BRPI0717882A2

BRPI0717882A2 - Métodos para aumentar a produção de um anticorpo humanizado, murino humanizado ou anticorpo parental; ou um fragmento, fragmento de ligação a epitopo ou fragmento de ligação a antígeno dos mesmos em uma célula hospedeira pela reengenharia de sequência, anti-corpo e anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo e ácido nucléico isolado

Info

Publication number: BRPI0717882A2
Application number: BRPI0717882-4A
Authority: BR
Inventors: Xiao-Mai Zhou; Daniel Tavares
Original assignee: Immunogem Inc
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2007-10-30
Publication date: 2013-10-29
Also published as: IL197823A0; WO2008073598A2; JP2010508043A; MX2009003480A; US20080138898A1; EP2069379A4; CN101535332A; EP2069379A2; CA2667502A1; WO2008073598A3; AU2007333485A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO HUMANIZADO, MURINO HUMANIZADO OU ANTICORPO PARENTAL; OU UM FRAG- MENTO, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A EPITOPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DOS MESMOS EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA PELA RE-ENGENHARIA DE SEQÜÊNCIA, ANTICORPO E ANTICORPO VARIANTE OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A EPITOPO DO MESMO E ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO".

Este pedido reivindica prioridade sobre Pedido provisório U.S. N0 60/855.361, depositado em 31 de outubro de 2006, a descrição completa do qual é incorporada neste pedido por referência. CAMPO DE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos de produção de anti- corpos melhorados. Mais particularmente, a métodos em que os anticorpos são reprojetados tal que os anticorpos re-engeheirados sejam produzidos com maior rendimento em células hospedeiras em comparação ao anticorpo parental do anticorpo reprojetado. ANTECEDENTES

Anticorpos monoclonais têm uma ampla variedade de usos inclu- indo diagnóstico in vitro, reagentes de laboratório, e terapêuticos. Atualmen- te, há pelo menos 200 anticorpos ou fragmentos de anticorpo passando tes- tes clínicos (Morrow, K. J., Jr., Monoclonal antibody production techniques. Gen. Eng. News, 2002, 20(14): 21).

Expressão em alto nível de anticorpos em células CHO requer eficiência máxima da transcrição através da tradução e secreção. Plasmí- deos de expressão de mamíferos são principalmente projetados para alcan- çar altos níveis de RNAm através do uso de ativadores virais potentes como o gene ativador precoce imediado hCMV e a seqüência promotora em con- junto com sinais de poliadenilação estabilizada por transcrito como os sítios poli A SV40.

Construtos sintéticos de cDNA podem ser projetados para au- mentar ainda os níveis de RNAm pela eliminação dos sítios crípticos de spli-

Segue-se folha 1a 1a ce e outros elementos eis potencialmente prejudiciais dentro da seqüência de codificação de anticorpo. Além disso, os construtos sintéticos podem ati- var o maquinário de tradução gênica através do uso máximo do códon e pela minimização das energias de estrutura secundárias do RNAm (Trinh R, Gur- lmmunol. 2004 Jan; 40(10):717-22). Entretanto, até com tais sistemas de expressão maximizados, níveis de expressão em células de mamíferos po- dem variar significativamente entre anticorpos diferentes. Análise de etapas celulares diferentes que são necessárias para a síntese de moléculas de anticorpo a partir da expressão de plasmídeos, leva à noção de que as pro- priedades da região variável de um anticorpo podem afetar os níveis de ex- pressão de um dado anticorpo. Entretanto, pouco é conhecido sobre as ca- racterísticas da seqüência e a estrutura de regiões variáveis que podem afe- tar a expressão gênica independente de eficiência de tradução ou transcri- ção.

Muitos anticorpos derivados de subclasses específicas de genes de região variáveis são biofisicamente predispostos à baixa estabilidade que pode levar à baixa expressão gênica. Regiões variáveis de cadeia leve e pesada humanas podem ser classificadas em subgrupos com graus variados da estabilidade estrutural baseada em uma análise de uma biblioteca de fa- go scFv humana ((Ewert S, Honegger A, Pluckthun A. Structure-based im- provement of the biophysical properties of immunoglobulin VH domains with a generalizable approach. Biochemistry. 2003 Feb 18; 42(6): 1517-28). Um anticorpo ou fragmento pertencente a um subgrupo com membros de baixa estabilidade podem ter uma propensão a agregar-se e pode ser difícil de expressar devido ao enovelamento ou montagem ineficientes.

Além disso, resíduos que desempenham papéis críticos em pro- cessos como enovelamento e secreção muitas vezes são altamente conser- vados em seqüências de linhagem germinativa, mas podem ser alterados durante a geração do repertório de anticorpo primário e maturação de afini- dade através de mutações somáticas. Isto pode levar a anticorpos que têm baixa estabilidade e baixa expressão. Uma modificação de resíduo único pode alterar dramaticamente a ligação chaperona ou montagem da cadeia leve/cadeia pesada e resultar em um aumento na cadeia pesada não- pareada intracelular que é consequentemente degradada (Dul JL, Argon Y. A single amino acid substitution in the variable region of the Iight chain speci- fically blocks immunoglobulin secretion. Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Oct; 87(20):8135-9; Wiens GD1 LekkerkerkerA1 Veltman I, Rittenberg MB. Muta- tion of a single conserved residue in VH complementarity-determining region 2 results in a severe Ig secretion defect. J Immunol. 2001 Aug 15;167(4):2179-86). Outras mutações desestabilizantes incluem introdução de resíduos hidrofílicos inseridos ou resíduos hidrofóbicos de superfície. Re- síduos de empacotamento principais invariantes como a cadeia pesada Glu6/Gln6 são também sensíveis a modificações de resíduos em posições vizinhas como H7 e H10 (Honegger A, Plückthun A. The influence of the bu- ried glutamine or glutamate residue in position 6 on the structure of immuno- globulin variable domains. J Mol Biol. 2001 Jun 8; 309(3):687-99). Enquanto uma mutação somática não atravessa um limiar estrutural crítico, muitas se- qüências indesejáveis biofisicamente podem ser encontradas em anticorpos de ocorrência natural.

O potencial de estabilidade e expressão de muitos anticorpos pode ser aumentado com uma abordagem de re-engenharia da seqüência racional. Uma das abordagens mais simples para re-engenharia de um anti- corpo é utilizar a informação presente em bases de dados de milhares de seqüências de anticorpos (vide, por exemplo, Johnson G, Wu TT. Kabat Da- tabase and its applications: future directions. Nucleic Acids Res. 2001 Jan 1; 29(l):205-6.). Análise cuidadosa pode identificar resíduos potencialmente problemáticos. Por exemplo, resíduos individuais que são raramente encon- trados em uma dada posição podem ser alterados para combinar um resíduo consenso a esta posição para melhorar a estabilidade (Steipe B, Schiller B, Plückthun A, Steinbacher S. Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain. J Mol Biol. 1994 Jul 15; 240(3): 188-92.) e mesmo expressão equilibrada em linhagens celulares de mamíferos (Whit- comb EA, Martin TM, Rittenberg MB. Restoration of Ig secretion: mutation of germline-encoded residues in T15L chains Ieads to secretion of free Iight chains and assembled antibody complexes bearing secretion-impaired heavy chains. J Immunol. 2003 Feb 15; 170(4): 1903-9). A identificação e reversão de resíduos biofisicamente ofensivos, tais como resíduos de superfície hidro- fóbicos também podem levar à expressão melhorada ((Nieba L, Honegger A, Krebber C1 Pluckthun Α. Disrupting the hydrophobic patches at the antibody variable/constant domain interface: improved in vivo folding and physical characterization of an engineered scFv fragment. Protein Eng. 1997 Apr; 10(4):435-44). A maioria dos dados atualmente disponíveis para apoiar o redesenho racional de anticorpos biofisicamente estáveis foi gerada com fragmentos de anticorpo em sistemas de exposição em fago expresso em bactérias (Ewert S, Honegger A, Plückthun A. Stability improvement of anti- bodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods. 2004 Oct; 34(2): 184-99. Review).

Humanização por técnicas de enxerto de CDR pode fixar ou evi- tar estes problemas de estabilidade simplesmente pela escolha de uma es- trutura de região variável de doador humano de um dos subgrupos de linha- gem germinativa mais estáveis sempre que possível (Ewert e outros, 2004, supra). WO 2004/065417 fornece uma melhora adicional para produção de tais fragmentos de ligação a anticorpos e/ou antígenos em culturas celulares de mamíferos em rendimentos mais altos pela comparação da seqüência de aminoácidos da região Hipervariável 1 (HVRI) e/ou região Hipervariável 2 (HVR2) do domínio variável de um anticorpo para uma seqüência corres- pondente de aminoácidos HVRI e/ou HVR2 de cada uma das do subgrupo de seqüências de aminoácido consenso de domínio variável humano e sele- cionando o subgrupo de seqüência consenso que tem a maior identidade de seqüência com seqüência de aminoácidos HVRI e/ou HVR2 do domínio va- riável. Em W02004/065417, a seqüência consenso é derivada de anticorpos com mais idêntico HVRI e/ou HVR2 e é aplicada a anticorpos enxertados com CDR onde todas as seqüências estruturais são seqüências humanas completas.

Outros métodos de humanização, tais como os métodos de re- cobrir a superfície de anticorpos de roedor (Patente U.S. No. 5.639.641; Ro- guska MA, Pedersen JT1 Keddy CA, Henry AH, Searle SJ, Lambert JM, Goldmacher VS, Blattler WA, Rees AR, Guild BC. Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Feb 1 ; 91(3):969-73; Pedersen JT1 Henry AH, Searle SJ, Guild BC, Roguska M, Rees AR. Comparison of surface accessible residues in human and murine immunoglobulin Fv domains. Implication for humaniza- tion of murine antibodies. J Mol Biol. 1994 Jan 21; 235(3):959-73), de reves- timento de anticorpos (Patente U.S. No. 6.797.492; Padlan, E.A. 1991, Mol. Immunolgy 28:489-498), e deimunização de anticorpos (publicação N. W098/52976) mantêm o núcleo hidrofóbico da região variável murino. Como uma conseqüência, tais anticorpos humanizados com estruturas de núcleo murino na região variável derivada de uma linhagem germinativa murino com propriedades biofísicas inferiores herdarão provavelmente estas proprieda- des. Há, por isso, uma necessidade de métodos que possam melhorar as propriedades biofísicas de tais anticorpos humanizados. Estes métodos ren- deriam maior expressão de anticorpos de células de mamíferos com superfí- cie recoberta. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece em geral um método para melhorar as propriedades biofísicas de um anticorpo ("anticorpo parental" a seguir) que resulta na produção aumentada de anticorpo. O método identifica um ou mais resíduos de aminoácidos não-consenso na estrutura da região variável do anticorpo parental e preferencialmente os substitui com um ou mais resí- duos consenso. Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substi- tuídos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas.

Os resíduos consenso são identificados pelo alinhamento de uma coleção de seqüências de estrutura de região variável de anticorpo a partir de anticorpos das mesmas espécies (por exemplo, murino) ou através das espécies do mesmo gênero (por exemplo, mus e rattus) ou de todo os gêneros ou outra classificação taxonômica de acordo com suas relações naturais presumidas como aquelas das quais o anticorpo do qual o parental foi derivado pertence. Mais particularmente, a presente invenção engloba um método

para aumento da produção de um anticorpo parental ou um fragmento de ligação a epitopo dos mesmos em uma célula hospedeira pela re-engenharia de seqüência. A re-engenharia de seqüência compreende:

a) alinhamento de uma coleção de seqüências de estrutura de região variável de anticorpo a partir de anticorpos das mesmas espécies (por exemplo, murino) ou através das espécies do mesmo gênero (por exemplo, mus e rattus) ou de todo os gêneros ou outra classificação taxonômica de acordo com as suas relações naturais presumidas como aquelas das quais o anticorpo do qual o parental foi derivado pertence, em que tal alinhamento identifica resíduos de aminoácido mais freqüentemente encontrados (resí- duos consenso) em cada posição na estrutura; b) compararação dos resíduos consenso com os resíduos cor-

respondentes na seqüência de estrutura de região variável de anticorpo pa- rental;

c) identificação no anticorpo parental de um ou mais resíduos de aminoácidos não-consenso na seqüência de estrutura de região variável; e d) substituição no anticorpo parental ou fragmento do mesmo de

um ou mais resíduos de aminoácidos não-consenso com o resíduo consen- so na posição equivalente para produzir um anticorpo variante, em que o anticorpo variante é produzido na célula hospedeira em um rendimento mai- or quando comparado com o anticorpo parental. Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substituí-

dos por um resíduo não-consenso por considerações biofísicas.

A presente invenção também fornece em geral um método para melhorar as propriedades biofísicas de um anticorpo humanizado que resulta na produção aumentada de anticorpo. O método identifica um ou mais resí- duos de aminoácidos não-consenso no núcleo da estrutura da região variá- vel do anticorpo humanizado e os substitui com um ou mais resíduos con- senso. Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas. Os resíduos consenso são identificados pelo alinhamento de uma coleção de seqüências de estrutura de região variável de anticorpo a partir de anticorpos das mes- mas espécies ou através das espécies (por exemplo, murino) do mesmo gê- nero (por exemplo, mus e rattus) ou de todos os gêneros ou outra classifica- ção taxonômica de acordo com as suas relações naturais presumidas como aquelas das quais o anticorpo do qual o parental foi derivado pertence.

Dessa maneira, a presente invenção engloba um método para aumentar a produção de um anticorpo humanizado ou um fragmento de Iiga- ção a epitopo do mesmo em uma célula hospedeira pela re-engenharia da seqüência. A engenharia de seqüência compreende:

a) alinhamento de uma coleção de seqüências de estruturas de região variável de anticorpo a partir de anticorpos das mesmas espécies (por exemplo, murino) ou através das espécies do mesmo gênero (por exemplo, mus e rattus) ou de todo o gênero ou outra classificação taxonômica de a- cordo com as suas relações naturais presumidas como aquelas das quais o anticorpo do qual o parental foi derivado pertence, em que tal alinhamento identifica resíduos de aminoácido mais freqüentemente encontrados (resí- duos consenso) em cada posição na estrutura; b) comparação dos resíduos consenso com os resíduos corres-

pondentes na seqüência de estrutura de região variável de anticorpo huma- nizado;

c) identificação no anticorpo humanizado de um ou mais resí- duos não-consenso na seqüência da estrutura de região variável; e d) substituição no anticorpo humanizado ou fragmento do mes-

mo no dito um ou mais resíduos não-consenso com o resíduo consenso na posição equivalente para produzir um anticorpo variante, em que o anticorpo variante é produzido em uma célula com um rendimento maior quando com- parado ao anticorpo humanizado. Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substituí-

dos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para melhorar as propriedades biofísicas de um anticorpo murino humanizado que resulta na produção aumentada de anticorpo. O método identifica um ou mais resíduos de aminoácidos não-consenso na estrutura de região variável do anticorpo humanizado e os substitui com um ou mais resíduos consenso. Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas. Os resíduos consenso são identificados pelo alinhamento de uma coleção de seqüências de estru- tura de região variável de anticorpo a partir de anticorpos murinos.

Mais particularmente, a presente invenção engloba um método para aumento da produção de um anticorpo murino humanizado ou um fragmento de ligação a epitopo do mesmo em uma célula hospedeira pela re-engenharia de seqüência. A re-engenharia de seqüência compreende:

a) alinhamento de uma coleção de seqüências de estrutura de região variável de anticorpo murino, em que tal alinhamento identifica resí-

duos de aminoácido mais freqüentemente encontrados (resíduos consenso) em cada posição na estrutura;

b) comparação dos resíduos consenso com os resíduos corres- pondentes na seqüência de estrutura da região variável do anticorpo huma- nizado;

c) identificação no anticorpo humanizado de um ou mais resí-

duos de aminoácidos não-consenso na seqüência de estrutura da região variável; e

d) substituição na seqüência de estrutura da região variável do anticorpo humanizado ou dito fragmento do mesmo de um ou mais resíduos

não-consenso com o resíduo consenso na posição equivalente para produzir um anticorpo variante, em que o anticorpo variante é produzido em uma cé- lula com rendimento maior quando comparado ao anticorpo humanizado.

Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substituí- dos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas.

A invenção também engloba ácidos nucleicos isolados que codi-

ficam os anticorpos variantes. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra uma representação esquemática de um anti- corpo IgG e as regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

Um desenho da representação das regiões variáveis de cadeia pesada e leve é mostrada à direita com os resíduos de estrutura em cinza e o do CDR em preto. Os números de seqüência de resíduo de anticorpo Kabat são da- dos para região variável final bem como os limites de cada CDR.

A figura 2 mostra baixa produção de huC242 por células 293T algumas horas após transfecção transiente com um plasmídeo contendo os genes huC242. Plasmídeos para anticorpos humanizados A, B7 e huC242 foram normalizados na concentração e introduzidos em células 293T em paralelo a 2pg/ml. Os anticorpos secretados foram coletados no meio de cul- tura em 14 horas, 22 horas e 48 horas após transfecção. Concentrações de anticorpo foram determinadas usando um ELISA anti-hulgGI.

