8에 의해 표현되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 L사슬 가변영역(light chain variable region)을 포함하는 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

AGTKLELKR (서열번호 7);

EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

AGTKLELKR (서열번호 8).

유사하게, 하기의 서열번호 9, 서열번호 10, 또는 서열번호 11에 의해 표현되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 H사슬 가변영역(heavy chain variable region)을 포함하는 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 9);

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 10);

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11).

다른 실시예에서, 하기의 서열번호 8에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 또는 표면개질된 L사슬 가변영역을 갖는 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

AGTKLELKR (서열번호 8).

유사하게, 하기의 서열번호 10 또는 서열번호 11에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 또는 표면개질된 H사슬 가변영역을 갖는 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 10);

QAQLVQSGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11).

또한, 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 하기 표 1에서 별표시된 하나 이상의 위치에서 L사슬 및/또는 H사슬 아미노산 잔기가 치환되는 것을 포함할 수 있다. 상기 치환위치는 인간 잔기로의 변경을 요하는 CDR의 5Å 범위 내에서 발견된 쥐의 표면 프레임워크 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 쥐의 서열에 있어서 첫번째 아미노산 잔기 Q(서열번호 7)는 항체를 인간화하기 위해 E(서열번호 8)로 대체된다. 그러나, 이러한 잔기는 CDR에 근접하기 때문에 항체 친화도를 유지하기 위해서 쥐의 아미노산 잔기 Q로의 역 돌연변이가 요구될 수 있다.

표 1

또한, 표 2에는 muDS6 가변 영역 표면 잔기가 인간의 가변 영역 표면 잔기(가장 상동성을 가진 3개)와 정렬되어 있다. 표 1의 아미노산 잔기는 표 2에서 밑줄 친 아미노산 잔기에 대응한다.

표 2

또한, 본 발명은 CA6 글리코토프를 인지하고 결합하는 (1) 세포 결합 인자 및 (2) 세포독성 인자를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트를 제공한다. 상기 세포독성 컨쥬게이트에 있어서, 세포 결합 인자는 CA6 글리코토프와 높은 친화도를 가지며, 세포독성 인자는 CA6 글리코토프를 발현하는 세포에 대한 강한 세포독성도를 가짐으로써 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트는 효과적인 세포사멸제를 형성하게 된다.

바람직한 실시예에서, 세포 결합 인자는 항-CA6 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편이고, 보다 바람직하게는 인간화된 항-CA6 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편이다. 세포독성 인자는 절단형 또는 비-절단형 링커를 통해 상기 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편에 공유결합으로 부착된다. 보다 바람직한 실시예에서, 세포 결합 인자는 인간화된 DS6 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편이고, 세포독성 인자는 택솔, 메이탄시노이드, CC-1065 또는 CC-1065 유사체이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 세포 결합 인자는 인간화된 항-CA6 항체이고, 세포독성 인자는 메이탄시노이드 또는 탁산과 같은 세포독성 약제이다.

보다 바람직하게는, 세포 결합 인자는 인간화된 항-CA6 항체 DS6이고, 세포독성 인자는 DM1 또는 DM4와 같은 메이탄신 화합물(maytansine compound)이다.

또한, 본 발명은 CA6 글리코토프를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 방법을 포함한다. 바람직한 실시예에서, CA6 글리코토프를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 방법은 세포의 죽음을 수반하는 생체 내(in vivo) 방법이다. 그러나, 본 발명은 시험관 내(in vitro) 방법 및 생체 외(ex vivo) 적용을 배제하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 세포독성 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 치료제 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은 상기 치료제 조성물을 이용하여 암환자를 치료하는 방법을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 세포독성 컨쥬게이트는 항-CA6 항체 및 세포독성 인자를 포함한다. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 세포독성 컨쥬게이트는 인간화된 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트, 인간화된 DS6 항체-DM4 또는 인간화된 DS6 항체-탁산 컨쥬게이트를 포함하고, 이러한 컨쥬게이트는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 투여된다.

또한, 본 발명은 항-CA6 항체-세포독성인자 컨쥬게이트를 포함하는 키트 및 이의 사용방법을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 항-CA6 항체는 인간화된 DS6 항체이고, 세포독성 인자는 DM1, DM4 또는 탁산과 같은 메이탄신 화합물(maytansine compound)이며, 사용법은 암환자의 치료에 있어서 상기 컨쥬게이트의 사용에 관한 것이다. 또한, 상기 키트는 약제학적으로 허용가능한 제형의 준비를 위해 필요한 구성요소, 예를 들어 컨쥬게이트가 동결건조 상태 또는 농축된 형태일 때 필요한 희석제, 그리고 제형의 투여를 위해 필요한 구성요소를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 CA6 글리코토프에 특이적으로 결합하여 이를 인지하는 항체의 유도체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 항체 유도체는 CA6 글리코토프에 결합하는 항체를 표면개질하거나 인간화하여 제조함으로써 숙주에 대해 감소된 면역원성을 나타낸다.

추가로, 본 발명은 연구 및 진단 응용을 위해 표지되는 인간화된 항체 또는 이것의 단편을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 표지는 방사성 표지, 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 이미징 물질(imaging agent) 또는 금속이온이다.

또한, 본 발명은 상기 표지된 인간화 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 암으로 의심되는 피검자에 투여하고 피검자의 체내에서 상기 표지의 분포를 측정하고 모니터링하는 방식의 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간화된 항체 컨쥬게이트를 단독으로, 또는 다른 세포독성제 또는 치료제와 함께 암환자에게 투여하여 치료하는 방법을 제공한다. 치료대상이 되는 암은 예를 들어 유방암, 결장암, 난소종, 자궁내막암(子宮內膜癌, endometrial cancer), 골육종(骨肉腫, osteosarcoma), 자궁경부암(子宮頸部癌, cervical cancer), 전립선암, 폐암, 활액종(synovial carcinoma), 췌장암, CA6가 발현되는 육종 또는 암종, 또는 CA6 글리코토프가 우세하게 발현되는 것으로 결정된 다른 암들 중 하나 또는 그 이상일 수 있다.

특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 언급된 문헌과 특허들은 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.

도1은 DS6 항체가 선택된 암세포주에 결합하는 능력을 판단하기 위해 수행된 연구의 결과를 보여주는 도면이다. DS6 1차 항체 및 FITC가 접합된 항-마우스 IgG(H+L) 2차 항체와 함께 인큐베이션된 세포주들에 대한 형광값은 유동 세포 측정법(flow cytometry)에 의해 측정되었다. DS6 항체가 결합된 Caov-3 (도1A) 및 T-47D (도1B)는 각각 Kd 명시값 1.848 nM 및 2.586nM을 나타내었다. 항원 음성 세포주인 SK-OV-3 (도1C) 및 Colo205 (도1D)는 항원 특이적 결합을 나타내지 않았다.

도2는 에피토프 발현에 대한 도트 블롯팅(dot blotting) 분석 결과를 나타낸 다. Caov-3 (도2A 및 도2B), SKMEL28 (도2C), 및 Colo205(도2D)의 세포 용해물을 개별적으로 니트로셀룰로오즈 막에 찍고, 프로나아제(pronase), 프로테이나아제 K(proteinase K), 뉴라미니다아제(neuraminidase) 또는 과(過)요오드산(periodic acid)과 각각 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 상기 막은 DS6 항체(도2A), CM1 항체(도2B), R24 항체(도2C) 또는 C242 항체(도2D)로 면역블롯팅(immunoblotting)하였다.

도3은 DS6 항원 발현에 대한 도트 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. Caov-3 세포 용해물을 개별적으로 PVDF 막에 찍고, 트리플루오로메탄술폰산(TFMSA)의 존재 하에서 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 상기 막은 CM1 항체(1번과 2번) 또는 DS6 항체(3번과 4번)로 면역블롯팅하였다.

도4는 DS6 항원에 대한 글리코토프 분석 결과를 나타낸다. N-글리칸나아제(N-glycanase)("N-gly"), O-글리칸나아제("O-gly") 및/또는 시알리다아제(sialidase)("S")로 전처리한 Caov-3 세포 용해물을 니트로셀루로오즈 막에 찍고, DS6 항체 또는 CM1 항체(Muc1 VNTR)로 면역블롯팅하였다.

도5는 DS6 항원에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 세포 용해물을 면역침전시키고("IP"), DS6 항체로 면역블롯팅하였다. 상기 항원은 항원 양성인 Caov-3 세포(도5A 및 도5B) 및 T47D 세포(도5C)에서 관찰된 ＞250kDa 단백질 밴드에 대응한다. 항원 음성인 SK-OV-3 세포주(도5D) 및 Colo205 세포주(도5E)는 이러한 밴드를 나타내지 않는다. 면역침전 후, Caov-3 세포 용해물의 단백질 G 비드를 뉴라미니다아제("N")(도5A) 또는 과(過)요오드산("PA")(도5B)과 인큐베이션시켰다. 항체("α"), 전(前)-IP("Lys") 및 후(後)-IP 유동통과 ("FT") 세포용해물 대조군들을 동일한 겔에서 이동시켰다. 또한, Caov-3 면역침전물을 N-글리칸나아제(N-glycanase)("N-gly"), O-글리칸나아제("O-gly") 및/또는 시알리다아제(sialidase)("S")와 인큐베이션시켰고(도5F), 여기서 블롯은 비오틴화된 DS6와 스트렙타비딘-HRP에 의해 추적되었다.

도6은 Caov-3 (도6A) 및 HeLa (도6B) 세포 용해물 상에서 DS6 항체 및 CM1 항체의 면역침전 및/또는 면역블롯팅 결과를 나타낸다. CM1 및 DS6의 중복되는 웨스턴 블롯팅 신호는 DS6 항원이 Muc1 단백질 상에 존재함을 의미한다. HeLa 세포용해물에 있어서, Muc1 이중선은 직렬반복(tandem repeat)의 수에서 다른 대립유전자들에 의해 지시되는 Muc1 발현의 결과이다.

도7은 DS6 항체 샌드위치 ELISA 설계 (도7A) 및 표준 곡선(도7B)를 나타낸다. 상기 표준 곡선은 상업적으로 입수가능한 CA15-3 표준(standards)의 알려진 농도를 이용하여 생성되었다(여기서, 1 CA15-3 유닛 = 1 DS6 유닛).

도8은 정량적인 ELISA 표준 곡선을 나타낸다. 검출 항체 (스트렙타비딘-HRP/비오틴-DS6) 신호의 표준 곡선(도8C)은, 플레이팅된 염소의 항-마우스 IgG에 의해 포획되거나(도8A), ELISA 플레이트 상에 직접 결합된(도8B) 비오틴-DS6의 알려진 농도를 이용하여 결정되었다.

도9는 쥐의 DS6 항체에 대한 L사슬(도9A) 및 H사슬(도9B) 가변영역의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열에서 3개의 CDRs에 대해 밑줄이 그어져 있다(Kabat 정의).

도10은 Kabat 정의에 의해 결정되는 쥐의 DS6 항체의 L사슬(도10A) 및 H사슬(도10B) CDRs을 나타낸다. AbM 모델링 소프트웨어의 수행결과는 H사슬 CDRs에 대해 약간 상이한 결과를 나타낸다(도10C).

도11은 쥐의 DS6 항체에 대한 L사슬("muDS6LC")(서열번호 7의 1-95 잔기) 및 H사슬("muDS6HC")(서열번호 9의 1-98 잔기) 아미노산 서열을 나타내며, 이들은 IgVκap4(서열번호 23) 및 IgVh J558.41 (서열번호 24) 유전자들의 생식계열 서열과 정렬되어 있다. 어둡게 표시된 부분은 서열이 상이한 부위를 나타낸다.

도12는 Brookhaven 데이터베이스 내의 구조 파일들을 푼 것으로서, 쥐의 DS6(muDS6) L사슬("muDS6LC") 및 H사슬("muDS6HC") 서열과 가장 상동성을 갖는 10개의 L사슬 및 H사슬 항체 서열을 나타낸다.

도13은 표면 접근성 데이터(surface accessibility data) 및 계산결과를 나타내는 것으로서, 쥐의 DS6 항체의 L사슬 가변영역 중 어느 프레임워크 잔기가 표면 접근가능한 것인지를 예측한다. 25-35% 평균 표면 접근성을 갖는 위치들은 "？？"로 표시되었고, 이들은 2차 분석 대상이 되었다. DS6 항체의 L 사슬 가변영역의 계산결과는 도13a에 나타내었고, H사슬 가변영역의 계산결과는 도13b에 나타내었다.

도14는 prDS6 v1-0 포유류 발현 플라스미드 지도를 나타낸다. 이 플라스미드는 재조합된 키메라 DS6 항체 및 인간화된 DS6 항체를 구축하고 발현시키는데 사용되었다.

도15는 쥐의 DS6 항체("muDS6") 및 인간화된 DS6 항체("huDS6")(1.01 & 1.21)의 L사슬(도15A)과 H사슬(도15B) 가변 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.

도16은 인간화된 DS6 항체("huDS6")(1.01 & 1.21)에 대한 L사슬 가변영역의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.

도17은 인간화된 DS6 항체("huDS6") 1.01 (도17A) 및 1.21(도17B)에 대한 H사슬 가변영역의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.

도18은 KB 세포에 대한 어세이로부터 얻은 쥐의 DS6 (muDS6), 키메라 DS6 (chDS6), 및 인간화된 DS6 1.01판 (huDS6 vl.01) 및 1.21판 (huDS6 vl.21)의 유동 세포 측정 결합 곡선(flow cytometry binding curves)을 나타낸다. 쥐의 DS6 (muDS6), 키메라 DS6 (chDS6), 및 인간화된 DS6 1.01판 (huDS6 vl.01) 및 1.21판 (huDS6 vl.21) 항체들의 결합도(avidity)가 비교되었고(muDS6 = 0.82 nM, chDS6 = 0.69 nM, huDS6vl.01 = 0.82 nM, huDS6vl.21 = 0.85 nM), 그 결과 표면개질은 결합도를 감소시키지 않음을 알 수 있다.

도19는 muDS6, chDS6, 및 huDS6 vl.01 및 huDS6 vl.21 항체들을 비오틴화된 muDS6와 경쟁시킨 경쟁 결합 어세이의 결과를 나타낸다. 비오틴이 결합되지 않은 muDS6, chDS6, 및 huDS6 vl.01 및 huDS6 vl.21 항체들의 농도를 변화시키면서 2nM의 비오틴-muDS6과 스트렙타비딘-DTAF를 넣어 주는 방식으로 어세이를 수행한다. 모든 항체들의 IC50값들이 유사하여 항체 인간화는 결합도를 감소시키지 않음을 알 수 있다(muDS6 = 1.9 nM, chDS6 = 1.7 nM, huDS6vl.01 = 3.0 nM, huDS6vl.21 = 1.9 nM).

도20은 접합되지 않은 DS6 항체의 결합 친화도 대 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트 의 결합 친화도 판단결과를 나타낸다. 그 결과는 DM1 컨쥬게이션이 항체의 결합 친화도에 악영향을 주지 않음을 보여 주었다. DS6 항체-DM1 컨쥬게이트("DS6-DM1") 의 Kd 명시값(3.902 nM)은 접합되지 않은 항체("DS6")의 Kd 명시값(2.020 nM) 보다 약간 컸다.

도21은 항-마우스 IgG (H+L) DMl 컨쥬게이트(2°Ab-DMl)의 존재 또는 부존재하에서 DS6 항체를 이용한 간접적인 세포생존 어세이 결과를 나타낸다. 항원 양성인 Caov-3 세포들은 2차 컨쥬게이트("DS6 + 2°Ab-DMl")의 존재 하에서만 DS6 항체-의존적인 방식(IC₅₀ = 424.9 pM)으로 사멸되었다.

도22는 muDS6 항체의 보체-의존적인 세포독성 어세이(CDC) 결과를 나타낸다. 그 결과는 HAPC 세포(도22A) 및 ZR-75-1 세포(도22B)상에서 DS6 항체의 CDC 매개 효과는 없음을 보여 주었다.

도23은 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성 대 메이탄신 단독의 시험관내 세포독성 어세이 결과를 나타낸다. 집락형성 분석법(clonogenic assay)에서, DS6 항원-양성 난소암 세포주(도23A), 유방암 세포주(도23B), 자궁경부암 세포주(도23C) 및 췌장암 세포주(도23D)가 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트에 대한 지속적인 노출로 인한 세포독성에 대해 시험되었다(왼쪽 칸). 이들 세포주는 메이탄신 단독에 대해 72시간 노출시켜 메이탄신 민감도에 대해 유사하게 시험되었다(오른쪽 칸). 시험된 난소암 세포주는 OVCAR5, TOV-21G, Caov-4 및 Caov-3이었다. 시험된 유방암 세포주는 T47D, BT-20 및 BT-483이었다. 시험된 자궁경부암 세포주는 KB, HeLa 및 WISH였다. 시험된 췌장암 세포주는 HPAC, Hs766T 및 HPAF-II였다.

도24는 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성 어세이 결과를 나타낸다. MTT 세포생존율 어세이에서, 인간 난소암 세포주(도24A, 도24B, 도24C), 유방암 세포주(도24D, 도24E), 자궁경부암 세포주(도24F, 도24G) 및 췌장암 세포주(도24H, 도24I)는 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트 의존적인 방식으로 사멸되었다. 접합되지 않은 DS6 항체는 이들 세포들의 생장에 악영향을 주지 않아 세포독성효과를 위해서는 DM1 컨쥬게이션이 필요함을 알 수 있다.

도25A는 확립된 피하 KB 암 이종이식(異種移植, xenograft)에 대한 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트의 생체 내 항암 효과 연구결과를 나타낸다. 암세포는 0일째 접종되었고 6일째 최초 처치가 이루어졌다. 면역컨쥬게이트가 전체 5회분 투여량으로 매일 지속적으로 처치되었다. PBS 대조군 동물은 암 부피가 1500mm³을 초과하면 안락사시켰다. 컨쥬게이트는 각각 항체 농도 5.7 및 8.5mg/kg에 상응하는 150 또는 225㎍/kg DM1의 투여량으로 투여되었다. 마우스의 체중(도25B)은 연구기간 동안 모니터링되었다.

도26은 확립된 피하 암 이종이식(異種移植, xenograft)에 대한 DS6 항체-DM1 컨쥬게이트의 항암 효과 연구결과를 나타낸다. OVCAR5 (도26A 및 도26B), TOV-21G (도26C 및 도26D), HPAC (도26E 및 도26F), 및 HeLa (도26G and 도26H)세포들은 0일째 접종되었고, 면역컨쥬게이트는 6일째 및 13일째 처치가 이루어졌다. PBS 대조군 동물은 암 부피가 1000mm³을 초과하면 안락사시켰다. 컨쥬게이트는 항체 농도 27.7mg/kg에 상응하는 600㎍/kg DM1의 투여량으로 투여되었다. 마우스의 암 부피(도26A, 도26C, 도26E, 및 도26G) 및 체중(도26B, 도26D, 도26F, 및 도26H)은 연구기간 동안 모니터링되었다.

도27은 복막내(intraperitoneal) OVCAR5 암에 대한 muDS6 항체-DM1 컨쥬게이트의 생체 내 항암 효과 연구결과를 나타낸다. 암세포들은 0일째 복막 내로 주사되었고, 면역컨쥬게이트는 6일째 및 13일째 처치가 이루어졌다. 동물들은 체중 감소가 20%를 초과하면 안락사시켰다.

도28은 접합되지 않은 DS6 항체 및 탁산 접합 DS6 항체의 HeLa 세포들에 대한 결합 친화도 연구로부터 얻은 유동 세포 측정 결합곡선을 나타낸다. 탁산(MM1-202)-컨쥬게이션은 항체의 결합 친화도에 악영향을 주지 않는다. DS6-MM1-202 컨쥬게이트의 Kd 명시값(1.24nM)은 접합되지 않은 DS6 항체의 Kd 명시값(620pM) 보다 약간 컸다.

도29는 인간화된 DS6 1.10판 항체 컨쥬게이트의 시험관 내 결합 및 능력을 나타낸다. huDS6v1.01과 DM4의 컨쥬게이션은 KB 세포에 대한 huDS6v1.01의 결합도에 거의 영향을 주지 않는다(도29A). huDS6v1.01-DM4는 IC₅₀이 0.44nM로서 DS6 발현 WISH 세포들에 대한 강한 시험관내 세포독성을 나타낸다(도29B).

도30은 HPAC 췌장암 모델에 대한 huDS6v1.01-DM4 컨쥬게이트의 생체 내 항암 효과 연구결과를 나타낸다. huDS6v1.01-DM4는 강한 항암 활성을 나타내는 반면에, B4-DM4 대조군 컨쥬게이트(타겟이 HPAC 모델에서 발현되지 않음)는 본질적으로 활 성을 나타내지 않는다(도30A). 200㎍/kg의 투여량은 체중 감소를 수반하지 않아 동물들에게 독성이 아님을 알 수 있다(도30B).

본 발명은 여러 특성들 중에서도 항-CA6 단일 클론 항체, 항-CA6 인간화된 항체, 및 항-CA6 항체의 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 및 항체 단편들은 각각 세포 표면 상의 CA6 글리코토프를 특이적으로 인지하고 결합한다. CA6는 다수의 인간암에서 발현되는 것으로 알려져 있다: 장액성 난소암(serous ovarian carcinomas)의 95%, 자궁내막양 난소암(endometrioid ovarian carcinomas)의 50%, 자궁경부 신생물(neoplasms of the uterine cervix)의 50%, 자궁내막 신생물의 69%, 외음부 신생물의 80%, 유방암의 60%, 췌장암의 67% 및 요로상피암의 48%에서 발현된다. 반면에 CA6는 정상적인 인간 조직에서는 거의 발현되지 않는다.

