CN103180455A - 侦测致死系统的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用标志细胞内核因子A(NFA)的表达侦测病患是否存在致死系统的方法。另一方面，本发明提供一种方法用以预测是否具有转移的潜能以及是否处在发展转移的风险中，且该方法用于侦测病患的预后。

Description

侦测致死系统的方法
相关申请的交叉引用
本非临时申请案，主张于2010年7月22日提交的临时申请案Nos.61366679的优先权，其全部内容在此被并入作为引用文件。
技术领域
本发明有助于确认及侦测癌症微转移；及预测不同类型的癌症病患(不论癌症的病因起源)预后的方法、套组以及其用途。本发明进一步提供一种方法与套组帮助预测病患是否具有转移潜能的疾病以及是否罹患全身性转移的风险。
背景技术
大部分的死亡源自癌症，此是由于转移性病灶所致。然而，在过去50年来，因癌症研究而产生近200万篇论文后，我们尚未了解癌细胞转移是何时以及如何发生。目前可以确定的是：转移是癌细胞与其微环境间发展过程的最终产物；且全身性癌症的发展可能是由于原发性肿瘤的平行发展，和源自早期有传播性的上皮细胞与间质样肿瘤细胞(MTC)/间质样肿瘤干细胞(MTSC)所产生的转移，而上述有传播性的上皮细胞与间质样肿瘤细胞(MTC)/间质样肿瘤干细胞(MTSC)则是经由肿瘤细胞与基质细胞两者所产生的复合诱导物，将上皮-间质转换(EMT)稳定改编而产生的。然而，作为主要协调者以调节此复合网络的关键信号分子至今仍然尚未被证实。此外，学界普遍认为光依赖细胞培养与动物实验可能无法为全身性临床肿瘤学的研究上提供精确的模型。虽然自肿瘤移植实验可得到独具价值的结果，但是在扼要的解读、诠释此一整体性结果的数据上，则需要被强调且慎重执行，且这些结论须以癌症病患中的自发性肿瘤模式进行验证。例如，一些动物模式，譬如源自于发展肿瘤或转移的细胞株的异种移植，且这种针对人类癌症，特别是与旁分泌、自分泌及内分泌复合网络模式有关的保真度是备受质疑的。这也许可以解释为何在产生近两百万篇癌症论文后，我们尚未了解转移是何时以及如何发生，而得知此基本机制在癌症死亡率上具有相当大的影响。这也解释为何历经过去50年的全面性癌症研究，以目前的治疗方式往往无法治愈癌症病患。得自于实验室细胞培养与动物实验的关键结果，肯定必须以人类临床样本与癌症病患的肿瘤进行验证。
相较于单一癌症细胞疾病的领域，结合分子、细胞及全身临床肿瘤学的领域，使我们对于癌症的了解更加深入。此外，癌症是涉及在一般典型的癌细胞、宿主基质及骨髓细胞(BMC)相互之间的协同进化作用，并伴随着充作媒介的趋化因子与细胞因子网络，此网络是关于一多向性的信号网络机制。因此除了同时针对癌细胞组成物之外，还更需要针对癌症相关的基质以及涉及转移前微环境形成、异常骨髓(BM)微环境形成及原发性内分泌煽动的全身散播的骨髓细胞(BMC)，如此应该可改善大部份癌症病患的治疗、整体存活及最重要的生活质量。然而，在癌症发展期间，关于肿瘤-EMT-基质协同进化信号的恶性循环，与在细胞与全身临床肿瘤学上的最具潜力的分子信号标的仍有待证实。
最初，核因子A(NFA)是经确定为一种ATP·Mg-依赖蛋白磷酸酶的特定细胞膜与细胞质的活化因子A，但后来被称为一种多受质/多功能的脯氨酸导引蛋白激酶(PDPK)。由于在激酶结构域上的序列同源性极高，NFA因此被视为GSK3的亚型(肝醣合成酶激酶3)，且更名为GSK-3α。虽然GSK3/GSK-3β与NFA/GSK-3α两者在激酶结构域上结构相似且长期以来多被视为两种密切相关的信号分子，然而当根据本发明中所证实的人类临床研究时，这些信号分子的功能并非等同于先前在果蝇与啮齿动物中的研究。此外，深入的研究及大多数的注意力都集中在GSK-3β上，却以GSK-3之名称之，并未在许多领域的研究上对此GSK-3有进一步详尽的说明，且抑制此种激酶可能会导致肿瘤形成，所以如何治疗糖尿病而不引发癌症，便成为一个重要的课题。因此，NFA的独特角色已被忽略超过十年。为避免不必要的混淆，NFA一词将用以充分说明这个新的多受质/多功能激酶举足轻重的重要角色，以供更全面、完善的癌症控制的应用。
无论癌症的病因为何，如果在细胞内单一独特分子的表现及病患的疾病状态之间存在着可被预测的关系，那将会大受激赏。然而关于一种利用细胞内分子的表现情形，以评估、判断病患罹患不可治愈疾病的风险的方法目前并无成功的先例。
发明内容
