TWI512294B - 偵測致死系統之方法與組合物及其用途 - Google Patents

偵測致死系統之方法與組合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI512294B
TWI512294B TW100125785A TW100125785A TWI512294B TW I512294 B TWI512294 B TW I512294B TW 100125785 A TW100125785 A TW 100125785A TW 100125785 A TW100125785 A TW 100125785A TW I512294 B TWI512294 B TW I512294B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nfa
cancer
tumor
cell
patient
Prior art date
Application number
TW100125785A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201226903A (en
Inventor
Shiaw Der Yang
Original Assignee
Nat Univ Tsing Hua
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nat Univ Tsing Hua filed Critical Nat Univ Tsing Hua
Publication of TW201226903A publication Critical patent/TW201226903A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI512294B publication Critical patent/TWI512294B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

偵測致死系統之方法與組合物及其用途
本發明有助於確認及偵測癌症微轉移；及預測不同類型之癌症病患(不論癌症之病因起源)預後的方法、套組以及其用途。本發明進一步提供一方法與套組幫助預測一病患是否具有轉移潛能之疾病以及是否罹患全身性轉移之風險。
大部分的死亡源自癌症，此係由於轉移性病灶所致。然而，在過去50年來，因癌症研究而產生近200萬篇論文後，我們尚未了解癌細胞轉移是何時以及如何發生。目前可以確定的是：轉移是癌細胞與其微環境間發展過程之最終產物；且全身性癌症的發展可能是由於原發性腫瘤之平行發展，和源自早期有傳播性之上皮細胞與間質樣腫瘤細胞(MTC)/間質樣腫瘤幹細胞(MTSC)所產生之轉移，而上述有傳播性之上皮細胞與間質樣腫瘤細胞(MTC)/間質樣腫瘤幹細胞(MTSC)則是經由腫瘤細胞與基質細胞兩者所產生之複合誘導物，將上皮-間質轉換(EMT)穩定改編而產生的。然而，作為主要協調者以調節此複合網絡之關鍵信號分子至今仍然尚未被證實。此外，學界普遍認為光依賴細胞培養與動物實驗可能無法為全身性臨床腫瘤學的研究上提供精確的模型。雖然自腫瘤移植實驗可得到獨具價值的結果，但是在扼要的解讀、詮釋此一整體性結果之數據上，則需要被強調且慎重執行，且這些結論須以癌症病患中之自發性腫瘤模式進行驗證。例如，一些動物模式，譬如源自於發展腫瘤或轉移之細胞株的異種移植，且這種針對人類癌症，特別是與旁分泌、自分泌及內分泌複合網絡模式有關之保真度是備受質疑的。這也許可以解釋為何在產生近兩百萬篇癌症論文後，我們尚未了解轉移是何時以及如何發生，而得知此基本機制在癌症死亡率上具有相當大的影響。這也解釋為何歷經過去50年的全面性癌症研究，以目前的治療方式往往無法治癒癌症病患。得自於實驗室細胞培養與動物實驗之關鍵結果，肯定必須以人類臨床樣本與癌症病患之腫瘤進行驗證。
相較於單一癌症細胞疾病之領域，結合分子、細胞及全身臨床腫瘤學之領域，使我們對於癌症的了解更加深入。此外，癌症係涉及在一般典型之癌細胞、宿主基質及骨髓細胞(BMC)相互之間之協同進化作用，並伴隨著充作媒介之趨化因子與細胞因子網絡，此網絡係關於一多向性的信號網絡機制。因此除了同時針對癌細胞組成物之外，還更需要針對癌症相關之基質以及涉及轉移前微環境形成、異常骨髓(BM)微環境形成及原發性內分泌煽動之全身散播之骨髓細胞(BMC)，如此應該可改善大部份癌症病患之治療、整體存活及最重要的生活品質。然而，在癌症發展期間，關於腫瘤-EMT-基質協同進化信號之惡性循環，與在細胞與全身臨床腫瘤學上之最具潛力的分子信號標的仍有待證實。
最初，核因子A(NFA)係經確定為一種ATP．Mg-依賴蛋白磷酸酶之特定細胞膜與細胞質的活化因子A，但後來被稱之為一種多受質/多功能之脯胺酸導引蛋白激酶(PDPK)。由於在激酶結構域上之序列同源性極高，NFA因此被視為GSK 3的亞型(肝醣合成酶激酶3)，且更名為GSK-3 α。雖然GSK 3/GSK-3 β與NFA/GSK-3 α兩者在激酶結構域上結構相似且長期以來多被視為兩種密切相關之信號分子，然而當根據本發明中所證實之人類臨床研究時，這些信號分子之功能並非等同於先前在果蠅與齧齒動物中之研究。此外，深入的研究及大多數的注意力都集中在GSK-3 β上，卻以GSK-3之名稱之，並未在許多領域的研究上對此GSK-3有進一步詳盡之說明，且抑制此種激酶可能會導致腫瘤形成，所以如何治療糖尿病而不引發癌症，便成為一個重要的課題。因此，NFA之獨特角色已被忽略超過十年。為避免不必要的混淆，NFA一詞將用以充分說明這個新的多受質/多功能激酶舉足輕重的重要角色，以供更全面、完善的癌症控制之應用。
無論癌症的病因為何，如果在細胞內單一獨特分子的表現及病患的疾病狀態之間存在著可被預測的關係，那將會大受激賞。然而關於一種利用細胞內分子之表現情形，以評估、判斷病患罹患不可治癒疾病之風險的方法目前並無成功之先例。
