CN102692496B - Angptl4作为缺氧检测的标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ANGPTL4作为缺氧检测的标志物及其应用。具体地,本发明提供了血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)在制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒中的用途。本发明还提供了相应的缺氧检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤学和检测领域。更具体地,本发明涉及一种可用于缺氧检测的血清标记物ANGPTL4及其应用。
背景技术
ANGPTL4基因(最初该基因被发明人的实验室命名为pp1158)[朱洪新等,中华肿瘤杂志(2002)24(2):123-125]就是利用此功能筛选技术平台从人胎盘cDNA文库中克隆到的新基因,该基因cDNA全长为1943bp,开放阅读框含1218bp,编码406个氨基酸,预计分子量为45.2kDa。N端有一疏水信号肽和卷曲(Coiled-Coil)结构域,C端有一纤维蛋白原样(Fibrinogen-like)结构域。并于2000年首先将该基因(原基因名为pp1158)的cDNA序列在GenBank上登录(登录号为AF202636)。现已同Yoon等克隆的PGAR[Mol.Cell.Biol.,Jul 2000;20:5343-5349]和Kim等克隆的HFARP[Biochem.J,2000,346:603-610]由HUGO统一正式命名为ANGPTL4(angiopoietin-like 4)。
ANGPTL4在肿瘤转移中的作用越来越引起人们的关注。目前的研究表明ANGPTL4对肿瘤转移的影响是非常复杂的,在不同的肿瘤中有不同的作用:对Lewis肺癌细胞和黑色素瘤细胞B16F0的研究表明ANGPTL4能够通过对血管和肿瘤细胞的双重影响,即改变血管的渗透及肿瘤细胞的运动和侵润能力,来抑制肿瘤细胞的转移。与此相反,在乳腺癌的最新研究表明,TGFβ1在乳腺癌中诱导ANGPTL4的上调,乳腺癌细胞分泌的ANGPTL4能够破坏内皮细胞之间的连接,增加肺毛细管的渗透性,促进肿瘤细胞的跨血管内皮细胞的迁移,与TGFβ1共同启动了乳腺癌的肺转移。
另外,超过一半的晚期原位实体瘤存在局部缺氧,并分散在肿瘤的不同区域。造成肿瘤缺氧的原因主要是正常血管输送的氧气不能满足肿瘤快速生长的需要。为了减轻缺氧,肿瘤细胞会释放促进血管新生的分子,新生血管往往使血管网紊乱,有大量的血管盲端、扭曲血管以及动静脉间短路,易于肿瘤细胞穿透而形成远处转移。同时缺氧细胞基因组非常不稳定,具有更强的侵润性和转移能力。因此缺氧对肿瘤的进展包括肿瘤发生和转移过程中起着非常重要的作用。
据报道对缺氧或者说缺氧信号最为敏感的转录因子是HIF。其中HIF-1α与多种恶性肿瘤的发生、发展、转移及预后等多种生物学行为相关。HIF-1α是一个螺旋-环-螺旋的转录因子,普遍存在于哺乳动物细胞中;在常氧条件下,HIF-1α的脯氨酰和天冬酰胺酰残基被羟化,然后与VHL蛋白结合,发生降解,因此其半衰期非常短;而在缺氧条件下,HIF-1α不被降解,入核与HIF1β结合形成异源二聚体,发挥转录因子的功能。HIF-1α有可以调控很多与血管新生、细胞增殖、肿瘤转移、肿瘤细胞的侵润和糖代谢等有关的基因。
缺氧与肿瘤进展尤其是转移密切相关密切相关,肿瘤是否处于缺氧状态的判断一般是根据肿瘤组织的形态学以及缺氧诱导因子表达的改变,这需要肿瘤病人手术后得到肿瘤组织才能进行检测。从科学研究实验角度看,HIF-1α蛋白在常氧下半衰期非常短,检测不方便。
综上所述,本领域尚缺乏令人满意的检测缺氧状态的方法,更缺乏血清检测缺氧的方法。因此,本领域迫切需要开发可用于检测(尤其是血清检测)缺氧(状态)的标志物和方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可用于检测(尤其是血清检测)缺氧(状态)的标志物及其应用。
在本发明的第一方面,提供一种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特异性抗体的用途,它们用于制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒。
在另一优选例中,所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中,所述可检测标记选自下组:生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中,所述诊断试剂是单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的特异性抗体是单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的缺氧检测是血清检测。