相较于单一癌症细胞疾病的领域，结合分子、细胞及全身临床肿瘤学的领域，使我们对于癌症的了解更加深入。此外，癌症是涉及在一般典型的癌细胞、宿主基质及骨髓细胞(bone marrow cell，BMC)相互之间的协同进化作用，并伴随着充作媒介的趋化因子与细胞因子网络，此网络是关于一多向性的信号网络机制。因此除了同时针对癌细胞组成物之外，还更需要针对癌症相关的基质以及涉及转移前微环境形成、异常骨髓(BM)微环境形成及原发性内分泌煽动的全身散播的骨髓细胞(BMC)，如此应该可改善大部份癌症病患的治疗、整体存活及最重要的生活质量。相对于PDPK FA/GSK-3α(主要与主流癌症研究相关)与主要着重于如上述主流癌细胞的先前成果，本发明是关于一种通过一般典型的癌细胞、宿主基质及骨髓细胞(BMC)间的趋化因子与细胞素的网络，以检视PDPK在该前述几种细胞相互之间的作用与协同进化作用所扮演的角色。利用此新的方法，证实PDPK FA/GSK-3α在寄生基质与骨髓细胞(BMC)中的异常表现，在测定转移潜能上，扮演着决定性与指标性的角色。癌症病患若在一般典型的癌细胞、寄生基质及骨髓细胞(BMC)之中，发现PDPK FA/GSK-3α在相互作用与协同进化作用上有异常表现，则倾向于发展转移性疾病。因此，在一般典型的癌细胞、寄生基质及骨髓细胞(BMC)间的相互作用与协同进化作用的情况下，若带有PDPK FA/GSK-3α的异常表达，则在本发明中统称为“致死系统”。本文所提供的致死系统为有助于检测转移的普遍适用的预测因子，无论癌症病因起源为何，有助于监测不同类型癌症病患中的疾病状态与治疗反应及其用途。更值得一提的是，该致死系统为一种可靠的预测因子，无论病因起源为何，可用于检测是否病患具有转移及处于发展转移的风险。
因此，一方面，本发明提供的是一种检测方法，用来检测细胞表现型态的存在，较佳的是关于可用以指出病患是否具有致死系统的标志细胞，该方法包括取得病患的生物性样本；在生物样本中，测定标志细胞中的NFA的表达，其中在该病患标志细胞中的NFA的表达是指出致死系统的存在，其中该标志细胞为间质肿瘤细胞(MTC)。在一些实施例中，NFA的表达是通过分析NFA蛋白质含量而决定，例如使用对NFA专一抗体的免疫分析法。在其它方面，该表达可通过评估其活性、蛋白质、mRNA或DNA含量进行测定。生物性样本可为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。
另一方面，生物性样本中的致死系统的辨识可用于预测癌症病患的预后，且预测是否病患具有转移潜能及处于发展转移的风险。
另一方面，本发明所提供的是一种用以测定生物样本中致死系统的存在的诊断套组，该诊断套组至少包括用来测定该样本中NFA表现的试剂，以及用来评估致死系统的存在，共同包装于容器内的印刷操作说明。亦可包括其它检测试剂。
再者，另一方面，本发明所提供的是一种预测方法，该方法用于预测癌症病患的预后，且预测病患是否具有转移潜能及是否处于发展转移的风险中。该方法包括取得病患的生物性样本；测定该样本中的NFA的表达，其中NFA的表达是用以预测该病患是否正处于发展转移的风险之中。在一些实施例中，NFA的表达是通过分析NFA蛋白质含量而决定，例如使用对NFA专一抗体的免疫分析法。在其它方面，该表达可通过评估其活性、蛋白质、mRNA或DNA含量进行测定。生物性样本可为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。
如有必要，这些细胞可以通过特殊磁珠或流式细胞分选仪分离出来，用以侦测致死系统中高度表达的NFA。
当了解了以下的详细说明以及附加的图式及实例后，本发明的这些及其它目的与特征将全然显而易见。
附图说明
图1说明在乳腺癌发展期间，NFA致死系统是介导全面性自分泌-旁分泌-内分泌信号相互作用网络。利用协同进化状态与NFA表达作为优良模式，发现预后不佳的乳腺癌是伴随着在穿透前的单一个别NFA+/波形蛋白+/S100钙结合的蛋白A4(S100A4)/成纤维细胞特异蛋白-1+(FSP-1+)大的圆形转移间质样瘤细胞(MTC)(A)的释出，且特别是在远距的肿瘤基质(B)与血管周隙区(C)内以及亦在血管内区(D)内聚集，提供关于NFA在EMT诱导与乳房肿瘤发展上的关键角色的证据。随之而来的是，阶层式NFA+骨髓细胞(BMC)的组群，其包含较小子集的CD90+间质/造血干/源祖细胞(MSC/HSPC)(E与F)与CD34+HSPC(G)，连同较大子集的CD68+巨噬细胞(TAM)(H)与较小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纤维母细胞(CAF)(B与C)，可以在预后不佳乳房肿瘤基质内，同时被检测出，以与B和C中所示的NFA+MTC进行共同进化。