相較於單一癌症細胞疾病之領域，結合分子、細胞及全身臨床腫瘤學之領域，使我們對於癌症的了解更加深入。此外，癌症係涉及在一般典型之癌細胞、宿主基質及骨髓細胞(BMC)相互之間之協同進化作用，並伴隨著充作媒介之趨化因子與細胞因子網絡，此網絡係關於一多向性的信號網絡機制。因此除了同時針對癌細胞組成物之外，還更需要針對癌症相關之基質以及涉及轉移前微環境形成、異常骨髓(BM)微環境形成及原發性內分泌煽動之全身散播之骨髓細胞(BMC)，如此應該可改善大部份癌症病患之治療、整體存活及最重要的生活品質。相對於PDPK FA/GSK-3α(主要與主流癌症研究相關)與主要著重於如上述主流癌細胞之先前成果，本發明係關於一種藉由一般典型之癌細胞、宿主基質及骨髓細胞(BMC)間之趨化因子與細胞素的網絡，以檢視PDPK在該前述幾種細胞相互之間的作用與協同進化作用所扮演的角色。利用此新的方法，證實PDPK FA/GSK-3α在寄生基質與骨髓細胞(BMC)中的異常表現，在測定轉移潛能上，扮演著決定性與指標性的角色。癌症病患若在一般典型之癌細胞、寄生基質及骨髓細胞(BMC)之中，發現PDPK FA/GSK-3α在相互作用與協同進化作用上有異常表現，則傾向於發展轉移性疾病。因此，在一般典型之癌細胞、寄生基質及骨髓細胞(BMC)間之相互作用與協同進化作用的情況下，若帶有PDPK FA/GSK-3α之異常表現，則在本發明中統稱為「致死系統」。本文所提供之致死系統為有助於檢測轉移之普遍適用的預測因子，無論癌症病因起源為何，有助於監測不同類型癌症病患中之疾病狀態與治療反應及其用途。更值得一提的是，該致死系統為一種可靠的預測因子，無論病因起源為何，可用於檢測是否病患具有轉移及處於發展轉移之風險。
因此，於一方面，本發明提供的是一種檢測方法，用來檢測細胞表現型態之存在，較佳的是關於可用以指出一病患是否具有一致死系統的標誌細胞，該方法包括取得該病患之一生物性樣本；在生物樣本中，測定標誌細胞中之NFA之表現，其中在該病患標誌細胞中之NFA 的表現係指出致死系統的存在，其中該標誌細胞為間質腫瘤細胞(MTC)。於一些實施例中，NFA之表現係經由分析NFA蛋白質含量而決定，例如使用對NFA專一抗體的免疫分析法。在其他方面，該表現可藉由評估其活性、蛋白質、mRNA或DNA含量進行測定。生物性樣本可為骨髓、臍帶血、周邊血液、組織樣本、腹水、胸膜積水或體液。
於一方面，生物性樣本中之致死系統之辨識可用於預測癌症病患之預後，且預測是否病患具有轉移潛能及處於發展轉移之風險。
於另一方面，本發明所提供的是一種用以測定一生物樣本中致死系統之存在的診斷套組，該診斷套組至少包括用來測定該樣本中NFA表現的試劑，以及用來評估致死系統之存在，共同包裝於一容器內的印刷操作說明。亦可包括其他檢測試劑。
再者，於另一方面，本發明所提供的是一種預測方法，該方法用於預測癌症病患之預後，且預測病患是否具有轉移潛能及是否處於發展轉移之風險中。該方法包括取得該病患之一生物性樣本；測定該樣本中之NFA之表現，其中NFA之表現係用以預測該病患是否正處於發展轉移之風險中。於一些實施例中，NFA之表現係經由分析NFA蛋白質含量而決定，例如使用對NFA專一抗體的免疫分析法。在其他方面，該表現可藉由評估其活性、蛋白質、mRNA或DNA含量進行測定。生物性樣本可為骨髓、臍帶血、周邊血液、組織樣本、腹水、胸膜積水或體液。
如有必要，這些細胞可以藉由特殊磁珠或流式細胞分選儀分離出來，用以偵測致死系統中高度表現之NFA。
當瞭解了以下的詳細說明以及附加的圖式及實例後，本發明的這些及其他目的與特徵將全然顯而易見。
為清楚揭露，而不是限定，本發明的詳細描述被細分為如下的次段落。
A.定義
除非有其他定義，所有在此所用的技術及科學詞彙，如同作為本發明所屬技術領域中具有一般技藝者一般性地了解具有相同意義。在此指稱的所有專利、申請案、公開申請案及其他應用，以及基因庫登錄號皆完整以參考文獻被整合起來。若本章節提出的定義與其他專利、申請案、公開申請案及其他在此引用的參考文獻所提出的定義相反或不一致，以本章節提出的定義為主。
如本文中所使用之「一」或「一個」係意謂「至少一個」或「一或多個」。
如本文中所使用之「NFA」一詞係指脯胺酸導引蛋白激酶FA，亦被稱為肝醣合成酶激酶-3 α。關於此蛋白質之基因庫登錄號為AAD11986與AAH27984。
如本文中所使用之「生物樣本」係指來自一生物來源之任何樣本，包括但不限於骨髓、血液、組織樣本、腹水、胸膜積水、體液或細胞系。
如本文中所使用之「抗體」一詞係指一種經單離或重組結合之試劑，其包括必要的變異區序列以專一性鍵結一抗原決定位。因此，抗體是表現所要求生物活性之任何型式的抗體或其片段，例如，結合特定的目標抗原。因此，只要抗體表現出所預期的生物活性，例如專一性結合NFA時，用於被廣泛認知及特定地涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、人類抗體、擬人化抗體、嵌合抗體、奈米抗體、雙價抗體、多重專一抗體(例如雙特異抗體)及抗體片段，包括但不限於scFv、Fab及Fab2。
如本文中所使用之「標誌細胞」一詞係指可藉由標誌而識別之細胞，較佳為骨髓細胞(bone marrow cell,BMC)或癌症相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast,CAF)或循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)或循環腫瘤幹細胞(circulating tumor stem cell,CTSC)或上皮腫瘤細胞(epithelial tumor cell,ETC)或上皮腫瘤幹細胞(epithelial tumor stem cell,ETSC)或造血幹/源祖細胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)或間質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)或間質腫瘤細胞(mesenchymal tumor cell,MTC)或間質腫瘤幹細胞(mesenchymal tumor stem cell,MTSC)或腫瘤伴生巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)。舉例之標誌包括但不限於CD34、CD68、CD90、波形蛋白、成纖維細胞特異蛋白-1(FSP-1)、S100鈣結合之蛋白A4(S100A4)。