Kearse의 보고서[Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6):866-872 (2000)]는 CA6 에피토프의 특성화를 위해 하이브리도마 상등액을 사용하였는데, CA6 에피토프가 발견된 단백질을, CA6 에피토프를 포함하는 N-링크 탄수화물을 갖는 80kDa 단백질로서 잘못 동정하였다. 이후 본 발명자들은 정제된 DS6를 사용하여 CA6 에피토프가 250kDa 이상의 비-2황화결합된(non-disulfide linked) 당단백질의 O-링크 탄수화물 상에 존재하는 것을 밝혔다. 또한, 상기 당단백질을 뮤신, Muc1으로서 동정하였다. 서로 다른 Muc1 대립유전자들은 직렬반복서열수 변이(VNTR, variable number of tandem repeat)영역에서 상이한 직렬 반복수를 갖기 때문에 세포들은 종종 상이한 크기의 2개의 구별되는 Muc1 단백질을 발현시킨다(Taylor-Papadimitriou, Biochim. Biophys. Acta 1455(2-3):301-13 (1999). Muc1의 당화(Glycosylation) 차이 뿐만아니라 VNTR 영역에서의 직렬반복수 역시 세포주 마다 다르다.

과요드산에 대해 CA6 면역반응성이 떨어지는 것은 CA6가 탄수화물 에피토프인 "글리코토프"임을 의미한다. Vibrio Cholerae의 뉴라미니다아제(neuraminidase)처리에 CA6 면역반응성이 떨어지는 것도 CA6가 시알산 의존적인 글리코토프, 즉 "시알로글리코토프"임을 나타낸다.

CA6의 상세한 특성은 후술하는 실시예2에서 확인할 수 있다. CA6의 추가적인 상세정보는 아래의 문헌에서 확인할 수 있다[국제특허공개공보 WO 02/16401; Wennerberg et al., Am. J. Pathol. 143(4): 1050-1054 (1993); Smith et al., Human Antibodies 9:61-65 (1999); Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6):866-872 (2000); Smith et al., Int. J. Gynecol Pathol. 20(3):260-6 (2001); 및 Smith et al., Appl. Immunohistochem. MoI. Morphol. 10(2): 152-8 (2002)].

또한, 본 발명은 2개의 주요 구성요소로 구성된 세포독성 컨쥬게이트를 포함한다. 첫번째 구성요소는 CA6 글리코토프를 인지하고 결합하는 세포 결합 인자이다. 세포 결합 인자는 세포 독성 컨쥬게이트가 목적하는 세포만을 인지하여 결합하도록 높은 특이성을 가지면서 Muc1 상의 CA6 시알로글리코토프를 인지해야 한다. 높은 특이성으로 인해 컨쥬게이트는 비-특이적인 결합으로부터 나타나는 부작용을 적게 하면서 타겟화된 방식으로 작용하게 된다.

다른 실시예에서, 본 발명의 세포 결합 인자는 높은 친화도를 가지면서 CA6 글리코토프를 인지하기 때문에 컨쥬게이트가 충분한 시간 동안 타겟 세포와 접촉하 게 되고, 이로써 컨쥬게이트의 세포독성 약제 부분이 세포 상에 작용하게 하거나, 컨쥬게이트가 세포에 의해 내부도입되는 충분한 시간을 허용하게 된다.

바람직한 실시예에서, 세포독성 컨쥬게이트는 세포 결합 인자로서 항-CA6 항체, 보다 바람직하게는 쥐의 DS6 항-CA6 단일 클론 항체를 포함한다. 보다 바람직한 실시예에서, 세포독성 컨쥬게이트는 인간화된 DS6 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함한다. DS6 항체는 높은 특이성으로 CA6를 인지할 수 있고, 타겟화된 방식으로 세포독성인자를 암세포와 같은 비정상 세포 또는 조직으로 인도할 수 있다.

본 발명의 세포독성 컨쥬게이트의 두번째 구성요소는 세포 독성 인자이다. 바람직한 실시예에서, 세포독성인자는 택솔, DM1 또는 DM4와 같은 메이탄시노이드, CC-1065 또는 CC-1065 유사체이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 세포결합인자는 세포독성인자에 직접 또는 절단형 또는 비-절단형 링커를 통해 공유결합으로 부착된다.

세포결합인자, 세포독성인자 및 링커는 하기에서 상세하게 논의된다.

세포결합인자

본 발명의 화합물의 치료제로서의 효능은 적절한 세포결합인자의 선택에 좌우된다. 세포결합인자는 현재 알려진 것 또는 알려지고 있는 것으로 펩티드 및 비-펩티드를 포함할 수 있다. 세포결합인자는 특이적인 방식 또는 비-특이적인 방식으로 세포와 결합할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 통상, 이들은 항체(특히, 단 일 클론 항체), 림포카인(lymphokines), 호르몬, 성장인자, 비타민, 영양소-수송 분자(예를 들어, 트랜스페린(transferrin)) 또는 기타 세포결합분자 또는 물질일 수 있다.

보다 상세한 예로서 사용가능한 세포결합인자는 다음의 것들을 포함한다:

(a) 다중 클론 항체;

(b) 단일 클론 항체;

(c) Fab, Fab', 및 F(ab')₂, Fv와 같은 항체의 단편들(Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (I960));

(d) 인터페론(예를 들어, 알파, 베타, 감마);

(e) IL-2, IL-3, IL-4, IL-6와 같은 림포카인;

(f) 호르몬으로서, 예를 들어 인슐린, TRH(갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬), MSH(멜라닌 세포 자극 호르몬), 안드로젠 및 에스트로젠과 같은 스테로이드 호르몬;

(g) EGF, TGF-알파, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF 및 GM-CSF과 같은 성장인자 및 콜로니 자극인자(colony stimulating factor)(Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984));

(h) 트랜스페린(O'Keefe et al. J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)); 및

(g) 엽산과 같은 비타민.

항체

적절한 세포결합인자의 선택은 타겟이 되는 특정 세포집단에 좌우되나, 일반적으로 적절한 형태가 입수가능하거나 제조가능하다면 항체, 특히 단일 클론 항체가 선호된다.

단일 클론 항체 기술은 특이적인 단일 클론 항체 형태의 매우 특이적인 세포결합인자의 제조를 가능하게 한다. 본 기술분야에서 잘 알려진 것이 마우스, 래트, 햄스터 또는 기타 다른 포유류를 본래의 타겟 세포, 타겟 세포로부터 분리된 항원, 전체 바이러스(whole virus), 전체 바이러스를 약화시킨 것, 바이러스 외피 단백질과 같은 바이러스 단백질로 면역화시켜 생산되는 단일 클론 항체의 제조기술이다. 감작된 인간 세포도 사용될 수 있다. 단일 클론 항체의 다른 제조 기술은 scFv (단일 사슬 가변 영역), 특히 인간의 scFv의 파아지 라이브러리를 사용하는 것이다(예를 들어, Griffiths et al., 미국특허 5,885,793 및 5,969,108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587 참조).

전형적인 항체는 두개의 동일한 H사슬과 두개의 동일한 L사슬로 구성되고, 이들은 이황화결합(disulfide bond)에 의해 연결되어 있다. 가변 영역은 항체 H사슬 및 L사슬의 일부로서 항체 내에서 서열이 상이하고 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성 면에서 협력한다. 가변성은 통상 항체 가변 영역에 걸쳐 균일하게 분포하지 않는다. 가변성은 H사슬 및 L사슬 가변 영역 모두에서 상보성-결정 영역(CDRs) 또는 초가변 영역이라고 불리는 가변 영역의 3개의 세그먼트 내에 집중 된다. 가변영역에서 보존도가 높은 영역을 프레임워크 영역이라고 한다. H사슬 및 L사슬의 가변 영역은 대부분 베타-시트(beta-sheet) 구조를 채택하는 4개의 프레임워크 영역을 포함하고, 각각의 프레임워크 영역은 3개의 CDRs에 의해 연결된다. 3개의 CDRs은 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부의 경우 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 CDRs은 프레임워크 영역에 의해 근접하여 유지되고, 다른 사슬의 CDRs과 함께 항체의 항원결합위치 형성에 기여한다(E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 1991, NIH).

고정 영역(constant region)은 H사슬의 일부이다. 이는 비록 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지는 않지만 항체-의존적인 세포 독성에서 항체가 관여하는 것과 같은 이펙터(effector) 기능을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 적절한 단일 클론 항체는 쥐의 DS6 단일 클론 항체를 포함한다(미국특허 제6,596,503호; ATCC 기탁번호 PTA-4449).

인간화 또는 표면개질된 DS6 항체

바람직하게, 인간화된 항-CA6 항체는 본 발명의 세포 결합 인자로서 사용된다. 이러한 인간화된 항체의 바람직한 실시예는 인간화된 DS6 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이다.

인간화의 목표는 쥐의 항체와 같은 이종 항체를 인간에 도입하는 경우에 면역원성을 감소시키면서 완전한 항원 결합 친화도와 항체 특이성을 유지하는 것이 다.

인간화된 항체는 표면개질 및 CDRs 그라프팅(grafting)과 같은 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 본 명세서에서와 같이, 표면개질 기술은 분자 모델링, 통계학적 분석 및 돌연변이생성법의 조합을 이용하여 항체 가변 영역의 비-CDR 표면을 타겟 숙주의 알려진 항체의 표면과 닮도록 변환하는 것이다.

항체 표면개질 전략 및 방법, 그리고 상이한 숙주에서 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 기타 방법들이 미국특허 제5,639,641호 (Pedersen et al.)에 개시되어 있고, 이는 전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다. 간략하게 설명하면, 바람직한 방법에 있어서, (1) 항체 H사슬 및 L사슬 가변 영역의 모음에 대해 위치 정렬을 하면 H사슬 및 L사슬 가변영역의 프레임워크 표면노출 위치들 세트가 주어지는데, 여기서 모든 가변 영역에 대한 정렬 위치들은 적어도 대략 98%가 동일하다; (2) H사슬 및 L사슬 가변영역의 프레임워크 표면노출 아미노산 잔기들 세트가 쥐의 항체(또는 이것의 단편)에 대해 정의된다; (3) H사슬 및 L사슬 가변영역의 프레임워크 표면노출 아미노산 잔기들 세트(쥐의 표면노출 아미노산 잔기들 세트와 가장 근접하게 동일한 것)가 동정된다; (4) 상기 (2) 단계에서 정의된 H사슬 및 L사슬 가변영역의 프레임워크 표면노출 아미노산 잔기들 세트가 상기 (3) 단계에서 동정된 H사슬 및 L사슬 가변영역의 프레임워크 표면노출 아미노산 잔기들 세트에 의해 대체되는데, 쥐의 항체의 상보성-결정 영역의 임의의 잔기의 어떤 원자에 대해 5Å 범위 내에 있는 아미노산 잔기들은 제외한다; (5) 결합 특이성을 갖는 인간화된 쥐의 항체가 제조된다.

항체들은 CDR-그라프팅(EP 0239400; WO91/09967; 미국특허 5,530,101; 및 5,585,089), 덧붙임(veneering) 또는 표면개질(EP 0592106; EP 0519596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska M.A. et al., 1994, PNAS 91:969-973) 및 사슬 섞기(chain shuffling)(미국특허 제5,565,332호)를 포함하는 다양한 다른 기술들을 이용하여 인간화될 수 있다. 인간 항체들은 파아지 디스플레이 방법을 포함하는 본 기술분야에서 알려진 다양한 방법으로 만들어질 수 있다(미국특허 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 및 5,814,318; 국제특허공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 참조). 이들 문헌들은 전체가 본 발명의 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 Muc1 뮤신 상의 새로운 시알로글리코토프(CA6 글리코토프)를 인지하는 인간화된 항체 또는 이것의 단편을 제공한다. 다른 실시예에서, 인간화된 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편은 CA6 글리코토프를 발현하는 세포 생장을 저해하는 추가적인 능력을 갖는다.

보다 바람직한 실시예에서, 본 발명은 DS6 항체의 인간화된 또는 표면개질된 변형물을 제공하고, 상기 항체의 표면 노출 잔기 또는 이것의 단편은 L사슬 및 H사슬 모두가 알려진 인간의 항체 표면과 매우 닮도록 치환되어 있다. 본 발명의 인간화된 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 개선된 특성을 갖는다. 예를 들어, 인간화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 Muc1 뮤신 수용체 상의 새로운 시알로글리코토프(CA6 글리코토프)를 특이적으로 인지한다. 보다 바람직하게, 인간 화된 DS6 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 CA6 글리코토프를 발현하는 세포 생장을 저해하는 추가적인 능력을 갖는다. 인간화된 DS6 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편은 메이탄시노이드(maytansinoid)와 같은 약제와 접합되어, 항원 발현 세포에 대해 특이적인 세포독성(약제를 새로운 Muc1 CA6 시알로글리코토프에 대해 표적화함)을 갖는 프로드러그(prodrug)를 형성할 수 있다. 이러한 항체 및 작고 독성이 강한 약제(예를 들어, 메이탄시노이드, 탁산(taxanes) 및 CC-1065 유사체)를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트는 유방암 및 난소암과 같은 종양의 치료를 위한 치료제로서 사용될 수 있다.

상기 인간화된 DS6 항체는 본 명세서에서 완전히 특성화되는데, L사슬 및 H사슬 가변영역 각각의 아미노산 서열, 상기 L사슬 및 H사슬 가변영역의 유전자 DNA 서열, CDRs의 동정, 표면 아미노산의 동정 및 재조합 형태에서 발현 수단의 개시 등이 서술된다.

일실시예에서, 하기의 서열번호 1-3에 의해 표현되는 아미노산 서열을 갖는 CDRs을 포함하는 H사슬을 갖는 인간화된 DS6 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

SYNMH (서열번호 1);

YIYPGNGATNYNQKFKG (서열번호 2);

GDSVPFAY (서열번호 3).

상기 H사슬 CDRs이 AbM 모델링 소프트웨어에 의해 결정될 때 이들은 하기의 서열번호 20-22에 의해 표현된다:

GYTFTSYNMH (서열번호 20);

YIYPGNGATN (서열번호 21);

GDSVPFAY (서열번호 22).

동일한 실시예에서, 인간화된 DS6 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편은 하기의 서열번호 4-6에 의해 표현되는 아미노산 서열을 갖는 CDRs을 포함하는 L사슬을 갖는다:

SAHSSVSFMH (서열번호 4);

STSSLAS (서열번호 5);

QQRSSFPLT (서열번호 6).

또한, 하기의 서열번호 7 또는 서열번호 8에 의해 표현되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 L사슬 가변영역(light chain variable region)을 포함하는 인간화된 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

AGTKLELKR (서열번호 7);

EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

AGTKLELKR (서열번호 8).

유사하게, 하기의 서열번호 9, 서열번호 10, 또는 서열번호 11에 의해 표현 되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 H사슬 가변영역(heavy chain variable region)을 포함하는 인간화된 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 9);

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 10);

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11).

다른 실시예에서, 하기의 서열번호 8에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 또는 표면개질된 L사슬 가변영역을 갖는 인간화된 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

AGTKLELKR (서열번호 8).

유사하게, 하기의 서열번호 10 또는 서열번호 11에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 또는 표면개질된 H사슬 가변영역을 갖는 인간화된 항체 및 이것 의 에피토프-결합 단편이 제공된다:

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 10);

QAQLVQSGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11).

또한, 본 발명의 인간화된 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편은 L사슬 및/또는 H사슬 가변 영역의 변형물을 포함할 수 있는데, 여기서 CDRs에 근접한 인간 표면 아미노산 잔기들은 표 1의 별표시된 잔기들에 의해 정의되는 하나 이상의 위치(Kabat 번호매김)에서 대응하는 muDS6 표면잔기들로 대체되어 muDS6의 결합 친화도 및 특이성을 유지한다.

표 1

DS6 항체 L사슬 및 H사슬, 및 이들의 인간화된 변형물의 주요 아미노산 서열 및 DNA 서열은 본 명세서에 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 서열을 포함하는 항체 및 단편들에 제한되는 것이 아니다. 대신에 Muc1 수용체 상의 독특한 종양-특이적인 글리코토프인 CA6와 특이적으로 결합하는 모든 항체 및 단편들이 본 발명에 포함된다. 바람직하게는, CA6와 특이적으로 결합하는 항체 및 단편들은 수용체의 생물학적 활성을 길항작용한다. 보다 바람직하게, 이러한 항체들은 애고니스트(agonist) 활성이 실질적으로 없다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체단편들은 상기 DS6 항체 및 이들의 인간화 유도체와 기본 구조, CDRs, 및/또는 L사슬 및 H사슬의 아미노산 서열에 있어서 차이가 있을 수 있으나 이 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

DS6 항체의 CDRs은 모델링을 통해 동정되고 그 분자구조가 예측되었다. 또한, CDRs은 에피토프 인식에 있어 중요하지만 본 발명의 항체 및 단편에 있어 필수적인 것은 아니다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 항체 친화도 성숙에 의해 생산된 개선된 특성을 갖는 항체 및 단편들이 제공된다.

마우스 L사슬 IgVκap4 생식계열 유전자 및 H사슬 IgVh J558.41 생식계열 유전자(이들로부터 DS6 유도)가 도11에 DS6 항체와 정렬되어 도시되어 있다. 비교부위는 DS6 항체의 있음직한 체세포 돌연변이를 나타내고 CDRs내에 몇개를 포함한다.

DS6 항체의 H사슬 및 L사슬 가변 영역의 서열, 및 DS 항체의 CDRs 서열은 이전에는 알려지지 않았으나, 본 발명에서 도9A 및 도9B에 도시하였다. 이러한 정보는 DS6 항체의 인간화된 변형물을 제조하는데 사용될 수 있다.

항체 단편들

본 발명의 항체는 전술한 바와 같이 전장 항체 뿐만아니라 에피토프-결합 단편들을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "항체 단편"은 전장 항체에 의해 인지된 에피토프에 결합할 능력을 보유한 항체의 일부, 소위 "에피토프-결합 단편"을 포함한다. 본 발명을 제한하지 않는 항체 단편의 예로서 Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, 단일 사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 결합된 Fvs (dsFv) 및 V_L 또는 V_H 영역을 포함하는 단편들이 있다. 단일 사슬 항체를 포함하는 에피토프-결합 단편들은 가변 영역 단독 또는 힌지 영역(C_H1, C_H2, 및 C_H3 영역 ) 전체 또는 일부와 조합된 가변 영역을 포함할 수 있다.

이러한 단편들은 하나 또는 양쪽의 Fab 단편, 또는 F(ab')₂ 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체 단편들은 전체 항체의 6개 CDRs 모두를 포함한다. 단, 이러한 영역 모두 보다 적은 경우 즉, 3개, 4개 또는 5개 CDRs을 포함하여도 기능은 나타낸다. 추가로, 단편들은 다음의 면역글로불린 클래스 중 하나의 일원이거나 일원과 결합할 수 있다: IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE 및 이들의 하위클래스.

Fab 및 F(ab')₂ 단편들은 파파인(papain)(Fab 단편의 경우) 또는 펩신(pepsin)(F(ab')₂ 단편의 경우)과 같은 효소를 이용한 단백질 분해에 의해 제조될 수 있다.

단일 사슬 Fvs (scFv) 단편들은 항체 L사슬 가변영역(V_L)의 적어도 하나의 단편에 링크된 항체 H사슬 가변영역(V_H)의 적어도 하나의 단편을 포함하는 에피토프-결합 단편이다. 링커는 짧고 유연한 펩티드로서, V_L 및 V_H 가 일단 링크되면 적절한 3차원적인 접힘이 일어나서 전체 항체(이로부터 단일 사슬 항체 단편이 유래)의 타겟 분자 결합 특이성을 유지하는 것을 보장하도록 선정된다. V_L 또는 V_H 서열의 카르복실 말단은 링커에 의해 상보적인 V_L 또는 V_H 서열의 아미노산 말단에 공유결합으로 링크된다.

본 발명의 단일 사슬 항체 단편은 본 명세서에서 서술된 전체 항체의 가변 영역 또는 상보성-결정 영역(CDRs)의 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 이들 항체의 고정 영역 일부 또는 전체가 결여되어 있다. 이들 고정 영역은 항체 결합을 위하여 필수는 아니나, 전체 항체 구조의 주요한 부분을 구성한다. 따라서, 단일 사슬 항체 단편은 고정 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 사용과 연관된 일부 문제를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 항체 단편은 생물학적 분자와 H사슬 고정 영역 간의 바람직하지 않은 상호작용 또는 다른 바람직하지 않은 생물학적 활성이 나타나지 않는 경향이 있다. 추가로, 단일 사슬 항체 단편은 전체 항체 보다 상당히 작은데, 이는 전체 항체 보다 큰 모세관 투과성을 가짐으로써 단일 사슬 항체 단편이 보다 효율적으로 항원-결합 위치를 타겟화하기 위해 위 치를 잡고 결합하는 것을 가능하게 한다. 또한, 항체 단편은 원핵세포에서 비교적 큰 규모로 생산될 수 있어 생산을 촉진할 수 있다. 더욱이, 단일 사슬 항체 단편의 비교적 작은 크기는 전체 항체 보다 수용자의 면역반응을 덜 일으키게 한다.

단일 사슬 항체 단편은 당업자에게 잘 알려진 분자적 클로닝, 항체 파아지 디스플레이 라이브러리 또는 유사 기술에 의해 생성될 수 있다. 이들 단백질은 예를 들어 진핵세포 또는 세균을 포함하는 원핵세포에서 생산될 수 있다. 본 발명의 에피토프-결합 단편은 또한 당업계에 알려진 다양한 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에 있어서, 기능적 항체 영역은 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파아지 파티클의 표면 상에 디스플레이된다. 특히, 이러한 파아지는 레퍼토리(repertoire) 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 쥐)로부터 발현되는 에피토프-결합 영역을 디스플레이하기 위해 사용될 수 있다. 문제의 항원과 결합하는 에피토프-결합 영역을 발현하는 파아지는 항원, 예를 들어 고체상 표면 또는 비드에 결합 또는 포획된 표지된 항원에 의해 선택 또는 동정될 수 있다. 이들 방법에서 사용된 파아지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 필라멘트 파아지로서, 파아지로부터 발현된 결합 영역은 Fab, Fv 또는 이황화 결합으로 안정화된 Fv 항체 영역이 재조합으로 파아지 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질과 융합되어 있다.

본 발명의 에피토프-결합 단편을 만들기 위해 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예로서 하기의 문헌에 개시된 것들이 있다: Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT 국제출원번호 PCT/GB91/01134; PCT 국제공개번호 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국특허 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108. 이들 문헌 각각은 전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.