图2描述在肺癌发展期间，NFA致死系统是介导全面性自分泌-旁分泌-内分泌信号相互作用网络。利用协同进化状态与NFA表现作为一优良模式，发现预后不佳的肺癌是伴随着在穿透前的单一个别NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圆形转移间质样瘤细胞(MTC)(A)的释出，且特别是在远距的肿瘤基质(B)与血管周隙区(C)内以及亦在血管内区(D)内聚集，提供关于NFA在EMT诱导与肺部肿瘤发展上的关键角色的证据。随之而来的是，阶层式NFA+骨髓细胞(BMC)的组群，其包含较小子集的CD90+间质/造血干/源祖细胞(MSC/HSPC)(E与F)与CD34+HSPC(G)，连同较大子集的CD68+巨噬细胞(TAM)(H)与较小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纤维母细胞(CAF)(B与C)，可以在预后不佳肺部肿瘤基质内，同时被检测出，以与B和C中所示的NFA+MTC进行共同进化。
图3显示在胃癌发展期间，NFA致死系统是介导全面性自分泌-旁分泌-内分泌信号相互作用网络。利用协同进化状态与NFA表现作为一优良模式，发现预后不佳胃癌是伴随着在穿透前的单一个别NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圆形转移间质样瘤细胞(MTC)(A)的释出，且特别是在远距的肿瘤基质(B)与血管周隙区(C)内以及亦在血管内区(D)内聚集，提供关于NFA在EMT诱导与胃部肿瘤发展上的关键角色的证据。随之而来的是，阶层式NFA+骨髓细胞(BMC)的组群，其包含较小子集的CD90+间质/造血干/源祖细胞(MSC/HSPC)(E与F)与CD34+HSPC(G)，连同较大子集的CD68+巨噬细胞(TAM)(H)与较小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纤维母细胞(CAF)(B与C)，可以在预后不佳胃部肿瘤基质内，同时被检测出，以与B和C中所示的NFA+MTC进行共同进化。
图4说明在结直肠肿瘤发展期间，NFA致死是统系介导全面性自分泌-旁分泌-内分泌信号相互作用网络。利用协同进化状态与NFA表现作为一优良模式，发现预后不佳结直肠肿瘤是伴随着在穿透前的单一个别NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圆形转移间质样瘤细胞(MTC)(A)的释出，且特别是在远距的肿瘤基质(B)与血管周隙区(C)内以及亦在血管内区(D)内聚集，提供关于NFA在EMT诱导与结直肠肿瘤发展上的关键角色的证据。随之而来的是，阶层式NFA+骨髓细胞(BMC)的组群，其包含较小子集的CD90+间质/造血干/源祖细胞(MSC/HSPC)(E与F)与CD34+HSPC(G)，连同较大子集的CD68+巨噬细胞(TAM)(H)与较小的波形蛋白+/FSP-1+梭形纤维母细胞(CAF)(B与C)，可以在预后不佳结直肠肿瘤基质内，同时被检测出，以与B和C中所示的NFA+MTC进行共同进化。
图5说明作为潜在标靶的NFA致死系统的多方面角色，以供全面癌症控制。
具体实施方式
为清楚揭露，而不是限定，本发明的详细描述被细分为如下的次段落。
A.定义
除非有其它定义，所有在此所用的技术及科学词汇，如同作为本发明所属技术领域中具有一般技艺者一般性地了解具有相同意义。在此指称的所有专利、申请案、公开申请案及其它应用，以及基因库登录号皆完整以参考文献被整合起来。若本章节提出的定义与其它专利、申请案、公开申请案及其它在此引用的参考文献所提出的定义相反或不一致，以本章节提出的定义为主。
如本文中所使用的“一”或“一个”是指“至少一个”或“一或多个”。
如本文中所使用的“NFA”一词所述指脯胺酸导引蛋白激酶FA，亦被称为肝醣合成酶激酶-3α。关于此蛋白质的基因库登录号为AAD11986与AAH27984。
如本文中所使用的“生物样本”是指来自一生物来源的任何样本，包括但不限于骨髓、血液、组织样本、腹水、胸膜积水、体液或细胞系。
如本文中所使用的“抗体”一词是指一种经单离或重组结合的试剂，其包括必要的变异区序列以专一性键结一抗原决定位。因此，抗体是表现所要求生物活性的任何型式的抗体或其片段，例如，结合特定的目标抗原。因此，只要抗体表现出所预期的生物活性，例如专一性结合NFA时，用于被广泛认知及特定地涵盖单株抗体(包括全长单株抗体)、多株抗体、人类抗体、拟人化抗体、嵌合抗体、奈米抗体、双价抗体、多重专一抗体(例如双特异抗体)及抗体片段，包括但不限于scFv、Fab及Fab2。