如本文中所使用之「致死系統」一詞係指與標誌細胞中NFA異常表現有關聯的訊號交互作用網絡，較佳的是上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)或腫瘤-基質協同演化交流(tumor-stroma coevolutional communication,TSCC)。
如本文中所使用之「預後」一詞係指對於患有特殊疾病或病症(譬如癌症)之病患經過特定治療或干預後所預測之結果。
如本文中所使用之「轉移潛能」一詞係指癌細胞從原本的部位轉移至一或多個其它身體部位。
除非特別說明，對熟悉所屬技術領域、本發明所使用的實例、生化及臨床病理學技術的常用技術，所有在此使用的術語具有與一般技藝者的知識相同的意義。
B.用以偵測致死系統的方法及套組
與NFA異常表現相關的細胞，較佳地為一標誌細胞，稱為致死系統，提供一工具以鑑定一病患是否具有轉移潛能及是否處於發展轉移的風險中。於一方面，鑑定一生物樣本中之致死系統可用來監測各種類型癌症病患之疾病狀態與治療反應，且預測微轉移之發展。
因此，本發明之一目的即是提供一種偵測病患具有致死系統之細胞表現型態存在之方法，該方法包括取得來自該病患之一生物樣本，測定在該樣本細胞內NFA之表現，其中該病患細胞內NFA之表現顯示致死系統存在。在一些實施例中，NFA的表現係藉由分析NFA蛋白含量而進行測定，例如使用對NFA專一的抗體免疫分析法。在其他方面，該表現可藉由評估其活性、蛋白質、RNA或DNA含量而測定。生物樣本可為骨髓、臍帶血、周邊血液、組織樣本、腹水、胸膜積水或體液。
本發明之另一目的即是提供一種用以測定一生物樣本中致死系統之存在的套組，其中至少包括用以測定該樣本的細胞中NFA表現的一試劑，以及共同包裝於一容器、用以評估NFA相對含量的印刷操作說明。
任何偵測NFA表現的適當裝置可能被使用。該表現可藉由評估其在一生物樣本之細胞中的活性、蛋白、RNA或DNA含量而測定。例如，使用對NFA專一的抗體的免疫分析法可被採用。適當方法包括但不限定於免疫組織化學分析、免疫細胞化學分析、流式細胞分析、西方墨點分析、北方墨點分析、反轉錄-聚合酶鏈鎖反應及針對特定受質的磷酸化試驗。利用免疫組織化學染色技術，一般利用脫水及固定方式來製備一細胞樣本，再與耦合基因產物專一的標幟抗體進行反應，其中該標幟物通常是視覺上可偵測的，例如酵素標幟物、螢光標幟物、冷光標幟物及其類似物。
根據一實施例，取得來自病患之組織樣本，並且根據傳統組織錶裝技術，包埋該樣本再切片為例如3-5μm，固定、錶裝及乾燥，固定液可包括：例如福馬林，用以錶裝切片的包埋液可包括：例如石蠟，樣本可儲存於此條件下。在去石蠟及脫水後，樣本與包含對NFA專一之抗體的免疫試劑接觸，而抗體可包含多株或單株抗體，其中可包括完整抗體或能專一性地結合NFA蛋白的抗體片段。適當的多株抗血清或其他抗體可藉由對NFA蛋白或該蛋白合適片段免疫之適合的寄主動物而進行製備，並依據本技術領域的一般技藝者所知的通常技術收集及純化抗血清。專一性地與NFA反應的單株或多株抗體，較佳地為單株抗體，可由本領域所熟知的方法製作。而且，重組抗體也可由本領域所知的方法製作。具有108M-1親和力的單株抗體是較佳的，更佳地為109至1010M-1或更高。
抗體不是直接地就是間接地帶有一合適的偵測標幟物。或者，偵測標幟物可結合至二級抗體，例如可與一級抗體結合的羊抗兔免疫球蛋白G(goat anti-rabbit IgG)。多胜肽及抗體會藉由共價地或非共價地結合標幟上一種物質，以提供一個可偵測之信號。合適的標幟物包括但不 限定於放射性核酸、酵素、受質、輔助因子、抑制劑、螢光試劑、冷光試劑、磁性粒子及類似物。
可使用任何合適的方法，以取得來自病患之生物樣本。生物樣本可為周邊血液、臍帶血、骨髓、組織樣本、腹水、胸膜積水或體液。
用以測定一病患是否具有微轉移且是否處於發展轉移之風險中的套組，包括至少一容器，其至少包含一用以測定在此定義之細胞中NFA表現的試劑，及用以評估一生物樣本中的細胞是否含有一或多個致死系統的印刷操作說明。如本文中所使用之「試劑」一詞係意謂任何用於完成本發明所提供之任何方法的化合物、組合物或生物試劑(意即樣本、液體、或細胞「劑量」、抗體等)，包括但不限定在用於NFA的抗體、用於分離及製備細胞的緩衝液與載體、及/或用以分析及處理的膜、用於完成飽和及競爭結合試驗的緩衝液與載體、及放射性與非放射性標幟化合物。印刷操作說明亦包括試驗結果與致死系統表現型對照的操作說明。
C.實施例
除非在特定實施例中另有指示，否則所有免疫組織化學分析、免疫表現型分析、免疫細胞化學分析及統計分析以下列方法進行。
病患：關於免疫組織化學分析所使用之臨床病理資料與標本係經由病患醫療記錄之詳細回顧而得，這些病患在1987年至2004年之間，於台灣台北市台大醫院，進行癌症之最初腫瘤切除手術。將手術切除之標本固定於10%福爾馬林中，並常規處理以供石蠟包埋。將連續切片使用HE(hematoxylin and eosin)染色法染色以供組織分析，且觀察病患，直到2006年4月為止。此研究係經由該機構之監督與倫理委員會核准。
專一的抗NFA抗體之生產、鑑定及特徵