A figura 3 mostra níveis de RNAm huC242 HC e LC em células 293T transfectadas transitoriamente. HuC242 e outros anticorpos com su- perfície recoberta A, B1 C, D, E, F, foram introduzidos em células 293T em paralelo. RNAm total foi isolado a partir de cada amostra de célula transfec- tada 72 horas após transfecção e amostras foram posteriormente reversa- mente transcritas em cDNA. A figura 4 mostra um gel com bandas de anticorpo intacto mon-

tado, H2L2 marcado, e cadeia pesada, H marcada, a partir de células CHO que produzem huC242 ou Ac A recoberto na superfície. Expressão e monta- gem de Ac. A e clone 1 e clone 2 de huC242 foram comparados. As linha- gens celulares CHO para AC. A e os dois clones C242 foram cultivados em paralelo e as células lisadas. Lisados celulares totais foram submetidos à purificação em proteína A. IgGs isoladas foram separadas em um gel não- desnaturante e corados com Coomassie Blue.

A figura 5 A mostra a seqüência de região variável da cadeia pesada do anticorpo huC242 (SEQ ID NO:1) alinhada com a respectiva se- quência consenso de anticorpos murinos no banco de dados Kabat (SEQ ID NO:3). Os CDR1S são sublinhados e marcados em negrito. Os resíduos que se diferenciam entre as seqüências são destacados com fundos cinza e os resíduos preferenciais discutidos detalhadamente neste pedido são destaca- dos com fundos pretos. Os resíduos superficiais são marcados com um aste- risco "*" abaixo.

A figura 5 B mostra a seqüência de região variável da cadeia leve do anticorpo huC242 (SEQ ID N0:2) alinhada com a respectiva se- quência consenso de anticorpos murinos no banco de dados Kabat (SEQ ID NO:4). Os CDR1S são sublinhados e marcados em negrito. Os resíduos que se diferenciam entre as seqüências são destacados com fundos cinza e os resíduos preferenciais discutidos detalhadamente neste pedido são destaca- dos com fundos pretos. Os resíduos superficiais são marcados com um aste- risco "*" abaixo.

A figura 5 C mostra o alinhamento da seqüência de região variá- vel de cadeia leve de anticorpo huC242 (SEQ ID N0:5) alinhada com a res- pectiva seqüência consenso de quatro anticorpos murinos humanizados com superfície recoberta da ImmunoGen (huMy96 LC1 SEQ ID N0:6; rB4 LC1 SEQ ID NO:7; huEM 164 LC1 SEQ ID N0:8; huN901 LC1 SEQ ID N0:9; Consensus, SEQ ID NO: K)), que mostra que em quatro anticorpos humani- zados o aminoácido R é o resíduo de aminoácido conservado para o Q não- consenso encontrado no huC242. No banco de dados murino R é substituído com K, que é o resíduo de aminoácido mais conservado. Neste caso, K é substituível por R devido a propriedades semelhantes dos dois aminoácidos. No entanto, a substituição de Q por K é englobada por estar dentro do esco- po desta invenção. O alinhamento é baseado em Kabat.

A figura 6 mostra o aumento moderado na produção de IgG cau- sada por uma substituição única de aminoácido na estrutura de HC ou LC do huC242. A produtividade de variantes huC242 com substituições únicas na estrutura de aminoácidos é comparada com aquela do huC242 parental e anticorpo B. Quantidades iguais de plasmídeos foram transfectadas em célu- las 293T. Após 72 horas, os níveis de IgG secretados foram determinados com um ELISA. A ligação do variante huC242 a células Colo 205 que ex- pressam antígeno foi medida por FACS.

A figura 7 mostra o aumento significante na produção de IgG pela combinação de duas ou três variações HC e LC do huC242 em experi- mentos de expressão transiente em 293T. A produtividade de huC242 origi- nal é estabelecida como 1,0. IgGs secretados foram coletados a partir do meio de cultura 72 horas após transfecção.

A figura 8 mostra que os níveis de RNAm das variantes de HC e LC de huC242 permanecem inalterados. Níveis de RNAm de huC242 varian- te específico foram determinados por qPCR, e normalizada pelo RNAm de neo.

A figura 9 mostra o acúmulo aumentado de LC intracelular como resultado de substituições de resíduo de estrutura HC por eletroforese de Iisado celular total em um gel desnaturante. Células 293T foram Iisadas 72 horas após transfecção. HC e LC foram detectadas com anticorpos anti- hulgGI e anti-huK, respectivamente.

As figuras 10(a) e 10(b) mostram que as variações huC242 Ie- vam a síntese aumentada de HC e LC e montagem aumentada do anticorpo inteiro (H2L2) em células.

A figura 10(a): células 293T foram Iisadas 72 horas após trans- fecção. Os Iisados foram separados em um gel e transferidos para uma membrana, que foi marcada para HC e LC de IgG montada e não-montada (eletroforese foi sob condições não-desnaturantes). O blot foi reaproveitado e remarcado com anticorpo antitubulina para mostrar os níveis de amostra carregada.

A figura 10(b): IgGs foram isoladas a partir de Iisados celulares preparados como descrito na figura 10(a) usando contas de afinidade em proteína A. As amostras isoladas foram então submetidas a eletroforese em um gel não-desnaturante, que foi posteriormente corado com Coomassie Blue.

A figura 11 (a) mostra uma análise por FACS da ligação de huC242 e variantes de huC242 a células Colo 205. Ac B é um anticorpo con- trole não ligante.

A figura 11 (b) mostra uma análise por FACS da ligação de con- jugados de DM4 de huC242 e variantes do huC242 a células Colo 205. Ab B é um anticorpo de controle não-ligante.

A figura 11(c) mostra os resultados da ligação de competição de anticorpos huC242 parental e variante huC242 com huC242 parental marca- do com FITC em células Colo 205 usando análise de FACS. O anticorpo B serve como um controle não-ligante, não-competidor. A figura 12 mostra aminoácido huC242 e as seqüências de áci- dos nucleicos da cadeia pesada (Painel A; SEQ ID NOs: 11 e 12) e a cadeia leve ( Painel B; SEQ ID NOs: 13 e 14). Também mostra, no Painel C, a se- qüência de domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 15) e a sequên- cia de domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 16) do huC242 que re- presenta o códon(s) que codifica as modificações de aminoácidos identifica- das em huC242.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Enquanto a invenção é descrita com referência a anticorpos mu- rinos humanizados, aqueles versados na técnica ordinária entenderão que o método de re-engenharia pode ser aplicado a qualquer anticorpo para o qual há uma base de dados suficientemente grande a partir da qual derivar uma seqüência consenso da região(ões) variável de cadeia leve e/ou de cadeia pesada.

Um modo padrão de geração de anticorpos monoclonais para

antígenos humanos é imunizar outras espécies de animais com o antígeno, gerar hibridomas com célula B imune do animal, e selecionar os clones de hibridoma que secretam anticorpos que se ligam ao antígeno humano. Mais comumente, os animais usados são camundongos ou ratos, dessa maneira os anticorpos gerados são anticorpos murinos. Anticorpos monoclonais para antígenos humanos são usados em humanos com objetivos diagnósticos ou para tratamento de várias doenças, tais como câncer, doenças autoimunes, inflamação, e infecções. Entretanto, o uso de anticorpos monoclonais muri- nos em humanos é limitado, porque os anticorpos são reconhecidos como proteínas estranhas e provocam uma resposta imune, muitas vezes chama- da resposta HAMA (resposta de anticorpo de anti-camundongo humana). Para prevenir uma resposta HAMA, métodos foram desenvolvidos para a humanização de anticorpos murinos. Todos os métodos substituem o domí- nio da região murino constante (para a estrutura de domínio de um IgG vide Figura 1) com um domínio de região constante humano, mas diferem na es- tratégia de humanização do domínio de região variável do anticorpo. Método de enxerto CDR transfere os seis domínios CDR da região variável murino a uma região variável humana homóloga pela substituição dos domínios CDR humanos, dessa maneira, as regiões de estrutura de domínio variável muri- no são inteiramente substituídas por regiões de estrutura humana homóloga. Outros métodos de humanização, tais como os métodos de recobrir a super- fície de anticorpos de roedor (Patente U.S. No. 5.639.641; Roguska e outros 1994, Proc. Natl. Acad, Sei. U.S.A. 91:969-973, supra; Pedersen e outros 1994, J. Mol. Biol. 235:969-973, supra), de revestimento de anticorpos (Pa- tente U.S. No. 6.797.492; Padlan. E. A. 1991, Mol. Immunolgy 28:489-498, supra), e deimunização de anticorpos (publicação internacional N. W098/52976) mantêm o núcleo hidrofóbico da região de estrutura de domí- nio variável murino e modifica somente a superfície exposta à resíduos na região de estrutura com resíduos humanos. Por exemplo, um anticorpo hu- manizado usando a técnica de recobrimento da superfície contém resíduos humanos em todas as posições da estrutura da região variável acessíveis a solventes enquanto conserva os resíduos murinos nos CDR's e imerge posi- ções da estrutura da região variável. Estes anticorpos humanizados conser- vam a afinidade de ligação do anticorpo murino original que muitas vezes é perdida quando o núcleo hidrofóbico é substituído em outros métodos de humanização, tais como enxerto de CDR. Anticorpos humanizados são tipicamente produzidos tendo seus

genes expressos em uma célula hospedeira de mamífero, tal como células CHO (ovário de hamster chinês) ou células T293 (uma linhagem celular de rim humano). Observou-se que diferentes anticorpos humanizados prepara- dos pela tecnologia de recobrimento de superfície foram produzidos em quantidades diferentes nas mesmas células hospedeiras de mamíferos (Fi- gura 2), embora quantidades similares de RNAm para os anticorpos foram produzidas (Figura 3). Concluiu-se que a seqüência primária de aminoácidos das regiões variáveis afetou a produção dos anticorpos. Dessa maneira, de- senvolveu-se um método para melhorar a produtividade em células hospe- deiras de mamíferos de anticorpos monoclonais humanizados que têm um núcleo de aminoácidos murinos inseridos nas estruturas de região de domí- nio variável. ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES

10

15

25

30

MAb CH

CH1, CH2, CH3

VH VL CDR

CDRLI, CDRL2, CDRL3 CDRH1, CDRH2, CDRH3 FR

FRLI1 FRL2, FRL3, FRL4

qPCR

anticorpo monoclonal

região constante (domínio) da cadeia pesada regiões constantes 1, 2, & 3 da cadeia pesada CL região constante de cadeia leve região variável (domínio) da cadeia pesada região variável (domínio) da cadeia leve região de determinação de complementarieda- de

regiões de determinação de complementarie- dade de 1, 2, & 3 da cadeia leve regiões de determinação de complementarie- dade 1, 2, & 3 da cadeia pesada região de estrutura (domínio) de domínio variá- vel

regiões de estrutura 1, 2, 3, & 4 do domínio va- riável da cadeia leve FRHI1 FRH2, FRH3, FRH4 regiões de estrutura 1, 2, 3, & 4 do domínio va- riável da cadeia pesada reação em cadeia da polimerase quantitativa Descrição de Anticorpos e Definições

Como mostrado na Figura 1, os anticorpos compreendem tipi- camente duas cadeias pesadas ligadas por ligações dissulfeto e duas cadei- as leves. Cada cadeia leve é ligada a uma respectiva cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende em ordem, co- meçando no N-terminal, um domínio variável (região), um domínio constante (região) 1, uma região de dobradiça, e domínios constantes (regiões) 2 e 3. Cada cadeia leve tem um domínio variável (região) no N-terminal e um do- mínio constante no C-terminal. O domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. O domínio constante da cadeia leve é alinhada com o domínio constante 1 da cadeia pesada. Os domínios constantes nas cadeias leves e pesadas não estão implicados diretamente na ligação antígeno.

Os domínios variáveis de cada par de cadeias leves e pesadas formam o sítio de ligação ao antígeno. Os domínios nas cadeias leves e pe- sadas têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende uma estru- tura de quatro regiões, cujas seqüências são relativamente conservadas, unidas por três regiões de determinação de complementariedade (CDRs). As quatro regiões de estrutura de cada LC e HC adotam amplamente uma con- formação beta pregueada e as CDRs formam alças de união, e em alguns casos formando parte da estrutura beta pregueada. As seis CDRs de uma região variável de um anticorpo (três em cada uma das LC e HC) são manti- das na proximidade uma da outra e das regiões de estrutura e formam o sítio de ligação a antígeno. CDRs e regiões de estrutura de anticorpos podem ser determinadas por referência a Kabat ("Sequences of proteins of immunologi- cal interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Prin- ting Office, 1987).

Aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves maduras de imunoglobulinas são indicados Hx e Lx respectivamente, onde χ é um número que indica a posição de aminoácido de acordo com o esquema de Kabat (supra). Kabat lista muitas seqüências de aminoácido para anticor- pos de cada subgrupo (por exemplo, murino, humano, rato etc.). Kabat usa um método para atribuir um número de resíduos a cada aminoácido em uma seqüência listada, e este método para destinar números de resíduo que tor- nou-se padrão no campo. O esquema de Kabat é extensível a outros anti- corpos não incluídos no seu compêndio pelo alinhamento do anticorpo em questão com uma das seqüências consenso em Kabat por referência a ami- noácidos conservados. O uso da numeração do sistema Kabat prontamente identifica aminoácidos em posições equivalentes em anticorpos diferentes. Por exemplo, aminoácido no Ln (n sendo qualquer número inteiro, dito, por exemplo, 5) a posição de um anticorpo humano ocupa a posição equivalente a uma posição de aminoácido L5 de um anticorpo de camundongo. Quais- quer duas seqüências de anticorpos somente podem ser alinhadas de um modo, através do uso do esquema de numeração Kabat (supra). Por isso, para anticorpos, a identidade porcentual tem um significado único e bem de- finido.

Como usado neste pedido, o termo "região de estrutura" refere- se àquelas porções das regiões variáveis da cadeia leve e pesada da imu- noglobulina que são relativamente conservadas (isto é, com exceção das regiões CDRs) entre diferentes imunoglobulinas em um gênero compreen- dendo uma ou mais espécies, como definido por Kabat, e outros, supra.

Como usado neste pedido, "anticorpo variante" ou um "variante" refere-se a um anticorpo que tem uma seqüência de aminoácidos que se diferencia da seqüência de aminoácidos de um anticorpo parental. Tais vari- antes necessariamente têm menos de 100% de identidade ou similaridade de seqüência com o anticorpo parental. Em uma modalidade preferencial, a variante terá uma seqüência de aminoácidos que tem de aproximadamente 75% e menos de 100% de identidade ou similaridade com a seqüência de aminoácidos domínio variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo paren- tal, mais preferencialmente de aproximadamente 80% a menos de 100%, mais preferencialmente de aproximadamente 85% a menos de 100%, mais preferencialmente de aproximadamente 90% a menos de 100%, e ainda mais preferencialmente de aproximadamente 95% a menos de 100%. Identi- dade ou similaridade com respeito a esta seqüência é definida neste pedido como a porcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticos (isto é, mesmo resíduo) com os resíduos do anticorpo pa- rental, após alinhamento das seqüências e introduzir lacunas, se necessário, para alcançar a máxima identidade de seqüência porcentual. Nenhum N- terminal, C-terminal, ou extensões internas, deleções, ou inserções na se- qüência do anticorpo fora do domínio variável serão interpretados como afe- tando a identidade ou similaridade da seqüência. O anticorpo variante é ge- ralmente aquele que tem uma substituição de aminoácido na região variável (por um ou mais resíduos de aminoácido; por exemplo, por pelo menos um a aproximadamente vinte e cinco resíduos de aminoácido e preferencialmente por aproximadamente um a aproximadamente dez resíduos de aminoácido) quando comparado à região variável correspondente de um anticorpo paren- tal.

O anticorpo "parental" como usado neste pedido engloba um anticorpo produzido por um gene que predomina em uma população natural. Também inclui um anticorpo que é de forma mutante natural. Além disso, ainda incluídos estão os anticorpos que foram produzidos ou são suscetíveis a serem produzidos a partir de tal população natural de anticorpos ou a partir de seus mutantes naturais. Tais anticorpos incluem mas não são limitados a anticorpos humanizados ou com superfície recoberta, totalmente humanos, ou anticorpos quimerizados ou qualquer anticorpo, que pode ser criado ou manipulado segundo os ensinamentos da presente invenção. Tais anticor- pos geralmente possuem a especificidade de ligação ou possuem resíduos de ligação a antígeno do anticorpo original, mas em alguns casos tais anti- corpos também teriam uma especificidade de ligação diferente. Por exemplo, o anticorpo pode mostrar uma especificidade de ligação melhorada a um antígeno, que está parcialmente relacionada ou não-relacionada ao antígeno original.

Um exemplo não-restritivo de um anticorpo parental é "anticorpo parental C242" que refere-se a um anticorpo que tem resíduos de ligação a antígeno do, ou derivado do, anticorpo murino C242 (Patente U.S. N0 5.552.293) ou derivado do mesmo. Por exemplo, o anticorpo monoclonal C242 pode ser um anticorpo monoclonal murino ou um C242 humanizado, quimerizado, totalmente humano, possuindo resíduos de ligação a antígeno de anticorpo monoclonal murino C242.

Terapia direcionada ao alvo, tal como terapia direcionada ao an- ticorpo, oferece vantagens sobre a terapia não direcionada ao alvo, tais co- mo terapia sistêmica via administração oral ou intravenosa de fármacos ou terapia de corpo total, tal como terapia de radiação externa (XRT). Uma van- tagem da terapia direcionada ao anticorpo, e da terapia usando anticorpos monoclonais (MAcs), em particular, é a capacidade de entregar doses de um agente terapêutico a um tumor, com maior proteção do tecido normal dos efeitos do agente terapêutico. Esta terapia direcionada usa MAcs ou conju- gados a MAcs desprotegidos a agentes de ligação celular, tais como fárma- cos, toxinas bacterianas ou outras, radionucleotídeos, e agentes capturado- res de nêutrons, tais como adendos de boro.