如本文中所使用的“标志细胞”一词是指可通过标志而识别的细胞，较佳为骨髓细胞(bone marrow cell，BMC)或癌症相关纤维母细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)或循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)或循环肿瘤干细胞(circulating tumor stem cell，CTSC)或上皮肿瘤细胞(epithelial tumor cell，ETC)或上皮肿瘤干细胞(epithelial tumor stem cell，ETSC)或造血干/源祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC)或间质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)或间质肿瘤细胞(mesenchymaltumor cell，MTC)或间质肿瘤干细胞(mesenchymal tumor stem cell，MTSC)或肿瘤伴生巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)。举例的标志包括但不限于CD34、CD68、CD90、波形蛋白、成纤维细胞特异蛋白-1(FSP-1)、S100钙结合的蛋白A4(S100A4)。
如本文中所使用的“致死系统”一词是指与标志细胞中NFA异常表达有关联的讯号交互作用网络，较佳的是上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)或肿瘤-基质协同演化交流(tumor-stromacoevolutional communication，TSCC)。
如本文中所使用的“预后”一词是指对于患有特殊疾病或病症(譬如癌症)的病患经过特定治疗或干预后所预测的结果。
如本文中所使用的“转移潜能”一词是指癌细胞从原本的部位转移至一或多个其它身体部位。
除非特别说明，对熟悉所属技术领域、本发明所使用的实例、生化及临床病理学技术的常用技术，所有在此使用的术语具有与一般技艺者的知识相同的意义。
B.用以侦测致死系统的方法及套组
与NFA异常表达相关的细胞，较佳地为标志细胞，称为致死系统，提供一种工具以鉴定病患是否具有转移潜能及是否处于发展转移的风险中。在一方面，鉴定生物样本中的致死系统可用来监测各种类型癌症病患的疾病状态与治疗反应，且预测微转移的发展。
因此，本发明目的之一即是提供一种侦测病患具有致死系统的细胞表达型态存在的方法，该方法包括取得来自该病患的生物样本，测定在该样本细胞内NFA的表达，其中该病患细胞内NFA的表达显示致死系统存在。在一些实施例中，NFA的表达是通过分析NFA蛋白含量而进行测定，例如使用对NFA专一的抗体免疫分析法。在其它方面，该表达可通过评估其活性、蛋白质、RNA或DNA含量而测定。生物样本可为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。
本发明的另一目的是提供一种用以测定生物样本中“致死系统”存在的套组，其中至少包括用以测定该样本的细胞中NFA表达的试剂，以及共同包装于容器中、用以评估NFA相对含量的印刷操作说明。
任何侦测NFA表达的适当装置可能被使用。该表达可通过评估其在生物样本细胞中的活性、蛋白、RNA或DNA含量而测定。例如，使用对NFA专一的抗体的免疫分析法可被采用。适当方法包括但不限定于免疫组织化学分析、免疫细胞化学分析、流式细胞分析、西方墨点分析、北方墨点分析、反转录-聚合酶链锁反应及针对特定受质的磷酸化试验。利用免疫组织化学染色技术，一般利用脱水及固定方式来制备一细胞样本，再与耦合基因产物专一的标帜抗体进行反应，其中该标帜物通常是视觉上可侦测的，例如酵素标帜物、荧光标帜物、冷光标帜物及其类似物。
根据实施例，取得来自病患的组织样本，并且根据传统组织表装技术，包埋该样本再切片为例如3-5μm，固定、表装及干燥，固定液可包括：例如福尔马林，用以表装切片的包埋液可包括：例如石蜡，样本可储存于此条件下。在去石蜡及脱水后，样本与包含对NFA专一的抗体的免疫试剂接触，而抗体可包含多株或单株抗体，其中可包括完整抗体或能专一性地结合NFA蛋白的抗体片段。适当的多株抗血清或其它抗体可通过对NFA蛋白或该蛋白合适片段免疫的适合的寄主动物而进行制备，并依据本技术领域的一般技艺者所知的通常技术收集及纯化抗血清。专一性地与NFA反应的单株或多株抗体，较佳地为单株抗体，可由本领域所熟知的方法制作。而且，重组抗体也可由本领域所知的方法制作。具有108M-1亲和力的单株抗体是较佳的，更佳地为109至1010M-1或更高。