對應於NFA胺基酸序列471-483之羧基終端區域的胜肽QSTDATPTLTNSS(SEQ ID NO：1)係經由胜肽合成儀(型號9050，Milligen，Bedford，馬里蘭州)進行合成。根據由Reichlin(1980)所描述之過程，使用戊二醛作為交聯劑，將半胱胺酸殘基加至NH2端，以促進胜肽之耦合至牛血清蛋白。經過親和性管柱純化，其抗體產物可 被NFA的胺基酸471-483的C端胜肽中和，實驗的結果均證明此抗NFA抗體具有免疫的專一性。
免疫組織化學分析
以福馬林固定、石蠟包埋含有最多腫瘤細胞之腫瘤的組織切片(5μm)於二甲苯中脫蠟，接著於濃度漸減的乙醇中水合。使內生性過氧化酶以3%過氧化氫阻斷，然後以牛血清蛋白阻斷5分鐘。接著，將玻片上加入以0.05M Tris緩衝液(pH 7.4)稀釋的一級抗體(2μg/mL)NFA、OPN、IL-6、TGF β、TNF α、組織因子及VEGF，於4℃下培養16小時，然後與超級增強劑(super enhancer，Super SensitiveTM Non-Biotin Detection System，BioGenex，San Ramon，CA)於室溫下一起培養20分鐘，再以polymer-HRP(Super SensitiveTM)標幟物培養30分鐘。最後，免疫染色法係以DAB(3-3’ diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色。為了要雙重染色(double staining)，在抑制酵素反應後，將玻片在室溫下於DS-enhancer(Zymed,San Francisco,CA)中培養5分鐘，以防止在兩種染色系統間之交互作用，接著，將玻片與所示之特定標誌物於室溫下一起培養一小時，在清洗後，將玻片與抗小鼠鹼性磷酸酶(anti-mouse alkaline phosphatase)於室溫下一起培養30分鐘。使用BCIP/NBT溶液以顯現鍵結的特定標誌物，譬如波型蛋白/S100A4/FSP-1、CD90、CD34及CD68。NFA、OPN、IL-6、TGF β、TNF α、組織因子及VEGF免疫染色法則係以DAB呈色，為紅棕色。使用BCIP/NBT溶液，使大的圓形波形蛋白+/S100A4/FSP-1+ MTC與較小的梭形CAF、CD90+ MSC/HSPC、CD34+ HSPC及CD68+ TAM局部化而呈藍色。共同染色呈現紫黑色，單一染色法係以蘇木色素進行對比染色，而雙重染色法係以甲基綠溶液進行對比染色。
免疫細胞化學分析
於室溫、700rpm下將平均1×106個細胞進行細胞離心(Kubota 5200，日本)3分鐘，使細胞貼附在塗覆聚離胺酸的玻片上。於染色前，將細胞聚落(cytospots)以3.7%三聚甲醛固定15分鐘，並以0.2% Triton X-100處理90秒。使內生性過氧化酶以3%過氧化氫阻斷，接著以牛血 清蛋白阻斷10分鐘。將玻片與0.05M Tris緩衝液(pH 7.4)中所稀釋的抗NFA(anti-NFA)抗體(2μg/mL)於4℃下一起培養16小時，之後與超級增強劑(super enhancer，Super SensitiveTM Non-Biotin Detection System，BioGenex，San Ramon，CA)於室溫下培養20分鐘，再以polymer-HRP(Super SensitiveTM)標幟物一起培養30分鐘。最後，免疫染色係以DAB(3,3’ diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色。為雙重染色，在抑制酵素反應後，將玻片於DS-enhancer(Zymed,San Francisco,CA)中，在室溫下培養5分鐘，以防止兩種染色系統間之交互作用，然後，將玻片與所示之特定標誌物在室溫下一起培養1小時，於清洗後，將玻片與抗小鼠鹼性磷酸酶(anti-mouse alkaline phosphatase)於室溫下培養30分鐘。使用BCIP/NBT溶液以顯現鍵結的特定標誌物，譬如波型蛋白/S100A4/FSP-1、CD90、CD34及CD68。NFA、OPN、IL-6、TGF β、TNF α、組織因子及VEGF免疫染色法則係以DAB呈色，為紅棕色。使用BCIP/NBT溶液，使大的圓形波形蛋白+/S100A4/FSP-1+ MTC與較小的梭形CAF、CD90+ MSC/HSPC、CD34+ HSPC及CD68+ TAM局部化而呈藍色。共同染色呈現紫黑色，單一染色法係以蘇木色素進行對比染色，而雙重染色法係以甲基綠溶液進行對比染色。
以下實例被提供用以說明但並非限制本發明。
實例1. 癌症病患若帶有NFA + 腫瘤-EMT-基質-BMC致死系統，則即使在手術治癒後，仍具有預後不佳狀況
本實施例使用協同進化狀態與NFA表現作為一實驗模式。在預後不佳乳房腫瘤的病患樣本中，均會伴隨著出現單一個別NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圓形轉移MTC(圖1A)，尤其會在遠距的腫瘤基質(圖1B)與血管周隙區(圖1C)以及血管內區(圖1D)中聚集，此可提供關於NFA在EMT誘導與乳房腫瘤發展上之關鍵角色證據。可顯而易見的是：經由EMT之間質狀態會使癌細胞具有轉移與侵入之特性，也會誘導癌幹細胞特性、防止細胞凋亡與衰老，且有助於針對化療、免疫治療及標靶治療的免疫抑制與多重抗性。因此，癌細 胞之間質狀態有助於癌細胞具有轉移能力與侵略能力之潛力，促使癌症發展與轉移，這對於腫瘤細胞分離、遷徙、侵入及轉移是必要且關鍵的(圖1)。階層式NFA+骨髓細胞(BMC)之組群，其包含較小子集之CD90+間質/造血幹/源祖細胞(MSC/HSPC)(圖1E與F)與CD34+ HSPC(圖1G)，連同一個較大子集之CD68+巨噬細胞(TAM)(圖1H)與較小的波形蛋白+/FSP-1+梭形癌症相關之纖維母細胞(CAF)(圖1B與C)，可以在預後不佳乳房腫瘤基質內，同時被檢測出，以與圖1B和C中所示之NFA+ MTC進行共同進化。