O termo "epitopo" inclui qualquer determinante de proteína ca- paz da ligação específica a uma imunoglobulina. Os determinantes epitópi- cos normalmente consistem em grupamentos superficiais quimicamente ati- vos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e normalmente têm três características estruturais dimensionais específicas, bem como características de carga específica.

Um resíduo de aminoácido é chamado de um resíduo de estrutu- ra da região variável raro em uma dada posição na seqüência da região de estrutura, se for encontrado nesta posição em menos de 10% de todas as seqüências de anticorpo em uma grande base de dados de anticorpos muri- nos.

Um exemplo de uma grande base de dados é a base de dados de Anticorpos Kabat (vide, por exemplo, Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res. 2001 Jan I ;29(l):205-6.). Um grande banco de dados de anticorpo contém pelo menos 1000 seqüências de região variável de anticorpo individual.

Com as definições apresentadas acima, sem estar ligada por uma modalidade particular, a seguinte discussão é oferecida para facilitar o entendimento da invenção.

A presente invenção, em um aspecto não-restritivo, fornece um método para aumentar a produção em células de mamíferos de anticorpos humanizados que têm uma estrutura de núcleo murino da região variável. O método identifica resíduos de aminoácidos não-consenso no núcleo murino da estrutura da região variável e os substitui com o resíduo de aminoácido de uma seqüência consenso murino.

Dessa maneira, em uma modalidade, a presente invenção en- globa a produção de variantes de anticorpo ou fragmentos do mesmo, em que as variantes são fabricadas pela substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em um anticorpo parental com o resíduo correspondente a partir de uma seqüência de estrutura da região variável consenso. Como uma conseqüência de tal substituição(ões), anticorpos variantes ou fragmentos dos mesmos mostram a síntese de anticorpo aumentada quando introduzi- dos em uma célula hospedeira quando comparado ao anticorpo parental.

Em um anticorpo parental, a substituição é preferencialmente feita por um ou mais aminoácidos não-consenso, identificados através de alinhamento de cada seqüência da região de estrutura de domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo parental com uma se- qüência consenso e região de estrutura de domínio variável da cadeia pesa- da e da cadeia leve, com o resíduo de aminoácido de seqüência consenso correspondente.

Em uma modalidade preferencial, a substituição de resíduos de aminoácido em um anticorpo parental é realizada na cadeia pesada. Em ou- tra modalidade preferencial tal substituição de aminoácido é realizada na cadeia leve. Tal substituição na cadeia pesada ou leve de um anticorpo pa- rental pode ser realizada independentemente ou simultaneamente. A se- qüência consenso é derivada das seqüências de um subgrupo de anticorpos que pertencem às mesmas espécies (por exemplo, murino) ou através das espécies do mesmo gênero (por exemplo, mus ou rattus) ou de todo o gêne- ro ou outra classificação taxonômica de acordo com as suas relações natu- rais presumidas como aquelas das quais o anticorpo do qual o parental foi derivado.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método para au- mento da produção de um anticorpo variante ou fragmento do mesmo quan- do comparado com um anticorpo parental em uma célula hospedeira, o mé- todo compreendendo:

a) alinhamento de cada seqüência da região de estrutura de domínio de variável da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo pa- rental com uma seqüência consenso da região de estrutura de domínio vari- ável da cadeia pesada e da cadeia leve, em que a seqüência consenso da cadeia pesada ou leve é derivada de um banco de dados de domínios variá- veis de anticorpo murino; b) substituição de um ou mais resíduos da cadeia pesada na região da estrutura do domínio variável de anticorpo parental com um resíduo consenso da cadeia pesada murino ou substituição de um ou mais resíduos da cadeia leve na região de estrutura de domínio variável do anticorpo parental com um resíduo da cadeia leve consenso murino em que a substituição produz o anticorpo variante ou um fragmento do mesmo que quando introduzido na célula hospedeira é produzido em um rendimento maior quando comparado com o anticorpo parental; c) identificação no anti- corpo parental de um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados de Q45 ou A70 na cadeia leve, ou um ou mais resíduos de aminoácidos sele- cionados de E16, D26, K46 ou T89 na cadeia pesada, o resíduo de aminoá- cido determinado pelo esquema de numeração de resíduo de anticorpo Ka- bat; e d) substituição de um ou mais resíduos de aminoácido no anticorpo parental com um ou mais resíduos de aminoácido selecionado de K45 (op- cionalmente, K pode ser substituído por um resíduo não-consenso R por considerações biofísicas) ou D70, respectivamente, na cadeia leve, ou um ou mais resíduos de aminoácido selecionados a partir de A16, G26, E46 ou S46 ou V89, respectivamente, na cadeia pesada em que a substituição pro- duz o anticorpo variante ou fragmento do mesmo que quando introduzido na célula hospedeira é produzido em um rendimento maior quando comparado ao anticorpo parental. A substituição na cadeia pesada ou leve pode ser realizada in-

dependentemente ou simultaneamente.

Em uma modalidade preferencial, na cadeia leve do anticorpo variante Q45 é substituído por K45 (opcionalmente, K pode ser substituído por um resíduo não-consenso R por considerações biofísicas) e A70 é subs- tituído por D70 e na cadeia pesada do anticorpo variante E16 é substituído por A16; D26 é substituído por G26; K46 é substituído por E46 ou S46; e T89 é substituído por V89. Tal substituição aumenta preferencialmente o rendimento de anticorpo variante em pelo menos aproximadamente 100% ou aproximadamente 200%. Em uma modalidade preferencial, o rendimento é pelo menos aproximadamente 300% ou maior. Em uma modalidade mais preferencial, o rendimento é aproximadamente 400% ou maior. Em uma mo- dalidade ainda mais favorecida, o rendimento é aproximadamente 500% ou maior. O aumento no rendimento da proteína variante também pode depen- der de outros fatores, tais como, mas não limitados ao uso de fatores de crescimento ou o uso do meio sem soro para cultura de células.

A invenção também engloba um ácido nucleico isolado compre- endendo uma seqüência de codificação C242 inteira murino ou humana, humanizada ou quimerizada que tenha pelo menos uma variação em códons de aminoácido em uma região de codificação para uma seqüência de uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve, em que pelo menos uma variação aumenta o rendimento de uma proteína codi- ficada pelo gene C242 e em que a proteína inclui pelo menos uma variação de aminoácido codificada por pelo menos uma variação de códon.

Na substituição de cadeia leve é selecionada a partir das posi- ções da estrutura (esquema de numeração Kabat):

Q45 para K45; Opcionalmente, K pode ser substituído por um resíduo não-consenso R por considerações biofísicas. A70 para D70;

Na cadeia pesada, a substituição é selecionada a partir das po- sições da estrutura (esquema de numeração Kabat): E16 para A16 D26 para G26

K46 para E46 T89 a V89

Tal substituição de seqüência codifica para um produto gênico C242 variante, que é um anticorpo variante. A invenção também engloba um método para aumentar o rendi-

mento de um anticorpo, que é uma variante de um anticorpo parental, de uma cultura de célula hospedeira pela substituição no anticorpo parental de um ou mais resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (cadeia pesada) ou SEQ ID NO:2 (cadeia leve), o método compreendendo a) alinhamento de SEQ ID NO:1 (cadeia pesada) com uma se-

qüência de cadeia pesada consenso ou SEQ ID NO:2 (cadeia leve) com uma seqüência de cadeia leve consenso, em que a seqüência de cadeia pesada ou leve consenso é derivada de um banco de dados de seqüências de anticorpo murino (por exemplo, Banco de dados de Kabat - Johnson and Wu1 2001) pelo alinhamento de estruturas da região variável das cadeias pesada e leve de imunoglobulina usando programa de análise de seqüência de aminoácidos, tal como Vector NTI (Invitrogen);

b) identificação no anticorpo parental de um ou mais resíduos de aminoácido selecionados a partir de, E16, D26, K46 ou T89 na SEQ ID NO.: 1 e Q45 ou A70 no SEQ ID NO:2 o resíduo de aminoácido determinado pelo esquema Kabat, e

c) substituição de um ou mais dos resíduos de aminoácido; E16,

D26, K46 ou T89 na SEQ ID NO:1 e Q45 ou A70 no SEQ ID NO:2 com um resíduo de aminoácido selecionado a partir de A16, G26, E46, S46 ou V89, respectivamente, na SEQ ID NO:1 e K45 (opcionalmente, K pode ser substi- tuído por um resíduo não-consenso R por considerações biofísicas) ou D70, respectivamente, na SEQ ID NO:2, da seqüência consenso em que a substi- tuição resulta na produção de um anticorpo variante e em que quando o an- ticorpo variante é introduzido em uma célula hospedeira, o rendimento da variante é maior do que o anticorpo parental.

Em outra modalidade, a invenção engloba um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo, tal como uma variante de huC242, em que a variante tem uma ou várias substituições de aminoácido em um anticorpo parental que tem uma região variável compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID NO:1 [cadeia pesada huC242] e uma cadeia leve de SEQ ID NO:2 [cadeia leve huC242] e a variante mostra uma síntese me- Ihorada da cadeia leve e/ou pesada, e montagem melhorada da cadeia pe- sada/leve quando introduzido em uma célula hospedeira única quando com- parado ao anticorpo parental, em que a substituição é realizada em uma ou várias posições da região variável da cadeia pesada selecionadas a partir de 16, 26, 46, ou 89 no SEQ ID NO:1 ou posições da região variável da cadeia leve 45 ou 70, no SEQ ID NO:2, ou ambas, as posições que são determina- das por esquema de numeração Kabat. Mais preferencialmente, o anticorpo variante tem substituição de aminoácido selecionada a partir do grupo com- posto de resíduos da cadeia leve 045 a K45 (opcionalmente, K pode ser substituído com um resíduo não-consenso R por considerações biofísicas) ou A70 a D70 ou resíduos da cadeia pesada E16 a A16, D26 a G26, K46 a E46, ou T89 a V89 e está localizado na região de estrutura da cadeia pesa- da ou leve.

Em outra modalidade, o agente de ligação celular da presente invenção também reconhece especificamente um ligante, tal como o antíge- no C242 (CD44/CanAg), de forma que o conjugado estará em contato com a célula alvo por um período de tempo suficiente para permitir à porção de a- gente citotóxico do conjugado atuar sobre a célula, e/ou para permitir ao conjugado tempo suficiente para ser incorporado pela célula.

Em uma modalidade preferencial, os conjugados citotóxicos compreendem uma variante de um anticorpo anti-C242 como a agente de ligação celular, mais preferencialmente o conjugado citotóxico compreende uma variante selecionada a partir de anticorpo ou fragmento do mesmo de ligação ao epitopo A70D; Q45K/R; D26G;K46E; K46E/T89V; K46E/K82S; K46 E/E 16 A/D26G; A70D/K46E/T89V; K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G; A70D/K46E; Q45K (R)/K46E/T89V; A70D/D26G; Q45K(R)/K46E; A70D/K46E/D26G; Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G. Estes anticorpos são capazes de reconhecer especificamente o antígeno C242 (CD44/CanAg), e direcionar o agente citotóxico a uma célula anormal ou um tecido, tal como células de câncer, de uma maneira direcionada.

O segundo componente dos conjugados citotóxicos da presente invenção é um agente citotóxico. O termo "agente citotóxico" como usado neste pedido refere-se a uma substância que reduz ou bloqueia a função, ou crescimento, de células e/ou causa destruição de células.

Em modalidades preferenciais, o agente citotóxico é um taxol, um maitansinoide, tal como DM1 ou DM4, CC-1065 ou um análogo de CC- 1065. Em modalidades preferenciais, os agentes de ligação celular da pre- sente invenção são covalentemente ligados, diretamente ou através de um Iigador clivável ou não-clivável, ao agente citotóxico.

Em outra modalidade, o anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação ao epitopo do mesmo pode ser conjugado a um fármaco, tal como um maitansinoide, para formar uma pró-fármaco que tem citotoxicidade es- pecífica em direção a células que expressam o antígeno pelo direcionamen- to do fármaco a um ligante, tal como o antígeno C242 (CD44/CanAg). Con- jugados citotóxicos compreendem tais anticorpos e um fármaco pequeno, altamente tóxica (por exemplo, maitansinoides, taxanos, e análogos de CC- 1065) podem ser usados como um terapêutico para tratamento de tumores, tais como tumores de mama e ovarianos.

Dessa maneira, em uma modalidade, a variante do anticorpo do anticorpo parental produzida de acordo com os ensinamentos da presente invenção pode ser usada para a terapia direcionada como anticorpos desco- bertos ou como anticorpos que atuam como agentes de ligação celular. Agentes Citotóxicos.

O agente citotóxico usado no conjugado citotóxico da presente invenção pode ser qualquer composto que resulta na morte de uma célula, ou induza morte celular, ou de alguma maneira reduza a viabilidade celular. Agentes citotóxicos preferenciais incluem, por exemplo, maitansinoides e análogos de maitansinoide, taxoides, CC-1065 e análogos de CC-1065, do- Iastatina e análogos de dolastatina, definidos abaixo. Estes agentes citotóxi- cos são conjugados aos anticorpos, fragmentos de anticorpos, equivalentes funcionais, anticorpos melhorados e seus análogos como descrito neste pe- dido.

Os conjugados citotóxicos podem ser preparados por métodos in vitro. A fim de ligar um fármaco ou pró-fármaco ao anticorpo, um grupo de ligação é usado. Os grupos de ligação adequados são bem conhecidos na técnica e incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos ácido-lábeis, gru- pos fotolábeis, grupos peptidase-lábeis e grupos esterase-lábeis. Os grupos de ligação preferenciais são grupos dissulfeto e grupos tioéter. Por exemplo, conjugados podem ser construídos usando uma reação de troca de dissulfe- to ou pela formação de uma ligação tioéter entre o anticorpo e o fármaco ou pró-fármaco. Maitansinoides Entre os agentes citotóxicos que podem ser usados na presente invenção para formar um conjugado citotóxico são maitansinoides e análo- gos de maitansinoide. Exemplos de maitansinoides adequados incluem mai- tansinol e análogos de maitansinol. Maitansinoides são fármacos que inibem a formação de microtúbulo e que são altamente tóxicas a células de mamífe- ros.

Exemplos de análogos de maitansinol adequados incluem os que têm um anel aromático modificado e os que têm modificações em outras posições. Exemplos de alguns maitansinoides adequados são revelados em Patente U.S. Nos. 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; e 5.846.545.

Exemplos específicos de análogos adequados de maitansinol que têm um anel aromático modificado incluem: (1) C-19-decloro (Patente U.S. N0 4.256.746) (preparado por re-

dução de LAH de ansamitocina P2);

(2) C-20-hidróxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patente U.S. Nos 4.361.650 e 4.307.016) (preparado por demetilação usando Streptomy- ces ou Actinomyces ou declorinação usando LAH); e (3) C-20-demetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-decloro (Patente

U.S. N0 4.294.757) (preparado por acilação usando cloretos de acila).

Exemplos específicos de análogos de maitansinol adequados que têm modificações de outras posições incluem:

C-9-SH (Patente U.S. N0 4.424.219) (preparado pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5);

C-14-alcoximetil (demetóxi/CH20R) (Patente U.S. N0 4.331,

598);

C-14-hidroximetil ou aciloximetil (CH20H ou CH20Ac) (Patente U.S. N0 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia); C-15-hidróxi/acilóxi (Patente U.S. N0 4.364.866) (preparado pela

conversão de maitansinol por Streptomyces);

C-15-metóxi (Patente U.S. Nos 4.313.946 e 4.315.929) (isolado a partir de Trewia nudiflora);

C-18-N-demetil (Patente U.S. Nos 4.362.663 e 4.322.348) (pre- parado através da demetilação de maitansinol por Streptomyces); e

4,5-desóxi (Patente U.S. N0 4.371.533) (preparado através da tricioreto de titânio/ redução LAH de maitansinol).

Em uma modalidade preferencial, os conjugados citotóxicos da presente invenção utilizam maitansinoide DM1 que contém tiol, formalmente denominado N2-desacetil-N2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como o agente citotóxico. DM1 é representado pela seguinte fórmula estrutural (l):L(l).

Em outra modalidade preferencial, os conjugados citotóxicos da presente invenção utilizam o maitansinoide DM4 que contém tiol, formalmen- te denominado N2 -desacetil-N-2 (4-metil-4-mercapto-1 -oxopentil)-maitansina como o agente citotóxico. DM4 é representado pela seguinte fórmula (II) es- trutural:

Em modalidades adicionais da invenção, outras maitansinas, incluindo maitansinoides que contêm tiol e dissulfeto carregando uma substi- tuição mono- ou dialquila do átomo de carbono que carrega o átomo de en- xofre, podem ser usadas. Estas incluem um maitansinoide que têm, no C-3, C-14 hidroximetil, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetil, uma cadeia lateral de ami- noácido acilada com um grupo acila carregando um grupo sulfidrila impedi- do, em que o átomo de carbono do grupo acila carregando a função tiol tem um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aro- mático heterocíclico ou heterocicloalquila, e ainda em que um dos substituin- tes pode ser H, e em que o grupo acila tem um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a função carbonila e o átomo de enxofre.