抗体不是直接地就是间接地带有一合适的侦测标帜物。或者，侦测标帜物可结合至二级抗体，例如可与一级抗体结合的羊抗兔免疫球蛋白G(goatanti-rabbit IgG)。多肽及抗体会通过共价地或非共价地结合标帜上一种物质，以提供一个可侦测的信号。合适的标帜物包括但不限定于放射性核酸、酵素、受质、辅助因子、抑制剂、荧光试剂、冷光试剂、磁性粒子及类似物。
可使用任何合适的方法，以取得来自病患的生物样本。生物样本可为周边血液、脐带血、骨髓、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。
用以测定病患是否具有微转移且是否处于发展转移的风险中的套组，包括至少一个容器，其至少包含用以测定在此定义的细胞中NFA表达的试剂，及用以评估生物样本中的细胞是否含有一或多个“致死系统”的印刷操作说明。如本文中所使用的“试剂”一词是指任何用于完成本发明所提供的任何方法的化合物、组合物或生物试剂(即样本、液体、或细胞“剂量”、抗体等)，包括但不限定在用于NFA的抗体、用于分离及制备细胞的缓冲液与载体、及/或用以分析及处理的膜、用于完成饱和及竞争结合试验的缓冲液与载体、及放射性与非放射性标帜化合物。印刷操作说明亦包括试验结果与致死系统表现型对照的操作说明。
C.实施例
除非在特定实施例中另有指示，否则所有免疫组织化学分析、免疫表达型分析、免疫细胞化学分析及统计分析以下列方法进行。
病患：关于免疫组织化学分析所使用的临床病理数据与标本是通过病患医疗记录的详细回顾而得，这些病患在1987年至2004年之间，在台湾台北市台大医院，进行癌症的最初肿瘤切除手术。将手术切除的标本固定于10％福尔马林中，并常规处理以供石蜡包埋。将连续切片使用HE(hematoxylinnnd eosin)染色法染色以供组织分析，且观察病患，直到2006年4月为止。此研究是通过该机构的监督与伦理委员会核准。
专一的抗NFA抗体的生产、鉴定及特征
对应于NFA氨基酸序列471-483的羧基终端区域的多肽QSTDATPTLTNSS(SEQ ID NO∶1)是通过多肽合成仪(型号9050，Milligen，Bedford，马里兰州)进行合成。根据由Reichlin(1980)所描述的过程，使用戊二醛作为交联剂，将半胱胺酸残基加至NH2端，以促进多肽的耦合至牛血清蛋白。经过亲和性管柱纯化，其抗体产物可被NFA的氨基酸471-483的C端多肽中和，实验的结果均证明此抗NFA抗体具有免疫的专一性。
免疫组织化学分析
以福尔马林固定、石蜡包埋含有最多肿瘤细胞的肿瘤的组织切片(5μm)于二甲苯中脱蜡，接着在浓度渐减的乙醇中水合。使内生性过氧化酶以3％过氧化氢阻断，然后以牛血清蛋白阻断5分钟。接着，将玻片上加入以0.05M Tris缓冲液(pH7.4)稀释的一级抗体(2μg/mL)NFA、OPN、IL-6、TGFβ、TNF、组织因子及VEGF，于4℃下培养16小时，然后与超级增强剂(super enhancer，Super SensitiveTM Non-Biotin Detection System，BioGenex，San Ramon，CA)在室温下一起培养20分钟，再以polymer-HRP(Super SensitiveTM)标帜物培养30分钟。最后，免疫染色法系以DAB(3-3’diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色。为了要双重染色(double staining)，在抑制酵素反应后，将玻片在室温下于DS-enhancer(Zymed，San Francisco，CA)中培养5分钟，以防止在两种染色系统间的交互作用，接着，将玻片与所示的特定标志物于室温下一起培养一小时，在清洗后，将玻片与抗小鼠碱性磷酸酶(anti-mouse alkaline phosphatase)在室温下一起培养30分钟。使用BCIP/NBT溶液以显现键结的特定标志物，譬如波型蛋白/S100A4/FSP-1、CD90、CD34及CD68。NFA、OPN、IL-6、TGFβ、TNFα、组织因子及VEGF免疫染色法则系以DAB显色，为红棕色。使用BCIP/NBT溶液，使大的圆形波形蛋白+/S100A4/FSP-1+MTC与较小的梭形CAF、CD90+MSC/HSPC、CD34+HSPC及CD68+TAM局部化而呈蓝色。共同染色呈现紫黑色，单一染色法系以苏木色素进行对比染色，而双重染色法系以甲基绿溶液进行对比染色。
免疫细胞化学分析