如圖1B與C，NFA+波形蛋白+/S100A4/FSP-1+ MTC(大圓形)與NFA+波形蛋白+/S100A4/FSP-1+CAF(較小縮圖)，兩者的共同表現會常在具有臨床預後不佳或是癌症細胞轉移的腫瘤基質或血管周隙區內被檢測出來。NFA所媒介之EMT誘導作用顯然充作一橋樑，以引發NFA+ MTC與NFA+ CAF間之協同進化與交聯作用，經由腫瘤細胞與基質細胞間之長期旁分泌相互作用，以促進癌症發展，如圖1中所示。綜合以上結果，提供了全面性之臨床證據以支持目前之範例：腫瘤-基質協同進化與交流在腫瘤發展上扮演著一個重要的角色。腫瘤基質內之NFA顯然在如上所示之乳癌病患之不佳預後的測定上扮演著主要角色。綜合以上結果進一步證實在涉及乳房腫瘤發展之腫瘤-基質協同進化與交聯作用上NFA之關鍵角色。NFA可作為一種新的指標，發現EMT、腫瘤-基質協同進化交流(TSCC)及BMC皆會影響測定乳房腫瘤發展與轉移及乳癌病患之不佳預後，這符合EMT、TSCC及BMC可在癌症發展上扮演關鍵角色之目前範例。因此，本發明提供NFA致死系統，以供腫瘤-EMT-基質-BMC所媒介惡性循環之全面癌症控制，這對於乳房腫瘤之發展與進展是重要的。類似的觀察亦可延伸至肺(圖2)、胃(圖3)及結直腸(圖4)之預後不佳的腫瘤。即使於可能的治癒性及/或侵入性治療後，在具有不佳預後之癌症病患中，NFA-腫瘤-EMT-基質-BMC所媒介之惡性循環證明是最致命且廣泛表現之系統。因此，本發明提供一種分子、細胞及全身致死系統，以供全面癌症控制。
實例2. NFA致死系統為一種關於癌症病患預後之潛在標靶
在大群組研究中，超過50%預後不佳之乳癌病患(44/74)顯示帶有如上述之NFA致死系統。另一方面，若乳癌病患帶有NFA致死系統，則在治療後皆無法具有良好預後，而在67位預後良好的乳癌病患之群體中，無病患顯示帶有NFA致死系統。同樣地，~56%(44/78)預後不佳之肺癌病患顯示帶有NFA致死系統，且在53位預後良好的肺癌病患之群體中，無法偵測出假陽性病例。同樣地，~67%(61/91)預後不佳之GI癌症病患顯示帶有NFA致死系統，且在治療後，全部具有預後不佳之情況；在總計94位預後良好之肺癌病患中，於治療後無法偵測出假陽性病例。整體來說，於總計457位癌症病患中，包含214位預後良好與243位預後不佳之病例，超過60%(149/243)預後不佳之病患顯示帶有如圖1-4中所述之NFA致死系統，且於治療後全部具有預後不佳之情況，而214位預後良好之腫瘤患者未顯示帶有NFA致死系統。應注意到的是，預後不佳病患之主要群體係與骨頭轉移有關聯。綜合以上結果證明，在測定超過60%癌症病患之不佳臨床預後之病例上，NFA致死系統扮演主要且排他之關鍵角色，以供全面癌症控制(表1)。對於免疫監視、細胞死亡、早衰、化學治療、免疫治療及目前靶向治療，許多癌症病患之不佳預後顯然係主要經由NFA+BMC，且特別是具有多重抗性的轉移性間質樣癌幹細胞(metastatic mesenchymal-like cancer stem cells)之NFA+ MTC特性兩者進行測定。於另一方面，上述NFA+腫瘤基質內各種潛在EMT誘導物之向上調整可能導致似EMT過程之穩定重編程(stable reprogramming of EMT-like processes)，以保持具有轉移潛能之間質狀態下的NFA+腫瘤幹細胞。綜合所有結果表示分子、細胞及全身作用機制，用以解釋為何如圖1D-4D中所示單一個別NFA+/FSP-1+大圓形MTC係足以主要地測得各種類型癌症病患之不佳預後。因此，NFA係表示一種新的描述且先前未被發現之信號標靶，其在影響癌症進展與轉移之腫瘤幹細胞之間質狀態穩定維持上，扮演著舉足輕重的角色。
綜上所述，很明確的是，全面癌症控制需要同時針對自分泌、旁分泌及腫瘤-EMT-基質-BMC協同進化信號之全身內分泌作用。因此，本發明係提供可以同時針對癌症12種特徵之核心技術，該特徵包括EMT誘導之穩定重編程(stable reprogramming of EMT induction)、抗細胞死亡(antiapoptosis)、轉移前微環境形成(premetastatic niche formation)、全身性免疫抑制(systemic immunosuppression)、異常腫瘤-基質協同進化(aberrant tumor-stroma coevolution)及交聯(crosstalk)、癌症相關之發炎(cancer-related inflammation)、異常幹性(aberrant stemness)、異常骨髓微環境形成(aberrant bone marrow niche formation)、骨頭轉移(bone metastasis)及原發性全身內分泌煽動(primary systemic endocrine instigation)，以供全面癌症控制(圖5)。
總之，若帶有NFA之腫瘤細胞主要且排他地存在於間質狀態中，其中該間質狀態會與腫瘤細胞的轉移、侵入、血管生成轉換、免疫抑制、預防過早衰老與凋亡、對化療所誘導產生之癌細胞幹性與多抗性、免疫治療及標靶治療以及預後不佳有所相關。從初期上皮腫瘤發展至不同階段之轉移形成，包括循環腫瘤幹細胞(CTSC)與衍生物循環腫瘤細胞(CTC)之產生。然而，尚未有任何研究報告指出：一獨特之腫瘤標誌物足以明確的檢測出主要且決定的罕見循環腫瘤細胞(CTC)，以預測在治療期間與之後轉移之可能性。再者，目前循環腫瘤細胞(CTC)標誌物已在正常血液細胞中被檢驗出，且已產生許多假陽性反應。因此，免疫檢測技術已大多檢驗出在血液表現之細胞的上皮標誌物，且較顯著的為細胞角蛋白。例如，一種先進的標準化商用系統：由美國嬌生 公司(Johnson & Johnson USA)所開發之細胞搜索系統(Cell Search system)，為一種以EpCAM免疫磁性純化與細胞角蛋白染色為基礎之自動化裝置。