파아지 선택 이후에, 상기 단편들을 인코딩하는 파아지 영역이 분리되고, 이는 후술하는 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 선정된 숙주 세포에서 발현을 통해 에피토프-결합 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기의 문헌에 개시된 바와 같은 당업계에 알려진 방법들을 이용하여 재조합으로 Fab, Fab' 및 F(ab')₂을 생성하는 기술이 채택될 수 있다(PCT 공개공보 WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; 및 Better et al., 1988, Science 240:1041-1043). 이들 문헌은 전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다. 단일 사슬 Fvs 및 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 기술의 예는 아래의 문헌에 기술된 것을 포함한다(미국특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46- 88; Shu et al., 1993, PNAS 90:7995-7999; Skerra et al., 1988, Science 240:1038- 1040).

기능적 동등물

본 발명의 범위에는 항-CA6 항체 및 인간화된 항-CA6 항체의 기능적 동등물도 포함된다. "기능적 동등물"이라는 용어는 상동 서열을 갖는 항체, 키메라 항체, 합성 항체 및 변형 항체를 포함하고, 예를 들어 각 기능적 동등물은 CA6에 결합하는 능력에 의해 정의된다. 본 기술분야의 당업자라면 "항체 단편"으로 호칭되는 분자 그룹과 "기능적 동등물"로 호칭되는 그룹 간에 중복이 있음을 이해할 것이다. 기능적 동등물을 생산하는 방법은 하기의 문헌에 개시되어 있다(PCT 국제공개공보WO 93/21319, 유럽특허공보 239,400; PCT 국제공개공보 WO 89/09622; 유럽특허공보 338,745; 및 유럽특허공보 332,424). 이들 문헌은 전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.

상동 서열을 갖는 항체는 본 발명의 항-CA6 항체 및 인간화된 항-CA6 항체의 아미노산 서열과 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항-CA6 항체 및 인간화된 항-CA6 항체의 가변 영역의 아미노산 서열과 상동성을 갖는 것이다. 본 발명에서 아미노산 서열에 적용시 "서열 상동성"은 다른 아미노산 서열에 대해 적어도 대략 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 서열 상동성을 갖는 서열, 보다 바람직하게는 적어도 대략 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 서열로서 정의되며, 이는 예를 들어 Pearson 및 Lipman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988))에 따른 FASTA 조사 방법에 의해 결정된다.

본 명세서에서 키메라 항체는 항체의 다른 부분이 다른 동물 종으로부터 유래한 것을 의미한다. 예를 들어, 쥐의 단일 클론 항체로부터 유래한 가변 영역이 인간의 면역글로불린 고정 영역과 쌍을 이루는 항체를 들 수 있다. 이들 키메라 항체를 생산하는 방법은 본 기술분야에서 알려져 있다(Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국특허 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397). 이들 문헌은 전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.

키메라 항체의 인간화된 형태는 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역을 인간 프레임워크 영역으로 대체하여 만들어진다(PCT 국제특허공개 W092/22653 참조). 인간화된 키메라 항체는 인간 항체 영역으로부터 실질적으로 또는 완전히 유래한 상보성 결정 영역(CDRs) 및 인간 이외의 포유류로부터 실질적으로 또는 완전히 유래한 CDRs 이외의 고정 영역 및 가변 영역을 갖는 것이 바람직하다.

인공(합성) 항체는 scFv 단편, 이량체화 단편(diabody), 삼량체화 단편(triabody), 사량체화 단편(tetrabody) 및 mru를 포함한다(reviews by Winter, G. and Milstein, C, 1991, Nature 349: 293-299; Hudson, PJ. , 1999, Current Opinion in Immunology 11: 548-557 참조). 이들 각각은 항원 결합 능력을 갖는다. 단일 사슬 Fv 단편에 있어서, 항체의 VH 및 VL 영역은 유연한 펩티드에 의해 링크된다. 전형적으로, 링커 펩티드는 대략 15개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 링커가 훨씬 작다면 예를 들어 5개 아미노산이면, 이량체화 단편(2가의 scFv 이량체)이 형성된다. 링커가 3개 아미노산 잔기 이하로 축소된다면 삼량체화 단편 및 사량체 화 단편으로 불리는 삼량체 및 사량체 구조가 형성된다. 항체의 가장 작은 결합 단위는 CDR, 전형적으로는 H사슬의 CDR2로서 이는 충분한 특이적 인지 및 결합능력을 가져 별개로 사용될 수 있다. 이러한 단편은 분자 인식 단위 또는 mru로 불린다. 몇개의 mru들이 짧은 링커 펩티드에 의해 링크되어 단일 mru 보다 높은 친화도를 갖는 인공 결합 단백질을 형성할 수 있다.

본 발명의 기능적 동등물은 변형된 항체, 예를 들어 항체에 일정한 형태의 분자가 공유결합으로 부착되어 변형된 항체를 포함한다. 예를 들어, 변형된 항체는 당화, 아세틸화, 페길화(pegylation), 인산화, 아미드화(amidation), 알려진 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해, 세포 리간드 또는 다른 단백질로의 결합 등에 의해 변형된 항체를 포함한다. 공유결합 부착은 항체가 항-이디오 타이프(idiotype) 반응을 생성하는 것을 방해하지 않는다. 이러한 변형은 본 발명을 제한하지 않는 공지의 기술, 예를 들어 특이적 화학적 분해, 아세틸화, 포밀화, 튜니카마이신(tunicamycin)의 대사 합성 등과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 추가로 변형된 항체는 하나 이상의 비-전통적인(non-classical) 아미노산을 포함할 수 있다.

기능적 동등물은 상이한 프레임 워크 내에서 상이한 사슬 상에 상이한 CDRs을 교체하여 제조될 수 있다. 따라서, 예를 들어 어떤 CDRs 세트에 대해 상이한 H사슬을 치환함으로써 상이한 클래스의 항체, 예를 들어 IgGl-4, IgM, IgAl-2, IgD, IgE 항체 타입 및 이디오 타입이 생산될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 범위에 속하는 인공 항체는 전체적으로 합성인 프레임 워크 내에 일정한 CDRs 세트를 심어 넣어 제조될 수 있다.

기능적 동등물은 본 기술분야에서 알려진 다양한 방법을 사용하여 특정 CDRs 세트 옆에 위치하는 가변 및/또는 고정 영역 내에 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 일으켜서 즉각 제조될 수 있다.

본 발명의 항체 단편 및 기능적 동등물은 DS6 항체에 견주어 볼 때 CA6와 검출가능한 결합도를 갖는 분자들을 포괄한다. 검출가능한 결합도는 CA6에 대한 쥐의 DS6 항체 결합능력의 적어도 10-100%, 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 범위의 값들을 포함한다.

개선된 항체들

CDRs은 에피토프 인지 및 항체 결합을 위해 1차적으로 중요하다. 그러나, 항체의 동족 에피토프에 대한 인지 및 결합능력을 간섭하지 않으면서 CDRs을 포함하는 잔기들에 변경을 가하는 것이 가능하다. 예를 들어, 에피토프 인지에 영향을 주지 않고 에피토프에 대한 항체 결합 친화력을 증가시키는 변경이 만들어 질 수 있다.

따라서, 본 발명의 범위에는 CA6를 특이적으로 인지하고, 바람직하게는 CA6와 증가된 친화력으로 결합하는 개선된 쥐 항체 및 인간화된 항체가 포함된다.

몇몇 연구들은 1차 항체 서열에 대한 지식과 이것의 결합 및 발현 수준과 같은 특성에 기초하여 항체 서열의 다양한 위치에서 하나 이상의 아미노산 변경을 도 입하는 경우의 영향을 조사하였다(Yang, W. P. et al., 1995, J. MoI. Biol., 254, 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539).

이들 연구에서 1차 항체의 동등물들은 올리고뉴클레오티드-매개된 위치 지향 돌연변이생성법(site directed mutagenesis), 카세트 돌연변이생성법(cassette mutagenesis), 에러-프론 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링(DNA shuffling) 또는 E.coli에 대한 돌연변이유발 유전자 균주(mutator-strain)와 같은 방법들을 사용하여, CDR1, CDR2, CDR3 또는 프레임워크 영역에서 H사슬 및 L사슬 유전자 서열을 변경함으로써 생성되었다(Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535- 539; Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). 1차 항체의 서열을 변경하는 이들 방법은 2차 항체의 친화력을 개선하게 된다(Gram, H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3576- 3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 10701-10705; Davies, J. 및 Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. MoI. Biol., 256, 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 27622-27628).

항체에 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경하는 유사한 전략에 의해 본 발명에 기술된 항체 서열은 CA6에 대한 개선된 친화력과 같은 개선된 기능을 갖는 항-CA6 항체를 개발하는데 사용될 수 있다.

또한, 개선된 항체는 개선된 특성을 갖는 항체를 포함하는데, 이들 항체는 동물 면역화, 하이브리도마 형성 및 특정한 특성을 갖는 항체 선택의 표준 기술에 의해 준비된다.

세포 독성 인자

본 발명의 세포독성 컨쥬게이트에서 사용되는 세포독성인자는 세포를 사멸에 이르게 하거나, 세포사멸을 유도하거나, 또는 일정한 방식으로 세포생존율을 감소시키는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 바람직한 세포독성인자는 아래에서 정의되는 바와 같은 메이탄시노이드 및 이의 유사체, 택소이드, CC-1065 및 이의 유사체, 돌라스타틴(dolastatin) 및 이의 유사체를 포함하는다. 이들 세포독성인자는 전술한 바와 같은 항체, 항체 단편, 기능적 동등물, 개선된 항체 및 이의 유사체에 접합된다.

세포독성 컨쥬게이트는 시험관내 방법으로 준비될 수 있다. 약제 또는 프로드러그를 항체에 결합시키기 위해 연결기(linking group)가 사용된다. 적절한 연결기는 당업계에 잘 알려져 있고, 이황화기, 티오에테르기, 산 불안정기(acid labile group), 광 불안정기, 펩티다아제 불안정기 및 에스테라아제 불안정기를 포함한다. 바람직한 연결기는 이황화기 및 티오에테르기이다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 이황화 교환반응을 이용하거나, 항체와 약제 또는 프로드러그 사이에 티오에테르 결합을 형성하여 구성될 수 있다.

메이탄시노이드

세포독성 컨쥬게이트를 형성하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 세포독성 인자들 중에서 메이탄시노이드 및 이의 유사체가 있다. 적절한 메이탄시노이드의 예로서 메이탄시놀과 이의 유사체가 있다. 메이탄시노이드는 미세소관 형성을 방해하고 포유류 세포에 매우 독성인 강한 약제이다.

적절한 메이탄시놀 유사체의 예로서 변형된 방향족 고리를 갖거나 다른 위치에서 변형을 갖는 것들이 있다. 이러한 적절한 메이탄시노이드는 다음의 미국특허들에 개시되어 있다(미국특허 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 및 5,846,545).

변형된 방향족 고리를 갖는 메이탄시놀 유사체의 특정예는 다음과 같다:

(1) C-19-데클로로(dechloro)(미국특허 4,256,746) (안사미토신 P2(ansamytocin P2)의 LAH 환원에 의해 제조);

(2) C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸(demethyl)) +/-C-19-데클로로 (미국특허 4,361,650 및 4,307,016) (스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 악티노마이세스(Actinomyces)를 이용한 탈메틸화, 또는 LAH를 이용한 탈염소화에 의해 제조); 및

(3) C-20-데메톡시(demethoxy), C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로 (미국특허 4,294,757) (아실 클로라이드를 이용한 아실화에 의해 제조).

다른 위치에서 변형을 갖는 메이탄시놀 유사체의 특정예는 다음과 같다:

(1) C-9-SH(미국특허 4,424,219) (H₂S 또는 P₂S₅와 메이탄시놀의 반응에 의해 제조);

(2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH₂OR) (미국특허 4,331,598);

(3) C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸(acyloxymethyl) (CH₂OH or CH₂OAc) (미국특허 4,450,254) (Nocardia로부터 준비);

(4) C-15-히드록시/아실옥시(미국특허 4,364,866) (스트렙토마이세스(Streptomyces)에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조);

(5) C-15-메톡시 (미국특허 4,313,946 및 4,315,929) (Trewia nudiflora로부터 분리);

(6) C-18-N-데메틸(demethyl)(미국특허 4,362,663 및 4,322,348) (스트렙토마이세스(Streptomyces)에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조); 및

(7) 4,5-데옥시(deoxy) (미국특허 4,371,533) (메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드(titanium trichloride)/LAH 환원에 의해 제조).

바람직한 실시예에서, 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트는 세포독성 인자로서 티올-함유 메이탄시노이드(DM1), 정식명칭으로서 N^2'-데아세틸(deacetyl)-N^2'-(3-머갑토-l-옥소프로필)-메이탄신을 이용한다. DM1은 하기의 구조식(Ⅰ)에 의해 표현된다:

다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트는 티올-함유 메이탄시노이드인 N^2'-데아세틸(deacetyl)-N^2'-(4-메틸-4-머갑토-l-옥소펜틸)-메이탄신을 이용한다. DM4는 하기의 구조식(Ⅱ)에 의해 표현된다:

또 다른 실시예에서, 본 발명은 다른 메이탄신, 즉 티올 및 이황화-함유 메이탄시노이드로서 황원자를 갖는 탄소 원자 상에서 모노 또는 디-알킬 치환을 갖는 것을 사용할 수 있다. 이들은 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시, 또는 C-20 데스메틸(desmethyl)에서 아실화된 아미노산 측쇄[간섭된 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)를 갖는 아실기 가짐]를 갖는 메이탄시노이드이고, 티올 작용기를 갖는 상기 아실기의 탄소 원자는 하나 또는 2개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 CH₃, C₂H₅, 1개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 또는 분지된 알킬 또는 알케닐, 3개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 상기 치환기의 하나는 수소일 수 있으며, 아실기는 카르보닐 작용기와 황 원자 사이에서 적어도 3개의 탄소원자길이의 직쇄상 사슬을 갖는다.

이러한 추가 메이탄신은 구조식(Ⅲ)에 의해 표현되는 화합물을 포함한다:

상기 식에서, Y'은

(CR₇CR₈)₁(CR₉=CR₁₀)_pC=C_qA_r(CR₅CR₆)_mD_u(CR₁₁=CR₁₂)_r(C=C)_sB_t(CR₃CR₄)_nCR₁R₂

SZ이고,

R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로 CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이며, 또한 R₂는 H이 될 수 있고;

A, B, D는 3개-10개의 탄소원자를 갖는 시클로알킬 또는 시클로알케닐, 단순형 또는 치환된 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이며;

R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₁, 및 R₁₂는 각각 독립적으로 H, CH₃, C₂H₅, 1개- 10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소 원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

l, m, n, o, p, q, r, s 및 t 중 적어도 두 개가 어떤 경우에도 0이 아니면l, m, n, o, p, q, r, s, 및 t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5 중의 정수이고;

Z는 H, SR 또는 -COR이며, 여기서 R은 1개-10개 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환된 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이다.

구조식 (III)의 바람직한 실시예는 아래와 같은 조건의 구조식 (III)의 화합물을 포함한다:

R₁는 H, R₂는 메틸, Z는 H인 것;

R₁ 및 R₂는 메틸, Z는 H인 것;

R₁는 H, R₂는 메틸, Z는 -SCH₃인 것; 그리고

R₁ 및 R₂는 메틸, Z는 -SCH₃인 것.

또한, 이러한 추가 메이탄신에는 하기 구조식 (IV-L), (IV-D), 또는 (IV-D,L)에 의해 표현되는 화합물들이 포함된다:

상기 식에서, Y는 (CR₇CR₈)_l(CR₅CR₆)_m(CR₃CR₄)_nCR₁R₂SZ이며,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 또한 R₂는 수소일 수 있으며;

R_3, R₄, R₅, R₆, R_7, R₈는 각각 독립적으로 H, CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로 시클로알킬 라디칼이고;

l, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5까지의 정수이고, 또한 n은 0일 수 있으며;

Z는 H, SR 또는 -COR이고, 여기서 R은 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 또는 분지된 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환된 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

May는 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸(desmethyl)에서 측쇄를 갖는 메이탄시노이드를 나타낸다.

구조식 (IV-L), (IV-D) 및 (IV-D,L)의 바람직한 실시예는 다음과 같은 조건의 구조식 (IV-L), (IV-D) 및 (IV-D,L) 화합물을 포함한다:

R₁은 수소이고, R₂는 메틸이며, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는 수소인 것;

R₁ 및 R₂는 메틸이고, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 수소인 것;

R₁은 수소이고, R₂는 메틸이며, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는 -SCH₃인 것; 그리고

R₁ 및 R₂는 메틸이고, R₅, R₆, R₇, R₈ 는 각각 수소이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 -SCH₃인 것.

세포독성인자는 구조식(IV-L)에 의해 표현된 것이 바람직하다.

또한, 추가의 메이탄신으로서 구조식(V)에 의해 표현되는 화합물이 포함된다:

상기 식에서, Y는 (CR₇CR₈)_l(CR₅CR₆)_m(CR₃CR₄)_nCR₁R₂SZ이며,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 또한 R₂는 수소일 수 있으며;

R_3, R₄, R₅, R₆, R_7, R₈는 각각 독립적으로 수소, CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원 자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

l, m, n은 각각 독립적으로 1 내지 5 중의 정수이고, 또한 n은 0일 수 있으며;

Z는 수소, SR 또는 -COR이고, 여기서 R은 1개-10개의 탄소원자를 가진 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 가진 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환된 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이다.

구조식(V)의 바람직한 실시예는 하기 조건의 구조식 (V)의 화합물을 포함한다:

R₁은 수소이고, R₂는 메틸이며, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는 수소인 것;

R₁ 및 R₂는 메틸이고, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 수소인 것;

R₁은 수소이고, R₂는 메틸이며, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0이고, Z는 -SCH₃인 것; 그리고

R₁ 및 R₂는 메틸이고, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이며, l 및 m은 1이고, n은 0이며, Z는 -SCH₃인 것.

이러한 추가의 메이탄신으로서 구조식(VI-L), (VI-D), 또는 (VI-D,L)에 의해 표현되는 화합물을 추가로 포함할 수 있다:

상기 식에서, Y₂는 (CR₇CR₈)_l(CR₅CR₆)_m(CR₃CR₄)_nCR₁R₂SZ₂이며,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 또한 R₂는 수소일 수 있으며;

R_3, R₄, R₅, R₆, R_7, R₈는 각각 독립적으로 수소, CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

l, m, n은 각각 독립적으로 1 내지 5 중의 정수이고, 또한 n은 0일 수 있으며;

Z₂는 SR 또는 -COR이고, 여기서 R은 1개-10개의 탄소원자를 가진 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 가진 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환된 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이며;

May는 메이탄시노이드이다.

이러한 추가의 메이탄신에는 구조식(VII)에 의해 표현되는 화합물이 포함된다:

상기 식에서, Y₂'는

(CR₇CR₈)_l(CR₉=CR₁₀)p(C=C)_qA_r(CR₅CR₆)_mD_u(CR₁₁=CR₁₂)_r(C=C)_sB_t(CR₃CR₄)_nCR₁R₂SZ₂이고,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 가진 직쇄상 또는 분지된 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 가진 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 또한 R₂는 수소가 될 수 있으며;

A, B, D는 각각 독립적으로 3개-10개의 탄소원자를 가진 시클로알킬 또는 시클로알케닐, 단순형 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₁, R₁₂는 각각 독립적으로 수소, CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 가진 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 가진 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이며;

l, m, n, o, p, q, r, s, t 중에서 적어도 두 개가 어떠한 경우에도 0이 아니라면 l, m, n, o, p, q, r, s, t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이고;

Z₂은 SR 또는 -COR이고, 여기서 R은 1개-10개의 탄소원자를 가진 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환된 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이다.

구조식(VII)의 바람직한 실시예에는 R1이 수소이고, R2가 메틸인 구조 식(VII)의 화합물이 포함된다.

전술한 메이탄시노이드는 항-CA6 항체 DS6, 이것의 동족체(homologue) 또는 단편에 접합될 수 있는데, 상기 항체는 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸(desmethyl)에서 발견되는 아실화된 아미노산 측쇄의 아실기 상에 존재하는 티올 또는 이황화 작용기를 사용하여 메이탄시노이드에 연결된다. 상기 아실화된 아미노산 측쇄의 아실기는 하나 또는 두 개의 치환기를 갖는 탄소에 위치한 티올 또는 이황화 작용기를 가지며, 상기 치환기는 CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 가진 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 가진 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 또한 상기 치환기 중 하나는 수소일 수 있으며, 상기 아실기는 카르보닐 작용기와 황원자 사이에 적어도 3개의 탄소원자가 있는 직쇄상 사슬 길이를 가진다.

본 발명의 바람직한 컨쥬게이트는 구조식(VIII)의 메이탄시노이드에 접합된 항-CA6 항체 DS6, 또는 이것의 동족체 또는 단편을 포함하는 것이다:

상기 식에서, Y₁'는

(CR₇CR₈)_l(CR₉=CR₁₀)p(C=C)_qA_r(CR₅CR₆)_mD_u(CR₁₁=CR₁₂)_r(C=C)_sB_t(CR₃CR₄)_nCR₁R₂S-이고,

A, B, D는 각각 독립적으로 3개-10개의 탄소원자를 갖는 시클로알킬 또는 시클로알케닐, 단순형 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₁, 및 R₁₂는 각각 독립적으로 H, CH₃, C₂H₅, 1개- 10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소 원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

l, m, n, o, p, q, r, s 및 t 중 적어도 두 개가 어떤 경우에도 0이 아니면l, m, n, o, p, q, r, s, 및 t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5 중의 정수이다.

바람직하게는 R₁은 수소이고 R₂는 메틸이거나, R₁ 및 R₂는 메틸이다.

본 발명의 보다 바람직한 컨쥬게이트는 구조식 (IX-L), (IX-D), 또는 (IX-D,L)의 메이탄시노이드에 접합된 항-CA6 항체 DS6, 이것의 동족체 또는 단편을 포함하는 것이다:

상기 식에서, Y₁은 (CR₇CR₈)_l(CR₅CR₆)_m(CR₃CR₄)_nCR₁R₂S-이고,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 또한 R₂는 수소일 수 있으며;

R_3, R₄, R₅, R₆, R_7, R₈는 각각 독립적으로 수소, CH₃, C₂H₅, 1개-10개의 탄소원자를 갖는 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 3개-10개의 탄소원자를 갖는 분지된 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고;

l, m, n은 각각 독립적으로 1 내지 5 중의 정수이고, 또한 n은 0일 수 있으며;

May는 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸(desmethyl)에서 측쇄를 갖는 메이탄시노이드를 나타낸다.