在另一优选例中,所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)。
在本发明的第二方面,提供了一种用于缺氧检测的诊断试剂盒,所述的试剂盒含有:
(a)一容器,所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特异性抗体;以及
(b)标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测;
或者所述的试剂盒含有:
(a’)一容器,所述容器中含有抗HIF-1α的特异性抗体和另一容器以及位于该容器中的特异性扩增ANGPTL4启动子区域HRE1的特异性引物;以及
(b’)标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测。。
在另一优选例中,所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中,所述可检测标记选自下组:生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中,所述的抗体是单克隆抗体。
在本发明的第三方面,提供了一种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途,它被(a)用作血清学检测缺氧的标志物;或(b)用于制备血清缺氧检测的试剂盒。
在本发明的第四方面,提供了一种“HIF-1α-ANGPTL4”复合物,所述的复合物是HIF-1α蛋白结合于ANGPTL4的启动子区域HRE1而形成的复合物。
在另一优选例中,所述的HIF-1α和ANGPTL4都来源于人。
在本发明的第五方面,提供了本发明第四方面中所述的复合物的用途,它被用于制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒。
在本发明的第六方面,提供了一种ANGPTL4的启动子区域HRE1的用途,它被用于制备“HIF-1α-ANGPTL4”复合物。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了缺氧上调ANGPTL4的表达。各图如下:
a.实时定量PCR检测结果表明缺氧能明显上调SMMC-7721、Huh7和MHCC-97L细胞中ANGPTL4的表达;
b.蛋白印迹检测结果表明缺氧能明显上调SMMC-7721、Huh7和MHCC-97L细胞中ANGPTL4的表达;
c.DFO在常氧条件下模拟缺氧环境,能够明显上调MHCC-97L细胞和SMMC-7721细胞中HIF-1α和ANGPTL4的蛋白水平。
d.MHCC-97L和SMMC-7721细胞在裸鼠皮下接种后,每周取材一次,获得的瘤组织进行免疫荧光染色,结果表明随着时间的延长,肿瘤体积的增大,瘤内缺氧程度增加,HIF-1α和ANGPTL4表达上调并在缺氧区共表达。
e.免疫组化结果表明在肝癌患者临床标本中HIF-1α的表达和ANGPTL4的表达密切相关。
图2显示了缺氧通过HIF-1α上调MHCC-97L和SMMC-7721细胞中ANGPTL4的表达。各图如下:
a.在MHCC-97L细胞中利用siRNA干扰HIF-1α和HIF-2α后,在缺氧条件下培养24h,蛋白印迹实验表明HIF-1α干扰后,即使在缺氧条件下,ANGPTL4的表达不再明显上调;而干扰HIF-2α则无影响;
b.在SMMC-7721细胞中利用siRNA干扰HIF-1α和HIF-2α,结果同a;
c.不同浓度2ME2处理缺氧条件下培养的MHCC-97L细胞和SMMC-7721细胞,蛋白印迹检测HIF-1α和ANGPTL4蛋白水平的变化。
图3显示了HIF-1α能够与ANGPTL4启动子区域的HRE结合。各图如下:
a.生物信息学分析表明ANGPTL4启动子区域有5个HRE;
b.ChIP实验表明HIF-1α能够与ANGPTL4启动子区域的HRE1结合,表明ANGPTL4是HIF-1α的靶基因。
图4显示了ANGPTL4抗体抑制缺氧诱导的跨血管内皮细胞迁移。各图如下:
a.缺氧能够促进SMMC-7721细胞的跨血管内皮细胞的迁移,加入ANGPTL4抗体后,能明显抑制缺氧诱导的跨血管内皮细胞的迁移;
b.为迁移细胞数统计图;*指P<0.001。
图5显示了ANGPTL4抗体抑制缺氧诱导的跨血管内皮细胞迁移。各图如下:
a.采用Western blot检测ANGPTL4在各肝癌细胞系中蛋白的表达;