Tais maitansinas adicionais incluem compostos representados

pela fórmula (III):

0

em que:

Y' representa

R1R2SZ, em que:

R1 e R2 são cada um independentemente alquila ou alquenila linear ou ramificada tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substi- tuída ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila, e, além disso, R2 pode ser H;

A, B, D são cicloalquilas ou cicloalquenilas tendo de 3 a 10 áto- mos de carbono, arila simples ou substituída ou radical aromático heterocí- clico ou heterocicloalquila;

R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, e R12 são cada um in- dependentemente H, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou hete- 10

15

20

25

rocicloalquila;

I, m, η, o, ρ, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s, t e u não sejam zero a qualquer momento; e

Z é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aro- mático heterocíclico ou heterocicloalquila.

Modalidades preferenciais da fórmula (III) incluem compostos da fórmula (III) em que:

R1 é metila, R2 é H e Z é H.

R1 e R2 são metila e Z é H.

R1 é metila, R2 é H, e Z é -SCH3.

R1 e R2 são metila, e Z é -SCH3.

Tais maitansinas adicionais também incluem compostos repre- sentados pela fórmula (IV-L), (IV-D), ou (IV-D1L):

<JV-D,L)

em que:

Y1 representa (CR7R8)1(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ,

em que:

R1 e R2 são cada um independentemente alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radi- cal aromático heterocíclico ou heterocicloalquila, e além disso R2 pode ser H;

R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou al- quenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, feni- la substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila; I, m e η são cada um independentemente um número inteiro de um a 5, e além disso η pode ser 0;

Z é H, SR ou -COR em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aro- mático heterocíclico ou heterocicloalquila; e

Pode representar um maitansinoide que carrega a cadeia lateral em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi ou C-20 desmetila.

Modalidades preferenciais de fórmulas (IV-L), (IV-D) e (IV-D1L) incluem compostos de fórmulas (IV-L)1 (IV-D) e (IV-D1L) em que: R1 é metila, R2 é H1 R5, R6, R7, e R8 são cada um H, I e m são cada um 1, η é 0, Z é H.

R1 e R2 são metila, R5, R6, R7, R8 são cada um H1 I e m são 1, η é O1 e Z é H.

R1 é H1 R2 é metila, R5, R6, R7, e R8 são cada um H1 I e m são

cada um 1, η é O1 e Z é -SCH3.

o,

N

Y

ψ \ ρ ò

......l!

Ò

Y em que

Y representa (CR7R8)1(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, em que:

R1 e R2 são cada um independentemente alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radi- cal aromático heterocíclico ou heterocicloalquila, e além disso R2 pode ser H;

R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou al- quenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, feni- la substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila;

I, m e η são cada um independentemente um número inteiro de de 1 a 5, e além disso η pode ser 0; e

Modalidades preferenciais da fórmula (V) incluem compostos da fórmula (V) em que:

R1 é metila, R2 é H, R5, R6, R7, e R8 são cada um Η; I e m são

cada um 1; η é 0; e Z é H.

R1 e R2 são metila; R5, R6, R7, R8 são cada um Η, I e m são 1; η é 0; e Z é H.

R1 é metila, R2 é H, R5, R6, R7, e R8 são cada um Η, I e m são cada um 1, η é 0, eZé-SCH3.

R1 e R2 são metila, R5, R6, R7, R8 são cada um Η, I e m são 1, η é 0, e Z é -SCH3.

Tais maitansinas adicionais incluem ainda compostos represen- tados pela fórmula (Vl-L), (Vl-D), ou (VI-D1L) H;,C*\X. Λ^Χ X3CX.

r^r ^ ^v May [ι * T Wa/ ^ ^

O1 O1 o

(VJ-L) (VI-D) (VI-D, L)

em que:

Y' representa

(CRjRiH)I(CRi)=CR !«^(C^CXjAOÍCR.Í R6)mDa(CR 11 =CR \ 2)r(C~C' )3i(CR R+),»(* RjR3SZ. em que:

A, B, D são cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila;

R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, e R12 são cada um in- dependentemente H, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou hete- rocicloalquila;

I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s, t e u não sejam zero a qualquer momento; Z é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo

de 1 a 10 átomos de carbono , alquila ou alquenila ramificada ou cíclica ten- do de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila; e

Pode ser um maitansinoide. Modalidades preferenciais da fórmula (VI) incluem compostos da fórmula (VI) em que:

R1 é metila, R2 é H e Z é H. R1 e R2 são metila e Z é H. R1 é metila, R2 é H, e Z é -SCH3. R1 e R2 são metila, e Z é -SCH3.

Os maitansinoides supracitados podem estar conjugados ao an- ticorpo anti-C242 variante A70D; Q45K/R; D26G; K46E; K46E/T89V; K46E/K82S; K46E/E16A/D26G; A70D/K46E/T89V; K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G; A70D/K46E; Q45K(R)/K46E/T89V; A70D/D26G; Q45K(R)/K46E; A70D/K46E/D26G; Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G ou um homólogo ou fragmento do mesmo, em que o anticorpo é ligado ao maitansinoide utilizando funcionalidade tiol ou dissulfe- to que está presente no grupo acila de uma cadeia lateral de aminoácido acilado encontrada em C-3, C-14 hidroximetil, C-15 hidróxi ou C-20 desmetil do maitansinoide, e em que o grupo acila do cadeia lateral do aminoácido acilado tem sua funcionalidade tiol ou de dissulfeto localizada em um átomo de carbono que tem um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo alqui- Ia ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alqueni- Ia ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila, e além disso um dos substituintes pode ser H, e em que o grupo acila tem um com- primento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade carbonila e o átomo de enxofre.

Um conjugado preferencial da presente invenção é aquele com- preendendo a variante A70D; Q45K/R; D26G; K46E; K46E/T89V; K46E/K82S; K46E/E16A/D26G; A70D/K46E/T89V; K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G; A70D/K46E; Q45K(R)/K46E/T89V; A70D/D26G; Q45K(R)/K46E; A70D/K46E/D26G; Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G ou um homólogo ou fragmento da mesma, conjugado a um maitansinoide da fórmula (VIII): em que:

Y1' representa

R ι Rj>S·, em que:

R1 e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substi- tuída ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila, e, além disso, R2 pode ser H;

A, B, D são cada um independentemente cicloalquila ou cicloal- quenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila;

I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s, t e u não sejam zero a qualquer momento; Preferencialmente, R1 é metila, R2 é H ou R1 e R2 são metila. Um conjugado ainda mais preferencial da presente invenção é aquele que compreende o anticorpo anti-C242 variante A70D; Q45K/R D26G; K46E; K46E/T89V; K46E/K82S; K46E/E16A/D26G A70D/K46E/T89V; K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G A70D/K46E; Q45K(R)/K46E/T89V; A70D/D26G; Q45K(R)/K46E A70D/K46E/D26G; Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G ou um homólogo ou fragmento do mesmo, conjugado a um maitansinoide de fórmula (IX-L), (IX-D)1 ou (IX-D1L)

H^/ f ΗΛ/ f H^H I

o χ JL o. ^C A JK J^. Jl^

Mayx Vv^Y5 May Y> Yl May7 V^n^y,

Al o 1

IX-L IX-D IX-DX

em que

Y1 representa (CR7R8)1 (CR5R6)m(CR3R4)nCR1 R2S-, em que:

R1 e R2 são cada um independentemente alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radi- cal aromático heterocíclico ou heterocicloalquila, e, além disso, R2 pode ser H;

R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou al- quenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, feni- la substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocicloalquila; I, m e η são cada um independentemente um número inteiro de

1 a 5, e além disso η pode ser 0; e

Pode representar um maitansinol que carrega a cadeia lateral em C-3, C-14 hidroximetil, C-15 hidróxi ou C-20 desmetil.

Modalidades preferenciais de fórmulas (IX-L), (IX-D) e (IX-D1L) incluem compostos de fórmulas (IX-L), (IX-D) e (IX-D1L) em que: R1 é metila, R2 é H, ou R1 e R2 são metila. R1 é metila, R2 é H; R5, R6, R7, R8 são cada um Η, I e m são 10

cada um 1; η é 0,

R1 e R2 são metila; R5, R6, R7, e R8 são cada um Η, I e m são

1, η é 0.

Preferencialmente o agente citotóxico é representado pela fór- mula (IX-L).

Um conjugado adicional preferencial da presente invenção é a-

quele que compreende o anticorpo anti-C242 variante A70D; Q45K/R; D26G

K46E; K46E/T89V; K46E/K82S; K46E/E16A/D26G; A70D/K46E/T89V

K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G; A70D/K46E

Q45K(R)/K46E/T89V; A70D/D26G; Q45K(R)/K46E; A70D/K46E/D26G

Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G ou um homólogo ou fragmento do

mesmo, conjugados a um maitansinoide da fórmula (X):

o

Q

Of \

0

MeO

N

O

\/V \

o-

NH O

(X)

em que os substituintes são como definidos para a fórmula (IX) acima.

Um conjugado adicional preferencial da presente invenção é a- quele que compreende o anticorpo anti-C242 variante A70D; Q45K/R; D26G K46E; K46E/T89V; K46E/K82S; K46E/E16A/D26G; A70D/K46E/T89V K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G; A70D/K46E Q45K(R)/K46E/T89V; A70D/D26G; Q45K(R)/K46E; A70D/K46E/D26G Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G ou um homólogo ou fragmento do mesmo, conjugados a um maitansinoide da fórmula (XI): May

N

O

Λ

γ- May'

/

,0

May'

κ

,0

(Xf-U

0

0 (XI-D)

ο

(XI-D, Κ)

em que os substituintes são como definidos para a fórmula (VIII) acima.

Especialmente preferenciais são quaisquer compostos descritos acima, em que R1 é H1 R2 é metila, R5, R6, R7 e R8 são cada um Η, I e m são cada 1, e η é 0.

Além disso, especialmente preferenciais são quaisquer dos compostos descritos acima, em que R1 e R2 são metila, R5, R6, R7, R8 são cada um Η, I e m são 1, e η é 0.

Além disso, o estereoisômero L-aminoacila é preferencial.

Exemplos de alquilas ou alquenilas lineares tendo de 1 a 10 á- tomos de carbono incluem, mas não são limitados a, metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, propenila, butenila e hexenila.

Exemplos de alquilas ou alquenilas ramificadas tendo de 3 a 10 átomos de carbono incluem, mas não são limitados a, isopropila, isobutila, sec-butila, terc-butila, isopentila, 1-etil-propila, isobutenila e isopentenila.

Exemplos de alquilas ou alquenilas cíclicas tendo de 3 a 10 áto- mos de carbono incluem, mas não são limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclopentenila, e ciclo-hexenila.

Arilas simples incluem arilas que têm de 6 a 10 átomos de car- bono, e arilas substituídas incluem arilas que têm de 6 a 10 átomos de car- bono que carregam pelo menos um substituinte alquila que contêm de 1 a 4 átomos de carbono, ou substituinte alcóxi, tal como metóxi, etóxi, ou um substituinte halogênio ou um substituinte nitro.

Exemplos de arila simples que contêm de 6 a 10 átomos de car- bono incluem o fenila e naftila.

Exemplos de arila substituída incluem nitrofenil, dinitrofenil.

Radicais aromáticos heterocíclicos incluem grupos que têm a- néis de 3 a 10 membros contendo um ou dois heteroátomos selecionados de Ν, O ou S. Radicais heterocicloalquila incluem compostos cíclicos, compre- endendo sistemas de anéis de 3 a 10 membros, contendo um ou dois hete- roátomos, selecionados de N1 O, ou S.

Exemplos de radicais aromáticos heterocíclicos incluem piridila, nitro-piridila, pirolila, oxazolila, tienila, tiazolila, e furila.

Exemplos de radicais heteroalquila incluem di-hidrofurila, tetra- hidrofurila, tetra-hidropirolila, piperidinila, piperazinila, e morfolino.

Cada um dos maitansinoides ensinados em Patente U.S. N. 7.276.497 também podem ser usados no conjugado citotóxico da presente invenção. A revelação inteira de Patente U.S. N. 7.276.497 é incorporada neste pedido por referência. Grupos de ligação contendo dissulfeto

A fim de ligar o maitansinoide a um anticorpo, tal como o anti- corpo anti C242 variante A70D; Q45K/R; D26G; K46E; K46E/T89V: K46E/K82S; K46E/E16A/D26G; A70D/K46E/T89V; K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G; A70D/K46E; Q45K(R)/K46E/T89V: A70D/D26G; Q45K(R)/K46E; A70D/K46E/D26G; Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G, o maitansinoide compreende uma porção de ligação. A porção de ligação contém uma ligação química que leva em conta a Iibe- ração de maitansinoides totalmente ativos em um determinado sítio. Liga- ções químicas adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem liga- ções dissulfeto, ligações ácido-lábeis, ligações fotolábeis, ligações peptida- se-lábeis e ligações esterase-lábeis. São preferenciais ligações dissulfeto.

A porção de ligação também compreende um grupo químico rea- tivo. Em uma modalidade preferencial, o grupo químico reativo pode estar covalentemente ligado ao maitansinoide através de uma porção de ligação ligada ao dissulfeto.

Grupos químicos reativos particularmente preferenciais são éste- res de N-succinimidila e ésteres de N-sulfossuccinimidila. Maitansinoides particularmente preferenciais compreendendo

uma porção de ligação que contém um grupo químico reativo são ésteres C- 3 de maitansinol e seus análogos onde a porção de ligação contém uma Ii- gação dissulfeto e o grupo reativo químico compreende um éster de N- succinimidila ou N-sulfossuccinimidila.

Muitas posições em maitansinoides podem servir como a posi- ção para ligar-se quimicamente a porção de ligação. Por exemplo, a posição C-3 tendo um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com hidróxi e a posição C-20 tendo um grupo hidróxi são todos esperados a serem úteis. Entretanto, a posição C-3 é pre- ferencial e a posição C3 de maitansinol é especialmente preferencial.

Enquanto a síntese de ésteres de maitansinol que tem uma por- ção de ligação é descrita quanto a porções de ligação contendo ligação dis- sulfeto, um versado na técnica entenderá que porções de ligação com outras ligações químicas (como descrito acima) também podem ser usadas com a presente invenção, como podem outros maitansinoides. Exemplos específi- cos de outras ligações químicas incluem ligações ácido-lábeis, ligações foto- lábeis, ligações peptidase-lábeis e ligações esterase-lábeis. A descrição de Patente U.S. N. 5.208.020, incorporado neste pedido, ensina a produção de maitansinoides carregando tais ligações.

A síntese de maitansinoides e derivados de maitansinoides que têm uma porção dissulfeto que carrega um grupo reativo são descritos em Patente U.S. N0S 6.441.163 e 6.333.410, e Patente U.S. Publication No. 2003-0055226 A1, cada uma dos quais é neste pedido incorporado por refe- rência.

Os maitansinoides contendo grupo reativo, tal como DM1, são reagidos com um anticorpo anti-C242 variante A70D; Q45K/R; D26G; K46E; K46E/T89V; K46E/K82S; K46E/E16A/D26G; A70D/K46EAT89V; K46E/D26G; K46E/K82S/D26G; K46E/T89V/D26G; A70D/K46E; Q45K(R)/K46E/T89V; A70D/D26G; Q45K(R)/K46E; A70D/K46E/D26G; Q45K(R)/D26G; Q45K(R)/K46E/D26G, para produzir conjugado citotóxico. Estes conjugados podem ser purificados por HPLC ou porfiltração em gel. Vários esquemas excelentes para produção de tais conjugados

anticorpo-maitansinoide são fornecidos em Patente U.S. Nos. 6.333.410, 6.411.163 e 6.716.821 e Patente U.S. No. 2003-0055226 Al, cada um dos quais é incorporado neste pedido em sua totalidade.

Em geral, uma solução de um anticorpo em tampão aquoso po- de ser incubada com um excesso molar de maitansinoides tendo uma por- ção de dissulfeto que porta um grupo reativo. A mistura de reação pode ser extinta pela adição de amina em excesso (tal como etanolamina, taurina, etc.). O conjugado maitansinoide-anticorpo então pode ser purificado pela filtração em gel.

O número de moléculas maitansinoides ligadas por molécula de anticorpo pode ser determinado medindo espectrofotometricamente a faixa da absorvância em 252 nm e 280 nm. Uma média de 1 a 10 de moléculas de maitansinoides/ molécula de anticorpo é preferencial.

Conjugados de anticorpos com fármacos maitansinoides podem ser avaliados pela sua capacidade de suprimir a proliferação de várias linha- gens celulares não desejadas in vitro. Por exemplo, linhagens celulares, tais como a linhagem de carcinoma epidermóide humano A-431, a linhagem ce- lular de câncer de pulmão de pequenas células humano SW2, a linhagem de tumor de mama humana SKBR3 e a linhagem de Iinfoma de Burkitt Namal- wa podem ser facilmente usadas para a avaliação de citotoxicidade destes compostos. Células a serem avaliadas podem ser expostas aos compostos durante 24 horas e as frações de sobrevivência das células medidas em en- saios diretos por métodos conhecidos. Valores de IC50 podem então ser calculados a partir dos resultados dos ensaios. Grupos de ligação contendo PEG

Maitansinoides também podem ser ligados a anticorpos usando grupos de ligação PEG, como apresentado em U.S Patent No. 6.716.821. Estes grupos de ligação de PEG são solúveis tanto na água como em sol- ventes não-aquosos, e podem ser usados para juntar um ou mais agentes citotóxicos a um agente de ligação celular. Exemplos de grupos de ligação a PEG incluem Iigantes de PEG hetero-bifuncionais que se ligam a agentes citotóxicos e agentes de ligação celular em extremidades opostas dos Iigan- tes através de um grupo funcional sulfidrila ou dissulfeto em uma extremida- de, e um éster ativo em outra extremidade. Como um exemplo geral da síntese de um conjugado citotóxico utilizando um grupo de ligação a PEG1 referência é novamente feita a U.S Patent. 6.716.821 para detalhes específicos. A síntese começa com a rea- ção de um ou mais agentes citotóxicos que portam uma porção de PEG rea- tiva com um anticorpo, resultando no deslocamento do éster ativo terminal de cada porção de PEG reativa por um resíduo de aminoácido do anticorpo, para render um conjugado citotóxico compreendendo um ou mais agentes citotóxicos covalentemente ligados a um anticorpo através de um grupo de ligação a PEG. Outros grupos de ligação

Conjugados de maitansinoide compreendendo Iigadores não- cliváveis são descritos em Patente U.S. N0 2005-0169933 Al, a descrição inteira do qual é incorporada neste pedido por referência. Taxanos

O agente tóxico usado nos conjugados citotóxicos de acordo

com a presente invenção também pode ser um taxano ou derivados do mesmo.