구조식 (IX-L), (IX-D), (IX-D,L)의 바람직한 실시예에는 다음과 같은 조건을 갖는 구조식 (IX-L), (IX-D), (IX-D,L)의 화합물이 포함된다:

R₁은 수소이고 R₂는 메틸이거나, R₁ 및 R₂이 메틸인 것;

R₁은 수소이고, R₂는 메틸이며, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0인 것; 그리고

R₁ 및 R₂는 메틸이고, R₅, R₆, R₇, R₈는 각각 수소이며, l 및 m은 1이고, n은 0인 것.

바람직한 세포독성인자는 구조식 (IX-L)에 의해 표현된 것이다.

보다 바람직한 컨쥬게이트는 구조식(X)의 메이탄시노이드에 접합된 항-CA6 항체 DS6, 이것의 동족체 또는 단편을 포함하는 것이다:

상기 식에서 치환기는 상기 구조식(IX)에 대해 정의된 바와 같다.

상기 기재된 화합물 중 특히 바람직한 것은 R₁은 수소이고, R₂은 메틸이며, R₅, R₆, R_7, R₈은 각각 수소이고, l 및 m은 각각 1이며, n은 0인 경우이다.

상기 기재된 화합물 중 보다 특별히 바람직한 것은 R₁ 및 R₂은 메틸이고, R₅, R₆, R₇, R₈은 각각 수소이며, l 및 m은 1이고, n은 0인 경우이다.

또한, L-아미노아실 광학이성질체(L-aminoacyl stereoisomer)가 바람직하다.

2004. 5. 20.자로 출원된 미국특허출원 제10/849,136호에 개시된 각각의 메이탄시노이드 역시 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트에 사용될 수 있다. 미국특허출원 제10/849,136호의 개시내용은 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.

이황화물-포함 연결기

메이탄시노이드를 DS6 항체 등의 세포결합인자에 연결하기 위해 메이탄시노이드는 연결성분(linking moiety)을 포함한다. 상기 연결성분에는 특정 위치에서 완전히 활성인 메이탄시노이드 방출을 허용하는 화학적 결합이 포함된다. 적절한 화학적 결합은 당업계에 알려져 있고, 이황화결합, 산 불안정 결합, 광 불안정 결합, 펩티다아제 불안정 결합 및 에스테라아제 불안정 결합이 포함된다. 바람직한 결합은 이황화결합이다.

또한, 상기 연결성분은 반응성 화학기를 포함한다. 바람직한 실시예에서,반응성 화학기는 이황화결합 연결성분을 통해 메이탄시노이드에 공유결합될 수 있다.

특별히 바람직한 반응성 화학기는 N-숙신이미딜 에스테르(N-succinimidyl esters) 및 N-설포숙신이미딜 에스테르(N-sulfosuccinimidyl esters)이다.

반응성 화학기를 포함하는 연결성분을 갖는 것으로 특히 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀의 C-3 에스테르 및 이의 유사체로서, 연결성분이 이황화결합을 포함하고 화학반응기가 N-숙신이미딜 에스테르 또는 N-설포숙신이미딜 에스테르를 포함하는 것이다.

메이탄시노이드 상의 많은 위치가 연결성분을 화학적으로 연결하는 위치로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸기로 변형된 C-14 위치, 히드록시기로 변형된 C-15 위치 및 히드록시기를 가지는 C-20 위치는 모두 사용 가능하다. 그러나, C-3 위치가 바람직하며 메이탄시놀의 C-3 위치가 특히 바람직하다.

연결성분을 갖는 메이탄시놀 에스테르의 합성이 이황화결합-포함 연결성분으 로서 기술되지만, 당업자라면 다른 화학적 결합(전술한 바와 같음)을 가진 연결성분도 본 발명에서 사용가능한 것임을 이해할 것이다. 다른 화학적 결합의 특정 예로서, 산 불안정 결합, 광 불안정 결합, 펩티다아제 불안정 결합, 에스테라아제 불안정 결합이 있다. 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되는 미국특허 제5,208,020호에는 전술한 결합을 갖는 메이탄시노이드의 제조가 설명되어 있다.

반응기를 갖는 이황화 성분을 가지는 메이탄시노이드 및 그 유도체의 제조는 미국특허 6,441,163 및 6,333,410, 그리고 미국특허출원 10/161,651에 설명되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.

DM1과 같은 반응기-포함 메이탄시노이드는 DS6 항체 등의 항체와 반응하여 세포독성 컨쥬게이트를 생산한다. 이들 컨쥬게이트들은 HPLC 또는 겔 여과(gel-filtration)에 의해 정제될 수 있다.

항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트 생산에 대한 몇몇 훌륭한 기술의 개요는 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되는 미국특허 6,333,410, 및 미국특허출원 09/867,598, 10/161,651 및 10/024,290에 기술되어 있다.

일반적으로 수용성 완충용액 내의 항체 용액은 반응기를 갖는 이황화 성분을 함유하는 몰 과량의 메이탄시노이드와 인큐베이션될 수 있다. 반응 혼합물에 과량의 아민(예를 들어, 에탄올아민, 타우린 등)을 첨가하여 반응을 종료시킬 수 있다. 그런 다음, 메이탄시노이드-항체 컨쥬게이트는 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.

항체 분자당 결합된 메이탄시노이드 분자의 수는 분광기로 252 nm 및 280 nm에서 측정한 흡광도 비를 측정하여 결정될 수 있다. 평균 항체 분자 하나 당 1개- 10개의 메이탄시노이드 분자 수가 바람직하다.

항체와 메이탄시노이드 약물의 컨쥬게이트는 원하지 않는 다양한 세포주의 시험관 내 증식을 억제하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들면 인간의 편평상피세포암(epidermoid carcinoma) 세포주 A-431, 인간의 소세포 타입 폐암 세포주 SW2, 인간의 유방암 세포주 SKBR3 및 버킷의 임파종 세포주 Namalwa(Burkitt's lymphoma line Namalwa)와 같은 세포주는 이들 화합물의 세포독성 평가를 위해 손쉽게 사용될 수 있다. 평가 세포들은 24시간 동안 상기 화합물에 노출시켰고, 알려진 방법으로 직접 분석하여 생존 세포 비율을 측정하였다. 분석 결과 IC₅₀ 값이 산출될 수 있다.

PEG-함유 연결기

메이탄시노이드는 또한 PEG 연결기를 사용하여 세포결합인자에 연결될 수 있다(미국특허출원 제10/024,290호 참조). 이들 PEG 연결기는 수용성 및 비수용성 용매 모두에서 용해될 수 있고, 하나 또는 그 이상의 세포독성인자를 세포결합인자에 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 대표적인 PEG 연결기에는 헤테로-이중기능성(hetero-bifunctional) PEG 연결기가 포함되는데, 상기 연결기는 대향되는 위치에서 세포독성인자 및 세포결합인자와 결합하되, 한쪽 말단에서는 설퍼히드릴 또는 이황화 작용기를 통해, 그리고 다른 쪽 말단에서는 활성 에스테르를 통해 결합한다.

PEG 연결기를 이용한 세포독성 컨쥬게이트의 합성에 대한 일반적인 예의 세부사항은 참고자료인 미국특허출원 제10/024,290호에 기술되어 있다. 반응성 PEG 성분을 갖는 하나 또는 그 이상의 세포독성인자가 세포결합인자와 반응하여 합성이 개시되고, 세포결합인자의 아미노산 잔기가 각각의 반응성 PEG 성분의 말단 활성 에스테르를 교체함으로써, PEG 연결기를 통해 세포결합인자에 공유결합된 하나 또는 그 이상의 세포독성인자를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트가 생성된다.

탁산

본 발명에 따른 세포독성 컨쥬게이트에서 사용되는 세포독성인자는 탁산 또는 그 유도체가 될 수 있다.

탁산은 세포독성을 갖는 천연물인 파클리탁셀(paclitaxel)[택솔(Taxol)], 및 반-합성의 유도체인 도세탁셀(Docetaxel)[택소티어(Taxotere)]을 포함하는 화합물 군으로서, 이들 두 화합물은 암치료에 널리 사용되는 것이다. 탁산은 세포분열시 방추사 독소로서 튜블린의 탈중합체화를 방해하여 세포사멸을 유도한다. 도세탁셀 및 파클리탁셀이 암치료에 유용한 약제이지만 정상 세포에 대한 비특이적인 독성문제 때문에 이들의 항종양 활성은 제한된다. 또한, 도세탁셀 및 파클리탁셀 등의 화합물은 세포결합인자의 접합에 사용될 만한 능력이 충분하지 않다.

세포독성 컨쥬게이트 제조에 있어서 사용되는 바람직한 탁산은 구조식(XI) 의 탁산이다:

항체 등의 세포결합인자에 탁산을 접합시키기 위한 방법과 함께 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트에서 사용가능한 탁산 합성방법은 미국특허 5,416,064, 5,475,092, 6,340,701, 6,372,738, 6,436,931, 및 미국특허출원 10/024,290, 10/144,042, 10/207,814, 10/210,112, 10/369,563에 세부사항이 기술되어 있다.

CC-1065 유사체

또한, 세포독성 컨쥬게이트에서 사용되는 세포독성인자는 CC-1065 또는 그 유도체일 수 있다.

CC-1065는 스트렙토마이세스 제렌시스(Streptomyces zelensis) 배양액으로부터 분리된 강력한 항종양 항생물질이다. CC-1065는 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉사트(methotrexate), 빈크리스틴(vincristine) 등의 일반적인 항암제보다 시험관 내에서 약 1000배 이상 효능이 있다(B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)). CC-1065 및 이것의 유사체는 미국특허 6,372,738, 6,340,701, 5,846,545, 5,585,499에 개시되어 있다.

CC-1065의 세포독성능은 그것의 알킬화 활성과, DNA-결합활성 또는 DNA-삽입활성(DNA-intercalating activity)과 연관되어 있다. 이들 두가지 활성은 분자에 있어서 상호 떨어진 부위에 존재한다. 따라서 알킬화 활성은 시클로프로파피롤로인돌(CPI) 서브 유닛에 존재하고 DNA-결합활성은 두 개의 피롤로인돌 서브 유닛에 존재한다.

비록 CC-1065가 세포독성인자로서 매력적인 특성을 지니지만, 치료용으로는 한계를 가진다. CC-1065를 마우스에 주입하면 지연성 간독성을 일으키는데 12.5μg/kg으로 1회 정맥 내 투여 후 50일째 사망으로 이어졌다 [V. L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)]. 이러한 사실은 지연성 독성을 일으키지 않는 유사체 개발노력을 자극하였고, CC-1065를 모델로 한 보다 단순한 유사체 합성법이 기술되었다[M.A. Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)].

다른 일련의 유사체에서, CPI 부위가 시클로프로파벤지인돌(CBI)로 대체되었다[D.L. Boger et al., J. Org. Chem., 55, 5823-5833, (1990), D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)]. 이들 화합물은 모체 약물의 높은 시험관 내 약물효능을 유지하면서도 마우스에 지연성 독성을 일으키지 않는다. CC-1065처럼 이들 화합물은 DNA의 마이너 그루부(minor groove)에 공유결합하여 세포사멸을 유발하는 알킬화제이다. 그러나, 가장 유망한 유사체인 아도젤레신(Adozelesin) 및 카젤레신(Carzelesin)에 대한 임상실험은 실망스런 결과를 가져왔다[B.F. Foster et al., Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996); I. Wolff et al., Clin. Cancer Res., 2,1717-1723 (1996)]. 이들 약제는 높은 전신 독성 때문에 낮은 치료효과를 나타낸다.

CC-1065 유사체의 치료효능은 종양부위로의 표적화된 전달을 통해 생체 내 분포를 변화시킴으로써 크게 개선될 수 있고, 결과적으로 비표적 조직에 대한 보다 낮은 독성 그리고 보다 낮은 전신 독성을 유발하게 된다. 목적 달성을 위해 특이적으로 종양 세포를 표적화하는 세포결합인자와 CC-1065 유사체 및 유도체와의 컨쥬게이트가 개시되어 있다(미국특허 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545). 이들 컨쥬게이트는 전형적으로 시험관 내에서 높은 표적특이적 세포독성을 나타내며, 마우스의 인간 종양 이종이식 모델에서 예외적인 항종양 활성을 나타낸다[R.V. J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)].

항체 등의 세포결합인자에 CC-1065 유사체를 접합시키기 위한 방법과 함께 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트에서 사용될 수 있는 CC-1065 유사체 합성방법은 미국특허 5,475,092, 5,846,545, 5,585,499, 6,534,660, 6,586,618 및 미국특허출원 10/116,053 및 10/265,452에 세부사항이 기술되어 있다.

다른 약제

메토트렉사트(methotrexate), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil), 칼리케아미신 (calicheamicin), 튜불리신(tubulysin), 튜불리신 유사체(tubulysin analogs), 듀오카르마이신(duocarmycin) 및 듀오카르마이신 유사체, 돌라스타틴(dolastatin) 및 돌라스타틴 유사체 등의 약제 또한 본 발명의 컨쥬게이트 제조에 적합하다. 약제 분자는 혈청 알부민 등의 중간매개분자를 통해 항체 분자에 연결될 수 있다. 독사루비신(Doxarubicin) 및 다노루비신(Danorubicin) 화합물 또한 유용한 세포독성인자이며, 이는 예를 들면 미국특허출원 09/740991에 기술되어 있다.

치료제 조성물

또한, 본 발명은 다음과 같은 것을 포함하는 치료제 조성물을 제공한다:

(a) 하나 또는 그 이상의 유효량 세포독성 컨쥬게이트, 및

(b) 제약학적으로 허용가능한 담체.

유사하게, 본 발명은 유효량의 세포독성 컨쥬게이트 또는 세포독성 컨쥬게이트를 함유하는 치료제를 단독으로 또는 다른 세포독성인자나 치료제와 함께 표적 세포 또는 표적 세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는 선택된 세포집단의 생장을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 치료제 조성물을 사용하여 암을 가지는 환자를 치료하는 방법이 포함된다.

이전에 기술된 방법에 의해 세포독성 컨쥬게이트의 시험관 내 효능 및 특이성을 평가할 수 있다(예를 들면, R.V.J. Chari et al, Cancer Res. 55:4079-4084 (1995) 참조). 마우스에 있어서 인간종양 이종이식 모델에 의해 항종양 활성을 평 가할 수 있다 (예를 들면, Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623 (1996) 참조).

적합한 제약학적으로 허용가능한 담체는 잘 알려진 것으로서 임상 상황이 허용하는 바에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이 담체로는 희석제 및 부형체(excipient)가 포함된다.

적절한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예로서는 (1) 약 1-25 mg/ml의 인간 혈청 알부민을 포함하거나 포함하지 않는 둘베코(Dulbecco) 인산완충식염수(pH ~ 7.4), (2) 0.9% 생리식염수 (0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스를 포함하고, 또한 트립타민(tryptamine)과 같은 항산화제 및 트윈 20(Tween 20)과 같은 안정화제를 포함할 수도 있다.

선택된 세포집단의 생장을 억제하는 방법은 시험관 내, 생체 내, 생체 외에서 실시될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이 생장 억제는 단시간 또는 장시간에 걸친 세포생장 지연, 세포 생존율 감소, 세포 사멸 유발, 세포 용해 및 세포사멸 유도를 의미한다.

시험관 내 사용의 예에는 질환을 갖고 있는 세포 또는 종양성 세포를 죽이기 위한 동일한 환자로의 이식에 앞선 자가 골수 처치; 면역력 있는 T 세포 사멸 및 이식편대숙주질환(GVHD) 방지를 위한 이식에 앞선 골수 처치; 표적 항원을 발현하지 않는 변이를 제외한 모든 세포를 죽이기 위해, 또는 원하지 않는 항원을 발현하는 변이를 죽이기 위한 세포배양물 처치가 포함된다.

비-임상적인 시험관 내 사용 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정된다.

임상적인 생체 밖(ex vivo) 사용의 예는 암치료 또는 자가면역질환 치료에 있어서 자가 이식에 앞서 종양 세포 또는 임파구를 골수로부터 제거하거나, 이식편대숙주질환(GVHD) 방지를 위해 이식에 앞서 T 세포와 다른 임파구를 자가 또는 동종의 골수 또는 조직으로부터 제거하는 것이다. 치료는 다음과 같이 수행될 수 있다. 골수가 환자 또는 다른 개인으로부터 추출되고 본 발명의 세포독성인자가 첨가되어 있는 혈청이 포함된 배지에서 배양된다. 농도는 약 10μM 에서 1pM로 하고, 배양시간은 약 37^oC에서 약 30 분에서 약 48 시간으로 한다. 정확한 배양 농도 및 시간 조건, 즉 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 배양 후에 골수세포는 혈청을 포함하는 배지로 세척되고, 알려진 방법에 따른 정맥 내 주입에 의해 환자에게 복귀시킨다. 골수 추출과 처치된 세포의 재주입 시간 사이에 파괴성 화학요법이나 전신 방사선 치료와 같은 다른 치료를 받고 있는 환자의 경우, 처치된 골수세포는 표준 의료장비를 사용하여 액화질소에서 냉동 저장된다.

생체 내 임상용 사용을 위한 세포독성 컨쥬게이트는 무균 및 내독소(endotoxin) 수준에 대해 테스트된 용액으로서 제공될 것이다. 적절한 세포독성 컨쥬게이트 투여의 예는 다음과 같다. 컨쥬게이트는 4주 동안 매주 정맥 볼루스(bolus)로서 투여된다. 일반적인 생리적 식염수 50-100 ml(5-10 ml의 인간 혈청 알부민이 첨가될 수 있음)로 볼루스 투여가 이루어진다. 투여량은 1회 정맥 내 투여 당 10 μg-100 mg이 될 것이다(하루에 100 ng-1 mg/kg의 범위). 보다 바람직하게 투여량은 50 μg-30 mg이 될 것이다. 가장 바람직하게는 1-20 mg이 될 것이다. 4주간의 치료 후에 환자는 주간 단위로 치료를 계속 받을 수 있다. 투여 방식, 부형제, 희석제, 투여량, 시간 등에 관한 특정 임상 프로토콜은 임상 상황이 허용하는 바에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.

선택된 세포집단을 사멸시키는 생체 내 또는 생체 밖 방법에 따라 치료될 수 있는 의학적 조건들의 예로는 모든 형태의 악성종양으로서, 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 난소암, 자궁경부암, 임파선암, 골육종, 활액종, CA6가 발현되는 육종 또는 암종, 그리고 CA6 글리코토프가 우세하게 발현되는 것으로 결정된 다른 암들; 전신 루푸스, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 등의 자가면역 질환; 신장 이식거부, 간 이식거부, 폐 이식거부, 심장 이식거부, 골수 이식거부 등의 이식거부; GVHD 질환; mV 감염, HIV 감염, AIDS 등의 바이러스 감염; 그리고 람블편모충증(giardiasis), 아메바증(amoebiasis), 주혈흡충병 (schistosomiasis) 등의 기생충 감염 및 다른 감염을 포함한다.

키트(kit)

본 발명은 키트, 예를 들면 전술한 세포독성 컨쥬게이트를 포함하는 키트, 및 특정 세포 유형을 사멸시키기 위한 세포독성 컨쥬게이트의 사용방법(사용지침)을 포함한다. 상기 사용방법에는 세포독성 컨쥬게이트를 시험관 내, 생체 내, 생체 외에서 사용하기 위한 지침이 포함된다.

일반적으로 상기 키트는 세포독성 컨쥬게이트를 포함하는 구획을 가진다. 세포독성 컨쥬게이트는 냉동건조형태, 액상, 또는 키트 내에 포함되도록 수정가능한 다른 형태일 수 있다. 상기 키트는 키트 내의 지침에 기술된 방법을 실행하기 위해 필요한 부가적 요소들, 예를 들면 냉동건조 분말을 재구성하기 위한 멸균 용액, 환자에게 투여하기 전에 세포독성 컨쥬게이트와 결합시키는 첨가제, 및 컨쥬게이트를 환자에 투여하는 것을 도와주는 도구를 포함할 수 있다.

추가 실시예들

또한, 본 발명은 연구 또는 진단 분야에서의 사용을 위해 추가로 표지되는 단일클론 항체, 인간화된 항체 및 이것의 에피토프-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 표지는 방사성 표지, 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 이미징 물질(imaging agent) 또는 금속이온이다.

또한, 본 발명은 상기 표지된 인간화된 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 암으로 의심되는 피검자에 투여하고 피검자의 체내에서 상기 표지의 분포를 측정하고 모니터링하는 방식의 진단방법을 제공한다.

실시예

본 발명의 광범위한 범위는 다음 실시예들을 참고하여 이해될 수 있으며, 이러한 실시예들은 본 발명을 특정 실시예에 제한하기 위해 의도된 것이 아니다.

실시예 1: 유동 세포 측정 결합(flow cytometry binding) 어세이에 의한 항원 양성 및 음성 세포주의 확인

유동세포측정 분석(flow cytometric analysis)은 세포 표면에 DS6 에피토프인 CA6의 위치를 결정하기 위해 사용되었다. 인간 세포주는 OVCAR5 (Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6):866-872 (2000)), OVCAR8 및 IGROV1 세포 (M. Seiden, Massachusetts General Hospital)를 제외하고 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 입수하였다. 모든 세포들은 이후 배지로서 언급되는 4 mM의 L-글루타민, 50 U/ml의 페니실린, 50㎍/ml의 스트렙토마이신(Cambrex Bio Science, Rockland, ME) 및 10% v/v의 우태아 혈청(fetal bovine serum) (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO)이 보충된 RPMI 1640에서 생장시켰다. 세포들은 37℃, 5% CO₂의 습도조절된 인큐베이터에서 배양되었다.