b.采用ELISA方法检测细胞培养上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表达;
c.采用Western blot检测ANGPTL4在过表达细胞系细胞裂解液和细胞培养上清中蛋白的表达;
d.采用ELISA方法检测过表达细胞培养系培养上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表达;
e.SMMC-7721过表达ANGPTL4细胞接种裸鼠6周后,裸鼠血清中ANGPTL4浓度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,缺氧能够明显上调ANGPTL4,并证实了ANGPTL4是HIF-1α的靶基因,受其直接调控。进一步的分析表明在裸鼠成瘤组织和肝癌患者肿瘤组织中ANGPTL4的表达和HIF-1α的表达是呈正相关的。ANGPTL4是血管生成素样基因家族的成员之一,与肿瘤细胞的生长、迁移、浸润和血管新生密切相关。ANGPTL4作为一个分泌性蛋白,在细胞培养上清和人血清中均可以利用ELISA检测到,方法简便。因此血清ANGPTL4可以作为缺氧检测的标志物。在此基础上完成了本发明。
ANGPTL4蛋白和基因
在本发明中,术语“本发明蛋白”、“ANGPTL4蛋白”、“ANGPTL4多肽”或“血管生成素样蛋白ANGPTL4”可互换使用,都指具有人血管生成素样蛋白ANGPTL4氨基酸序列AAG22490(gi:10732648)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的血管生成素样蛋白ANGPTL4。此外,该术语还包括全长的ANGPTL4及其片段。本发明所指的ANGPTL4蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
在本发明中,术语“ANGPTL4基因”、“ANGPTL4多核苷酸”或“血管生成素样蛋白基因ANGPTL4”可互换使用,都指具有人ANGPTL4核苷酸序列(AF202636)的核酸序列。需理解的是,当编码相同的氨基酸时,密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是,由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时,核苷酸的变换也是可被接受的。
在得到了ANGPTL4的氨基酸片段的情况下,可根据其构建出编码它的核酸序列,并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的ANGPTL4核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ANGPTL4多肽。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码人ANGPTL4多肽的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,ANGPTL4多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ANGPTL4编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;昆虫细胞;动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
特异性抗体
在本发明中,术语“本发明抗体”和“抗ANGPTL4的特异性抗体”可互换使用。
本发明还包括对人ANGPTL4多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于人ANGPTL4基因产物或片段。较佳地,指那些能与人ANGPTL4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ANGPTL4蛋白的分子,也包括那些并不影响人ANGPTL4蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人ANGPTL4基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab”或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人,美国专利No.4,946,778);或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的人ANGPTL4基因产物或者其具