Taxanos são uma família de compostos que inclui paclitaxel (Ta- xol), um produto natural citotóxico, e docetaxel (Taxotere), um derivado se- missintético, dois compostos que são largamente usados no tratamento de câncer. Taxanos são toxinas para o fuso mitótico que inibem a despolimeri- zação da tubulina, resultando em morte celular. Enquanto docetaxel e pacli- taxel são agentes úteis no tratamento de câncer, a sua atividade antitumoral é limitada por causa da sua toxicidade não-específica em relação a células normais. Além disso, os compostos como os próprios paclitaxel e docetaxel não são suficientemente potentes para serem usados em conjugados de agentes de ligação celular.

Um taxano preferencial para uso na preparação de conjugados citotóxicos é o taxano da fórmula (XI): O 0 S/? ON

SL λ

O NH O

H λ^Ο

0Η 5 OAC JaQ

MeO-<\ //-OMe

(Xi)

Métodos para sintetizar taxanos exemplares que pode ser usa- dos nos conjugados citotóxicos da presente invenção, junto com métodos para conjugar os taxanos a agentes de ligação celular, tais como anticorpos, são descritos detalhadamente em Patente U.S. Nos. 5.416.064, 5.475.092, 6.340.701, 6.372.738. 6.436.931, 6.596.757, 6.706.708 e 6.716.821 e em Patente U.S. No. 2004-0024049 Al. Análogos CC-1065

O agente tóxico usado nos conjugados citotóxicos de acordo com a presente invenção também pode ser CC-1065 ou derivado do mesmo. CC-1065 é um antibiótico antitumoral potente isolado a partir do

caldo de cultura de Streptomyces zelensis. CC-1065 é aproximadamente 1000 vezes mais potente in vitro do que são os fármacos anti-câncer comu- mente usados, tais como doxorrubicina, metotrexato e vincristina (B.K. Bhu- yan e outros, Câncer Res., 42, 3532-3537 (1982)). Exemplos não-restritivos de CC-1065 e seus análogos adequados para uso na presente invenção são descritos em Patente U.S. N°s 6.372.738, 6.340.701, 5.846.545 e 5.585.499.

A potência citotóxica do CC-1065 foi correlacionada com sua atividade alquilante e sua atividade de ligação ao DNA ou intercalante de DNA. Estas duas atividades residem em partes separadas da molécula. Dessa maneira, a atividade alquilante é contida na subunidade ciclopropapir- roloindol (CPI) e a atividade de ligação ao DNA reside em duas subunidades pirroloindol.

Embora CC-1065 tenha certas características atraentes como um agente citotóxico, tem limitações no uso terapêutico. Administração de CC-1065 a camundongos causou uma hepatotoxicidade retardada levando a mortalidade no dia 50 após uma dose intravenosa única de 12,5 □ Mg/kg {V.L. Reynolds e al.. J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)}. Isto estimulou es- forços para desenvolver análogos que não causam a toxicidade retardada, e a síntese de análogos mais simples modelados no CC-1065 foram descritas {M.A. Warpehoski e outros, J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)}.

Em outra série de análogos úteis na presente invenção, a porção CPI foi substituída por uma porção ciclopropabenzindol (CBI) {D.L. Boger e outros, J. Org. Chem., 55, 5823-5833, (1990), D.L. Boger e outros, BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)}. Estes compostos mantêm a alta po- tência in vitro do fármaco parental, sem causar a toxicidade retardada em camundongos. Como CC-1065, estes compostos são agentes alquilantes que se ligam ao sulco menor do DNA de uma maneira covalente para causar a morte celular. Entretanto, a avaliação clínica dos análogos mais promisso- res, Adozelesin e Carzelesin, têm levado a resultados decepcionantes {B.F. Foster e outros, Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996); I. Wolff e outros, Clin. Câncer Res., 2,1717-1723 (1996)}. Estos fármacos apresentam baixos efeitos terapêuticos por causa da sua alta toxicidade sistêmica.

A eficácia terapêutica dos análogos de CC-1065 pode ser muito melhorada pela modificação pela distribuição in vivo através da entrega dire- cionada ao sítio tumoral, resultando em menor toxicidade para tecidos não- direcionados, e dessa maneira, menor toxicidade sistêmica. A fim de alcan- çar este objetivo, conjugados de análogos e derivados de CC-1065 com a- gentes de ligação celular que visam especificamente células tumorais foram descritos {US Patents; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545}. Estes conjugados tipicamente apresentam alta citotoxicidade alvo específica in vitro, e excep- cional atividade antitumoral em modelos de xenoenxerto de tumor humano em camundongos {R.V. J. Chari e outros, Câncer Res., 55, 4079-4084 (1995)}.

Os métodos para sintetizar análogos de CC-1065 que podem ser usados nos conjugados citotóxicos da presente invenção, junto com méto- dos para conjugar os análogos a agentes de ligação celular, tais como anti- corpos, são descritos detalhadamente em Patente U.S. Nos. 5.475.092, 5.846.545, 5.585.499, 6.534.660, 6.586.618 e 6.756.397 e no Pedido de Pa- tente U.S. N0 2003-0195365 A1. Outros fármacos

Fármacos, tais como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, caliqueamicina, tubulisina e análogos de tubulisina, duocarmicina e análogos de duocarmici- na, dolastatina e análogos de dolastatina, tais como auristatinas e análogos, são também adequados para a preparação de conjugados da presente in- venção. As moléculas de fármaco também podem ser ligadas às moléculas de anticorpos através de uma molécula veículo intermediária, tal como al- bumina sérica. Compostos Doxarrubicina e Danorrubicina, como descritos, por exemplo, em Série U.S. N0 09/740991, também podem ser agentes cito- tóxicos úteis. Estes fármacos também podem ser usados para a coterapia como discutido abaixo. Coterapia

A frase "terapia de combinação" (ou "coterapia"), significa o uso de um anticorpo variante, tal como uma variante do anticorpo huC242, um agente quimioterápico, ou um imunotoxina, e é destinada incluir administra- ção de cada agente em uma maneira seqüencial em um regime que fornece- rá efeitos benéficos da combinação de fármacos. Coterapia é destinada da mesma forma para incluir a coadministração destes agentes em uma manei- ra simultânea substancialmente, tal como pela ingestão de uma dosagem única que tem uma proporção fixada destes agentes ativos ou ingestão de múltiplos medicamentos, separados de cada agente. "Terapia de combina- ção" também inclui a administração simultânea ou seqüencial por via intra- venosa, intramusculares ou outra parenteral, no corpo, inclusive a absorção direta através tecidos membranosos de mucosas, como encontrado nas passagens dos seios. Administração seqüencial também inclui combinações de fármacos onde os elementos individuais podem ser administrados em tempos diferentes e/ou por vias diferentes mas que atuam em combinação para fornecer um efeito benéfico.

A frase "terapeuticamente eficaz" é destinada a qualificar a quantidade de cada agente para uso na terapia de combinação que alcança- rá o objetivo de melhorar a redução ou prevenção tumoral, por exemplo, a progressão de tumores, evitando efeitos colaterais adversos tipicamente as- sociados com cada agente.

Uma terapia de combinação preferencial consistiria essencial-

mente em dois ou mais agentes ativos, ou seja, um anticorpo huC242 vari- ante descoberto ou um conjugado do mesmo e outro agente selecionado de uma imunotoxina, um agente quimioterápico, um imunomodulador ou um anticorpo, que se diferencia do anticorpo variante. Os agentes seriam usa- dos em combinação em uma faixa de variação de peso de aproximadamente 0,5 para um a aproximadamente vinte para um do anticorpo descoberto ou conjugado do mesmo a qualquer um dos outros agentes. Uma faixa prefe- rencial destes dois agentes seria de aproximadamente um para um a apro- ximadamente quinze para um, enquanto uma faixa mais preferencial seria de aproximadamente um para um a aproximadamente cinco para um, depen- dendo no final da seleção do anticorpo ou conjugado e qualquer um dos ou- tros agente. Dependendo das necessidades do paciente, a proporção do anticorpo ou conjugado do mesmo, e outro agente também pode ser inverti- da. Por exemplo, após o tratamento inicial, se um paciente é encontra-se mais responsivo a uma dose maior de um dos outros agentes quando com- parado ao anticorpo descoberto variante ou um conjugado do mesmo, um provedor de tal medicação pode trocar a proporção para fazer o tratamento mais eficaz. A preparação de imunotoxinas é geralmente bem conhecida na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. N0 4.340.535, incorporado neste pedido por referência). Cada uma das seguintes patentes e pedidos de pa- tentes são incorporados neste pedido por referência para os efeitos ainda mais completos dos presentes ensinamentos quanto à geração, purificação e uso da imunotoxina: U.S. Pat. Nos. 5.855.866; 5.776.427; 5.863.538; 6.004.554; 5.965.132; 6.051.230; e 5.660.827; e U.S. Application Ser. No. 07/846.349.

Anticorpos variante, tais como uma variante de huC242, também podem estar ligados diretamente ou indiretamente a um imunomodulador. Entre os modificadores de resposta biológica (tais como um imunomodulado- res) que de algum modo pode aumentar a destruição do tumor pelo anticor- po desta invenção estão incluídos linfocinas, tais como: Fator de Necrose Tumoral, Fator de Ativação de Macrófago, Fator de Estimulação de Colônia, Interferons, etc.

Quando a coterapia envolve um complexo injetável, pode com- preender ainda um agente terapêutico selecionado do grupo composto de hormônios, immunossupressores, antibióticos, citostáticos, diuréticos, agen- tes gastrintestinais, agentes cardiovasculares, agentes anti-inflamatórios, analgésicos, anestésicos locais, e um agente neurofarmacológico, em que estes agentes são administrados para reduzir o risco de qualquer efeito cola- teral.

Composição Terapêutica

A invenção também refere-se a uma composição terapêutica para tratamento de um distúrbio hiperproliferativa em um mamífero que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo vari- ante da invenção e veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalida- de, a composição farmacêutica é para o tratamento de câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, ovário, cérvice e órgãos linfáticos, os- teossarcoma, carcinoma sinovial, um sarcoma ou um carcinoma na qual Ca- nAg está expresso, e ainda outros cânceres para serem determinados no quais CanAg está predominantemente expresso. Em outra modalidade, a composição farmacêutica refere-se ao tratamento de outros distúrbios tais como, por exemplo, doenças autoimunes, tais como Iupus sistêmico, artrite reumatóide, e esclerose múltipla; rejeições a enxerto, tais como rejeição a transplante renal, rejeição a transplante de fígado, rejeição a transplante de pulmão, rejeição a transplante cardíaco, e rejeição a transplante de medula óssea; doença do enxerto contra o hospedeiro; infecções virais, tais como infecção por mV, infecção por HIV, AIDS, etc.; e infecções parasitárias, tais como giardíase, amebíase, esquistossomose, e outros como determinadas por um versado na técnica ordinária.

A invenção imediata fornece composições farmacêuticas com- preendendo:

uma quantidade eficaz de um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo da presente invenção, e

um veículo farmaceuticamente aceitável, que pode ser inerte ou fisiologicamente ativo.

Como usado neste pedido, "veículos farmaceuticamente aceitá- veis" incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimen- tos, agentes antibacterianos e antifúngicos, e similares que são fisiologica- mente compatíveis. Exemplos dos veículos, excipientes e/ou diluentes ade- quados incluem um ou mais de água, solução salina, de solução salina tam- ponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e similares, bem como combi- nações dos mesmos. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes iso- tônicos, tais como açúcar, poliálcoois, ou cloreto de sódio na composição. Em particular, exemplos relevantes de veículos adequados incluem: (1) so- lução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, pH ~ 7,4, contendo ou não contendo aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albumina sérica huma- na, (2) solução salina a 0,9% (cloreto de sódio (NaCI) 0,9% p/v) e (3) dextro- se a 5% (p/v); e também pode conter um antioxidante, tal como triptamina e um agente estabilizante, tal como Tween 20.

As composições neste pedido também podem conter um agente terapêutico adicional, segundo a necessidade para um distúrbio particular que é tratado. Preferencialmente, o anticorpo variante ou fragmento de Iiga- ção a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e o anti- corpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo da presente invenção, e o composto ativo suplementar terão atividades complementares, que não afetam adversamente um ao outro. Em uma modalidade preferenci- al, o agente terapêutico adicional é antagonista do fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator tecidual (TF), proteína C, proteína S, fator de crescimento derivado da plaqueta (PDGF), ou receptor HER2. As composições da invenção podem estar em várias formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquida, semissólida, e sóli- da, mas a forma preferencial depende do modo desejado de administração e aplicação terapêutica. Composições típicas preferenciais estão na forma de soluções injetáveis ou infusíveis. O modo preferencial da administração é parenteral (por exemplo, intravenoso, intramuscular, intraperinoneal, subcu- tâneo). Em uma modalidade preferencial, as composições da invenção são administradas intravenosamente como um bolus ou pela infusão contínua durante o período do tempo. Em outra modalidade preferencial, são injeta- dos por via intramuscular, subcutâneo, intra-articular, intrassinovial, intratu- moral, peritumoral, intralesional, ou perilesional, para exercer efeitos tera- pêuticos locais bem como sistêmicos.

Composições estéreis para administração parenteral podem ser preparadas pela incorporação de anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e o anticorpo variante ou fragmento de ligação ao epitopo do mesmo da presente inven- ção na quantidade necessária no solvente apropriado, seguido pela esterili- zação por microfiltração. Como solvente ou veículo, pode ser usado água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e similares, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, poliálcoois, ou cloreto de sódio na composição. Estas composições também podem con- ter adjuvantes, em particular, agentes umectantes, isotonizantes, emulsifi- cantes, dispersantes e estabilizantes. Composições estéreis para adminis- tração parenteral também podem ser preparadas na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas no momento do uso em água estéril ou qualquer outro meio estéril injetável.

Anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e o anticorpo variante ou fragmen- to de ligação a epitopo do mesmo da presente invenção também podem ser administrados oralmente. Como composições sólidas para administração oral, pastilhas, pílulas, pós (cápsulas gelatinosas, sachês) ou grânulos po- dem ser usados. Nestas composições, o ingrediente ativo de acordo com a invenção é misturado com um ou mais diluentes inertes, tais como amido, celulose, sacarose, Iactose ou sílica, sob uma corrente de argônio. Estas composições também podem compreender substâncias com exceção de diluentes, por exemplo, um ou mais lubrificantes, tais como estearato de magnésio ou talco, um colorante, um revestimento (pastilha revestida de a- çúcar) ou um esmalte.

Como composições líquidas para administração oral, podem ser usadas soluções farmaceuticamente aceitáveis, suspensões, emulsões, xa- ropes e elixires contendo diluentes inertes, tais como água, etanol, glicerol, óleos vegetais ou óleo de parafina. Estas composições podem compreender substâncias com exceção de diluentes, por exemplo, produtos umectantes, adoçantes, espessantes, flavorizantes ou estabilizantes de produtos.

As doses dependem do efeito desejado, a duração do tratamen- to e a via da administração usada; estão geralmente entre 5 mg e 1000 mg por dia oralmente para um adulto com doses unitárias nos limites de 1 mg a 250 mg da substância ativa. Em geral, o médico determinará a dosagem a- propriada dependendo da idade, peso e quaisquer outros fatores específicos para o indivíduo a ser tratado. A melhoria ou os anticorpos variantes ou o conjugados dos

mesmos da presente invenção pode ser usado em formulações terapêuticas como um agonista ou antagonista que são preparados para armazenamento pela mistura das variantes ou dos conjugados dos mesmos que têm o grau desejado de pureza com opcionais veículos, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis, [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edi- tion, Osol, A. Ed. (1980); Pedido de Patente N°: 10/846.129], na forma de soluções aquosas ou formulações liofilizadas. Veículos, excipientes, ou es- tabilizadores aceitáveis são não-tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butila ou benzil álcool; parabenos de alquila, tal como parabeno de metila ou propila; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que aproximadamente 10 resíduos); proteí- nas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hi- drofílicos, tais como polivinilpilorridona; aminoácidos, tais como glicina, glu- tamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissaca- rídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agen- tes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, tre- halose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; comple- xos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônico, tal como TWEENPLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

As variantes também podem ser formuladas em lipossomos. Li- possomos que contêm a molécula do interesse são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como descritos em Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985); Hwang e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); e Patente U.S. Nos 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com o tempo de circulação aumentado são descritos em Patente U.S. No. 5.013.556.