세포들(1-2×10^-5cells/well)은 96-웰 플레이트에서 FACS 완충용액(2% 염소 혈청, RPMI)으로 순차적으로 농도가 희석된 DS6 항체와 함께 얼음 위에서 3-4 시간 동안 배양되었다. 세포들은 4℃에서 테이블 탑 원심분리기(table top centrifuge)에서 5분간 1500rpm으로 회전시켜 침강시켰다. 배지를 제거한 후에 웰은 150 ㎕의 FACS 완충용액으로 다시 채워졌다. 그런 다음 세척단계가 반복되었다. FITC-표지된 염소의 항-마우스 IgG (Jackson Immunoresearch)가 FACS 완충용액으로 1:100 희석되었으며, 얼음 위에서 1시간 동안 세포와 함께 배양되었다. 플레이트는 빛에 의한 신호의 광탈색을 막기 위해 호일(foil)로 덮여졌다. 2회 세척 후에 세포는 1% 포름알데히드로 고정되고 유동세포분석기로 분석되었다.

종양 면역조직화학으로부터 예상된 바와 같이, 난소, 유방, 자궁경부 및 췌 장 기원의 세포주에서 CA6 에피토프가 우세하게 발견되었다(표 3). 그러나, 다른 종양 유형의 몇몇 세포주는 제한된 CA6 발현을 나타냈다. DS6 항체는 K_D 명시값 135.6 pM로 결합한다(PC-3 세포의 경우, 표 3 참조). 항원 양성 세포주에서 결합곡선 (도 1)의 최대 평균 형광값(maximum mean fluorescence) (표 3)은 상대적 항원 농도를 암시한다.

표 3

세포주	조직	항원	MMF*	Kd 명시값(M)		세포주	조직	항원	MMF*	Kd 명시값(M)
HL-60	혈액	-				Caov-3	난소	+	465.20	5.478x 10-09
Jurkat	혈액	-				Caov-4	난소	+	149.00	4.043 x 10-09
Namalwa	혈액	-				ES-2	난소	-
U-937	혈액	-				IGROV1	난소	-
T98G	뇌	+	35.94	1.775 X 10-10		OV-90	난소	-
BT-20	유방	+	232.20	9.142 x 10-10		OVCAR-3	난소	-
BT-474	유방	-				OVCAR5	난소	+	97.10	1.473 x 10-09
BT-483	유방	+	1911.00	1.366 x 10-08		OVCAR8	난소	-
BT-549	유방	+	71.39	1.046 x 10-09		PA-1	난소	-
CAMA-1	유방	+	12.46	2.330 x 10-09		SK-OV-3	난소	-
MCF-7	유방	+	81.41	2.890 x 10-09		SW 626	난소	-
MDA-MB-157	유방	+	8.635	1.972 x 10-10		TOV-112D	난소	-
MDA-MB-231	유방	+	31.85	1.460 x 10-09		TOV-21G	난소	+	87.79	3.067 x 10-10
MDA-MB-468	유방	+	71.58	8.127 x 10-10		AsPC-1	췌장	-
SK-BR-3	유방	-				BxPC-3	췌장	+	79.99	5.263 x 10-09
T-47D	유방	+	559.58	3.424 x 10-09		HPAC	췌장	+	2228.00	2.348 x 10-08
ZR-75-1	유방	+	811.67	4.299 x 10-09		HPAF-II	췌장	+	266.50	2.811 x 10-09
HeLa	자궁경부	+	242.50	6.938 x 10-10		Hs766T	췌장	+	182.90	2.319 x 10-09
KB	자궁경부	+	119.56	1.110 x 10-09		MIAPaCa2	췌장	-
WISH	자궁경부	+	1133.55	2.380 x 10-09		MPanc96	췌장	-
Colo205	장	-				SU.86.86	췌장	+	36.86	1.043 x 10-09
DLD-1	장	-				SW1990	췌장	+	36.17	3.679 x 10-10
HCT-8	장	-				PC-3	전립선	+	24.81	1.356 x 10-10
HT-29	장	-				A375	피부	-
Caki-1	신장	-				SKMEL28	피부	-
A549	폐	-				KLE	자궁	-
SW2	폐	-

^* 최대 평균 형광값(average maximum relative mean fluorescence; MMF)

실시예 2: DS6 에피토프의 특성화

DS6 항원인 CA6의 특성을 단백질가수분해 (프로나아제 및 프로테이나아제 K) 및/또는 당분해 (뉴라미니다아제 및 과요오드산)에 의해 분해된 CA6-양성 세포용해물(또는 세포여액)(Caov-3)의 도트 블랏(dot blot)을 면역블롯팅(immunoblotting)에 의해 분석하였다. 양성 대조군을 위해, 다양한 에피토프 타입을 인식하는 다른 항체들이 항원 양성 세포주의 용해물에 대해 테스트되었다(Caov-3 및 CM1; Colo205 및 C242; SKMEL28 및 R24). CM1은 Muc-1의 직렬반복서열수 변이 영역(VNTR)의 단백질 에피토프를 인식하여 단백질 에피토프를 조절하는 항체이다. C242는 Muc-1 상의 새로운 결장암 특이적인 시알산-의존적인 글리코토프(CanAg)에 결합하여 단백질 상의 글리코토프를 조절한다. R24는 흑색종에 특이적인 GD3 강글리오시드에 결합하여 비단백질 골격 상의 글리코토프를 조절한다.

Caov-3, Colo205, 및 SKMEL28 세포들은 15cm 조직배양 플레이트에 이식되었다. 배지(30mL/plate)는 세포용해(lysis) 전 날에 새로 갈아주었다. 변형된 RIPA 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, 0.25% 소디움 데옥시콜레이트), 프로테아제 억제제[PMSF, 펩스타틴 A(Pepstatin A), 루펩틴(Leupeptin), 아프로티닌(Aprotinin)], 및 PBS는 얼음 위에서 미리 냉각되었다. 배지가 플레이트로부터 흡출된 후에 세포는 냉각된 PBS 10 ml로 두 번 세척되었다. 이후의 절차들 모두는 얼음 위에서 및/또는 4℃ 냉장실에서 실시되었다. 최총 PBS 세척액이 흡출된 후 세포들은 1-2 mL의 세포용해 완충용액 (프로테아제 억제제가 새롭게 첨가된 RIPA 완충액으로서, PMSF가 1 mM, 펩스타틴 A가 1 μM, 루펩틴이 10 ㎍/ml, 아프로티닌이 2㎍/ml의 최종농도가 되도록 첨가)에서 용해되었다. 셀 리프터(cell lifter)를 사용하여 플레이트의 세포용해물을 잘게 만들고, 18G 니들을 사용하여 현탁액을 위 아래로 (5-10 회) 피펫팅하여 세포용해물을 분쇄하였다. 세포용해물은 10 분 동안 회전된 다음에 미세원심분리기에서 최대 (13K rpm)로 10 분간 원심분리되었다. 펠렛은 버려지고 상층액은 브래드포드 단백질 분석키트(Bradford Protein assay kit) (Biorad)를 사용하여 분석되었다.

세포용해물 (2 ㎕)은 건조된 0.2 ㎛의 니트로셀룰로오스막 위로 직접 피펫팅되었다. 스폿은 약 30분 동안 공기중 건조되었다. 막은 각각 한 개의 스폿을 함유하는 조각으로 절단되었다. 스폿은 프로나아제(1 mg/ml 효소, 50 mM Tris pH 7.5, 5 mM CaCl₂), 프로테이나아제 K (1 mg/ml 효소, 50 mM Tris pH 7.5, 5 mM CaCl₂), 뉴라미니다아제 (20 mU/ml 효소, 50 mM 아세트산나트륨 pH 5, 5 mM CaCl₂, 100 ㎍/ml BSA) 또는 과요오드산 (20 mM, 0.5M 아세트산나트륨 pH 5) 존재 하에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 시약은 Roche (효소) 및 VWR (과요오드산)로부터 구입하였다. 막은 5분간 T-TBS 세척 완충액 (0.1% Tween 20, 1X TBS)으로 세척되었고, 차단완충용액(blocking buffer) (3% BSA, T-TBS)에서 2시간 동안 실온에서 차 단되었으며, 차단 완충용액에서 2 ㎍/ml의 1차 항체(즉, DS6, CM1, C242, R24)와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션되었다. 막은 5분간 T-TBS로 3회 세척된 다음, HRP-접합된 염소의 항-마우스 (또는 인간) IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch; 차단 완충용액으로 1:2000으로 희석)로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 면역블롯은 3회 세척되었고 ECL 시스템 (Amersham)을 사용하여 현상하였다.

분해된 대조군 세포용해물의 면역 블롯(immunoblot)(도 2)은 단백질 에피토프를 인식하는 항체에 대해 예상된 바와 같이 당분해 신호가 영향을 받지 않는 반면에 CM1 신호는 단백질분해에 의해 파괴되었음을 나타낸다. C242 신호는 단백질 상의 글리코토프를 인식하는 항체에 대해 예상된 바와 같이 단백질분해 또는 당분해에 의해 파괴되었다. 단백질분해로 영향을 받지 않는 R24 신호는 강글리오시드(ganglioside)를 인식하는 항체에 대해 예상된 바와 같이 뉴라미니다아제 또는 과요오드산으로 파괴되었다. 분해된 Caov-3 세포용해물 도트 블롯(dot blots)에 대한 DS6 면역블롯은 단백질분해 및 당분해 화합물 처리에 의한 신호 감소를 보여준다. 따라서, C242와 같이 DS6는 단백질 코어 상의 탄수화물 에피토프에 결합한다. 또한, DS6 면역블롯(immunoblot)에서의 신호는 뉴라미니다아제 처리에 민감했다. 따라서, CanAg와 같이 CA6는 시알산-의존적인 글리코토프이다.

CA6의 탄수화물 성질을 확인하기 위해 Caov-3 세포 용해물이 PVDF 막 위로 스폿되었고, 대기온도의 질소 하에서 5분 동안 화학적 탈글리코실화 시약인 트리플루오로메탄 술폰산(TFMSA)으로 처리되었다. 블롯은 T-TBS로 세척되었고 CM1 또는 DS6로 면역블롯팅하였다(도 3). DS6 신호는 CA6가 글리코토프라는 증거를 제공하는 산처리에 의해 파괴되었다. TFSMA 처리에 대한 CM1 신호의 증가는 산처리가 필터 상의 단백질에 영향을 주지 않는다는 것을 의미하며, 당분해 처리는 CM1에 의해 인식되는 단백질 에피토프를 벗긴다는 것을 암시한다.

CA6가 존재하는 탄수화물 구조를 밝히기 위해, 도트 블롯(dot blots)은 N-글리카나아제, O-글리카나아제, 및/또는 시알리다아제로 분해되었다(도 4). Caov-3 세포용해물(100 ㎍, 30㎕)은 100℃에서 5분 동안 SDS 및 β-머캅토에탄올을 포함하는 2.5 ㎕의 변성완충액(Glyko)으로 인큐베이션되었다. 변성된 세포용해물은 37℃에서 1시간 동안 1 ㎕의 N-글리카나아제, O-글리카나아제, 및/또는 시알리다아제 A (Glyko)로 분해되었다. 분해된 세포용해물은 전술한 바와 같이 니트로셀룰로오스 상에 스폿팅(2 ㎕)되었고 면역블롯팅되었다.

N-글리카나아제는 DS6 면역블롯 신호에 대해 명시적인 영향을 주지 않는다. 그러나, 시알리다아제로 분해된 샘플들은 아무런 신호를 내보내지 않았다. O-글리카나아제는 시알리다아제에 의한 사전처리없이는 시알화된 O-링크 탄수화물을 분해할 수 없기 때문에, O-글리카나아제 단독으로 처리된 샘플의 DS6 신호는 영향을 받지 않았다. 반면에, N-글리카나아제는 활성을 위해 글리코시드 효소에 의한 사전처리를 요구하지 않는다. N-글리카나아제 처리가 DS6 신호에 영향을 주지 않는다는 사실은 CA6 에피토프가 시알화된 O-링크 탄수화물 사슬 상에서 존재할 가능성이 가장 높음을 암시한다.

실시예 3: CA6 에피토프가 발견된 항원에 대한 설명

CA6 시알로글리코토프가 발견된 항원을 동정하기 위해, DS6 면역침전물이 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의해 분석되었다. 세포용해물의 상층액(1 mL/샘플; 3-5 mg 단백질)은 단백질 G 비드(30 ㎕)에 의해 미리 정화되었고, 4℃에서 1-2 시간 동안 교반하면서 1 ml의 RIPA 완충용액으로 평형상태로 하였다. 이후의 절차들은 모두 얼음 위 및/또는 4℃ 냉장실에서 실시되었다. 미리 정화된 비드는 마이크로원심분리기에서 간단하게 (2-3초) 분리되었다. 미리 정화된 상층액은 깨끗한 튜브로 이동되었고 회전시키면서 2㎍의 DS6와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 깨끗하고 평형상태인 단백질 G 비드(30㎕)가 세포 용해물에 첨가되었고 회전시키면서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 비드-세포용해물 현탁액은 마이크로원심분리기에서 간단하게 회전시켜 가라앉게 하였고, 면역침전 후 세포용해물 샘플이 선택적으로 취해졌다. 비드는 1 mL의 RIPA 완충액으로 5-10회 세척되었다.

면역침전된 DS6 샘플은 이후 30㎕의 뉴라미니다아제(20 mU 뉴라미니다아제(Roche), 50 mM 아세트산나트륨 pH 5, 5 mM CaCl₂, 100 ㎍/ml BSA) 또는 30㎕의 과요오드산 (20 mM 과요오드산 (VWR), 0.5M 아세트산나트륨 pH 5)로 37℃에서 1시간 동안 분해처리되었고, 30㎕의 2X 샘플 로딩 완충용액 (β-머캅토에탄올 함유)에서 다시 현탁시켰다. 비드는 5분간 가열되었고, 로딩 완충용액의 상층액은 4-12% 또는 4-20% 트리스-글리신 겔(Invitrogen)상으로 로딩되었다. 상기 겔은 Laemmli 전기영동 완충액에서 125 V로 1.5 시간 동안 전기영동되었다. 상기 겔 샘플은 20 mA에서 미니 트랜스-블롯 이동장치 (Biorad)를 사용하여 밤새 0.2 μm 니트로셀룰 로오스막(Invitrogen)으로 이동되었다. 상기 막은 상기 실시예 2에서 기술된 바와 같이 DS6로 면역블롯팅되었다.

다른 방법으로서, 면역침전된 비드는 먼저 변성된 후에 N-글리카나아제, O-글리카나아제 및/또는 시알리다아제 A (Glyko)에 의해 효소적으로 분해되었다. 상기 비드는 27㎕의 인큐베이션 완충용액 및 2㎕의 변성 용액 (Glyko)에서 다시 현탁되었고 100℃에서 5분간 인큐베이션되었다. 실온으로 냉각된 후에 세제 용액(2 ㎕)이 첨가되었고, 샘플은 1 ㎕의 N-글리카나아제, O-글리카나아제, 및/또는 시알리다아제 A로 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션되었다. 5X 샘플 로딩 완충용액 (7㎕)을 첨가한 후에 샘플은 5분간 가열되었다. 전술한 바와 같이, 샘플에 대해 SDS-PAGE를 수행하였고 샘플은 면역블롯팅되었다.

DS6는 항원 양성 세포용해물에서 볼 수 있는 >250 kDa의 단백질 밴드를 면역침전시킨다(도5A, 도5B, 도5C). 몇몇 세포주(즉, T-47D)에서 이중 밴드(doublet)가 관찰된다. >250 kDa 밴드는 뉴라미니다아제 또는 과요오드산으로 처리된 Caov-3 면역침전물에서 사라졌는데(도5A 및 도5B), 이는 CA6 에피토프가 >250 kDa 밴드 상에 존재함을 암시한다. 또한, >250 kDa 밴드는 면역침전물을 N-글리카나아제로 처리하는 것에 민감하지 않은 것으로 나타났는데, 이는 O-링크 탄수화물 상에 CA6이 존재한다는 점과 일치한다(도 5F). 250 kDa 밴드가 CA6 항원임을 더욱 지지하는 것은 DS6가 DS6 항원 음성 세포로부터 아무런 밴드도 면역침전하지 않는다는 사실이다 (도5D 및 도5E).

여러 가지 증거에 의하면 CA6 항원이 Muc1이라는 것을 암시한다. 고분자량 및 O-링크 탄수화물에 특이적인 당분해 효소 민감성 때문에 CA6 항원은 뮤신인 것으로 보인다. 뮤신 과발현은 특히 유방 및 난소 종양에서 특징적인 것으로서, 이는 DS6의 주요 종양 반응성과 일치한다. 또한, CanAg (Muc1 상의 시알로글리코토프)처럼 CA6는 과염소산 침전에 민감하지 않는데, 이는 CA6 항원이 고도로 O-글리코실화된 것을 암시한다. DS6를 발현하는 몇몇 세포주에서 DS6는 >250 kDa의 이중 밴드를 면역침전시키는데, 이는 CA6가 Muc1임을 암시한다. 인간에서의 Muc1의 존재는 2개의 구별되는 Muc1 대립유전자의 존재에 의해, 즉 직렬 반복수의 차이로 상이한 분자량을 갖는 2개의 Mucl 단백질 발현에 의해 증명된다.

CA6가 Muc1 상에서 발견되는지를 테스트하기 위해, Caov-3 세포용해물로부터의 DS6 면역침전물에 대해 SDS-PAGE가 수행되었고, DS6 또는 Muc1 VNTR 항체인 CM1으로 면역블롯팅시켰다. 도6A에서 볼 수 있는 것과 같이 CM1은 DS6로 면역침전된 >250 kDa 밴드와 강하게 반응한다. 도 6B에서 HeLa 세포 용해물로부터의 DS6 및 CM1 면역침전물은 DS6 또는 CM1로 면역블롯팅될 때 동일한 >250 kDa의 이중 밴드를 나타낸다. 본 결과들은 CA6 에피토프가 실제 Muc1 단백질 상에 위치하는 것을 암시한다. HeLa (및 T-47D) 세포에서 발견되는 DS6 이중 밴드(doublet)는, Muc1 발현이 상이한 직렬 반복수를 갖는 구별되는 대립유전자에 의해 지시된다는 사실에 의해 설명될 수 있다.

비록 CM1 및 DS6은 동일한 Muc1 단백질에 결합하지만, 구별되는 에피토프이다. 트리플루오로메탄 술폰산(TFMSA)에 의한 Caov-3 세포용해물 도트 블롯(dot blots)의 화학적 탈-글리코실화는 DS6 신호를 제거하였다(도 3). 그러나, 동일한 처리는 CM1 신호를 증가시켰다. 탈글리코실화는 CM1 항체에 대한 숨은 에피토프를 노출시켰을 수 있다. 또한, DS6 및 CM1에 대한 유동 세포 측정 결합결과들의 비교(표 4)를 보면, CA6 에피토프가 Mucl을 발현하는 모든 세포에 존재하는 것은 아님을 알 수 있다. CA6 에피토프가 Muc1 CanAg 시알로글리코토프를 매우 높은 수준으로 발현하는 것으로 알려진 세포주인 Colo205에서 발현되지 않는다는 것은 주목할 만하다(표 3).

표 4

		DS6		CM1
	세포주	MMF*	Kd 명시값 (M)	MMF*	Kd 명시값(M)
DS6 양성 & CM1 양성	BT549	71.39	1.046 ×10-09	187.90	6.056 ×10-09
	CaOV3	465.20	5.478 ×10-09	1031.00	7.479 ×10-09
	HeLa	242.50	6.938 ×10-10	334.80	2.907 ×10-09
	KB	119.56	1.110 ×10-09	338.00	5.345 ×10-09
	MCF7	81.41	2.890 ×10-09	1023.00	8.694 ×10-09
DS6 음성 & CM1 양성	KLE	27.48	-	561.70	8.156 ×10-09
	OVCAR3	21.19	-	192.50	5.949 ×10-09
	SKOV3	17.53	-	49.41	6.246 ×10-09

^*최대 평균 형광값(maximum mean relative fluorescence; MMF)

실시예 4: 이탈된(흘러들어간) CA6 에피토프의 정량분석

다수의 암환자에서 혈류 속으로 흘러들어가는 분자인 Muc1 상에 CA6 에피토프가 있기 때문에, 이러한 혈류 수준이 DS6 항체 요법을 방해하는지 여부를 결정하기 위한 정량적 접근이 이루어졌다. 항원에 대한 순환하는 항체의 결합은 혈액으로 부터 신속한 면역 복합체의 제거를 이끄는 것으로 생각된다. 만약 투여되는 항체 중 상당 부분이 혈류로부터 신속히 제거된다면 종양에 도달하는 항체 양이 감소되어 항체 치료의 항종양 활성 감소 결과를 가져올 것으로 보인다. 항체가 고성능 세포독성 화합물에 접합되어 있을 때, 컨쥬케이트(접합체)의 급속한 제거는 비특이적 독성을 상당히 증가시킬 수 있을 것이다. 따라서, DS6-DM1 등의 항체-소형 약제 컨쥬게이트의 경우, 높은 수준으로 흘러들어간 항원은 항종양 효과 감소 및 투여량 제한적인 독성 증가 모두를 가져올 것으로 예상된다.

항체요법의 최근 임상실험은 약물역학적으로 흘러들어간 항원 농도의 영향에 대한 정보를 제공했다. 예를 들면 her2/neu-발현 전이성 유방암의 치료에 사용된 항체인 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin)에 의한 임상실험에 있어서, 트라스투주맙 제거에 대한 약물역학은 흘러들어간 Her2/neu 수치가 500 ng/mL 보다 작을때는 변경되지 않는 것으로 나타났다(Pegram et al., J. Clin. Oncol. 16(8):2659-71 (1998). 흘러들어간 Her2/neu의 분자량이 110,000 달톤(Daltons)인 것을 가정할 때, 4.5 nM 이하의 흘러들어간 Her2/neu의 몰 농도는 약물역학에 영향을 주지 않는 것으로 보인다.