在室温、700rpm下将平均1×106个细胞进行细胞离心(Kubota5200，日本)3分钟，使细胞贴附在涂覆聚离胺酸的玻片上。在染色前，将细胞聚落(cytospots)以3.7％三聚甲醛固定15分钟，并以0.2％Triton X-100处理90秒。使内生性过氧化酶以3％过氧化氢阻断，接着用牛血清蛋白阻断10分钟。将玻片与0.05M Tris缓冲液(pH7.4)中所稀释的抗NFA(anti-NFA)抗体(2μg/mL)于4℃下一起培养16小时，之后与超级增强剂(super enhancer，Super SensitiveTM Non-Biotin Detection System，BioGenex，San Ramon，CA)在室温下培养20分钟，再以polymer-HRP(Super SensitiveTM)标帜物一起培养30分钟。最后，免疫染色是以DAB(3，3’diaminobenzidinetetrahydrochloride)呈色。为双重染色，在抑制酵素反应后，将玻片于DS-enhancer(Zymed，San Francisco，CA)中，在室温下培养5分钟，以防止两种染色系统间的交互作用，然后，将玻片与所示的特定标志物在室温下一起培养1小时，清洗后，将玻片与抗小鼠碱性磷酸酶(anti-mouse alkalinephosphatase)在室温下培养30分钟。使用BCIP/NBT溶液以显现键结的特定标志物，譬如波型蛋白/S100A4/FSP-1、CD90、CD34及CD68。NFA、OPN、IL-6、TGFβ、TNFα、组织因子及VEGF免疫染色法则系以DAB显色，呈红棕色。使用BCIP/NBT溶液，使大的圆形波形蛋白+/S100A4/FSP-1+MTC与较小的梭形CAF、CD90+MSC/HSPC、CD34+HSPC及CD68+TAM局部化而呈蓝色。共同染色呈现紫黑色，单一染色法系以苏木色素进行对比染色，而双重染色法系以甲基绿溶液进行对比染色。
以下实例被提供用以说明但并非限制本发明。
实例1.癌症病患若带有NFA+肿瘤-EMT-基质-BMC致死系统，则即
使在手术治愈后，仍具有预后不佳状况
本实施例使用协同进化状态与NFA表现作为一实验模式。在预后不佳乳腺癌的病患样本中，均会伴随着出现单一个别NFA+/波形蛋白+/S100A4/FSP-1+大的圆形转移MTC(图1A)，尤其会在远距的肿瘤基质(图1B)与血管周隙区(图1C)以及血管内区(图1D)中聚集，此可提供关于NFA在EMT诱导与乳腺癌发展上的关键角色证据。显而易见的是：经由EMT的间质状态会使癌细胞具有转移与侵入的特性，也会诱导癌干细胞特性、防止细胞凋亡与衰老，且有助于针对化疗、免疫治疗及标靶治疗的免疫抑制与多重抗性。因此，癌细胞的间质状态有助于癌细胞具有转移能力与侵略能力的潜力，促使癌症发展与转移，这对于肿瘤细胞分离、迁徙、侵入及转移是必要且关键的(图1)。阶层式NFA+骨髓细胞(BMC)的组群，其包含较小子集的CD90+间质/造血干/源祖细胞(MSC/HSPC)(图1E与F)与CD34+HSPC(图1G)，连同一个较大子集的CD68+巨噬细胞(TAM)(图1H)与较小的波形蛋白+/FSP-1+梭形癌症相关的纤维母细胞(CAF)(图1B与C)，可以在预后不佳乳房肿瘤基质内，同时被检测出，以与图1B和C中所示的NFA+MTC进行共同进化。如图1B与C，NFA+波形蛋白+/S100A4/FSP-1+MTC(大圆形)与NFA+波形蛋白+/S100A4/FSP-1+CAF(较小缩图)，两者的共同表现会常在具有临床预后不佳或是癌症细胞转移的肿瘤基质或血管周隙区内被检测出来。NFA所媒介的EMT诱导作用显然充作桥梁作用，以引发NFA+MTC与NFA+CAF间的协同进化与交联作用，经由肿瘤细胞与基质细胞间的长期旁分泌相互作用，以促进癌症发展，如图1中所示。综合以上结果，提供了全面性的临床证据以支持目前的范例：肿瘤-基质协同进化与交流在肿瘤发展上扮演着一个重要的角色。肿瘤基质内的NFA显然在如上所示的乳癌病患的不佳预后的测定上扮演着主要角色。综合以上结果进一步证实在涉及乳房肿瘤发展的肿瘤-基质协同进化与交联作用上NFA的关键角色。NFA可作为一种新的指标，发现EMT、肿瘤-基质协同进化交流(TSCC)及BMC皆会影响测定乳房肿瘤发展与转移及乳癌病患的不佳预后，这符合EMT、TSCC及BMC可在癌症发展上扮演关键角色的目前范例。因此，本发明提供NFA致死系统，以供肿瘤-EMT-基质-BMC所媒介恶性循环的全面癌症控制，这对于乳房肿瘤的发展与进展是重要的。类似的观察亦可延伸至肺(图2)、胃(图3)及结直肠(图4)的预后不佳的肿瘤。即使于可能的治愈性及/或侵入性治疗后，在具有不佳预后的癌症病患中，NFA-肿瘤-EMT-基质-BMC所媒介的恶性循环证明是最致命且广泛表现的系统。因此，本发明提供一种分子、细胞及全身致死系统，以供全面癌症控制。
实例2.NFA致死系统为一种关于癌症病患预后的潜在标靶