Imunolipossomos particularmente úteis pode ser gerados pelo método de evaporação em fase reversa com uma composição lipídica com- preendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomas são expulsos através de filtros do tamanho de poro definido para produzir lipossomos com diâmetro desejado. Fragmen- tos Fab de um anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomos como descrito em Martin e outros, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) através de uma reação de permutação de dissulfeto. Um agente qui- mioterápico (tal como Doxorrubicina) é opcionalmente contido no lipossomo. Vide Gabizon e outros, J. National Câncer Inst. 81(19):1484(1989).

A formulação neste pedido também pode conter mais de um composto ativo como necessária para indicação particular que é tratada, pre- ferencialmente aquelas atividades complementares que não afetam adver- samente um ao outro. Tais moléculas estão presentes apropriadamente em combinação em quantidades que são eficazes para o objetivo desejado. Por exemplo, uma variante C242 ou um conjugado da mesma pode ser combi- nado com um agente coterapêutico, tal como, agente quimioterápico.

Os ingredientes ativos também podem ser capturadas em micro- cápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas coacervação ou por polime- rização interfacial, por exemplo, microcápsula de gelatina ou hidroximetilce- Iulose e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em siste- mas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macro- emulsões. Tais técnicas são descritas em Remington1S Pharmaceutical Sci- ences 16th edition. Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isto é prontamente executado pela filtração através de membranas de filtração estéreis, como discutido acima. Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas.

Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem ma- trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antago- nista, matrizes as quais estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis [por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)], polilactideos (Patente U.S. N0 3.773.919), co-polímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de etila, acetato de etileno vinil não- degradável, co-polímeros de ácido láctico ácido glicólico degradáveis, tais como o Lupron Depot™ (microesferas injetáveis compostas de co-polímero de ácido láctico ácido glicólico e acetato de leuprolída), e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico. Enquanto polímeros, tais como acetato de etileno vinil e ácido láctico ácido glicólico permitem a liberação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas de períodos do tempo menores. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo tem- po, podem desnaturar ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis modifica- ções na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto que é a formação de ligação S-S intermolecular através da permuta de tiodissuIfeto, a estabilização pode ser alcançada pela modificação dos resíduos sulfidrila, liofilização das soluções acídicas, controle da umidade do conteúdo, uso de aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas. Métodos Terapêuticos de Uso

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de inibição da atividade do antígeno C242 pela administração de um anticor- po que antagoniza a função de anti-CD44/CanAg (antígeno), a um paciente em necessidade do mesmo. Qualquer um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e o anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo da inven- ção, pode ser usado terapeuticamente. Em uma modalidade preferencial, os anticorpos variantes ou

fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou conjugado de um agente cito- tóxico e os anticorpos variantes ou epitopo dos mesmos de fragmentos de ligação da invenção estão usados para o tratamento de um distúrbio hiper- proliferativa em um mamífero. Em modalidade mais preferencial, uma das composições farmacêuticas descrita acima, e a qual contém um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epi- topo do mesmo da invenção, é usada para o tratamento de um distúrbio hi- perproliferativa em um mamífero. Preferencialmente, a distúrbio é câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, ovário, cérvice e órgãos linfá- ticos, osteossarcoma, carcinoma sinovial, um sarcoma ou uma carcinoma em que CanAg está expresso, e outros cânceres ainda para ser determina- dos no quais CanAg é predominantemente expresso. Em outra modalidade, dita que a composição farmacêutica refere-se a outros distúrbios tais como, por exemplo, doenças autoimunes, tais como Iupus sistêmico, artrite reuma- tóide, e esclerose múltipla; as rejeições a enxerto, tais como rejeição a transplante renal, rejeição a transplante de fígado, rejeição a transplante de pulmão, rejeição a transplante cardíaco, e rejeição a transplante de medula óssea; doença do enxerto contra o hospedeiro; infecções virais, tais como infecção por mV, infecção por HIV, AIDS, etc.; e infecções parasitárias, tais como giardíase, amebíase, esquistossomose, e outras como determinadas por um versado na técnica ordinária.

Similarmente, a presente invenção fornece um método para ini- bição do crescimento de populações celulares selecionadas compreendendo células contatantes com alvo, ou tecido contendo células alvo que expres- sam CanAg, com uma quantidade eficaz de um anticorpo variante ou frag- mento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente cito- tóxico e um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo da presente invenção, ou agente terapêutico compreendendo um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e um anticorpo variante ou fragmento de ligação a epi- topo do mesmo, sozinhos ou em combinação com outros agentes citotóxicos ou terapêuticos.

O método para inibição do crescimento de populações celulares selecionadas pode ser praticado in vitro, in vivo, ou ex vivo. Como usado neste pedido, "inibição do crescimento" significa reduzir a velocidade do crescimento de uma célula, reduzindo viabilidade celular, causando a morte de uma célula, Iisar uma célula e induzir morte celular, ao longo de um curto ou longo período de tempo.

Exemplos de usos in vitro incluem tratamentos de medula óssea autóloga antes do seu transplante no mesmo paciente a fim de matar células doentes ou malignas; tratamentos da medula óssea antes do seu transplante a fim de matar células T competentes e prevenir a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD); tratamentos das culturas celulares a fim de matar to- das as células exceto as variantes desejadas que não expressam o antígeno alvo; ou matar variantes que expressam antígeno indesejado. As condições de uso in vitro não-clínico são prontamente deter-

minadas por um versado na técnica.

[166] Exemplos de uso clínicos ex vivo são para remover células tumorais ou células linfóides da medula óssea antes do transplante autólogo no tratamento de câncer ou no tratamento de doença autoimune, ou para remover células T e outras células Iinfoides da medula óssea ou tecido autó- logo ou halogeneico antes do transplante a fim de prevenir a doença do en- xerto contra o hospedeiro (GVHD). O tratamento pode ser realizado como se segue. A medula óssea é coletada do paciente ou de outro indivíduo e então incubada em meio contendo soro ao qual é adicionado o anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agen- te citotóxico e o anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo da invenção. Faixas de concentração de aproximadamente 10 μΜ a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas em aproximadamente 370C. As condições exatas da concentração e o tem- po da incubação, isto é, a dose, são prontamente determinadas por um ver- sado na técnica. Após a incubação, as células de medula óssea são lavadas com meio contendo soro e devolvidas ao paciente pela infusão i.v. de acordo com métodos conhecidos. Em circunstâncias onde o paciente recebe outro tratamento, tal como um curso de quimioterapia ablativa ou irradiação do corpo total entre o tempo de coleta do tutano e a reinfusão das células trata- das, as células de tutano tratadas são armazenadas congeladas em nitrogê- nio líquido usando equipamento médico padrão.

Para uso clínico in vivo, o anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo ou um conjugado de um agente citotóxico e o anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo da invenção serão for- necidos como soluções que são testadas para esterilidade e para níveis de endotoxina. Exemplos de protocolos adequados de administração de conju- gado citotóxica são como se segue. Conjugados são dados semanalmente durante 4 semanas como um bolo i.v. cada semana. Doses em bolus são dadas em 50 a 100 ml da solução salina normal à qual 5 a 10 ml da albumi- na sérica humana podem ser adicionados. As dosagens serão 10Dpg a 1 g por administração, i.v. (faixa de 100 ng a 10 mg/kg por dia). Mais preferenci- almente, as dosagens variarão de 50 pg a 30 mg. Ainda mais preferencial- mente, as dosagens variarão de 1 mg a 20 mg. Após quatro semanas de tratamento, o paciente pode continuar a receber tratamento segundo uma base semanal. Protocolos clínicos específicos quanto a via de administra- ção, excipientes, diluentes, dosagens, tempos, etc. podem ser determinados por um versado na técnica como as garantias da situação clínica.

Diagnóstico

Os anticorpos ou os fragmentos de anticorpo da invenção tam- bém podem ser usados para detectar o antígeno C242(anti-CD44/CanAg) em uma amostra biológica in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, os anti- corpos C242 variantes da invenção são usados para determinar o nível de anti-CD44/CanAg em um tecido ou em células derivadas do tecido. Em uma modalidade preferencial, o tecido é um tecido doente. Em uma modalidade preferencial do método, o tecido é um tumor ou uma biópsia do mesmo. Em uma modalidade preferencial do método, um tecido ou uma biópsia do mes- mo é primeiro excisada de um paciente, e os níveis de anti-CD44/CanAg no tecido ou biópsia podem então ser determinados em um imunoensaio com os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção. O tecido ou biópsia do mesmo pode ser congelado ou fixado. O mesmo método pode ser usado para determinar outras propriedades do anti-CD44/CanAg, tais como sua modificação pós-traducional (por exemplo, glicolação), níveis de superfície celular, ou localização celular.

O método descrito acima pode ser usado para diagnosticar um câncer em um indivíduo que se sabe ou se suspeita ter câncer, em que o nível de CanAg medido no dito paciente é comparado com aquele de um indivíduo normal referência ou padrão. O dito método pode então ser usado para determinar se um tumor expressa CanAg, que pode sugerir que o tumor responderá bem ao tratamento com os anticorpos, fragmentos de anticorpo ou conjugados de anticorpo da presente invenção. Preferencialmente, o tu- mor é um câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, ovário, cérvice e órgãos linfáticos, osteossarcoma, carcinoma sinovial, um sarcoma ou um carcinoma em que CanAg está expresso, e outros cânceres ainda para serem determinados nos quais CanAg é predominantemente expresso.

A presente invenção fornece ainda para anticorpos monoclonais variantes, anticorpos variantes humanizados e fragmentos de ligação a epi- topo dos mesmos que são ainda marcados para uso em pesquisa ou aplica- ções diagnosticas. Em modalidades preferenciais, o marcador é um radio- marcador, um fluoróforo, um cromóforo, um agente de visualização ou um íon metálico.

Um método do diagnóstico é também fornecido no qual os ditos anticorpos marcados ou de fragmentos de ligação a epitopo dos mesmos são administrados a um indivíduo suspeitando ter câncer, e a distribuição do marcador no corpo do indivíduo é medida ou monitorada. Conjunto

A presente invenção também inclui conjuntos, por exemplo, compreendendo um conjugado citotóxico descrito e instruções para uso do conjugado citotóxico para morte de tipos particulares de célula. As instruções podem incluir instruções para uso dos conjugados citotóxicos in vitro, in vivo ou ex vivo.

Tipicamente, o conjunto terá um compartimento contendo o con- jugado citotóxico. O conjugado citotóxico pode estar em uma forma Iiofiliza- da, forma líquida, ou outra forma modificável para ser incluída em um con- junto. O conjunto pode também conter elementos adicionais necessários a prática do método descrito nas instruções no conjunto, tais como uma solu- ção esterilizada para reconstituição de um pó liofilizado, agentes adicionais para combinação com o conjugado citotóxico antes da administração a um paciente, e instrumentos que ajudam na administração do conjugado a um paciente.

Desenho da seqüência consenso

As seqüências consenso foram criadas pela marcação dos resí- duos presentes de cada posição no banco de dados de seqüência de anti- corpo murino de Kabat. Vários milhares de seqüências da região variável da cadeia leve e pesada foram alinhadas com o módulo CIustaIW na análise de seqüência e programa de manipulação de dados "Vector NTI" (um produto da Invitrogen Corp.). Vide também Lu G, Moriyama EN Vector NTI, a bal- anced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform. 2004 Dec;5(4):378-88. O alinhamento foi importado para uma planilha do Micro- soft Excel para calcular que resíduos foram mais freqüentemente encontra- dos em cada posição nos bancos de dados da região variável da cadeia leve e pesada murino e então emitiu os resultados como seqüências "consenso".

Em ocasião, consenso poderia ser dividido entre dois resíduos de aminoáci- do, em que o menor de dois aminoácidos conservados é escolhido para me- lhorar as propriedades biofísicas ou considerações de humanização de um anticorpo. Por exemplo, no caso imediato, na cadeia leve Q45 é substituída pelo R que não substitui o resíduo não-consenso com o resíduo consenso murino, que é K. Tais observações são evidentes para um versado na técni- ca sem experimentação indevida ou necessitando destes detalhes específi- cos.

O banco de dados de seqüência Kabat está comercialmente dis- ponível através da compra de uma licença. Além disso, milhares de sequên- cias de anticorpo murino estão publicamente disponíveis para baixar no sítio eletrônico do NCBI e podem ser usados para gerar dados similares.

Todas as referências citadas neste pedido e nos exemplos que seguem são expressamente incorporadas por referência em sua plenitude.

O amplo escopo desta invenção é melhor entendido com refe- rência aos seguintes exemplos, que não são destinados a limitar a invenção a modalidades específicas. EXEMPLOS Materiais

Os preps de plasmídeo pSynC242 e controle foram preparados por técnicas de purificação padrão com CsCI2. QuikChange Site-Directed Mutagenesis System foi obtido de Stratagene(#200518). RNeasy Mini Kit foi encomendado da Qiagen (#74104). Superscript First Strand Synthesis para reações de transcriptase reversa foi de GibcoBRL(#11904-418). Cyber Gre- en real time PCR Master Mix foi obtida de Applied Biosystems (#4309155). Estreptavidina conjugada fluoresceína foi de Jackson Immuno Research (# 016-010-084 Img/ml). Placas com fundo em U de 96 cavidades foram da FALCON (#3077). EZ-Link SuIfo-NHS-LC-Biotin foi da Pierce (#21335). Métodos

Substituição de aminoácido nas estruturas HC e LC de huC242 por mutagê- nese sítio-dirigida Desenho do Iniciador Pares de iniciadores para PCR complementares para reações de

mutagênese eram em tamanho de 30 bases e continham a substituição de nucleotídeo(s) desejada no meio dos iniciadores. Purificou-se iniciadores em PAGE e foram reconstituídos em 150 ng/μΙ. Reações de Mutagênese por PCR Reações de PCR foram preparadas como se segue: 5 μΙ de

tampão de reação 10 vezes (Stratagene), 20 ng dsDNA molde, 0,85 μΙ (125 ng) de iniciador reverso, 1 μΙ de dNTP 400 mM (Stratagene), e ddH20 foram adicionados a um volume final de 50 μΙ em um tubo epindorf de parede fina. Finalmente, 1 μΙ de Pfu Turbo DNA polimerase (2,5 U/μΙ, Stratagene) foi adi- cionado à mistura de reação e os tubos foram colocados em um termocicla- dor MJ Research. As condições das reações foram como se segue:

1 ciclo em 95°C por 30 segundos

12 ciclos de 95°C por 30 segundos, seguidos por 55°C por 1 mi- nuto, e 68°C por 11 minutos (1 minuto/kb com um molde de 11 kb). O número de ciclos foi aumentado para 14 quando duas bases foram modificadas.

1 ciclo a 68°C por 8 minutos

Mantido a 4°C

Transformação de células competentes foi realizada como se

segue:

O molde de DNA da PCR foi neutralizado por digestão com en-

zima de restrição de dependente de metilação, Dpnl (Stratagene). A diges- tão por restrição foi realizada com 1 μΙ de Dpn 1 adicionada diretamente à reação de PCR e incubada a 27°C durante 1 hora. A reação foi então trans- formada pela adição de 3 ΠμΙ do produto de PCR digerido por Dpnl a 50 Dpl de células competentes XL-1 (Stratagene), incubação em gelo durante 30 minutos, seguidos por um pulso de calor de 42°C por 45 segundos, retor- nando ao gelo durante 2 minutos, e então adicionando 0,5 ml de tampão SOC para uma incubação final a 37°C por 1 hora em agitação a 225 RPM. As células transformadas foram plaqueadas em placas LB/Amp (300 μΙ por placa) e incubadas a 37°C durante a noite. Confirmação da mutagênese O plasmídeo de DNA foi isolado a partir das colônias transfor-

madas com colunas Qiagen mini prep e separadas por eletroforese em gel de agarose. Plasmídeos que mantiveram a mesma mobilidade eletroforética que o DNA molde foram ainda analisados por sequenciamento das regiões VH e VL a fim de confirmar os produtos de mutagênese esperados. Reações de sequenciamento foram realizadas por técnicas de sequenciamento auto- mático padrão (Sterky F, Lundeberg J Sequence analysis of genes and ge- nomes. J Biotechnol. 2000 Jan 7;76(1):1-31). Transfecções transientes

Transfecção transiente com plasmídeos de expressão de anti- corpo foram realizadas com Qiagen's Superfection reagent Kit. Para assegu- rar a equivalência de transfecção entre os plasmídeos testados, as concen- trações de DNA foram medidas pela OD260 e confirmadas pela visualização em um gel de agarose. Antes de transfecção, 3 χ 105 células 293T foram plaqueadas em 6 discos de cavidades. Misturas de transfecção foram feitas até 0,6 ml por cavidade com 2 μg de plasmídeo de DNA (ou TE para o bran- co controle), misturadas com 15 μΙ de Superfect (Qiagen) e incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos. A mistura foi adicionada as células 293T que foram então colocadas em uma incubadora a 37°C, C02 5% por 2 horas. Após, as células foram lavadas com meio de cultura celular e final- mente incubadas em 1 mL do meio de cultura por Oh, 14 h, 22 h e 48 h em uma incubadora a 37°C, C02 5% para permitir a produção de anticorpo. Os anticorpos secretados foram coletados do meio de cultura a 0 h, de 14 h, de 22 h e de 48 h após transfecção. A concentração de anticorpo foi medida por ELISA quantitativa anti-hulgGI (QE). Quantitativo do ELISA

Quantitativo do ELISA foi realizado em placas de 96 cavidades cobertas com um anticorpo IgG anti-ovelha humano (The Binding Site Limi- ted, UK1 product code AU0006) por 1 hora à temperatura ambiente. As pla- cas foram então bloqueadas com 1% de soro neonatal de cabra em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. Os sobrenadantes de transfecção foram di- luídos em série e aplicados às placas bloqueadas seguido por outra incuba- ção à temperatura ambiente por 1 h. As placas do ELISA foram então lava- das 4 vezes com PBS./0,05% Tween-20, anticorpo secundário foi adicionado (anticorpo anti-humano Kappa conjugado a peroxidase (The Binding Site Limited, UK1 product code APO 15), e as placas foram novamente incubadas por 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as placas foram lavadas 4 vezes com PBS./0,05% de Tween-20 e ABTS foi adicionado (ABTS 0,5 mg/ml, H202 0,03% em tampão citrato 0,1 Μ). A absorvância da placa de ELISA foi lida em OD405 e a concentração de IgGI humana foi calculada em relação à absorvância dos padrões internos.