또 다른 실시예에서 칸투주맙 머탄신(cantuzumab mertansine) (huC242-DM1)에 의한 임상실험은 사전처리되어 흘러들어간 CanAg (C242 에피토프) 수치와 항체제거의 약물역학 사이에 아무런 관련이 없음을 보여주었다(Tolcher et al., J. Clin. Oncol. 21(2):211-22 (2003). DS6에 의해 인식되는 CA6 에피토프와 유사한 CanAg 에피토프는 Muc1 상에 위치하는 특정 종양에 특이적인 O-링크 시알로글리코 토프이다. 그러나, CanAg 에피토프의 이종성은 몰 단위의 정량을 어렵게 한다. 일반적인 집단에서 Muc1 대립유전자는 직렬반복서열수 변이 영역(VNTR)에서의 직렬 반복수에 따라 길이가 다양하다. O-링크된 글리코실화를 위한 몇개의 위치가 각각의 직렬 반복에서 나타난다. 복잡한 CanAg 발현에 더하여, 고유의 글리코실 전이효소 활성에 있어서 세포 간의 변이가 다양하다. 따라서, 한 명의 환자에게서도 Mucl 분자 당 광범위한 CanAg 에피토프가 가능하다. 또한, Muc1 분자 당 CanAg 에피토프 비는 환자 집단 마다 상이할 것이다. 이 때문에, 혈청 샘플 내의 흘러들어간 CanAg은, CanAg 에피토프를 갖는 흘러들어간 Muc1이 C242에 의해 포획되고 비오틴화된 C242/스트렙타비딘 HRP 시스템에 의해 검출되는 샌드위치 ELISA에 의해 측정된다. 흘러들어간 CanAg는 Mucl 몰 농도 보다는 혈청 1ml 당 에피토프 수에 비례하는 표준단위(U)로 정량화된다. 유사하게, 흘러들어간 CA6 에피토프의 정량화에 대해서도 유사한 상황이 발생한다. 대조적으로, 트라스투주맙의 경우에는 흘러들어간 her2/neu 분자 당 단지 하나의 에피토프만이 있어 흘러들어간 항원의 정량화를 상당히 단순화시킨다.

흘러들어간 CA6 에피토프 수치를 트라스투주맙 및 칸투주맙 머탄신으로 행한 임상시험에서 확인된 수치들과 연관시키기 위해, Muc1 상의 시알로글리코토프와 같은 복잡한 에피토프의 몰 농도를 얻는 방법이 개발되었다. 먼저, DS6에 대한 단순한 샌드위치 ELISA 분석이 행해졌다. 분석 설명은 도7A에 도시되어 있다. DS6은 CA6 에피토프를 갖는 Muc1을 포획하기 위해 사용되었다. 각각의 Muc1 분자는 다수의 CA6 에피토프를 가지기 때문에, 비오틴화된 DS6가 추적 항체로서 사용되었다. 포획된 CA6에 결합된 비오틴화된 DS6는 기질로서 ABTS를 사용한 스트렙타비딘-HRP에 의해 검출되었다. CA6 에피토프는 난소암 환자 혈청으로부터 포획되거나, 또는 유방암 환자에 있어서 흘러들어간 Mucl을 모니터링하기 위해 사용되는 Mucl 테스트 키트(CA15-3)로부터 얻은 표준샘플로부터 포획되었다. DS6 U/ml(units/ml)는 CA15-3 표준 U/ml와 동등하도록 임의로 설정했다.

도 7B에는 CA15-3 표준이 사용된 DS6 샌드위치 ELISA 결과가 도시되어 있다. 생성된 곡선은 CA15-3 어세이에서 CA15-3 표준으로 얻은 것과 매우 유사하다. DS6 U/ml를 CA6 몰 농도로 전환하기 위해, 신호를 피코그램 단위의 DS6로 바꾸는 비오틴화된 DS6에 대한 표준곡선이 필요하다. CA6 에피토프와 비오틴화된 DS6 항체 간의 일대일 화학량론 및 비오틴화된 DS6의 분자량이 160,000 달톤인 것을 가정하면, 첨가된 샘플 용적당 포획된 CA6 몰을 계산할 수 있다.

도8A 및 도8B에는 비오틴화된 DS6에 대한 표준곡선을 제공하는 두 개의 방법에 대한 설명이 있다. 도8A에서 염소의 항-마우스 IgG 다중클론항체가 비오틴화된 DS6를 포획하기 위해 사용되고, 비오틴화된 DS6는 이후 도7에 도시된 샌드위치 ELISA 분석에서 사용된 것과 동일한 방식으로 검출된다. 도8B에 도시된 방법에서 비오틴화된 DS6는 직접 ELISA 플레이트 상에 놓여지고 도8A에서와 같이 검출된다.도8C에서 확인되는 바와 같이 각 방법에 의해 생성된 비오틴화된 DS6 표준곡선은 서로 일치한다.

표 5에는 흘러들어간 다양한 항원들에 대한 난소암 환자 혈청 샘플의 분석이 도시되어 있다. 일반적으로 CA125 ELISA는 흘러들어간 CA125 U/ml를 측정하여 난소 암 환자의 치료를 모니터링하는데 사용된다. CA125 측정기구에 혈청 샘플이 제공되었다. 일반적으로 CA15-3 ELISA는 흘러들어간 Muc1 U/ml를 측정하여 유방암 환자의 치료를 모니터링하는데 사용되는데, 이는 DS6에 의해 인지되는 것과 구별되는 에피토프를 인지하는 항체들을 포획 및 검출하는 방식으로 이루어진다. 표 5에서는 CA15-3가 난소암 환자 혈청샘플에서 측정된다.

표 5

혈청 No.	CA1251 (U/ml)	CA15-31 (U/ml)	DS62 (U/ml)	DS63 (pM)	DS64 (pM)
4	72.80	117.72	29.79	52.13	188.94
5	3651.90	98.19	567.02	654.44	>2560.00
6	930.50	87.08	504.15	667.56	2505.00
7	76.00	72.70	135.65	246.94	778.25
8	32.50	18.44	39.96	65.19	239.88
9	551.70	292.39	>975.61	1512.31	>2560.00
10	90.00	42.40	49.48	85.19	305.88
11	200.50	60.58	92.32	152.38	526.75
12	283.00	35.67	83.65	135.81	485.06
13	197.50	20.61	35.92	61.06	216.25
14	100.60	6.13	12.39	23.19	88.06
15	34.60	59.18	199.85	286.63	1228.56
17	196.40	56.75	66.53	130.44	405.88
18	16.90	30.45	34.43	60.81	223.69
19	22.00	263.93	118.98	191.69	728.94
22	110.70	21.44	16.46	29.94	111.38
1 상업용 ELISA 키트로 결정됨
2 상업용 CA15-3 표준으로 결정됨 (1 CA15-3 U = 1 DS6 U)
3 염소의 항-마우스 IgG & 비오틴-DS6 표준곡선
4 비오틴-DS6 표준곡선

표 5에 나타난 CA15-3의 값을 얻기 위해 CanAg Diagnostics에서 구입한 CA15-3 효소면역분석장치(Enzyme Immnuno Assay Kit)가 사용되었다. DS6 U/ml의 경우, 표준곡선이 DS6 샌드위치 ELISA에서의 CA15-3 표준(CanAg Diagnostics에서 구 입한 CA15-3 효소면역분석장치로부터 얻음)을 사용하여 생성되었다. DS6 U/ml는 CA15-3 U/ml와 동등하도록 임의로 설정했다. 표 5의 마지막 2열에서 피코몰(pM) 단위의 흘러들어간 CA6는 도8C에 도시된 비오틴화된 DS6 표준곡선을 사용하여 계산되었다.

CanAg 정량분석의 경우, CanAg 혈청 수준은 치료에 앞서 칸투주맙 머탄신 임상실험에 참가한 환자들에 대해 보고된 것들이다(Tolcher et al., J. Clin. Oncol.21(2):211-22 (2003). DS6에 대해 기술된 것과 유사한 ELISA 분석을 사용하여 CanAg 표준을 이용한 CanAg 표준곡선을 생성하였다. C242가 CanAg 표준을 포획하기 위해 사용되었다. 포획된 CanAg는 비오틴화된 C242 추적자를 사용하여 검출되는데, 기질로서 ABTS를 사용하는 스트렙타비딘-HRP에 의한 현상이 뒤따르게 된다. 비오틴화-C242 표준곡선은 비오틴화된 DS6에 대해 수행된 바와 같이 구성되어, 순환하는 CanAg 에피토프의 U/ml 단위를 몰농도로 전환가능하게 한다. 표 6에는 칸투주맙 머탄신 임상실험 환자로부터의 CanAg 수준과 이에 대응하는 순환하는 CanAg의 산출 몰농도가 나타나 있다.

표 6

CanAg1 (U/ml)	CanAg2 (pM)	CanAg3(pM)
31240	19185.7	34592.8
8687	3535	9619.3
7456	4579	8256.2
3686	2263.7	4081.6
1447	888.7	1602.3
1262	775	1397.4
718	441	795.1
547	335.9	605.7
394	242	436.3
381	234	421.9
329	202.1	364.3
322	197.8	356.6
306	187	338.8
284	174.4	314.5
247	151.7	273.5
242	148.6	268
229	140.6	253.6
227	139.4	251.4
184	113	203.7
120	73.7	132.9
107	65.7	118.5
100	61.4	110.7
81	49.7	89.7
81	49.7	89.7
67	41.1	74.2
53	32.5	58.7
45	27.6	49.8
43	26.4	47.6
39	24	43.2
36	22.1	39.9
24	14.7	26.6
18	11.1	19.9
17	10.4	18.8
<10	6.1	11.3
<10	6.1	11.3
<10	6.1	11.3
<10	6.1	11.3
1 샌드위치 ELISA로 측정된 순환하는 CanAg의 사전처리수준
2 염소의 항-마우스 IgG & 비오틴-C242 표준곡선
3 비오틴-C242 표준곡선

난소암 환자에 있어서 흘러들어간 CA6의 pM 수치를 CanAg-양성 암환자에 있어서 흘러들어간 CanAg에 대해 계산된 수치와 비교하면 일반적으로 CA6 수치가 CanAg 수치와 유사함을 알 수 있다. 또한, 16명의 난소암 환자 혈청 중에서 단 2명의 것만이 4.5nM 보다 높은 CA6 수준을 보이며 (혈청 샘플 번호 5 및 9의 경우 신호가 표준곡선의 범위를 벗어남), 상기 수준 이상에서는 Her2/neu-양성 유방암 환자에 대한 임상실험에서 변경된 허세핀(herceptin) 약물역학이 관찰되었다. 4.5nM보다 높은 CanAg 수준은 37명의 임상실험 환자 중에서 3명에서만 나타났다. 본 임상실험에서 흘러들어간 CanAg 수준과 칸투주맙 머탄신의 보다 신속한 제거는 상관관계가 없었다. 그러나, 가장 높은 수준의 CanAg(31240 U/ml)를 나타낸 환자에 대해서만 8시간 후-수혈(transfusion)을 위해 샘플링하였다. 이러한 결과는 CA6 및 CanAg와 같은 Muc1의 에피토프가 암환자에 있어서 혈액으로 흘러들어가지만 그 수준은 항체 치료를 방해하는 수준이 아님을 시사한다.

실시예 6: 쥐의 DS6 항체 가변영역 클로닝

DS6와 같은 쥐의 단일클론항체는 인간면역 시스템에 의해 외래 물질로 인식되기 때문에 임상적 이용에는 제한이 있다. 환자는 신속하게 인간의 항-마우스 항체(HAMA)를 분화시켜 쥐 항체를 신속히 제거하여 버린다. 이 때문에 쥐의 DS6 (muDS6)의 가변영역은 인간화된 DS6(huDS6) 항체를 생산하기 위해 표면개질되었다.

쥐의 DS6 항체 가변영역은 RT-PCR에 의해 클로닝되었다. 전체 RNA는 퀴아진 알엔이지 미니프렙 키트(Qiagen RNeasy miniprep kit)를 사용하여 DS6 하이브리도마 세포들이 들러붙은 T175 플라스크로부터 정제되었다. RNA 농도는 UV 분광기를 통해 결정되었고, RT 반응은 4-5㎍의 전체 RNA에 대해 깁코 수퍼스크립트 II 키 트(Gibco Superscript II kit) 및 랜덤 헥사머 프라이머(random hexamer primer)를 사용하여 수행하였다.

PCR 반응은 다음의 문헌에 기재된 방법에 기초하여 축퇴 프라이머(degenerate primer)를 가지고 수행하였다[(Wang Z et al., J Immunol Methods. Jan 13;233(1-2):167-77 (2000)]. RT 반응 혼합물은 축퇴성 PCR 반응(degenerate PCR reaction)을 위해 직접 사용되었다. 3'L사슬 프라이머인 HindKL (TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC)(서열번호 25) 및 3'H사슬 프라이머인 BamIgG1(GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC)(서열번호 26)가 사용되었고, 5'말단 PCR 프라이머의 경우에는, L사슬 프라이머로서 Sac1MK (GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA)(서열번호 27)가 사용되었고, H사슬 프라이머로서 EcoR1MH1 (CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC)(서열번호 28) 및 EcoR1MH2 (CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG)(서열번호 29)의 동등혼합물이 사용되었다 (혼합 염기: H = A+T+C, S = G+C, Y = C+T, K = G+T, M = A+C, R = A+G, W = A+T, V = A+C+G, N = A+T+G+C).

10% DMSO로 보충되는 것을 제외하면 PCR 반응은 표준에 따른다 (50㎕의 반응 혼합물에는 최종농도로서 1X 반응 완충용액(ROCHE), 2mM의 각각의 dNTP, 1mM의 각각의 프라이머, 2㎕의 RT 반응물, 5㎕의 DMSO 및 0.5㎕ Taq (ROCHE)이 포함됨). PCR 반응은 MJ 리서치 열순환기(MJ research thermocycler) 상에서 Wang 등(J Immunol Methods. Jan 13;233(1-2):167-77 (2000))의 프로그램을 응용하여 다음과 같이 수행되었다: 1) 94 ℃, 3 분; 2) 94 ℃, 15 초; 3) 45 ℃, 1 분; 4) 72 ℃, 2 분; 5) 2)번 단계로 복귀 후 29회 반복; 6) 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장 단계를 수행하여 종료. PCR 산물은 제한효소(제한위치는 PCR 프라이머에 의해 생성됨)를 사용하여 pBluescript II SK+ (Stratagene)으로 클로닝되었다. 시크라이트(Seqwright) 시퀀싱 서비스는 H사슬 및 L사슬 클론의 서열을 결정하였다.

5'말단 cDNA 서열을 확인하기 위해 PCR 및 클로닝이 추가 실시되었다. 축퇴성 PCR 클론으로부터 결정된 DS6 경쇄(L사슬) 및 중쇄(H사슬) cDNA 서열이 NCBI 블라스트 검색 웹사이트(NCBI's Blast search website)로 플러그인되었으며, 제출된 신호 서열을 가진 쥐의 항체서열이 저장되었다. PCR 프라이머는 관련 DNA 서열 사이에서 보존된 부분을 사용하여 신호 펩티드로부터 설계되었다. EcoRI 제한 위치가 리더 서열 프라이머에 추가되었고(표 7), 이들이 전술한 RT-PCR 반응에서 사용되었다.

표 7

DS6 신호서열 축퇴성 프라이머 (DS6 signal sequence degenerate primers)
명칭	서열
H사슬 - DS6HClead	ttttgaattcaataactacaggtgtccact - 서열번호 30
L사슬 - KTILClead	ttttgagctccagattttcagcttcctgct - 서열번호 31

몇개의 개별적인 L사슬 및 H사슬 클론에 대해 서열이 결정되었는데, 이는 중합효소가 일으키는 서열 오류 가능성을 확인하고 회피하기 위해서이다. 오로지 단일 서열만이 L사슬 및 H사슬 RT-PCR 클론 양자에 대해 얻어졌다. 이들 서열은 신호 서열로 연장하는 쥐의 DS6 L사슬 및 H사슬 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 설 계하기에 충분했다. 뒤따르는 PCR 반응의 후속 클론들은 최초 축퇴성 프라이머에 의해 변경된 가변영역의 5'말단 서열을 확인하였다. 다양한 cDNA 클론으로부터 축적된 결과는 도9에 제시된 최종적인 쥐의 DS6 L사슬 및 H사슬 서열을 제공하였다. Kabat 및 AbM 정의를 사용하여, 3개의 L사슬 및 H사슬 CDRs이 확인되었다(도9 및 도10). NCBI IgBlast 데이터베이스에 대한 조사로부터, muDS6 항체의 L사슬 가변영역은 쥐의 IgVκap4 생식계열 유전자로부터 유래된 것으로 보이는 반면, H사슬 가변영역은 쥐의 IgVh J558.41 생식계열 유전자로부터 유래된 것으로 보이는 것을 알 수 있다(도 11).

실시예 7: DS6 항체의 가변영역 표면 잔기의 결정

Pedersen 등 (1994) 및 Roguska 등(1996)에 의해 기술된 항체 표면개질 기술은 쥐의 항체 가변 서열의 표면 잔기를 예측하는 것부터 시작된다. 표면잔기는 물 분자에 접근가능한 전체 표면의 적어도 30%를 차지하는 아미노산으로 정의된다. muDS6에 대한 표면잔기를 찾기 위한 해결된 구조가 없는 상태에서 본 발명자들은 127개의 항체구조 파일 세트에서 가장 상동성인 서열을 가진 10개의 항체를 배열했다(도12). 각각의 Kabat 위치에 대한 용매 접근성은 이들 배열된 서열에 대해 평균되었다(도13A 및 도13B).

25% 및 35% 사이의 평균 접근성을 가진 표면위치가 2차 분석 대상이 되었고, 이를 위해 어느 기준 위치에 접하는 2개의 동일한 잔기를 포함하는 항체의 하위 세트를 비교하였다(도13A 및 도13B). 2차 분석 후, muDS6 H사슬에 대해 예상된 21개 의 표면잔기가 23개로 증가하였는데, 30% 보다 큰 예상 표면접근성을 가진 잔기 목록에 Tyr3 및 Lys23이 추가되었다. 대부분의 표면개질된 항체에 있어서, H사슬 CDR1에 대해서는 Kabat 정의가 사용되었지만, DS6에 대해서는 AbM 정의가 연산과정 중에 사용되어 H사슬 잔기 T28 (Kabat 정의를 사용했다면 프레임워크 표면잔기로 정의되었을 것임)이 프레임워크 표면 잔기로서 정의되지 않았다. L사슬 표면 위치의 수는 16에서 15로 감소하였는데, 이는 Ala80의 예상 표면접근성이 2차 분석에서 30.5% 에서 27.8%로 감소했기 때문이다. muDS6 H사슬 및 L사슬 가변서열은 38개의 예상 표면 접근성 프레임워크 잔기를 가진다.

실시예 8: 인간 항체 선택

쥐의 DS6 가변영역의 표면 위치는 Kabat 데이터베이스의 인간 항체서열의 대응 위치와 비교되었다(Johnson G, Wu TT. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):205-6 (2001)). 항체 데이터베이스 관리 소프트웨어 SR (Searle, 1998)을 사용하여 가공하지 않은 인간 항체의 H사슬 및 L사슬 쌍으로부터 표면 잔기를 추출하고 배열하였다. CDR의 5Å 범위 내에 있는 위치에 주목하면서, 가장 동일한 표면잔기를 갖는 인간 항체 가변영역 표면을 선택하여 쥐의 DS6 항체 가변영역 표면잔기와 교체하였다.

실시예 9: 키메라 및 인간화된 항체 발현벡터

L사슬 및 H사슬이 짝을 이룬 서열은 단일 포유류 발현벡터로 클로닝되었다. 인간 가변서열을 위한 PCR 프라이머는 제한위치를 형성하는데, 이 제한위치를 통해 인간 신호서열이 pBluescriptII 클로닝 벡터에 추가된다. 상기 가변서열은 L사슬 또는 H사슬에 대해 각각 EcoRI 및 BsiWI 또는 HindIII 및 ApaI에 의해 포유류 발현 플라스미드로 클로닝될 수 있다(도14). L사슬 가변서열은 인간의 IgKappa 고정 영역 상에 인-프레임(in-frame)으로 클로닝되었고, H사슬 가변서열은 인간의 IgGamma1 고정영역 서열로 클로닝되었다. 최종 발현 플라스미드에서 인간 CMV 프로모터가 L사슬 및 H사슬 cDNA 서열 모두의 발현을 촉진시킨다.

실시예 10: DS6 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 잔기의 확인

대부분의 인간화 작업에서 대상 항체의 분자 모델에 대한 잠재적 문제 잔기로서, CDR에 근접한 잔기에 대한 확인작업이 이루어졌다. 지나온 연구 경험은 모델을 만드는 것 만큼이나 문제 예상에 있어서 효과적이지만, 연구대상인 표면개질된 항체의 수가 증가하면서 DS6에 대해서는 분자모델이 확립되지 않았다. 대신에 쥐의 DS6 표면잔기는 앞서 표면개질된 항체들과 비교되었고, 항체의 결합활성에 높은 위험도 내지 낮은 위험도로 영향을 미치는 잔기들이 확인되었다.

유사한 잔기들 세트가 CDR의 5Å 범위 내에 있는 것으로서 반복적으로 확인되는데, 이는 밝혀진 항체 구조 및 인간화 분자 모델 모두에서 확인된다. 이러한 데이터를 이용하여, 표1은 CDR의 5Å 범위에 근접하고 CDR의 5Å 범위 내에 존재할 수 있는 쥐의 DS6 잔기를 제시하고 있다. 이들 위치의 다수가 앞선 인간화 과정에서 변경되었지만 H사슬 위치 74만이 결합활성의 손실을 가져왔다. 쥐 항체의 결합 활성을 보존하기 위해, 쥐의 잔기는 huC242 및 huB4 모두에서 상기 위치에서 보존되었다. 반면에, 인간화된 6.2G5C6에서는 동일한 위치가 대응되는 인간 잔기로 변경되었지만 활성손실이 없었다(6.2G5C6는 자주 단순히 항-C6로 언급되는 항-IGF1-R 항체이다). 표 1의 어떤 잔기도 인간화된 항체 내에서 문제를 야기할 수 있지만, H사슬 잔기 P73은 이 부위에서의 이전 경험 때문에 특별히 관심대상이 될 것이다.