在大群组研究中，超过50％预后不佳的乳癌病患(44/74)显示带有如上述的NFA致死系统。另一方面，若乳癌病患带有NFA致死系统，则在治疗后皆无法具有良好预后，而在67位预后良好的乳癌病患的群体中，无病患显示带有NFA致死系统。同样地，～56％(44/78)预后不佳的肺癌病患显示带有NFA致死系统，且在53位预后良好的肺癌病患的群体中，无法侦测出假阳性病例。同样地，～67％(61/91)预后不佳的GI癌症病患显示带有NFA致死系统，且在治疗后，全部具有预后不佳的情况；在总计94位预后良好的肺癌病患中，于治疗后无法侦测出假阳性病例。整体来说，于总计457位癌症病患中，包含214位预后良好与243位预后不佳的病例，超过60％(149/243)预后不佳的病患显示带有如图1-4中所述的NFA致死系统，且于治疗后全部具有预后不佳的情况，而214位预后良好的肿瘤患者未显示带有NFA致死系统。应注意到的是，预后不佳病患的主要群体是与骨头转移有关联。综合以上结果证明，在测定超过60％癌症病患的不佳临床预后的病例上，NFA致死系统扮演主要且排他的关键角色，以供全面癌症控制(表1)。对于免疫监视、细胞死亡、早衰、化学治疗、免疫治疗及目前靶向治疗，许多癌症病患的不佳预后显然是主要通过NFA+BMC，且特别是具有多重抗性的转移性间质样癌干细胞(metastatic mesenchymal-likecancer stem cells)的NFA+MTC特性两者进行测定。在另一方面，上述NFA+肿瘤基质内各种潜在EMT诱导物的向上调整可能导致似EMT过程的稳定重编程(stable reprogramming of EMT-like processes)，以保持具有转移潜能的间质状态下的NFA+肿瘤干细胞。综合所有结果表示分子、细胞及全身作用机制，用以解释为何如图1D-4D中所示单一个别NFA+/FSP-1+大圆形MTC系足以主要地测得各种类型癌症病患的不佳预后。因此，NFA是表示一种新的描述且先前未被发现的信号标靶，其在影响癌症进展与转移的肿瘤干细胞的间质状态稳定维持上，扮演着举足轻重的角色。
表1
Figure GDA00003079348400131
综上所述，很明确的是，全面癌症控制需要同时针对自分泌、旁分泌及肿瘤-EMT-基质-BMC协同进化信号的全身内分泌作用。因此，本发明是提供可以同时针对癌症12种特征的核心技术，该特征包括EMT诱导的稳定重编程(stable reprogramming of EMT induction)、抗细胞死亡(antiapoptosis)、转移前微环境形成(premetastatic niche formation)、全身性免疫抑制(systemic immunosuppression)、异常肿瘤-基质协同进化(aberranttumor-stroma coevolution)及交联(crosstalk)、癌症相关之发炎(cancer-related inflammation)、异常干性(aberrant stemness)、异常骨髓微环境形成(aberrant bone marrow niche formation)、骨头转移(bone metastasis)及原发性全身内分泌煽动(primary systemic endocrine instigation)，以供全面癌症控制(图5)。
总之，若带有NFA的肿瘤细胞主要且排他地存在于间质状态中，其中该间质状态会与肿瘤细胞的转移、侵入、血管生成转换、免疫抑制、预防过早衰老与凋亡、对化疗所诱导产生的癌细胞干性与多抗性、免疫治疗及标靶治疗以及预后不佳有所相关。从初期上皮肿瘤发展至不同阶段的转移形成，包括循环肿瘤干细胞(CTSC)与衍生物循环肿瘤细胞(CTC)的产生。然而，尚未有任何研究报告指出：一独特的肿瘤标志物足以明确的检测出主要且决定的罕见循环肿瘤细胞(CTC)，以预测在治疗期间与之后转移的可能性。再者，目前循环肿瘤细胞(CTC)标志物已在正常血液细胞中被检验出，且已产生许多假阳性反应。因此，免疫检测技术已大多检验出在血液表现的细胞的上皮标志物，且较显著的为细胞角蛋白。例如，一种先进的标准化商用系统：由美国娇生公司(Johnson & Johnson USA)所开发的细胞搜索系统(Cell Search system)，为一种以EpCAM免疫磁性纯化与细胞角蛋白染色为基础的自动化装置。近来，此细胞搜索技术(Cell Search technology)已经由美国食品药物管理局(FDA)核准，用于带有转移性乳癌、大肠癌及前列腺癌的患者中循环肿瘤细胞(CTC)的血液分析。然而，最近美国临床肿瘤协会(ASCO)在关于目前已知且具有应用潜力的肿瘤标志的调查指出，其达成共识的结论是：目前对于循环肿瘤细胞(CTC)含量的监测于临床使用尚未成熟，建立循环肿瘤细胞(CTC)的预测/预后/诊断性价值的目前核心技术仍待改善。