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的,表达人ANGPTL4蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人ANGPTL4蛋白功能的抗体以及不影响人ANGPTL4蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ANGPTL4基因产物的片段或功能区,通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人ANGPTL4基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生;与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人ANGPTL4蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测标本(尤其是血清样本)中的人ANGPTL4蛋白。
检测方法
利用ANGPTL4存在于血清中,且与肿瘤缺氧密切相关这一特点,本发明还提供了缺氧检测的方法,尤其是血清学检测方法。
在本发明的一个优选例中,本发明提供一种检测血清ANGPTL4的ELISA法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。
检测试剂盒
本发明还提供了一种缺氧检测的试剂盒,它含有本发明的抗ANGPTL4的免疫球蛋白或免疫偶联物,或其活性片段。
用本发明的人缺氧检测的血清学诊断试剂盒检测为阳性的对象,其肿瘤缺氧程度明显高于正常人群或一般肝癌患者。
本发明的主要优点包括:
(1)首次提供了一种通过血清标志物检测和判断肿瘤缺氧程度的方法,有助于检测或辅助检测缺氧状态,从而有助于尽早采取相应治疗措施。
(2)血清检测方法更方便快速,更容易为病人接受。
(3)便于动态监察HCC患者的病情进展。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实验方法
缺氧实验
缺氧实验在三气(CO2/N2/O2)细胞培养箱中进行。实验前一天取对数期生长的细胞接入6孔板,并在37℃,5%CO2和饱和湿度条件下培养;待细胞贴壁后(约24小时),将细胞转移到三气培养箱,在37℃,5%CO2,2%O2和饱和湿度条件下培养24小时,裂解细胞,制备蛋白和总RNA。
DFO处理模拟缺氧环境实验:
实验前一天取对数期生长的细胞接入6孔板,并在37℃,5%CO2和饱和湿度条件下培养;铁离子螯合剂(甲磺酸去铁胺)(Deferoxamine mesylate,缩写DFO,购自Sigma公司)稀释于含10%FBS的DMEM中,DFO设梯度浓度,分别为2μM、20μM和200μM;细胞培养约24小时后,每孔加入2ml配制好的含DFO的DMEM,继续培养24小时,裂解细胞,制备蛋白和总RNA。
2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,缩写2ME2,购自sigma公司)处理实验:
同上述接种细胞,2ME2设梯度浓度稀释于含10%FBS的DMEM中,浓度分别为0.2μM、1μM、5μM、25μM和50μM;细胞培养约24小时后,每孔加入配制好的含2ME2的DMEM,继续培养24小时,裂解细胞,制备蛋白和总RNA。
HIF-1α和HIF-2α干扰后缺氧实验:
siRNA干扰HIF-1α和HIF-2α实验按“siRNA干扰试验”一节中所述方法进行;干扰24小时后将细胞转移到三气培养箱,在37℃,5%CO2,2%O2和饱和湿度条件下培养24小时,裂解细胞,制备蛋白和总RNA。
siRNA干扰实验
将siRNA干扰片段采用逆向转染的方法导入目标细胞中。转染前将40pmolsiRNA片段和2μl Lipofectamine 2000分别溶于100μl Opti-MEM,轻轻摇匀,静置5分钟;然后将Lipofectamine 2000稀释液加入到siRNA片段稀释液中,再静置20分钟;在静置期间将贴壁细胞消化悬于无抗生素的DMEM培养基中,使细胞浓度约为1×105个/ml;待siRNA-Lipofectamine 2000复合物形成后,将混合液吸至12孔板中;然后将1ml细胞悬液加入已含有siRNA-Lipofectamine 2000溶液的孔中混匀;转染后细胞置于37℃,5%CO2和饱和湿度条件下,培养24-48小时再进行基因敲减的验证和功能实验。
siRNA干扰缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α表达实验
siRNA干扰片段采用逆向转染的方法导入目标细胞中。各有效干扰片段序列见表1:
表1.siRNA片段序列
跨血管内皮细胞迁移实验
所用肿瘤细胞均由质粒pLGS标记,该质粒是luciferase和GFP双标的质粒,是将含luciferase和GFP两个基因的DNA片段通过BamHI/XhoI酶切位点装入pWPXL载体而形成)。取对数期生长的常规的人内皮HUVEC细胞(ATCC:CRL-1730)接入Trans-well小室(3×104细胞,100μl DMEM培养基),培养至细胞融合(约24h);接种悬于100μl DMEM的1×105肿瘤细胞,下室加含10%FBS的DMEM,三孔重复;20小时后,小室用4%的福尔马林固定;将小室外侧的细胞刮掉,在倒置荧光显微镜下观察,随机选拍6个视野,进行计数并分析。
ANGPTL4抗体处理实验
HUVEV细胞的接种同前。接种肿瘤细胞时,在肿瘤细胞的悬液中加兔抗ANGPTL4抗体(可购自Santa Cruz,M-200,sc-66807),至终浓度为40μg/ml;对照组加相同浓度的不针对ANGPTL4的兔IgG对照抗体;其余步骤同上。
细胞免疫化学分析
切片预处理:将5μm厚度的肝癌组织微阵列切片在二甲苯中脱蜡两次,每次10分钟,然后通过梯度酒精水化。组织中内源性过氧化物酶灭活采取的方式是将切片在含0.3%过氧化氢的甲醇中室温孵育30分钟,抗原修复则通过将切片置于柠檬酸盐缓冲液(10mM,pH 6.0)中微波(>94℃)加热10分钟。
组化抗原标记:室温下SuperBlocking封闭液(可购自Pierce公司)封闭30分钟后,切片在4℃下与一抗孵育过夜,次日在PBS中洗涤三次,每次5分钟,共15分钟,再在室温下进行1小时的二抗孵育、常规DAB显色。显色后切片采用苏木素复染,行常规脱水、透明、中性树胶封片,染色结果在显微镜下观察并拍照。
SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹分析
细胞裂解和蛋白电泳:用冰预冷的PBS洗涤培养细胞,收集后将其悬在含有蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)的RIPA缓冲液(购自Pierce公司)中裂解,裂解过程在冰上进行30分钟。4℃条件下12,000r/min离心10分钟后收集上清,然后采用常规BCA法蛋白定量。定量后的样品与5×上样缓冲液混合并在95-100℃水浴中变性5分钟。蛋白电泳在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)及缓冲体系中进行,样品按30-60μg/孔上样,80/120V恒压电泳。
免疫印迹:电泳结束后,采用湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜条件:220mA恒流作用30分钟。结束后将膜在PBST(0.1%Tween 20)中漂洗一次,浸入5%脱脂奶粉封闭液中,室温封闭1小时。然后将膜浸入用封闭液稀释的适当浓度的一抗,4℃孵育过夜。次日以PBST洗膜三次,每次10分钟。之后与封闭液稀释的过氧化物酶偶联二抗进行反应,室温孵育1小时后,再以PBST洗膜三次。目标蛋白条带的发光显影利用SuperSignal化学发光试剂(购自Pierce公司)进行。
所有Western免疫印迹实验均以β肌动蛋白(β-actin)作为内参。
实时定量PCR检测
逆转录:用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara公司),在200μl微量离心管中配置混合液:5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2μl;PrimeScript RTEnzyme Mix I 0.5μl;Oligo dT Primer(50μM)0.5μl;Random 6mers(100μM)0.5μl;总RNA 500ng;DEPC水补足10μl。37℃反应15分钟,85℃处理5秒钟,然后冰浴冷却。其中,总RNA用常规方法抽提。
定量PCR:将逆转录得到的cDNA反应液1∶50稀释备用。PCR反应在20μl体系中进行:2μl cDNA稀释液(相当于50ng起始RNA量);上下游引物各0.4μl;2×SYBR Premix Ex TaqTM Solutions(Takara公司)10μl;灭菌蒸馏水7.2μl。PCR反应在ABI 7300定量PCR仪上进行,反应条件为两步法PCR扩增标准程序:第一步95℃,30秒,1个循环;第二步95℃,5秒,60℃,31秒,40个循环。反应测得的基因表达水平使用内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为参照标化。
条件性培养基上清的收取