실시예 11: 가장 상동성인 인간 표면의 선택

muDS6의 표면개질을 위한 인간 항체 표면 후보들이 SR 소프트웨어를 사용하여 Kabat 항체 서열 데이터베이스로부터 검색되었다. 본 소프트웨어는 항체 데이터베이스에 대해서만 특이적인 잔기 위치를 검색하기 위한 인터페이스를 제공한다. 원래 쌍을 보존하기 위해 L사슬 및 H사슬 모두의 표면 잔기가 비교되었다. Kabat 데이터베이스로부터 가장 상동성을 갖는 인간 표면이 서열 명명 순위에 따라 정렬되었다. SR Kabat 데이터베이스 소프트웨어로 정렬된 상위 3개의 표면이 표 2에 제시되어 있다. 이후, 이들 표면은 어느 인간 표면이 표 1에서 확인된 잔기들에 대한 최소한의 변경을 요구하는지를 확인하기 비교되었다. 항-Rh(D) 항체인 28E4 (Boucher et al, 1997)는 최소한의 표면잔기 변경을 요구하며(총 11 개), 이들 잔기 중 3개 만이 잠재적 문제 잔기 목록에 포함된다. 28E4 항체가 가장 상동적인 인간 표면을 제공하기 때문에 muDS6의 표면개질을 위한 최선의 후보이다.

실시예 12: 인간화된 DS6 항체를 위한 DNA 서열의 구성

DS6의 11개 표면 잔기는 PCR 돌연변이생성법을 사용하여 변경되었다. PCR 돌연변이생성법은 표면개질된 인간 DS6 유전자를 구축하기 위해 쥐의 DS6 가변영역 cDNA 클론 상에서 수행되었다. 하기 표 8에 나타난 바와 같이, 인간화 프라이머 세트는 표면개질된 DS6에 요구되는 아미노산 변경을 일으키도록 설계되었다.

표 8

프라이머 명칭	프라이머 서열
DS6HCapa	cgatgggcccttggtggaggctgcagagacagtgaccaga	서열번호 32
DS6LCBsi	ttttcgtacgtttcagctccagcttggt	서열번호 33
DS6HC5end	caggtgtacactcccaggcttatctccagcagtct	서열번호 34
huC6HCApa	cgatgggcccttggtggaggcggcagagacagtgaccaga	서열번호 35
ds6lc5et	caggtgtacactccgagattgttctcacccagtctccagcaacc atgtctgcatct	서열번호 36
ds6LCr18	ggcactgcaggttatggtgaccctctcccctggaga	서열번호 37
ds6lcs77f	caatcagcagcatggaggctgaaga	서열번호 38
ds6lcs77r	gcctccatgctgctgattgtgaga	서열번호 39
DS6HCvvkp	caggtgtacactcccaggctcagctcgtgcagtctggggctg aggtggtgaagcccggggcctcagt	서열번호 40
DS6HCt	ttgactgcagacacatcctccagcaca	서열번호 41
ds6hcQT	gtgtctgcagtcaatgtggccttgccctggaacttctgat	서열번호 42
huDS6HCapa	cgatgggcccttggtggaggcggcagagacagtgacaaga	서열번호 43

10% DMSO로 보충되는 것을 제외하면 PCR 반응은 표준에 따른다 (50㎕의 반응 혼합물에는 최종농도로서 1X 반응 완충용액(ROCHE), 2mM의 각각의 dNTP, 1mM의 각각의 프라이머, 100ng의 주형, 5㎕의 DMSO 및 0.5㎕ Taq (ROCHE)이 포함됨). PCR 반응은 MJ 리서치 열순환기(MJ research thermocycler) 상에서 다음과 같이 수행되었다: 1) 94 ℃, 1 분; 2) 94 ℃, 15 초; 3) 55 ℃, 1 분; 4) 72 ℃, 1 분; 5) 2)번 단계로 복귀 후 29회 반복; 6) 72 ℃에서 4분 동안 최종 연장 단계를 수행하여 종료. PCR 산물은 대응하는 제한효소로 잘려졌고 pBluescript 클로닝 벡터로 클로 닝되었다. 클론은 아미노산 변경을 확인하기 위해 시퀀싱되었다.

H사슬 잔기 P73의 변경은 과거에 문제를 야기했기 때문에 두 종류의 H사슬을 구축하였는데, 하나는 인간 28E4 T73을 갖는 것이고 또 하나는 쥐의 P73을 보유하는 것이다. 상기 2종류의 인간화된 DS6 모두에서 다른 10개의 표면잔기가 쥐의 것으로부터 인간의 28E4 잔기로 변경되었다(표 2). 일반적인 명명법에 따르면, 대부분의 인간 버전은 모두 11개의 인간 표면잔기를 가지기 때문에 1.0 버전이다. 추가의 버전이 요구되는 경우, 즉 최대수의 쥐의 잔기를 포함하는 버전에 대해 버전 1.1을 확보해 두는 경우에 쥐의 P73을 보유하는 H사슬은 1.2 버전이다. 두 개의 인간화 버전의 아미노산 서열은 쥐의 아미노산 서열과 정렬되어 도15A 및 도15B에 도시되어 있다. 인간화된 DS6 항체 유전자 모두는 일시적이면서도 안정된 트랜스펙션을 위해 항체 발현 플라스미드로 클로닝되었다(도14). 인간화된 항체 버전 1.01 및 1.21의 cDNA 및 아미노산 서열은 L사슬 가변영역이 동일하고 도16에 도시되어 있다. 인간화된 항체 버전 1.01 및 1.21의 H사슬 cDNA 및 아미노산 서열은 도17A 및 도17B에 도시되어 있다.

실시예 13: CHO 세포에서의 huDS6의 발현 및 정제 그리고 친화도 측정

인간화된 DS6가 muDS6의 결합 친화도를 보유하는지를 결정하기 위해서는 항체 발현 및 정제가 필요했다. CHO 세포는 인간의 고정 영역 및 쥐의 가변 영역을 갖는 DS6의 키메라 버전(chDS6), 또는 huDS6v1.01 또는 huDS6v1.21에 의해 안정적으로 트랜스펙션되었다.

CHODG44 세포 (4.32 X 10⁶세포/플레이트)가 비선택성 배지[4 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙토마이신 및 10% v/v FBS가 보충된 알파 MEM + 뉴클레오티드(Gibco)]의 15 cm 플레이트에 뿌려졌고, 37℃, 5% CO₂의 습도조절된 배양기에 놓여졌다. 다음날, 세포는 폴리펙트(Polyfect) 트랜스펙션을 위한 퀴아젠(Qiagen) 추천 프로토콜의 변형본을 사용하여 chDS6 발현 플라스미드로 트랜스펙션되었다. 비선택적 배지가 세포로부터 흡출되었다. 상기 플레이트는 예열된 (37℃) 7ml의 PBS로 세척되었고 20ml의 비선택적 배지가 재보충되었다. 플라스미드 DNA (11 ㎍)는 800㎕의 하이브리도마 SFM (Gibco)으로 희석되었다. 그런 다음, 70 ㎕의 폴리펙트(Polyfect)(Qiagen)가 DNA/SFM 혼합물에 첨가되었다. 폴리펙트(Polyfect) 혼합물은 수초 동안 가볍게 볼텍싱되었고, 10분 동안 대기온도에서 인큐베이션되었다. 비선택적 배지(2.7 ml)가 상기 혼합물에 첨가되었다. 최종 혼합물은 플레이트 상의 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션되었다.

트랜스펙션 혼합물/배지가 플레이트에서 제거되었고, 세포가 트립신 처리되었으며 계수되었다. 그리고 나서, 세포는 96-웰 플레이트(250 ㎕/웰)에서 선택 배지(4 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 10% v/v FBS, 1.25 mg/ml G418가 보충된 알파 MEM-뉴클레오티드)에 다양한 농도(1800, 600, 200, 67 세포수/웰)로 플레이트되었다. 세포는 필요한 경우 배지를 보충하면서 2-3 주 동안 배양되었다. 웰은 정량 ELISA를 사용하여 항체 생산수치에 대해 검색되었다. 이뮬론(Immulon) 2HB 96-웰 플레이트는 염소의 항-인간 IgG F(ab)₂ 항체로 코팅되었 고(Jackson Immunoresearch; 100㎕의 50mM 탄산나트륨 완충용액(pH 9.6)에서 1㎍/웰), 대기온도 하에서 흔들면서 1.5 시간 동안 배양되었다. 이후의 모든 단계는 대기온도 하에서 실시되었다. 웰은 T-TBS (0.1% Tween-20, TBS)로 두 번 세척되었고 200㎕의 차단완충용액 (1% BSA, T-TBS)으로 1시간 동안 차단되었다. 웰은 T-TBS로 두 번 세척되었다. 별도의 플레이트에서 항체 표준, EM164 (100 ng/ml) 및 배양 상층액이 차단완충용액으로 순차적으로 희석되었다(1:2 또는 1:3). 상기 희석액(100 ㎕)은 ELISA 플레이트로 이동되었고 1시간 동안 인큐베이션되었다. 웰은 T-TBS로 세 번 세척되었고, 차단완충용액으로 1:3000으로 희석된 100㎕의 염소의 항-인간 IgG Fc-AP(Jackson ImmunoResearch)와 함께 45 분간 인큐베이션되었다. T-TBS로 5회 세척 후, 웰은 100 ㎕의 PNPP 현상제[10 mg/ml PNPP(p-니트로페닐 포스페이트, 디소디움 염(Disodium salt); Pierce), 0.1 M 디에탄올아민 pH 10.3 완충용액]를 사용하여 25분 동안 현상하였다. 405nm에서의 흡광도가 ELISA 플레이트 리더로 측정되었다. 표준곡선의 직선 부분에서의 흡광도 값(배양 상층액)이 항체 수준을 결정하기 위해 사용되었다.

ELISA에 의해 확인된 가장 높은 수율의 클론이 계대 클로닝되어 확대되었고 냉동 세포들이 준비되었다.

huDS6vl.01 및 huDS6vl.21의 발현을 위해, DG44 CHO 세포(Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, NY)가 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드가 공급된 알파 MEM(Gibco catalog #12571, Grand Island, New York)에서 배양되었다. 상기 배지에 10% 우태아 혈청(HyClone catalog # SH30071.03, Logan, UT), 1% 젠타마이신(gentamicin) (Mediatech catalog# 30-005-CR, Hemdon, VA), 및 2mM의 L-글루타민(L-glut) (BioWhittaker catalog#17-605E, Walkersville, MD)이 보충되었다. 이러한 배합의 배지를 CHO 완전 배지라고 한다.

DG44 CHO 세포(5x10⁶)가 50㎍의 huDS6 플라스미드 DNA로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션에 앞서, 세포들이 트립신(Gibco catalog # 15090-046, Grand Island, NY)을 사용하여 플라스크에서 제거되었고, 비-보충 알파 MEM(리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드가 결여된 것)(Gibco catalog #12561, Grand Island, NY)으로 2회 세척되었다. 이를 세척 배지라고 부른다. 세포들은 0.4 cm 갭 전극 큐베트(cuvettes) (BioRad catalog # 1652088, Hercules, PA)에서 플라스미드 DNA와 혼합되었다. 이들 혼합물은 얼음에서 2분간 놓여졌고, BioRad 일렉트로포레이션 장치에 의해 1,000μF 및 260V의 펄스가 인가되었다. 일렉트로포레이션 이후에 세포들은 2분간 얼음 위에서 인큐베이션되었다. 그런 다음, 세포들은 CHO 완전 배지가 있는 5개의 24-웰 플레이트(Costar catalog # 3524)에 놓여졌고, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 유지되었다. 48시간 이후, 상기 배지는 웰로부터 제거되었다. 웰은 세척 배지로 한번 헹구어졌고, 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드가 없고 1% 젠타마이신(gentamicin), 2 mM L-glut, 10% 투석된 우태아 혈청(Gibco catalog # 26400-044, Grand Island, NY), 및 1.25 mg/mL의 제네티신(geneticin) (G418) (Gibco catalog # 11811, Grand Island, NY)이 보충된 알파 MEM(Gibco catalog #12561, Grand Island, NY)이 공급되었다. 이러한 완전한 배합의 배지를 선택 배지라고 부른다. 클론들이 대략 2주간 선택배지에서 배양되었고, 이 기간동안 정량 ELISA에 의해 항체 생산이 탐색되었다. ELISA에 의해 확인된 가장 높은 수율의 클론이 계대 클로닝되어 확대되었고 냉동 세포들이 준비되었다.

정제를 위한 충분한 항체를 생산하기 위해 세포는 초저 IgG FBS (Gibco)가 보충된 30 ml의 선택 배지를 가진 15 cm 플레이트(~ 1× 10⁶ 세포수/플레이트)로 확장되었고, 1주일간 배양되었다. 배양 상층액은 250 ml의 원추형 튜브에 모아졌고, 테이블 탑 원심분리기에서 회전하강시킨 다음(2000 rpm, 5분, 4℃), 0.2 μm 여과장치로 살균여과되었다.

DS6 정제를 위해 NaOH 펠릿이 여과된 배양 상층액에 추가되어 최종 pH 8.0 이 되도록 하였다. 하이 트랩 알프로틴 에이 칼럼(Hi Trap rProtein A column) (Amersham)은 20-50 칼럼 부피의 결합완충용액으로 평형상태로 하였다. 상층액은 튜브연동식 펌프를 사용하여 칼럼 상에 놓여졌다. 그런 다음, 칼럼은 50 칼럼부피의 결합완충용액으로 세척되었다. 결합된 항체는 유리완충용액(100 mM 아세트산, 50 mM NaCl, pH 3)을 사용하여 칼럼에서 유리시켜 분획 콜렉터에 세팅된 튜브로 옮겼다. 유리된 항체는 중화완충용액(2M K₂HPO₄, pH 10.0)을 사용하여 중화되었고, PBS로 밤새 투석되었다. 투석된 항체는 0.2μm 주사 여과기를 통해 여과되었다. 280nm에서의 흡광도가 최종 단백질 농도를 결정하기 위해 측정되었다.

정제된 huIgG의 친화도는 유동세포 측정법을 통해 muDS6와 비교되었다. 1차 실험에서 CA6-발현 세포주인 KB에 대한 직접결합이 측정되었다. 도18에 도시된 바 와 같이, muDS6, chDS6, huDS6vl.Ol 및 huDS6vl.21은 Kd 명시값이 각각 0.82 nM, 0.69 nM, 0.82nM 및 0.85 nM로서 매우 유사한 친화도를 보여주었고, 이는 표면개질이 CDRs을 파괴하지 않았음을 암시한다. huDS6 버전이 muDS6의 친화도를 유지하는 것을 확인하기 위해 경쟁적 결합 실험이 행해졌다. 본 유형의 장점은 동일한 검출 시스템, 즉 비오틴-muDS6/스트렙타비딘-DTAF가 쥐 항체 및 인간 항체 모두에서 사용된다는 점이다. 비오틴-DS6와 경쟁하는 muDS6, chDS6, huDS6v1.01 및 huDS6v1.21의 능력을 비교하는 경쟁결합 분석의 결과가 도19에 도시되어 있다. muDS6, chDS6, huDS6v1.01 및 huDS6v1.21 각각에 대해 EC₅₀ 명시값은 1.9 nM, 1.7 nM, 3.0nM 및 1.9 nM이다. 본 결과는 인간화된 DS6를 생산하기 위한 muDS6의 표면개질이 결합 친화도를 거의 감소시키지 않음을 의미한다.

실시예 14: DS6-DM1 세포독성 컨쥬게이트의 제조

muDS6 항체 (8 mg/ml)는 디티오피리딜기(dithiopyridyl)를 도입하기 위해 8배 몰 과량의 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP)를 사용하여 변형시켰다. 반응은 95% v/v 완충용액 A(50 mM KPi , 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.5) 및 5% v/v DMA에서 실온에서 2시간 동안 진행되었다. 다소 팽창한 반응 혼합물은 NAP 또는 세파덱스(Sephadex) G25 칼럼(완충용액 A로 평형상태로 된 것)을 통해 겔여과 되었다. 변형 정도는 280nm에서의 항체 흡광도를 측정함으로써 결정되었으며, DTT 방출 2-머캅토피리딘(Spy)은 280 및 343 nm에서 측정하였다. 변형된 muDS6는 Spy에 대해 1.7배 몰 과량의 N ^2'-데아세틸-N-^2'(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신 (L-DM1)을 사용하여 2.5mg Ab/mL 농도로 접합되었다. 반응은 DMA(3% v/v)를 갖는 완충용액 A (97% v/v)에서 진행되었다. 상기 반응물은 실온에서 ∼20시간 동안 밤새 인큐베이션되었다. 혼탁한 반응 혼합물은 원심분리되었으며(1162 x g, 10 분), 상층액은 완충용액 B (1X PBS pH 6.5)로 평형상태로 된 NAP-25 또는 S300 (탠덤 3, 3x 26/10 탈염된 칼럼, G25 매체) 칼럼을 겔여과되었다. 펠릿(pellet)은 버렸다. 컨쥬게이트는 0.22 μm 밀렉스(Millex) GV 필터를 사용하여 멸균여과되었으며, 슬라이드 에이 라이저(Slide-A-Lyzer)를 이용하여 완충용액 B로 투석하였다. muDS6 분자 당 연결된 DM1 분자 수는 여과된 물질의 252nm 및 280nm에서의 흡광도를 측정하여 결정되었다. DM1/Ab 비율은 4.36인 것으로 확인되었으며 접합된 muDS6의 단계 수율은 55%이었다. 접합된 항체 농도는 1.32 mg/mL이었다. 정제된 컨쥬게이트는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)(SEC)에 의해 생화학적으로 특성이 밝혀졌는데, 92% 단량체인 것으로 밝혀졌다. 정제된 컨쥬게이트 내에서의 DM1 분석에 의하면 99%가 항체에 공유결합된 것으로 나타났다. 도20에서는 Caov-3 세포에 대한 muDS6-DM1 컨쥬게이트 및 변형되지 않은 muDS6의 유동세포측정 결합에서 muDS6의 접합이 약간의 친화도 감소만을 유발하는 것을 나타내고 있다.

실시예 15: muDS6-DM1의 시험관 내 세포독성

접합되지 않은 상태의 항체로서 muDS6는 세포배지에서 증식 활성이나 생장 억제 활성을 나타내지 않는다 (도21). 그러나, 염소의 항-마우스 IgG H사슬 및 L사슬에 대한 DM1 컨쥬게이트의 존재 하에서 muDS6가 세포와 함께 인큐베이션될 때, muDS6는 이러한 컨쥬게이트를 세포에 표적화시켜 전달하여 간접적인 세포독성을 일으키는 데에 매우 효과적이다(도21). 접합되지 않은 muDS6의 고유 활성을 추가로 테스트하기 위해 muDS6을 사용한 보체-의존적인 세포독성 어세이(CDC)가 행해졌다. HPAC 및 ZR-75-1 세포(25000개 세포수/웰)는 200 ㎕의 RHBP 배지(RPMI-1640, 0.1% BSA, 20mM HEPES (pH 7.2-7.4), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신)에서 5% 인간 혈청 또는 토끼 혈청 및 다양하게 희석된 muDS6의 존재 하에 96-웰 플레이트에 놓여졌다. 세포는 2시간 동안 37^oC에서 배양되었다. 그런 다음, 알라마 블루(Alamar Blue) (최종농도 10%) 반응시약(Biosource)이 상층액에 첨가되었다. 세포는 형광값 측정 전 5-24 시간 동안 배양되었다. 쥐의 DS6는 보체-의존적인 세포독성 어세이(CDC)에서 아무런 영향도 미치지 않았다(도22). 이는 muDS6의 치료적 응용이 독성 효과 분자의 접합을 필요로 함을 의미한다.

메이탄시노이드가 접합된 muDS6 항체의 세포독성은 다양한 DS6 양성 세포주에서 2개의 상이한 어세이를 사용하여 조사되었다. 배양 배지로 희석된 2ml의 컨쥬게이트가 있는 6-웰 플레이트상에 세포(1000-2500개 세포수/웰)들이 플레이팅된 상태에서 집락형성 분석법이 실시되었다. 세포는 다양한 농도, 일반적으로 3 X 10^-11 M 에서 3 X 10^-9 M 까지의 컨쥬게이트에 지속적으로 노출되었으며, 37℃, 6% CO₂ 의 습도조절된 챔버에서 5-9일 동안 배양되었다. 웰은 PBS로 세척되었고, 집락은 1% w/v 크리스탈 바이올렛/10% v/v 포름알데히드/PBS 용액으로 염색되었다. 결합되지 않은 염색제는 증류수로 웰로부터 세척되었으며 플레이트는 건조시켰다. 집락의 수는 라이카 스테레오줌 4(Leica StereoZoom 4) 해부 현미경을 사용하여 계수되었다.

플레이팅 효율(PE)은 플레이트된 세포수 대 집락수로 계산되었다. 생존 비율(surviving fraction)은 "처리된 세포의 PE/비처리된 세포의 PE"로서 산출되었다. IC₅₀ 농도는 세포 생존비율 대 컨쥬게이트의 몰 농도를 그래프로 그려서 결정되었다. 집락형성 분석법(도23)에 있어서, muDS6-DM1은 Caov-3 세포사멸에 효율적이었는데, 평가된 IC₅₀이 800 pM이었다. 항원 음성 세포인 A375는 테스트된 muDS6-DM1의 최고 농도인 3 x 10^-9M의 컨쥬게이트에 의해 약간만 영향을 받았는데, 이는 컨쥬게이트의 세포사멸능력이 항원 발현 세포에 대해서만 특이하게 진행됨을 보여준다. 그러나, 메이탄신에 대한 분명한 민감성에도 불구하고 다수의 다른 DS6 양성 세포주는 면역 컨쥬게이트에 대해 특별히 민감하지 않았다. 모든 자궁경부암 세포주 (HeLa, KB, 및 WISH)는 컨쥬게이트에 대해 민감한 반면에, 난소암 및 유방암 세포주는 소수만이 컨쥬게이트에 의한 세포독성 효과를 나타냈다. 췌장암 세포주는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.

MTT 실험에서 세포는 1000-5000개 세포수/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 뿌 려졌다. 세포는 200㎕의 배양 배지에서 접합되지 않은 muDS6 또는 muDS6-DM1 면역컨쥬게이트의 순차 희석액으로 플레이팅되었다. 샘플은 3개로 나누어 실험하였다. 세포 및 항체/컨쥬게이트 혼합물은 2-7일간 배양되었으며, 이 기간 동안 세포 생존율이 MTT([3(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드)]어세이에 의해 평가되었다. MTT(50 ㎍/웰)가 배양 상층액에 첨가되었으며 3-4 시간 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 배지는 제거되었고 MTT 포르마잔(formazan)은 DMSO (175㎕/웰)에서 용해되었다. 540-545nm에서의 흡광도가 측정되었다. MTT 세포 생존율 어세이(도24C)에서 면역 컨쥬게이트는 효과적으로 Caov-3 세포를 사멸시킬 수 있었는데, 평가된 IC₅₀이 약 1.61 nM이었다. 최고 농도의 컨쥬게이트를 가진 웰은 접합되지 않은 항체(아무런 영향 없음)를 가진 웰과 비교할 때 생존 세포를 포함하고 있지 않았다 (도21 및 도24).