近來，此細胞搜索技術(Cell Search technology)已經由美國食品藥物管理局(FDA)核准，用於帶有轉移性乳癌、大腸癌及前列腺癌之患者中循環腫瘤細胞(CTC)之血液分析。然而，最近美國臨床腫瘤協會(ASCO)在關於目前已知且具有應用潛力的腫瘤標誌之調查指出，其達成共識的結論是：目前對於循環腫瘤細胞(CTC)含量之監測於臨床使用尚未成熟，建立循環腫瘤細胞(CTC)之預測/預後/診斷性價值之目前核心技術仍待改善。如上文所述，癌症病患若在血管周隙區內帶有NFA+波形蛋白+/FSP-1+大圓形MTC，則即使於可能治癒性治療後，皆未能有良好預後。反之，所有預後良好之病患未顯示此種MTC類型。現在很明確的是，MTC為循環腫瘤細胞(CTC)與循環腫瘤幹細胞(CTSC)之潛在提供者。因此，本發明係提供偵測最具潛力之MTC、MTSC、CTC及CTSC之方法與組合物，主要預測即使在可能治癒性治療後，癌症病患之微轉移與不佳預後。相較於影響正常過程與病理過程兩者之多數EMT誘導者(譬如Twist、Snail、Slug、TGF β 1、TNF α、VEGF及IL-6)的兩極作用，NFA致死系統代表一種新的標靶，以使EMT恢復，而不會破壞正常生理功能。因此，在癌症的發展與進展，特別是微轉移與骨頭轉移之前與期間，本發明係提供致死系統之方法與組合物，以供全面癌症控制，包括預測、預防、個人化醫療保健及緩和(圖5)。
根據上文，本發明係提供一種預測病患是否具有微轉移且處於發展轉移風險之方法。
圖1說明在乳房腫瘤發展期間，NFA致死系統係介導全面性自分泌-旁分泌-內分泌信號相互作用網絡。利用協同進化狀態與NFA表現作為一優良模式，發現預後不佳的乳房腫瘤係伴隨著在穿透前之單一個別NFA+/波形蛋白+/S100鈣結合之蛋白A4(S100A4)/成纖 維細胞特異蛋白-1+(FSP-1+)大的圓形轉移間質樣瘤細胞(MTC)(A)的釋出，且特別是在遠距的腫瘤基質(B)與血管周隙區(C)內以及亦在血管內區(D)內聚集，提供關於NFA在EMT誘導與乳房腫瘤發展上之關鍵角色之證據。隨之而來的是，階層式NFA+骨髓細胞(BMC)之組群，其包含較小子集之CD90+間質/造血幹/源祖細胞(MSC/HSPC)(E與F)與CD34+ HSPC(G)，連同較大子集之CD68+巨噬細胞(TAM)(H)與較小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纖維母細胞(CAF)(B與C)，可以在預後不佳乳房腫瘤基質內，同時被檢測出，以與B和C中所示之NFA+ MTC進行共同進化。
圖2描述在肺部腫瘤發展期間，NFA致死系統係介導全面性自分泌-旁分泌-內分泌信號相互作用網絡。利用協同進化狀態與NFA表現作為一優良模式，發現預後不佳肺部腫瘤係伴隨著在穿透前之單一個別NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圓形轉移間質樣瘤細胞(MTC)(A)的釋出，且特別是在遠距的腫瘤基質(B)與血管周隙區(C)內以及亦在血管內區(D)內聚集，提供關於NFA在EMT誘導與肺部腫瘤發展上之關鍵角色的證據。隨之而來的是，階層式NFA+骨髓細胞(BMC)之組群，其包含較小子集之CD90+間質/造血幹/源祖細胞(MSC/HSPC)(E與F)與CD34+ HSPC(G)，連同較大子集之CD68+巨噬細胞(TAM)(H)與較小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纖維母細胞(CAF)(B與C)，可以在預後不佳肺部腫瘤基質內，同時被檢測出，以與B和C中所示之NFA+ MTC進行共同進化。
圖3顯示在胃部腫瘤發展期間，NFA致死系統係介導全面性自分泌-旁分泌-內分泌信號相互作用網絡。利用協同進化狀態與NFA表現作為一優良模式，發現預後不佳胃部腫瘤係伴隨著在穿透前之單一個別NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圓形轉移間質樣瘤細胞(MTC)(A)的釋出，且特別是在遠距的腫瘤基質(B)與血管周隙區(C)內以及亦在血管內區(D)內聚集，提供關於 NFA在EMT誘導與胃部腫瘤發展上之關鍵角色的證據。隨之而來的是，階層式NFA+骨髓細胞(BMC)之組群，其包含較小子集之CD90+間質/造血幹/源祖細胞(MSC/HSPC)(E與F)與CD34+ HSPC(G)，連同較大子集之CD68+巨噬細胞(TAM)(H)與較小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纖維母細胞(CAF)(B與C)，可以在預後不佳胃部腫瘤基質內，同時被檢測出，以與B和C中所示之NFA+ MTC進行共同進化。
圖4說明在結直腸腫瘤發展期間，NFA致死系統係介導全面性自分泌-旁分泌-內分泌信號相互作用網絡。利用協同進化狀態與NFA表現作為一優良模式，發現預後不佳結直腸腫瘤係伴隨著在穿透前之單一個別NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圓形轉移間質樣瘤細胞(MTC)(A)的釋出，且特別是在遠距的腫瘤基質(B)與血管周隙區(C)內以及亦在血管內區(D)內聚集，提供關於NFA在EMT誘導與結直腸腫瘤發展上之關鍵角色的證據。隨之而來的是，階層式NFA+骨髓細胞(BMC)之組群，其包含較小子集之CD90+間質/造血幹/源祖細胞(MSC/HSPC)(E與F)與CD34+ HSPC(G)，連同較大子集之CD68+巨噬細胞(TAM)(H)與較小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纖維母細胞(CAF)(B與C)，可以在預後不佳結直腸腫瘤基質內，同時被檢測出，以與B和C中所示之NFA+ MTC進行共同進化。