将生长状态良好的细胞消化计数,每种细胞均以相同细胞数接至10cm的细胞培养皿中。到第二天约达到90%左右的融合度,换含0.02%FBS的DMEM。在37℃,5%CO2和饱和湿度条件下培养24小时,收取培养基上清,4℃条件下3000r/min离心备用。若用于Western blot实验的样品,与5×上样缓冲液混合并在95-100℃水浴中变性5分钟。
分泌性ANGPTL4蛋白的ELISA检测
细胞培养基上清以及裸鼠血清中sANGPTL4的浓度测定均按照R&D公司ELISA Development System说明书进行,方法如下:
1)在不含任何蛋白的PBS中稀释捕获抗体(浓度为0.8μg/ml),将该稀释后的捕获抗体100μl/孔加入到酶标板内。
2)将酶标板封好防止蒸发,在室温孵育过夜。
3)吸干每一孔的液体并加400μl洗液洗涤,重复3次。最后一步,将板中液体移出并将酶标板在干净的纸巾上吸附。
4)加300μl/孔封闭液封板,室温孵育1小时。
5)重复步骤3。
6)每孔加100μl适当稀释的标准品和标本,轻轻拍打酶标板1分钟。贴上封板膜,室温孵育2小时。本研究中样本的稀释度为1∶10或1∶50。
7)重复步骤3。
8)每孔加100μl检测抗体(浓度为400ng/ml),贴上新的封板膜,室温孵育2小时。
9)重复步骤3。
10)每孔加100μl链亲和素(Streptavidin)-HRP。
11)重复步骤3。
12)每孔加100μl底物(TMB液体底物系统,Sigma Aldrich公司),避光,室温孵育5-30分钟进行显色反应。
13)每孔加50μl终止液(2N H2SO4),轻轻振荡酶标板确保充分混匀。
14)在30分钟内在酶标仪上采用450nm波长对结果进行判读。
15)数据分析和计算。
重组表达载体pWPXL-ANGPTL4的构建
用肝细胞cDNA为模板,设计和合成引物扩增人ANGPTL4的完整的全长序列,并在5’端和3’端分别引入PmeI/NdeI酶切位点。通过常规PCR法扩增ANGPTL4开放阅读框。将扩增的PCR扩增片段纯化后用PmeI/NdeI酶切,与同样经过PmeI/NdeI酶切的pWPXL载体(可购自Addgene公司)连接,16℃连接过夜,获得pWPXL-ANGPTL4,并经酶切检验和测序验证。
包装病毒
本发明中使用的慢病毒包装体系是购自Addgene公司的三质粒系统,包括pWPXL/pLVTHM(携带目的基因或干扰片段),psPAX2和pMD2.G。将生长状态良好的HEK-293T细胞(ATCC:CRL-11268)接至10cm的细胞培养皿中,到第二天约达到95%以上的融合度,进行转染。转染试剂用Lipofectamine 2000,三质粒的用量的摩尔比为1∶1∶1,总量为24.6μg。操作过程参照Lipofectamine 2000的操作说明:将12μg的pWPXL/pLVTHM或相应的pWPXL-ANGPTL4/pLVTHM-shRNA,9μg psPAX2和3.6μg pMD2.G与1.5ml的Opti-MEM混合,60μl的Lipofectamine2000与1.5ml的Opti-MEM混合,室温放置5分钟;将以上两种混合液轻柔混合,室温孵育20分钟,形成转染复合物;将混合液加入到已接好的HEK-293T细胞中,再加DMEM至总体积10ml;转染6小时后换10ml含10%FBS的DMEM,终止转染;24小时后观察荧光,转染效率要达到90%以上;60小时收取培养液,4℃条件下3000r/min离心,0.4μm的滤膜过滤,滤液分装,-70℃冻存备用。
肿瘤细胞的病毒感染
将生长状态良好的肿瘤细胞,接至6孔板,第二天约达到60-70%的融合度,进行感染。用含10%FBS的DMEM将病毒液1∶4稀释,在稀释液中加polybrene至终浓度为10μg/ml;将稀释液加到细胞中,培养6小时后换10%FBS的DMEM。24小时可观察荧光。
数据处理
实验获得数据按常规方法进行整理和统计分析。计量数据以平均值±标准差的形式表示,采用Student's t-test分析其统计学意义;分类数据采用Chi-square检验。统计检验得到的概率P<0.05认为具有统计学意义。
实施例1
缺氧能明显上调ANGPTL4表达
将肝癌细胞系SMMC-7721、Huh7、MHCC-97L细胞在缺氧条件下培养24小时,收集蛋白和总RNA,进行Western印迹和定量PCR检测,结果表明在缺氧条件下,ANGPTL4的表达能明显上调(图1a,b)。
缺氧诱导剂DFO能够在常氧状态下模拟缺氧环境,DFO处理SMMC-7721和MHCC-97L细胞24小时后,发现DFO在稳定HIF-1α蛋白的同时,也上调了ANGPTL4的表达(图1c左侧为MHCC-97L、右侧为SMMC-7721细胞细胞)。