다른 세포주에 대한 MTT 어세이 결과는 약간 상이했다(도24A, 도24B, 및 도24D-I). 많은 경우에 있어서, 비록 약간의 세포독성이 관찰되었지만 컨쥬게이트는 전체 세포 집단을 완벽하게 사멸시킬 수는 없었다(WISH 세포의 경우 예외임). BT-20, OVCAR5, 및 HPAC 세포는 특히 저항성을 가졌다: 최고 접합체 농도(32 nM)의 웰에서 50% 이상의 세포가 여전히 생존하였다.

실시예 16: 생체 내에서의 컨쥬게이트 항종양 활성

muDS6-DM1 컨쥬게이트의 생체 내 활성을 설명하기 위해 인간 종양 이종이식 이 SCID 마우스에서 이루어졌다. 인간의 자궁경부암 세포주인 KB의 피하주입 모델이 개발되었다. KB 세포는 시험관 내에서 생장되어 수집되었으며, 100 μL 무혈청 배지 내의 5 X 10⁶개 세포를 각각의 마우스의 우측 어깨 아래에 주입하여 6일 동안 생장시켰고, 평균 종양 용적이 144 ± 125 mm³이 되는 시점에 약물처리가 개시되었다. 마우스에게 5일 동안 매일 PBS, 150μg/kg DM1 농도의 컨쥬게이트, 또는 225 μg/kg DM1 농도의 컨쥬게이트(그룹 당 2 마리)가 정맥 내로 투여되었다. 독성 반응은 처치 과정 중 매일 관찰되었다. 종양 용적 (도25A) 및 대응 체중 (도25B)은 연구기간 전체를 통해 관찰되었다.

PBS 대조군으로 처리한 KB 종양은 약 4일 동안 두배가 되면서 급속하게 성장하였다. 반면에, 컨쥬게이트로 처리된 마우스 그룹에서는 225μg/kg 및 150μg/kg 투여량 그룹의 경우 처치를 시작한 후 각각 14일째 및 18일째에 완전한 종양 감소를 보여주었다. 150 μg/kg 투여량에서 종양 지연은 약 70일이었다. 225μg/kg에서의 처리는 120일째의 연구 종료 시점까지 종양 재발의 증거가 없어 치료효과를 나타냈다. 도25B에서 확인되는 바와 같이, 150 μg/kg 그룹의 마우스는 체중 감소를 나타내지 않았는데, 이로부터 상기 투여량이 견딜만하다는 것을 알 수 있다. 보다 고농도의 투여량에서도 마우스는 일시적으로 3% 체중감소만을 경험하게 된다. 5일 치료과정 동안에 마우스는 아무런 가시적인 독성 신호를 보여주지 않았다. 본 연구는 muDS6-DM1 처리가 KB 이종이식 종양을 가진 마우스를 비독성 투여량으로 치료할 수 있음을 보여준다.

muDS6-DM1 활성은 피하 이종이식 모델에 대해 추가로 테스트되었다(도26 참조). 이종이식 목적으로 사용된 종양 세포주는 일정한 범위의 시험관 내 메이탄신 민감성 및 CA6 에피토프 농도를 보여주었다(하기 표9). OVCAR5 세포 및 TOV-21G는 난소 종양 세포주이고, HPAC는 췌장 종양 세포주이며, HeLa은 자궁경부 종양 세포주이다. OVCAR5 및 TOV-21G 세포는 낮은 표면 CA6 발현을 나타내며, HeLa 세포는 중간 수준의 표면 CA6 발현을 나타내고, HPAC 세포는 높은 CA6 표면 발현 밀도를 나타낸다. TOV-21G 및 HPAC 세포는 메이탄신 민감성이고, OVCAR5 및 HeLa 세포는 2-7배 적은 메이탄신 민감성을 가진다.

표 9

세포주	MMF*	Kd 명시값(M)	집락형성분석법 메이탄신 IC50 (M)	집락형성분석법 컨쥬게이트 IC50 (M)	MTT 어세이 컨쥬게이트 EC50 (M)
BT-20	232.20	9.14 x 10-10	3.50 x 10-10	> 3.00 x 10-09	1.44 x 10-08
BT-483	1911.00	1.37 x 10-08	1.50 x 10-10	1.00 x 10-10	N/A
Caov-3	465.20	5.48 x 10-09	3.20 x 10-11	8.00 x 10-10	1.61 x 10-09
Caov-4	149.00	4.04 x 10-09	6.00 x 10-10	> 3.00 x 10-09	N/A
HeLa	242.50	6.94 x 10-10	1.00 x 10-10	1.80 x 10-09	N/A
HPAC	2228.00	2.35 x 10-08	5.50 x 10-11	1.80 x 10-09	1.84 x 10-09
HPAF-II	266.50	2.81 x 10-09	6.00 x 10-10	> 3.00 x 10-09	1.00 x 10-08
Hs766T	182.90	2.32 x 10-09	> 3.00 x 10-09	> 3.00 x 10-09	> 3.20 x 10-08
KB	119.56	1.11 x 10-10	3.00 x 10-11	1.40 x 10-09	3.01 x 10-09
OVCAR5	97.10	1.47 x 10-09	3.20 x 10-10	> 3.00 x 10-09	8.46 x 10-07
T-47D	559.58	3.42 x 10-09	1.20 x 10-10	> 3.00 x 10-09	N/A
TOV-21G	87.79	3.07 x 10-10	4.80 x 10-11	2.00 x 10-09	6.88 x 10-09
WISH	1133.55	2.38 x 10-09	9.00 x 10-11	4.60 x 10-10	6.69 x 10-10
ZR-75-1	811.67	4.30 x 10-09	1.00 x 10-10	N/A	9.45 x 10-10

^*최대 평균 형광값(average maximum relative mean fluorescence)

4개의 세포주를 시험관 내에서 생장시켜 수집하였으며, 100 μL 무혈청 배지내의 1 x 10⁷개의 세포를 각각의 마우스의 우측 어깨 아래에 주입하였고(모델당 6 마리), 6일간 생장시켜 평균 종양용적이 다음과 같이 되면 약물 처리를 개시하였다: OVCAR5의 경우, 시험 및 대조군으로 각각 평균 종양용적이 57.6±6.7 및 90.2±13.4 mm³이 되는 경우; HPAC의 경우, 시험 및 대조군으로 각각 평균 종양용적이 147.1±29.6 및 176.2±18.9 mm³이 되는 경우; HeLa의 경우, 시험 및 대조군으로 각각 평균 종양용적이 194.3±37.2 및 201.7±71.7mm³이 되는 경우; TOV-21G의 경우, 시험 및 대조군으로 각각 평균 종양용적이 96.6±22.8 및 155.6± 13.4 mm³ 이 되는 경우. 각각의 모델에 대해 세 마리의 대조군 마우스가 매주 두 번의 PBS 투약 처리되었으며, 세 마리 시험용 마우스에는 매주 두 번 컨쥬게이트(600μg/kg DM1)를 정맥 내 투여하였다. 독성 반응은 처리 중 매일 관찰되었으며, 종양용적 및 체중은 전체 연구과정을 통해 관찰되었다. 다양한 모델에 대한 컨쥬게이트 효율이 도26A, 도26C, 도26E 및 도26G에서 그래프로 나타나며, 대응되는 체중은 도26B, 도26D, 도26F, 및 도26H에 표시되어 있다. OVCAR5, TOV-21G 및 HPAC 세포주는 각 모델의 PBS 대조군에서 확인되는 바와 같이 심각한 종양을 형성한다. HeLa 모델은 급격한 성장을 개시하기 전에 약 3주간의 지연기간을 가졌다. 모든 모델에서 DS6-DM1 컨쥬게이트 처리는 모든 마우스에서 완전한 종양의 감소를 가져왔다. TOV-21G, HPAC 및 HeLa 모델에 대해 마우스는 61일째에 종양이 없는 상태를 유지한다. OVCAR5 모델에 서 종양 투여 후 약 45일 만에 종양이 재발했다. 따라서, 이 모델에서의 muDS6-DM1 처리는 종양 성장을 약 34일 지연시키는 결과를 가져온다. 이러한 성장 지연은 OVCAR5 세포가 메이탄신에 덜 민감하고 낮은 CA6 에피토프 발현을 가지기 때문에 의미가 있는 것이다. CA6 에피토프 밀도(농도)가 높거나 메이탄신에 보다 더 민감한 경우의 모델에서 종양 감소는 보다 명백하다. 단지 2회의 투약이 실시되었다는 것이 주목할 만하다. 체중감소가 관찰되지 않았기 때문에 본 연구에서 사용된 투약 일정은 마우스에게 독성적인 것이 아닌 것이 명백하다. 추가의 투여 또는 고농도의 컨쥬게이트 투여로 치료가 달성될 수 있을 것이다.

인간 난소암은 대개 복막성이다. OVCAR5 세포는 인간의 질병과 유사한 방식으로 종양 및 복수를 형성하는 SCID 마우스에서 복막내(IP) 모델로서 강력하게 생장한다. IP 모델에서의 활성을 설명하기 위해, muDS6-DM1는 OVCAR5 IP 종양을 갖는 마우스를 치료하는 데에 사용되었다(도27). OVCAR5 세포는 시험관 내에서 생장되어 수확되었으며, 100 μL 무혈청 배지 내의 1 X 10⁷ 개의 세포가 복막 내로 주입되었다. 종양은 6일 동안 생장시킨 후 이 시점에서 처치가 개시되었다. 마우스는 2주 동안 매주 PBS 또는 DS6-DM1 컨쥬게이트(600㎍/kg DM1 투여량)로 처리되었고 복막염으로 인한 체중감소를 모니터링하였다. 28일째에 PBS 마우스 그룹은 20% 이상의 체중감소를 보였고 안락사되었다. 처치된 그룹은 20%를 초과하는 체중감소를 보인 45일째에 희생되었다. 본 연구는 OVCAR5 세포가 메이탄신에 덜 민감하고 세포당 CA6 에피토프 밀도가 희박함에도 불구하고, 악성의 OVCAR5 IP 모델에 있어서 muDS6-DM1가 종양 성장을 지연시킬 수 있음을 보이고 있다. 사용된 투약 일정은 어떠한 가시적인 독성도 나타내지 않았기 때문에 추가 투여 및 고농도 투여로 종양 성장 지연 또는 치료가 달성될 수 있을 것이다.

실시예 17: DS6-SPP-MM1-202 택소이드 세포독성 컨쥬게이트의 합성 및 특성화

muDS6는 N-설포숙신이미딜 4-니트로-2-피리딜-펜타노에이트(SSNPP) 연결기(링커)에 의해 변형되었다. 90% 완충용액 A, 10% DMA 내의 50 mg muDS6 항체에 DMA 내의 10 당량 SSNPP이 첨가되었다. 항체의 최종농도는 8 mg/ml이었다. 반응은 실온에서 4시간 동안 휘저으면서 수행되었고, 반응물은 G25 크로마토그래피로 정제되었다. 항체 변형의 정도는 280nm(항체) 및 325nm(연결기)에서의 흡광도를 이용하여 분광기로 측정되었으며, 그 결과 3.82 연결기/항체를 갖는 것으로 나타났다. 항체의 회수는 43.3 mg 이었고, 수율은 87% 이었다. muDS6-니트로SPP의 접합은 택소이드 MM1-202(1812 P.16)와 접합되었다. 접합은 90% 완충용액 A, 10% DM1에서 42 mg 규모로 진행되었다. 택소이드는 0.43 당량/연결기(각 분취액)의 4 분취액(aliquot)으로 약 20시간에 걸쳐 첨가되었다. 이때 반응물은 눈에 띠게 탁하게 변했다. G25 정제 후에 얻은 컨쥬게이트는 약 4.3 택소이드/항체로서 약 64% 수율로 회수되었고, 약 1 당량의 연결기(링커)가 반응하지 않고 남겨졌다. 반응하지 않은 연결기를 제거하기 위해, 반응하지 않은 연결기에 대해 1 당량의 시스테인이 컨쥬게이트에 첨가되었고 밤새 휘저어졌다. 시스테인 첨가에 의해 황색 색조가 눈에 띠는데, 이 는 티오피리딘의 방출을 의미한다. 그런 다음, 반응 용액은 수일에 걸쳐 완충용액 B/0.01% 트윈 20에서 투석되었고 추가로 단독의 완충용액 B로 재투석되었다. 최종 컨쥬게이트는 2.86 약제/항체를 갖는다. 회수된 항체는 14.7 mg이었으며 총 35% 수율을 보였다. 또한, 컨쥬게이트는 SEC에 의해 생화학적으로 특성이 밝혀졌으며, 89%의 단량체, 10.5%의 이량체 및 0.5%의 보다 큰 분자량 집합체를 갖는 것으로 밝혀졌다.

HeLa 세포 상에서 muDS6-SPP-MM1-202 택소이드 대 muDS6 항체의 결합을 비교하는 유동세포측정 분석 결과가 도28에 도시되어 있다. 상기 결과에 의하면 muDS6가 탁산에 접합될 때 결합 활성을 유지함을 알 수 있다.

실시예 18: 인간화된 DS6 컨쥬게이트의 시험관 내 및 생체 내 활성

huDS6vl.01-SPDB-DM4 컨쥬게이트가 구성되었다. 이 컨쥬게이트는 컨쥬게이트에서의 연결기/메이탄신 약제 부분이 이황화 결합 주위 구조가 다른 점을 제외하고는 실시예 14에서 기술된 muDS6-SPP-DMl와 유사하다. 즉, muDS6-SPP-DMl 컨쥬게이트는 연결기의 항체 측의 이황화된 탄소 상에서 하나의 메틸기를 갖는 반면에, SPDB-DM4 컨쥬게이트는 연결기의 메이탄신 측의 이황화된 탄소 상에서 2개의 메틸기를 갖는다.

huDS6vl.01 항체(8 mg/ml)는 디티오피리딜기를 도입하기 위해 8배 몰 과량의 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB)를 이용한다. 상기 반응은 실온에서 1.5 시간 동안 95% v/v 완충용액 A (50 mM KPi , 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.5) 및 5% v/v 에탄올에서 수행하였다. 상기 반응 혼합물은 15ml 세파덱스(Sephadex) G25 칼럼 (완충용액 A로 평형상태로 된 것)을 통해 겔여과되었다. 변형 정도는 280nm에서의 항체 흡광도를 측정함으로써 결정되었으며, DTT 방출 2-머캅토피리딘(Spy)은 280 및 343 nm에서 측정하였다. 변형된 DS6는 Spy에 대해 1.7배 몰 과량의 N ^2'-데아세틸-N-^2'(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (L-DM4)을 사용하여 1.8mg Ab/mL 농도로 접합되었다. 반응은 DMA(3% v/v)를 갖는 완충용액 A (97% v/v)에서 진행되었다. 상기 반응물은 실온에서 ∼20시간 동안 밤새 인큐베이션되었다. muDS6의 컨쥬게이트와 대조적으로 상기 반응 혼합물은 투명하였고, 시트르산 완충용액(20 mM 시트르산, 135 mM NaCl, pH 5.5)으로 평형상태로 된 NAP 15ml G25 칼럼을 통해 즉각 겔여과하였다. 컨쥬게이트는 0.22 μm 밀렉스(Millex) GV 필터를 사용하여 멸균여과되었다. DS6 분자 당 연결된 DM4 분자 수는 여과된 물질의 252nm 및 280nm에서의 흡광도를 측정하여 결정되었다. DM4/Ab 비율은 3.2인 것으로 확인되었으며 접합된 DS6의 단계 수율은 69%이었다. 접합된 항체 농도는 1.51 mg/mL이었다. 정제된 컨쥬게이트는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)(SEC)에 의해 생화학적으로 특성이 밝혀졌는데, 92.5% 단량체인 것으로 밝혀졌다. 정제된 컨쥬게이트 내에서의 DM4 분석에 의하면 ＞99%가 항체에 공유결합된 것으로 나타났다.

도29A에서는 KB 세포에 대한 huDS6v 1.01-DM4 컨쥬게이트 및 변형되지 않은 DS6의 유동세포측정 결합에서 huDS6vl.01가 본질적으로 친화도를 상실하지 않는 것 을 보여주고 있다. 상기 결합은 CaOv-3 세포 대신에 KB 세포가 사용된 것을 제외하고는 본질적으로 도20에 기술된 것과 같이 수행되었다. huDS6vl.01의 시험관 내 세포독성은 본질적으로 도24G에 기술된 것과 같이 테스트되었다. huDS6vl.01로 사멸되는 WISH 세포는 IC₅₀ 값이 4.4 x 10^-10 M 인 반면에, 접합되지 않은 huDS6vl.01은 세포독성 활성을 나타내지 않았다.

huDS6v1.01-DM4의 생체 내 활성은 HPAC 췌장 모델에 대해 테스트되었다. HPAC 세포는 0일째에 주입되었고, 13일째에 면역 컨쥬게이트 처리가 수행되었다. PBS 대조군 동물은 종양 용적이 1000 mm³을 초과하면 안락사시켰다. 컨쥬게이트는 200μg/kg 또는 600μg/kg DM4 투여량으로 투여되었는데, 이는 각각 항체농도 15 mg/kg 및 45 mg/kg에 대응하는 것이다. 마우스의 종양 용적(도30A) 및 체중(도30B) 은 연구기간 동안 관찰되었다. huDS6vl.01-DM4는 200μg/kg DM4 투여량에서 강력한 항종양 활성을 나타내었고, 모든 마우스는 완전한 종양 감소를 보였다. HPAC 이종이식 종양 상에서 발현되지 않는 항원을 인식하는 대조군 B4-DM4 컨쥬게이트는 200μg/kg 투여량에서 활성을 나타내지 않았다. 마우스의 체중 감소가 없는 것(도30B)은 200μg/kg의 컨쥬게이트 치료량이 최대 허용가능한 투여량 이하임을 나타낸다. 이러한 결과로부터 인간화된 DS6 버전은 메이탄시노이드 약제의 표적화된 전달을 매개하여 강력한 항종양 활성을 유발함을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ImmunoGen, Inc. PAYNE, Gillian CHUN, Philip TAVARES, Daniel <120> A CA6 ANTIGEN-SPECIFIC CYTOTOXIC CONJUGATE AND METHODS OF USING THE SAME <130> F196622 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Asp Ser Val Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ser Ala His Ser Ser Val Ser Phe Met His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> exon <222> (1)..(321) <400> 7 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc ata 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Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 47 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 48 <211> 105 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Gln Ile Val Ser Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Met 20 25 30 Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Gln Thr Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Gln Ser Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Ile Met Thr Cys Ser Pro Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 51 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ala Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 52 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 110 <210> 53 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 54 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 55 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Phe Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Gly Ser Tyr Arg Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gln Gly Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Trp Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Asn Lys Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Tyr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 58 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Val Glu Leu Val Arg Ala Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Asn Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Ile Ala Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 59 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Thr Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 60 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly His Ser Tyr Tyr Phe Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 61 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ala Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Lys Gly Tyr Leu Ser Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Tyr Gly Gly Ser Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Gly Asn Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Asp Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val 115

Claims (20)

1. 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 H사슬 가변영역 또는 이것의 단편과, 적어도 하나의 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편을 포함하는 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편:

   QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

   WIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

   FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 9);

   QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

   WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

   FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 10);

   QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

   WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

   FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11).
2. 제1항에 있어서,

   상기 H사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편.
3. 제1항에 있어서,

   상기 H사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편.
4. 제1항에 있어서,

   상기 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 7 또는 서열번호 8에 의해 표현되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편:

   QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

   TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

   AGTKLELKR (서열번호 7);

   EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

   TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

   AGTKLELKR (서열번호 8).
5. 제1항에 있어서,

   상기 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이 것의 에피토프-결합 단편.
6. 제1항에 있어서,

   상기 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편.
7. 제1항에 있어서,

   상기 H사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 상기 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편.
8. 제1항에 따른 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
9. 제4항에 따른 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
10. 제7항에 따른 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
11. 제1항에 따른 항체의 H사슬 또는 이것의 에피토프-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
12. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
13. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
14. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
15. 제12항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
16. 제13항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
17. 제14항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
18. 항체 또는 에피토프-결합 단편을 제조하는 방법에 있어서,

    상기 항체 또는 에피토프-결합 단편의 발현을 촉진하는 조건 하에서 제15항의 숙주세포를 배양하는 단계와, 세포 배양액으로부터 상기 항체 또는 에피토프-결합 단편의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고,

    상기 항체 또는 이것의 에피토프-결합 단편은, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 H사슬 가변영역 또는 이것의 단편과, 적어도 하나의 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 에피토프-결합 단편을 제조하는 방법:

    QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

    WIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

    FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 9);

    QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

    WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

    FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 10);

    QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

    WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

    FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11).
19. 항체 또는 에피토프-결합 단편을 제조하는 방법에 있어서,

    상기 항체 또는 에피토프-결합 단편의 발현을 촉진하는 조건 하에서 제16항의 숙주세포를 배양하는 단계와, 세포 배양액으로부터 상기 항체 또는 에피토프-결합 단편의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고,

    상기 항체의 H사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖고,

    상기 항체의 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 7 또는 서열번호 8에 의해 표현되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 에피토프-결합 단편을 제조하는 방법:

    QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

    TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

    AGTKLELKR (서열번호 7);

    EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS

    TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG

    AGTKLELKR (서열번호 8);

    QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

    WIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

    FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 9);

    QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

    WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

    FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 10);

    QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE

    WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY

    FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11).
20. 항체 또는 에피토프-결합 단편을 제조하는 방법에 있어서,

    상기 항체 또는 에피토프-결합 단편의 발현을 촉진하는 조건 하에서 제17항의 숙주세포를 배양하는 단계와, 세포 배양액으로부터 상기 항체 또는 에피토프-결합 단편의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고,

    상기 항체의 H사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지며, 상기 항체의 L사슬 가변영역 또는 이것의 단편은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 에피토프-결합 단편을 제조하는 방법.

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