圖5說明作為潛在標靶之NFA致死系統之多方面角色，以供全面癌症控制。

Claims (8)

  1. 一種偵測一病患具有致死系統的方法，其包括：(a)取得該病患之一生物性樣本；(b)測定該生物性樣本中之一標誌細胞，其中該標誌細胞係選自癌症相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast,CAF)、間質樣腫瘤細胞(mesenchymal-like tumor cell,MTC)、間質樣腫瘤幹細胞(mesenchymal-like tumor stem cell,MTSC)、腫瘤伴生巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)及骨髓細胞(myeloid cell)所組成之群組；及(c)測定該標誌細胞中一NFA分子之表現；其中，當該病患之生物性樣本中的該標誌細胞測定出有該NFA分子表現，表示該病患具有致死系統。
  2. 如專利範圍請求項1之方法，其中該標誌細胞為間質樣腫瘤細胞(MTC)。
  3. 如專利範圍請求項1之方法，其中該生物性樣本係選自下列組成之組群：骨髓、臍帶血、周邊血液、組織樣本、腹水、胸膜積水及體液。
  4. 如專利範圍請求項1之方法，其中該NFA之表現係經由評估NFA蛋白質、mRNA或DNA。
  5. 如專利範圍請求項1之方法，其中該病患為癌症的病患。
  6. 一種檢測一癌症病患癌症微轉移的方法，其包括：(a)取得病患之一生物性樣本；(b)測定在該生物性樣本中之一標誌細胞，其中該標誌細胞係選自癌症相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast,CAF)、間質樣腫瘤細胞(mesenchymal-like tumor cell,MTC)、間質樣腫瘤幹細胞(mesenchymal-like tumor stem cell,MTSC)、腫瘤伴生巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)及骨髓細胞(myeloid cell)所組成之群組；及(c)測定在該標誌細胞中一NFA分子的表現；其中，當該癌症病患之生物性樣本中的該標誌細胞測定出該NFA分子，表示該癌症病患具有癌症微轉移。
  7. 如專利範圍請求項6之方法，其中該生物性樣本為骨髓、臍帶血、周邊血液、組織樣本、腹水、胸膜積水或體液。
  8. 如專利範圍請求項6之方法，其中該NFA分子之表現係經由評估該NFA分子的蛋白質、mRNA、DNA或活性含量進行測定。
TW100125785A 2010-07-22 2011-07-21 偵測致死系統之方法與組合物及其用途 TWI512294B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36667910P 2010-07-22 2010-07-22
US13/186,100 US20120040361A1 (en) 2010-07-22 2011-07-19 Methods and compositions for detection of lethal system and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201226903A TW201226903A (en) 2012-07-01
TWI512294B true TWI512294B (zh) 2015-12-11

Family

ID=45496528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100125785A TWI512294B (zh) 2010-07-22 2011-07-21 偵測致死系統之方法與組合物及其用途

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20120040361A1 (zh)
CN (1) CN103180455B (zh)
TW (1) TWI512294B (zh)
WO (1) WO2012010105A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103926408A (zh) * 2014-04-30 2014-07-16 天津医科大学肿瘤医院 一种用于预测nsclc病人预后的试剂盒及骨桥蛋白作为特异标记物的应用
EP3186397B1 (en) * 2014-08-25 2024-02-07 Creatv Microtech, Inc. Use of circulating cell biomarkers in the blood for detection and diagnosis of diseases and methods of isolating them
WO2016048299A1 (en) * 2014-09-24 2016-03-31 National Taiwan University Cancer-associated fibroblasts in maintaining stemness of cancer stem cells
WO2016086403A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Meridigen Biotech Co., Ltd. Method of distinguishing mesenchymal stem cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200611705A (en) * 2004-10-04 2006-04-16 Shiaw-Der Yang PDPK FA system and cancer