进一步在裸鼠成瘤组织中利用免疫荧光的方法检测了HIF-1α和ANGPTL4的表达,结果表明随着成瘤时间的延长,肿瘤体积增大,瘤内缺氧程度增加,HIF-1α和ANGPTL4的表达均上调,并在缺氧区共表达(图1d上面为MHCC-97L细胞、下面为SMMC-7721细胞)。这一结果在肝癌患者临床标本中也得到了验证(图1e)。
以上结果表明,ANGPTL4的表达与肝癌细胞缺氧状态密切相关,可作为肿瘤细胞的缺氧检测的标志物。
实施例2
缺氧通过HIF-1α蛋白上调ANGPTL4的表达
为了确定缺氧在肝癌细胞中对ANGPTL4的影响,本实施例中利用siRNA技术(序列见表1)进一步研究在此过程中起关键作用的转录因子。
实验结果表明:在肝癌细胞MHCC-97L中,用siRNA干扰HIF-1α后,即使在缺氧条件下培养细胞,ANGPTL4水平也不再明显上调;而干扰HIF-2α后,缺氧条件下培养细胞,ANGPTL4蛋白仍然明显上调(图2a)。
为证实该结果的可靠性,在肝癌细胞SMMC-7721中进行了同样的实验,结果表明在两个不同的肝癌细胞所得的结果是一致的(图2b)。
2-甲氧基雌二醇(2ME2)是雌激素的生理代谢产物,研究发现2-ME在体内外抑制多种实体瘤的生长和血管新生,包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、脑瘤、肝癌、前列腺癌和鼻咽癌等等。
2ME2是HIF-1α的抑制剂,有报道表明,2ME2能够通过抑制HIF-1α从而进一步抑制肿瘤的生长和血管新生,可作为实体瘤的抗肿瘤药物。本实施例也验证了在肝癌细胞系中2ME2对ANGPTL4的调节作用。
结果表明,在缺氧条件下,2ME2能够降低HIF-1α的蛋白量,同时也下调了ANGPTL4的表达,起到了与干扰HIF-1α相似的作用;同时还发现,2ME2对肝癌细胞的作用具有药物剂量依赖性(图2c左侧为MHCC-97L细胞,右侧为SMMC-7721细胞)。
实施例3
ANGPTL4是HIF-1α的靶基因
前述试验结果已表明HIF-1α和ANGPTL4的表达密切相关,缺氧可能是通过HIF-1α调控ANGPTL4的表达。在本实施例中,采用染色质免疫共沉淀(ChIp)实验进行进一步验证。方法如下:
SMMC-7721和MHCC-97L细胞在缺氧或常氧条件下培养24小时。然后在室温下在含1%甲醛的PBS中进行DNA-蛋白质交联10分钟。随后,利用抗缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)单克隆抗体(购自Sigma公司)或对照IgG抗体(购自Sigma公司)按照染色质免疫沉淀试剂盒(Sigma公司)说明书进行沉淀反应。沉淀得到的DNA纯化后作为模板,进行PCR检测。
如果HIF-1α与ANGPTL4的启动子区发生了结合,则对沉淀并纯化的DNA用针对ANGPTL4启动子各相应区域的特异性引物进行PCR扩增时,会产生相应的特异性扩增产物条带。
结果如图3所示,证实HIF-1α可以与ANGPTL4启动子区的HRE结合(图3a,b),不仅表明ANGPTL4是HIF-1α的靶基因,而且还证明了HIF-1α通过与ANGPTL4结合区的HRE1部分结合而形成的“HIF-1α蛋白-ANGPTL4”复合物。
实施例4
ANGPTL4抗体处理肝癌细胞可部分抑制其缺氧诱导的跨血管内皮细胞迁移
本发明人比较了SMMC-7721细胞在缺氧培养条件下和常氧培养条件下的跨血管内皮细胞迁移能力。
结果表明,在缺氧条件下培养,SMMC-7721具有更强的跨血管内皮细胞迁移能力。
为了验证ANGPTL4在这一过程中所起的重要作用,利用ANGPTL4抗体处理SMMC-7721细胞。
结果发现缺氧诱导的SMMC-7721细胞的跨血管内皮细胞迁移被ANGPTL4抗体部分抑制(图4),这提示说明ANGPTL4在缺氧诱导的跨内皮迁移中扮演了重要的角色。
实施例5
ANGPTL4在细胞水平和动物体内均能有效分泌至培养上清或血清中并能通过ELISA检测。
采用定量PCR方法和Western blot检测了多种常用的肝癌细胞系中ANGPTL4mRNA和蛋白的表达水平。
结果如图5所示。研究结果表明,在各种肝癌细胞培养上清中可以通过ELISA方法检测ANGPTL4浓度,其水平与细胞裂解液中表达的趋势相一致(图5a为各种肝癌细胞系细胞裂解液中ANGPTL4的蛋白水平,图5b为各种肝癌细胞系细胞培养上清液中ANGPTL4的蛋白水平)。
此外,本实施例中还选取ANGPTL4低表达的肝癌细胞Huh7和SMMC-7721,利用慢病毒载体构建了ANGPTL4稳定过表达细胞系,分别命名为Huh7-lenti-ANGPTL4和SMMC-7721-lenti-ANGPTL4,相应的对照命名为Huh7-lenti-control和SMMC-7721-lenti-control。