Comparação quantitativa de mRNA e níveis intracelulares HC/LC do huC242 original e mutado

Isolamento de RNA total

RNA total foi isolado a partir de 6 χ 106 células 293T transfecta- das transientemente com Qiagen RNeasy spin columns seguindo os proto- colos do conjunto. As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS, peleta- das, o sobrenadante foi removido e os péletes foram congelados a -80°C durante a noite. Os péletes celulares foram partidos em 500 μΙ de tampão RLT contendo β-mercaptoetanol 1% (v/v), misturado completamente, e então homogeneizado por passagem por uma agulha de 20 gauge 5 vezes. A cada homogeneizado, 500 μΙ de etanol 70% foi adicionado, o tubo foi misturado, então 700 μΙ da amostra foram aplicados em uma mini coluna RNeasy, e os tubos foram girados em 10.000 rpm por 15 segundos. O fluxo contínuo foi descartado e a coluna foi lavada com 350 μΙ de tampão RW1 seguida por outro giro a 10.000 rpm por 15 segundos. O DNA celular foi removido com 80 μΙ de solução de DNase I (10 μΙ de DNase I em 70 μΙ de Tampão RDD) adicionado ao centro da membrana da coluna, incubada à temperatura am- biente (20 a 30°C) por 15 min, então 350 μΙ do Tampão RW1 foram adicio- nados à coluna e os tubos foram girados a 10.000 rpm por 15 segundos. O fluxo contínuo foi descartado e a coluna foi transferida para um novo tubo coletor de 2 ml para duas lavagens adicionais com 500 μΙ de Tampão RPE cada e girada a 10.000 rpm por 15 segundos para primeira lavagem e 2 mi- nutos para a segunda lavagem. A coluna foi colocada em um novo tubo cole- tor de 2 ml e girada a velocidade total por 1 minuto para secar completamen- te a coluna. Finalmente, a coluna foi transferida para um novo tubo coletor de 1,5 ml e o RNA foi eluído com 30 μΙ água livre de RNase e girado a 10.000 rpm por 1 minuto. A concentração de RNA foi medida por OD260 e então as amostras foram armazenadas em -80°C. Síntese de cDNA

As reações de síntese de cDNA de fita foram realizadas com transcriptase reversa Superscript Il (Invitrogen), seguindo os protocolos do conjunto. A mistura de reação foi feita com 3 μg de RNA total , 3 pL de he- xâmeros randômicos, 1 μΙ_ de dNTP 10 mM, e completado a 10 Dpl com á- gua tratada com DEPC. A mistura foi incubada a 65°C por 5 minutos, e en- tão posta no gelo por pelo menos 1 minuto. A cada reação, 2 μΙ de tampão RT 10x, 4 μΙ de MgCI2 25 mM, 2 μΙ_ de DTT 0,1 M e D1 μΙ_ de inibidor de ribonuclease RNaseOUT foram adicionados, misturados, e incubados a 25°C por 2 minutos. Após, 1 μΙ de transcriptase reversa Superscript Il (50U) foi adicionado a cada tubo, misturado e incubado por 25°C por 10 minutos, 42°C por 50 minutos, 70°C por 15 minutos e então resfriado no gelo. A rea- ção foi coletada por um giro breve e o RNA foi removido com RNase H (1 μΙ adicionado a cada tubo e incubado a 37°C por 20 minutos) antes de prosse- guir com a PCR quantitativa. Estrutura da PCR quantitativa

As reações de PCR quantitativas foram realizadas em placas 96 cavidades usando o Cyber Green Real Time PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems). As reações de transcriptase reversa foram diluídas 1:500 e 10 μΙ de cada amostra foram plaqueadas em triplicata nas cavidades. Para ca- da par de iniciador, uma curva padrão (4 a 5 pontos) foi gerada usando 10 μΙ de diuições 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600 de uma amostra de RNA. Controles internos de transfecção foram também realizados em triplicata pa- ra cada amostra com iniciadores específicos para o gene de resistência a neomicina presente em cada plasmídeo. Um controle de número de célula separado também foi realizado para cada amostra usando iniciadores espe- cíficos para actina. A cada cavidade experimental e controle, 15 ΠμΙ da mis- tura de reação (0,05 μΙ de cada iniciador 100 μΜ, 12,5ΠμΙ de 2x Cyber Gre- en Real Time PCR Master Mix e 2,4 μΙ de ddH20) foram adicionados. As placas foram seladas e giradas para coletar os conteúdos antes de serem colocadas no termociclador em tempo real ABI prism 7000. As reações fo- ram realizadas a 95°C por 10 minutos seguido por 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Os dados de reação foram analisados com o programa ABI prism 7000.

Análise dos níveis intracelulares das cadeias pesada e leve

Células expressando IgGs estavelmente ou transientemente fo- ram Iisadas em tampão RIPA e as concentrações de proteína foram normali- zadas. Os Iisados celulares foram submetidos a eletroforese sob condições desnaturantes ou não-desnaturantes. As IgGs nos Iisados foram purificadas ou concentradas por técnicas de precipitação em Proteína A antes da eletro- forese como necessário. Os géis de acrilamida foram analisados por técni- cas de Western blotting usando anticorpos anti-lgG humana e anti-LCk hu- mano para visualizar as bandas da cadeia pesada e da cadeia leve, respec- tivamente.

Medição da afinidade de ligação HuC242 a células positivas para o antíqeno Ligação não-competitiva

Os anticorpos huC242 e o variante foram normalizados para 1 a 2 Dpg/ml com tampão de FACS (NGS 2,5% em meio RPMI). Amostras de 50ϋμΙ em duplicatas foram aplicadas em uma placa de 96 cavdiades e diluí- das em série 1:1 em tampão de FACS. Células Colo205 foram ressuspensas no tampão de FACS a 4x106 células/ml e 50 μΙ foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada por 2 horas e então lavada 2 vezes com 200 μΙ de tampão de FACS por cavidade seguido por giro a 4°C por 5 minutos em 1200 rpm. Os sobrenadantes foram retirados e 50 μΙ do anticorpo secun- dário marcado com FITC (1:100 diluído em tampão de FACS) foram adicio- nados a cada cavidade e a placa foi incubada a 4°C por 30 minutos. Final- mente, a placa foi lavada como descrito acima e as células foram fixadas com 200 μΙ/cavidade de Formaldeído 1% em PBS. A ligação de anticorpo relativa às células alvo foi analisada pela fluorescência em um citômetro de fluxo BD FACScalliber. Ligação competitiva

HuC242 foi biotinilada com I mg/ml de EZ-Link SuIfo-NHS-LC- Biotin (Pierce #21335) incubado à temperatura ambiente por 1 hora. A rea- ção foi parada com taurina e então dialisada contra PBS 1x a 4°C durante a noite. O huC242 biotinilado foi diluído a 1,6x10-9 M para uma concentração de reação final em 4x10-10 M.

O huC242 não marcado e os anticorpos variantes foram diluído em série 1:2 de 4x10-8 M a 1x10-11 M e 50 ϋμΙ de cada amostra foram adi- cionados à placa. Após, 50 μΙ por cavidade de huC242 biotinilado foram mis- turados por pipetação de cima para baixo 3 vezes. As células Colo 205 fo- ram lavadas duas vezes com o tampão de FACS, ressuspensas a 2x105 células/ml, e 100 μΙ foram misturados em cada cavidade contendo as mistu- ras de anticorpo. A placa foi incubada em gelo por 2 horas, lavadas 2 vezes com o tampão de FACS e então 50 μΙ Estreptavidina Conjugada a Fluores- ceína diluída 1:100 foram adicionados. Após, a placa foi incubada em gelo por 1 hora, lavadas 2 vezes com o tampão de FACS e as células foram fixa- das com 200 μΙ por cavidade de formaldeído 1% em PBS. A ligação competi- tiva foi analisada em um citômetro de fluxo BD FACScalliber. Baixa de produção de huC242 é observada dentro de horas após transfec- cão transiente de células 293T.

Transfecções transientes foram realizadas em células 293T para comparar a expressão de huC242 com anticorpos de controle conhecidos terem moderados a altos potenciais de expressão. Plasmídeos que codifi- cam os dois anticorpos humanizados de controle, bem como huC242 foram transfectados em células 293T em paralelo e anticorpos segregados foram coletados do meio de cultura 0 h, 14 h, 22 h e 48 h após a transfecção. Logo quatorze horas após transfecção, o huC242 foi secretado muito menor do que os anticorpos controle (Figura 2), e a diferença aumentou além do tem- po. Em 48 horas, o huC242 acumulado produzido foi somente aproximada- mente 7% do Controle A e 12% do Controle B.

Os níveis RNAm das cadeias pesada e leve de huC242 transfeccões transi- entes em 293T parecem normais

A fim de examinar se a baixa produção de huC242 é devida a baixos níveis de RNA mensageiro para IgG1 os mRNAs das cadeias pesada e leve de huC242 foi comparado com outros anticorpos humanizados no re- pertório da ImmunoGen. HuC242 e os anticorpos de controles foram trans- fectados em células 293T em paralelo e mRNAs foram isolados a partir das células após 72 h. As amostras foram analisadas por técnicas de RT-PCR quantitativa e os resultados (Figura 3) indicam que os níveis de RNAm de huC242 são comparáveis aos anticorpos controles. O RNAm da cadeia pe- sada de huC242 normalizado foi um tanto maior que a maioria dos anticor- pos, mas foi similar ao controle C. O RNAm da cadeia leve de huC242 foi menor que aquele do controle A, mas similar aos controles A e C. Tomados em conjunto, os níveis celulares de RNAm das cadeias pesada e leve de huC242 foi encontrado ser comparáveis com vários outros anticorpos capa- zes de alta produtividade. A proporção relativa de huC242 montado (H2L2) para HC (H) é significante- mente menor que a razão huB4 em linhagens celulares CHO estáveis

Com base nos resultados de qPCR, a baixa produtividade de huC242 provavelmente é pós-transcricional. Para analisar os eventos pós- transcricionais, a expressão intracelular e a montagem dos peptídeos das cadeias pesada e leve foram comparadas entre o controle A e huC242. A linhagem celular CHO estável que expressa o controle A foi comparado com duas linhagens celulares CHO estáveis que expressam huC242. Lisados celulares totais foram submetidos à purificação em proteína A e as IgGs iso- ladas foram separadas em um gel não-desnaturante e coradas com Coo- massie Blue (Figura 4). A presença de múltiplas espécies de montagem in- completa de huC242 comparadas com o anticorpo de controle sugere que a montagem ineficiente das cadeias pesada e leve, possivelmente devido à baixa compatibilidade entre os peptídeos ou suprimento insuficiente da ca- deia leve, possa ser uma raiz da baixa expressão do anticorpo huC242. Múltiplos resíduos de estrutura das cadeias pesada e leve de huC242 não se adequam às seqüências consenso A presença de resíduos não-consenso nas estruturas das cadei-

as pesada e leve de huC242 foi inicialmente realizada por alinhamento das seqüências de aminoácido da região variável de huC242 com anticorpos controle com superfície recoberta conhecidos por ser capazes de alto nível de expressão em linhagens CHO estáveis. Uma vez que resíduos que levam à baixa expressão provavelmente não são prevalentes na natureza, as estru- turas da região variável das cadeias pesada e leve de huC242 foram alinha- das as seqüências consenso geradas a partir das entradas dos bancos de dados Kabat de IgG 1 murino e cadeia leve Kappa respectivamente (Figura 5). As seqüências consenso murino foram utilizadas porque os resíduos in- seridos na superfície recoberta do anticorpo, tal como huC242 conserva to- dos os resíduos murinos do anticorpo murino parental original e os resíduos de superfície humanos seriam não geralmente considerados para substitui- ção. O resíduo 26(D), mostrado na Figura 5 é uma exceção àquele que é um resíduo inserido porque está exposto na superfície. Este resíduo foi substitu- ido com G porque começar com ele (D) é um resíduo murino e como uma regra geral, os resíduos murinos podem ser substituídos mesmo que sejam encontrados fora dos resíduos inseridos. O resíduo G a partir do consenso murino, neste caso, sucede ser consistente com a seqüência humana usada para a humanização de C242. As mesmas posições de estrutura huC242 que não combinam

com um pequeno grupo de anticorpos de recombinante também não combi- na com a seqüência consenso do amplo banco de dados. Além disso, muitos destes resíduos de huC242 foram encontrados por serem extremamente raros nas mesmas posições no banco de dados Kabat, variando no presente em 16% de anticorpos murinos baixo para tão pouco como 0,80% (vide Ta- bela abaixo). Estes resíduos de estrutura inseridos raros foram escolhidos para investigação adicional em se algum contribui para o baixo potencial de expressão do anticorpo huC242.

Tabela: Resíduos de aminoácidos raros na estrutura da região variável de huC242 e a freqüência do seu aparecimento no banco de dados de anti- corpo de Kabat. Para comparação, os resíduos de aminoácidos corres- pondentes da seqüência consenso e sua freqüência 1 é dada ESTRUTURA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA Resí- duo N0 huC242 Seqüência consenso a partir de Kabat Amino- ácido Freqüência em Kabat Amino- ácido Freqüência em Kabat 16 E 95/3408: 2,8% A 1533/3408: 45,6% 26 D 29/3661: 0,8% G 3612/2661: 98,7% 46 K 88/3715: 2,4% E 3563/3715: 95,9% 82A K 17/3745: 0,45% S 1953/3745: 52,1% 89 T 648/3894: 16,6% V 2147/3894: 55,1% ESTRUTURA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE 45 Q 244/2606: 9,4% K/R 2307/2606: 88,5% 70 A 39/2987: 1,3% D 1652/2987: 55,3%

Aumento moderado de produção de IgG por uma substituição DE aminoáci- do único em huC242 ou nas estruturas da cadeia leve.

Para investigar se os resíduos incomuns identificados nas estru- turas das cadeias pesada e leve de huC242 podem impactar negativamente na produção de anticorpo, estes resíduos foram substituídos pelos resíduos consenso correspondentes usando mutagênese sítio dirigida. A expressão de anticorpo variante de aminoácido único de huC242 foi comparado a huC242 e anticorpo de controle por transfecção transiente. Os respectivos plasmídeos de expressão foram transfectados em células 293T e após 72 horas, os níveis de IgGs secretados foram determinados por ELISA quantita- tivo. Aumentos moderados da produção de IgG foram alcançados por substi- tuições de aminoácido único nas regiões de estrutura da cadeia pesada ou leve de huC242 (Figura 6). Para assegurar que as substituições de resíduo não alteraram a

atividade de ligação ao anticorpo, as variantes huC242 foram avaliadas por FACS em células Colo 205 antígeno positivas. Os resultados mostraram que as substituições de aminoácido não modificaram o perfil de ligação (Figura 6).

Aumentos significantes na produtividade de anticorpo são alcançados pela combinação de duas a três modificações de resíduo na estrutura das cadei- as pesada e leve de huC242

As substituições de aminoácido em huC242 foram estendidas para incluir múltiplas modificações de resíduo de estrutura. Os construtos das cadeias pesada e leve variantes também foram misturados e combina- dos para construir um arranjo de pares de variantes huC242, cada um con- tendo duas ou mais substituições de resíduo. As produtividades relativas das variantes de huC242 foram comparadas em transfecções transientes de 293T como descrito acima. As várias combinações de substituição de resí- duos resultaram em diferentes níveis de produtividade, com os maiores au- mentos vistos naquelas contendo duas ou três modificações combinadas entre a estrutura de região variável das cadeias pesada e leve de huC242 (Figura 7).

Os níveis de RNAm das cadeias pesada e leve de variantes huC242 permanecem inalterados.

O aumento na produtividade de huC242 vista com as variantes de seqüências seriam devidas às propriedades melhoradas de transcrição, tradução ou pós-traducionais do anticorpo. Para investigar a fonte do au- mento da expressão de huC242, um experimento de qPCR foi conduzido avaliando os níveis de RNAm de huC242 e das variantes de seqüências huC242 expressas em células 293T transfectadas transientemente. Os re- sultados indicam que as variantes de huC242 produziram níveis similares de RNAm tanto da cadeia pesada como da leve quando comparada com huC242 (Figura 8). Isto sugere que o aumento da produção de anticorpo das variantes huC242 não foi devido ao aumento da transcrição ou estabilidade do RNAm, mas possivelmente devido às propriedades pós-transcricionais melhoradas.