US20100151457A1 (en) * 2008-12-17 2010-06-17 National Tsing Hua University Detection of Unhealthy Cell and Uses Thereof
TWI391660B (zh) * 2010-07-01 2013-04-01 Nat Univ Tsing Hua 偵測致死細胞的方法與材料及其應用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7329388B2 (en) * 1999-11-08 2008-02-12 Princeton Biochemicals, Inc. Electrophoresis apparatus having staggered passage configuration
WO2005083111A1 (en) * 2004-02-26 2005-09-09 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a)
GB0414894D0 (en) * 2004-07-02 2004-08-04 King S College London Biomarkers of alzheimer's disease
US8383357B2 (en) * 2005-03-16 2013-02-26 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors
CA2680589A1 (en) * 2007-03-14 2008-09-18 Universita' Degli Studi Di Milano - Bicocca Modulator compounds of the drug resistance in epithelial tumour cells
JP2010536371A (ja) * 2007-08-21 2010-12-02 ノダリティ，インコーポレイテッド 診断方法、予後および治療方法
US9194862B2 (en) * 2009-06-23 2015-11-24 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for determining cancer stem cell self-renewal potential

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200611705A (en) * 2004-10-04 2006-04-16 Shiaw-Der Yang PDPK FA system and cancer
US20100151457A1 (en) * 2008-12-17 2010-06-17 National Tsing Hua University Detection of Unhealthy Cell and Uses Thereof
TW201028480A (en) * 2008-12-17 2010-08-01 Nat Univ Tsing Hua Detection of unhealthy cell and uses thereof
TWI391660B (zh) * 2010-07-01 2013-04-01 Nat Univ Tsing Hua 偵測致死細胞的方法與材料及其應用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
范湘泫，脯氨酸導引蛋白質激酶FA在各種癌病的存活及預後的共通關鍵性角色，2008/09/24 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103180455A (zh) 2013-06-26
US20120040361A1 (en) 2012-02-16
WO2012010105A1 (en) 2012-01-26
CN103180455B (zh) 2015-12-16
TW201226903A (en) 2012-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5689133B2 (ja) 結腸直腸癌におけるｐｏｄｘｌタンパク質
JP5747419B2 (ja) 致死性細胞を検出する方法および組成物ならびにその使用
JP5348665B2 (ja) 病的細胞の検出及びその利用
TWI512294B (zh) 偵測致死系統之方法與組合物及其用途
EP2318841B1 (en) Anln protein as an endocrine treatment predictive factor
US20240069029A1 (en) Pd-ecgf as biomarker of cancer
Li et al. Increased expression of stomatin-like protein 2 (STOML2) predicts decreased survival in gastric adenocarcinoma: a retrospective study
AU2009213167B2 (en) RBM3 as a marker for breast cancer prognosis
TWI391660B (zh) 偵測致死細胞的方法與材料及其應用
EP2269073B1 (en) A method of assessing cancer status in a breast cancer patient
JP2017500590A (ja) 乳がんの予後診断方法