同样,在常氧条件下,过表达ANGPTL4的细胞系的细胞裂解液和培养上清中检测到的ANGPTL4水平相一致的(图5c,d)。将过表达外源ANGPTL4的细胞系细胞接种于裸鼠体内,在裸鼠血清中可采用ELISA方法检测到与细胞表达水平相一致的ANGPTL4浓度(图5e)。
实施例6
检测缺氧的试剂盒
制备一用于血清学检测缺氧的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)容器,以及位于容器内的特异性针对ANGPTL4的以下抗体:兔抗ANGPTL4抗体(可购自Santa Cruz,M-200或Invitrogen公司);和
(b)以及标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测。
用上述检测试剂盒,可通过ELISA法定量检测了未知血清样本中ANGPTL4的含量,并与标准值(正常人群中ANGPTL4的含量)相比,当ANGPTL4的含量明显高于标准值(如测量值,标准值≥1.5,较佳地≥2,更佳地≥3)时,可评定存在较高几率的缺氧。
实施例7
检测缺氧的试剂盒
制备一用于检测缺氧的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)容器,以及位于容器内的特异性针对HIF-1α的抗体:兔抗HIF-1α抗体(可购自购自Sigma公司或Abcam公司);
(b)特异性扩增ANGPTL4的启动子区HRE1的引物;以及
(c)标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测。
用上述检测试剂盒,先通过免疫沉淀,捕获HIF-1α以及处于结合状态的“HIF-1α-ANGPTL4”复合物。然后,将沉淀得到的DNA纯化后作为模板,进行定量PCR检测,从而测得未知样本中“HIF-1α-ANGPTL4”复合物的含量,并与标准值(正常人群中“HIF-1α-ANGPTL4”复合物的含量)相比,当“HIF-1α-ANGPTL4”复合物的含量明显高于标准值(如测量值,标准值≥1.5,较佳地≥2,更佳地≥3)时,可评定存在较高几率的缺氧。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特异性抗体的用途,其特征在于,用于制备肝癌细胞缺氧检测的诊断试剂。
2.血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特异性抗体的用途,其特征在于,所述血管生成素样蛋白4或其特异性抗体被用于制备肝癌细胞缺氧检测的诊断试剂盒。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有可检测标记。
4.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体带有可检测标记。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述可检测标记选自下组:化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
6.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述可检测标记为生色团。
7.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述诊断试剂是单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的缺氧检测是血清检测。
9.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述试剂盒含有:
(a)一容器,所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特异性抗体;以及
(b)标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测。
10.一种用于肝癌细胞缺氧检测的诊断试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒含有:
(a’)一容器,所述容器中含有抗HIF-1α的特异性抗体和另一容器以及位于该另一容器中的特异性扩增ANGPTL4启动子区域HRE1的特异性引物;以及
(b’)标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测。
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