Um aumento no peptídeo de cadeia leve intracelular é observa- do em conseqüência das variações de cadeia pesada Para estudar ainda os mecanismos possíveis associados com a produtividade aumentada de huC242 pelas substituições de resíduo de es- trutura da região variável, os níveis de peptídeo das cadeias pesada e leve intracelular foram comparados. O huC242 e as variantes de seqüência foram transientemente transfectadas em células 293T que foram Iisadas 72 horas após, e os Iisados celulares totais foram avaliados por técnicas de Western blotting sob condições desnaturantes. Tanto anticorpos secundários anti- hulgG 1 como anti-huK foram utilizados para visualizar ambas as bandas das cadeias pesada e leve no mesmo gel. De maneira interessante, as subs- tituições de resíduo na estrutura da região variável da cadeia pesada não afetaram a expressão de cadeia pesada mas sim aumentado o acúmulo in- tracelular da cadeia leve de huC242 não contendo substituições de resíduo (Figura 9). Estes resultados sugerem que as variantes da cadeia pesada de huC242 protegem a cadeia leve de huC242 de ser degradada, possivelmen- te através do aumento da compatibilidade da cadeia pesada com a cadeia leve que leva a um aumento da montagem de anticorpo e enfim a produção de anticorpo aumentada. Estes resultados também mostraram que as produ- tividades das variantes huC242 foram aproximadamente proporcionais aos seus níveis de cadeia leve intracelular, mas não os de cadeia pesada. As substituições de resíduo em huC242 levam à montagem melhorada das cadeias pesada e leve

Western blots realizados sob condições não-desnaturantes for- necem evidências adicionais de propriedades pós-traducionais melhoradas nas variantes de huC242. Lisados celulares totais a partir de células 293T transfectadas transientemente com huC242 e os construtos variantes foram avaliados com técnicas de Western blotting não-desnaturantes (Figura 10). Nestes experimentos, os anticorpos totalmente montados não-desnaturados poderiam ser visualizados em conjunto com as cadeias leve e pesada não- montada bem como produtos de montagem intermediária. A proporção intra- celular de IgG totalmente montada (H2L2) versus produtos de montagem intermediária (H2, H2L1, etc.) foi significativamente melhorada como um re- sultado das substituições de aminoácido (Figura 10(a)). Além disso, estes resultados mostraram que quando as variantes das cadeias pesada e leve foram usadas em combinação, os níveis intracelulares de ambas as cadeias foram aumentados. Isto sugere que as interações melhoradas entre as se- qüências de variantes das cadeias pesada e leve resultam na proteção intra- cadeia mútua da degradação.

Os construtos e variantes de huC242 foram avaliados em géis corados com Coomassie Blue para evitar artefatos potenciais associados com as técnicas de Western blotting (Figura 10(b)). Os Iisados celulares to- tais a partir das células 293T transientemente transfectadas foram submeti- dos a técnicas de purificação em Proteína A, então as IgGs isoladas foram aplicadas em PAGE não-desnaturante e posteriormente coradas com Coo- massie Blue. Os resultados são consistentes com os observados por Wes- tern blot, demonstrando níveis significantes de anticorpo parcialmente mon- tado na coluna huC242 e um aumento na proporção de anticorpo totalmente montado (H2L2) nas colunas de variante de huC242

As substituições de resíduo nas variantes de huC242 não afetam o atividade de ligação ao antígeno

A atividade de ligação relativa de huC242 e os construtos de va- riantes foram avaliados no células Colo205 antígeno positivas por FACS. As variantes de huC242 capazes aumentar a produtividade de anticorpo não exibiram modificações significantes no atividade de ligação a antígeno (Figu- ra 11 (a)). Para confirmação adicional destes resultados, um ensaio de liga- ção competitiva foi realizado pelo desafio de huC242 biotinilado ligado a cé- lulas Colo205 com variantes de huC242 não marcadas serialmente diluídas (Figura Il (b)). Este experimento demonstrou que as variantes de huC242 poderiam competir com huC242 pela ligação a células Colo205 antígeno positivas em uma maneira dependente da concentração. Os resultados combinados dos ensaios de ligação direta e competitiva indicam que huC242 e os construtos de variantes têm similares atividades de ligação. Aqueles versados na técnica apreciarão que as condições e téc-

nicas de re-engenharia, incluindo processos, com exceção daqueles que são especificamente ilustrados neste pedido podem ser empregadas na prática desta invenção como reivindicado sem recurso à experimentação indevida. Aqueles versados na técnica reconhecerão e entenderão que equivalentes funcionais dos procedimentos, condições de processo, e técnicas ilustradas neste pedido existem na técnica. Todos esses equivalentes conhecidos são destinados a ser englobados por esta invenção. LISTAGEM DE SEQUENCIA <110> ZHOU1Xiao-Mai TAVARES, Daniel

<120> MÉTODOS PARA MELHORAR A PRODUÇÃO DE ANTICORPO <130> A9267

<150> US 60/855361 <151> 2006-10-31 <160> 16

<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 119 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 cadeia pesada <400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 40 45

Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110

ThrThrVaI ThrVaI Ser Ser 115 <210>2 <211> 112 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 cadeia leve <400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 3 <211 > 132 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> seqüência consensual de murino de cadeia pesada <400>3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Trp Met His Asn Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Lys Ala Gly Asn Gly Gly Thr Lys Tyr 50 55 60

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 65 70 75 80

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr 100 105 110

Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130

<210> 4 <211> 119 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> seqüência consensual de murino de cadeia leve <400>4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30

Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ser Thr His Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly 100 105 110

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 <210> 5 <211> 132 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 seqüência de cadeia leve <400>5

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Val Pro Val 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 40 45

Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr 85 90 95

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110

Leu Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg 130

<210> 6 <211> 132 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huMy96 seqüência cadeia leve <400>6

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 10 15

Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val 40 45

Phe Phe Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile 50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr 100 105 110

Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg 130

<210>7 <211> 122 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> rB4 seqüência cadeia leve <400>7

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Val Asn Tyr 40 45

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Arg Arg Trp Ile 50 55 60

Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro 85 90 95

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe 100 105 110

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 <210> 8 <211> 132 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huEM164 seqüência cadeia leve <400>8

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30

Ser Leu Gly Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 40 45

Val His Ser Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg 130

<210>9 <211> 132 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huN901 seqüência cadeia leve <400>9

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 25 30

Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ile Ile 35 40 45

Ile His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg 130 <210> 10 <211> 121 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> seqüência de cadeia leve consensual <400> 10

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 25 30

Ser Pro Gly Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 40 45

Ile His Ser Asn Thr Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ser Gly Val Pro Asp 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser 85 90 95

Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Pro Thr Phe 100 105 110

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 <210> 11 <211 >468 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 seqüência de cadeia pesada <400> 11

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe 40 45

Thr Tyr Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp 115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu ThrVaI Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 12 <211> 1404 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 seqüência de cadeia pesada <400> 12

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccagttgg tgcagtctgg agccgaggtg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctgattatac cttcacatac tatggaatga actgggtgaa gcaggctccg 180 ggacagggtc tgaagtggat gggctggatc gacaccacca ctggagagcc aacatatgct 240 cagaagtttc agggacggat tgccttctct ttggagacct ctgccagcac tgcctatctg 300 cagatcaaaa gcctgaaatc tgaggacacc gctacatatt tctgtgccag acgggggcct 360 tacaactggt actttgatgt ctggggccag gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200 Page 10

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380 agcctctccc tgtctccggg taaa 1404 <210> 13 <211> 238 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 seqüência cadeia leve <400> 13

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Val Pro Val 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45

Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr 85 90 95

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110

Leu Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val TyrAIa Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 14 <211> 714 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 seqüência cadeia leve <400> 14

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgat 60 attgtgatga ctcagtctcc actgtctgta cctgtcactc ctggagagcc tgtatccatc 120 tcctgcaggt ctagtaagag tctcctgcat agtaatggca acacttactt gtattggttc 180 ctgcagaggc caggccagtc tcctcagctc ctgatatatc ggatgtccaa cctggtctca 240 ggagtcccag acaggttcag tggcagtggg tcaggaactg ctttcacact gagaatcagt 300 agagtggagg ctgaggatgt gggtgtttat tactgtctgc aacatctgga gtatccgttc 360 acgttcggtc ctgggaccaa gctggagctg aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 714 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 seqüência de domínio variável de cadeia pesada <400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 40 45

Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110

ThrThrVaIThrVaISerSer 115 <210> 16 <211> 113 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> huC242 seqüência de domínio variável de cadeia leve <400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

Claims

1. Método para aumentar a produção de um anticorpo murino humanizado ou um fragmento do mesmo em uma célula hospedeira pela re- engenharia de seqüência, caracterizado pelo fato de que compreende: a) alinhamento de uma coleção de seqüências de estrutura da região variável de anticorpo murino, em que tal alinhamento identifica os re- síduos de aminoácidos mais freqüentemente encontrados (resíduos consen- so) em cada posição na dita estrutura; b) comparação dos ditos resíduos consenso com os resíduos correspondentes na seqüência da estrutura da região variável do anticorpo humanizado; c) identificação no dito anticorpo humanizado de um ou mais re- síduos de aminoácidos não-consenso de na seqüência da estrutura da regi- ão variável; e d) substituição no dito anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo de um ou mais resíduos de aminoácidos não-consenso com o resí- duo consenso na posição equivalente para produzir um anticorpo variante, em que o dito anticorpo variante é produzido na dita célula hospedeira em um rendimento maior quando comparado com o dito anticorpo humanizado; e e) opcionalmente, um ou mais de aminoácidos são substituídos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito rendimento maior é pelo menos 2 vezes ou maior.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita substituição é na dita cadeia pesada.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita substituição é na dita cadeia leve.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita substituição é em ambas as cadeias pesada e leve.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a substituição é no núcleo da seqüência da estrutura da região variável.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não-consenso é um aminoá- cido raro.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado é huC242 e as substituições estão em uma ou mais posições da região variável da cadeia pesada selecionadas de .16, 26, 46, ou 89 na SEQ ID NO: 1 ou posições da região variável da cadeia leve 45 ou 70 na SEQ ID NO: 2, ou ambas, as posições que são determina- das pelo esquema de numeração de Kabat, e em que o aminoácido da se- qüência da região variável da cadeia leve é representado pela SEQ ID NO: 2 e a seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é repre- sentada pela SEQ ID NO: 1

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado é huC242 e as substituições de um ou mais selecionados a partir do grupo composto de Q45K/R e A70D na cadeia leve, e um ou mais selecionados a partir do grupo composto de resíduos de aminoácidos EIA, D26G, K46E e T89V na cadeia pesada, o resíduo aminoá- cido que é determinado pelo esquema de numeração de resíduo de anticor- po Kabat, e em que a seqüência de aminoácidos da região variável da ca- deia leve é representada pela SEQ ID NO: 2 e a seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é representado pela SEQ ID NO: 1.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado é huC242 e as substituições são uma ou mais selecionadas a partir do grupo composto de Q45K/R e A70D na ca- deia leve, o resíduo de aminoácido que é determinado pelo esquema de numeração de resíduo de anticorpo Kabat, e em que a seqüência de amino- ácidos da região variável da cadeia leve é representada pela SEQ ID NO: 2.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado é huC242 e as substituições são aque- las selecionadas a partir do grupo composto de resíduos de aminoácidos E1A, D26G, K46E, e T89V na cadeia pesada, o resíduo de aminoácido que é determinado pelo esquema de numeração de resíduo de anticorpo Kabat1 e em que a seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é representada pela SEQ ID NO:1.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado é huC242 e as substituições são aque- las selecionadas a partir grupo composto de resíduos de aminoácidos E1A, D26G, K46E, T89V, K46E/D26G, K46E/K82S, K46E/T89V, K46E/E16A/D26G, K46E/K82S/D26G e K46E/T89V/D26G na cadeia pesada, o resíduo de aminoácido que é determinado pelo esquema de numeração de resíduo de anticorpo Kabat, e em que a seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é representada pela SEQ ID NO: 1.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado é huC242 e as substituições são uma de A70D ou Q45K/R na cadeia leve e uma de K46E, D26G, K46E/D26G ou K46E/T89V na cadeia pesada, o resíduo aminoácido que é determinado pelo esquema de numeração de resíduo de anticorpo Kabat, e em que a seqüên- cia de aminoácidos da região variável da cadeia leve é representada pela SEQ ID NO: 2 e a seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é representada pela SEQ ID NO: 1.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o dito rendimento maior é de pelo menos 2 vezes ou maior.

15. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo mé- todo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 8 a 13.

16. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma seqüência humana inteira que codifica C242 tendo pelo menos uma variação em uma região da dita seqüência que codifica uma região va- riável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve, em que pelo menos uma dita variação aumenta o rendimento de uma proteína codificada pelo dito gene C242 e em que a dita proteína inclui pelo menos uma dita va- riação.

17. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que pelo menos uma dita variação compreende uma varia- ção em uma região da dita seqüência que codifica um motifo de aminoácido da região variável da cadeia pesada (Figura 12) ou uma região variável da cadeia leve (Figura 12) ou ambos.

18. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que pelo menos uma dita variação no dito motifo é sele- cionada a partir da substituição de um códon que codifica de Gln (CAG) para Lys (AAA) ou Arg (CGG)1 de um códon que codifica Ala (GCT) para Asp (GAT), de um códon que codifica Glu (GAG) para Ala (GCC), de um códon que codifica Asp (GAC) para Gly (GGC), de um códon que codifica Lys (AA- A) para Glu (GAA); ou de um códon que codifica Thr (ACC) para Val (GTC).

19. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que a dita substituição do dito códon ocorre em uma ca- deia leve ou uma pesada.

20. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que a dita substituição da cadeia leve é selecionada a par- tir de: Q45K/R GIn(CAG) para Lys(AAA) ou Arg(CGG) ou A70D AIa(GCT) para Asp (GAT)

21. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que a dita substituição da cadeia pesada é selecionada a partir de E16A Glu (GAG) para Ala (GCC); D26G Asp (GAC) para Gly (GGC); K46E Lys (AAA) para Glu (GAA); ou T89W Thr(ACC) para Val (GTC)

22. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que a dita seqüência codifica um produto gênico variante C242.

23. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zado pelo fato de que o dito produto gênico é um anticorpo.

24. Anticorpo variante ou fragmento de ligação a epitopo do mesmo, caracterizado pelo fato de que a dita variante tem uma ou mais substituições de aminoácidos em um anticorpo parental que tem uma região variável que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 [huC242] e uma cadeia leve da SEQ ID NO:2 [huC242] e a dita variante mostra uma síntese melhorada quando introduzida em uma célula hospedeira única quando comparada com o dito anticorpo parental.

25. Anticorpo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a dita substituição está em uma ou mais posições selecio- nadas a partir de 45 e 70, na dita SEQ ID NO:2 ou 16, 26, 46, ou 89 na dita SEQ ID NO:1, ditas posições sendo determinadas pelo esquema de nume- ração Kabat.

26. Anticorpo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a dita substituição é selecionada a partir do grupo composto de Q45K/R, A70D, E16A, D26G, K46E, ou T89V na cadeia pesada, ditas posições sendo determinadas pelo esquema de numeração Kabat.

27. Método para aumentar a produção de um anticorpo humani- zado ou um fragmento de ligação a epitopo do mesmo em uma célula hos- pedeira pela re-engenharia da seqüência, caracterizado pelo fato de que compreende: a) alinhamento de uma coleção de seqüências de estrutura da região variável de anticorpo a partir de anticorpos do mesmo gênero ou outra classificação taxonômica como aquela da qual o anticorpo humanizado foi derivado pertence, em que tal alinhamento identifica os resíduos de aminoá- cidos mais freqüentemente encontrados (resíduos consenso) em cada posi- ção na estrutura; b) comparação dos resíduos consenso com a seqüência dos resíduos correspondentes na estrutura da região variável do anticorpo hu- manizado; c) identificação no anticorpo humanizado de um ou mais resí- duos não-consenso na seqüência da estrutura da região variável; e d) substituição no anticorpo humanizado ou um fragmento dito do mesmo de um ou mais resíduos não-consenso com o resíduo consenso na posição equivalente para produzir um anticorpo variante, em que o anti- corpo variante é produzido em uma célula com um rendimento maior quando comparado com o anticorpo humanizado. e) Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substitu- idos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas.

28. Método para aumentar a produção de um anticorpo parental ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo em uma célula hospedei- ra pela re-engenharia da seqüência, caracterizado pelo fato de que compre- ende: a) alinhamento de uma coleção de seqüências de estrutura da região variável de anticorpo a partir de anticorpos do mesmo gênero ou outra classificação taxonômica como aquela da qual o anticorpo parental foi deri- vado pertence, em que tal alinhamento identifica os resíduos de aminoácidos mais freqüentemente encontrados (resíduos consenso) em cada posição na estrutura; b) comparação dos resíduos consenso com os resíduos corres- pondentes na seqüência da estrutura da região variável do anticorpo paren- tal; c) identificação no anticorpo parental de um ou mais resíduos de aminoácidos não-consenso na seqüência da estrutura da região variável; e d) substituição no anticorpo parental ou fragmento do mesmo de um ou mais resíduos de aminoácidos não-consenso com o resíduo consen- so na posição equivalente para produzir um anticorpo variante, em que o anticorpo variante é produzido na célula hospedeira em um rendimento mai- or quando comparado com o anticorpo parental. e) Opcionalmente, um ou mais aminoácidos podem ser substitu- ídos com um resíduo não-consenso por considerações biofísicas.