如上文所述，癌症病患若在血管周隙区内带有NFA+波形蛋白+/FSP-1+大圆形MTC，则即使于可能治愈性治疗后，皆未能有良好预后。反之，所有预后良好的病患未显示此种MTC类型。现在很明确的是，MTC为循环肿瘤细胞(CTC)与循环肿瘤干细胞(CTSC)的潜在提供者。因此，本发明是提供侦测最具潜力的MTC、MTSC、CTC及CTSC的方法与组合物，主要预测即使在可能治愈性治疗后，癌症病患的微转移与不佳预后。相较于影响正常过程与病理过程两者的多数EMT诱导者(譬如Twist、Snail、Slug、TGFβ1、TNFα、VEGF及IL-6)的两极作用，NFA致死系统代表一种新的标靶，以使EMT恢复，而不会破坏正常生理功能。因此，在癌症的发展与进展，特别是微转移与骨头转移之前与期间，本发明是提供致死系统的方法与组合物，以供全面癌症控制，包括预测、预防、个人化医疗保健及缓和(图5)。
根据上文，本发明系提供一种预测病患是否具有微转移且处于发展转移风险的方法。
Figure IDA00002760774100011

Claims (13)

1.一种“致死系统”的侦测方法，包括：
取得病患的生物性样本；
测定所述生物性样本中的标志细胞；及
测定所述标志细胞中NFA分子的表达；
其中，当所述生物性样本所包含的标志细胞中测定出具有NFA分子的表达，则表示病患具有“致死系统”。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述标志细胞选自骨髓细胞、癌症相关纤维母细胞、循环肿瘤细胞、循环肿瘤干细胞、上皮肿瘤细胞、上皮肿瘤干细胞、癌症干细胞、肿瘤繁殖细胞、造血干/源祖细胞、间质干细胞、间质肿瘤细胞、间质肿瘤干细胞、肿瘤伴生巨噬细胞或骨髓细胞中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述标志细胞为间质肿瘤细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述生物性样本选自骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述NFA的表达是通过评估NFA蛋白质mRNA、DNA或活性含量。
6.一种预测癌症病患预后状态的方法，包括：
取得癌症病患的生物性样本；
测定在所述生物性样本中的标志细胞；及
测定在所述标志细胞中NFA分子的表达；
通过测定所述生物性样本中的标志细胞的NFA分子的表达，以判断所述癌症病患具有预后不佳的状态。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述标志细胞选自骨髓细胞、癌症相关纤维母细胞、循环肿瘤细胞、循环肿瘤干细胞、上皮肿瘤细胞、上皮肿瘤干细胞、癌症干细胞、肿瘤繁殖细胞、造血干/源祖细胞、间质干细胞、间质肿瘤细胞、间质肿瘤干细胞、肿瘤伴生巨噬细胞或骨髓细胞中的一种或多种。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述生物性样本选自骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液中的一种或多种。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述NFA的表达是通过评估该NFA分子的蛋白质、mRNA、DNA或活性含量。
10.一种检测癌症病患癌症转移可能性的方法，包括：
取得癌症病患的生物性样本；
测定在所述生物性样本中的标志细胞；及
测定在所述标志细胞中NFA分子的表达；
其中，当所述生物性样本中所含有的标志细胞中测定出NFA分子的表达，则表示所述癌症病患具有癌症转移的高度可能性。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述标志细胞选自骨髓细胞、癌症相关纤维母细胞、循环肿瘤细胞、循环肿瘤干细胞、上皮肿瘤细胞、上皮肿瘤干细胞、癌症干细胞、肿瘤繁殖细胞、造血干/源祖细胞、间质干细胞、间质肿瘤细胞、间质肿瘤干细胞、肿瘤伴生巨噬细胞或骨髓细胞中的一种或多种。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述生物性样本为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述NFA分子的表达是通过评估该NFA分子的蛋白质、mRNA、DNA或活性含量。
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