ES2938362T3 - Procedimientos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas - Google Patents

Procedimientos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas Download PDF

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Abstract

La invención proporciona nuevas moléculas de ADN recombinante, composiciones y métodos para regular selectivamente la expresión de una molécula de polinucleótido transcribible o proteína recombinante en un tejido reproductivo masculino de una planta transgénica. La invención también proporciona plantas transgénicas, células vegetales, partes de plantas, semillas y productos básicos que comprenden dichas moléculas y composiciones de ADN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La invención se refiere, en general, a los campos de la agricultura, cultivo de plantas y biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a procedimientos y composiciones para regular selectivamente la expresión de proteínas en el tejido reproductor masculino de las plantas transgénicas y sus usos.
Descripción de la técnica relacionada
Se produce una semilla híbrida mediante la hibridación o la fertilización cruzada de plantas estrechamente relacionadas y se puede cultivar en plantas híbridas de progenie que poseen una combinación deseada de rasgos que no posee ninguna de las plantas originales. Las plantas híbridas pueden mostrar características agronómicas superiores como la mejora del tamaño de la planta, el rendimiento, la composición nutricional, la resistencia a enfermedades, la tolerancia a herbicidas, la tolerancia al estrés, la adaptación climática y otros rasgos deseados. La producción de semillas híbridas eficiente requiere que el polen de una planta no pueda autofertilizar la planta. Una limitación importante en la producción de una semilla híbrida para muchos cultivos es la falta de procedimientos simples, confiables y económicos para androesterilizar las plantas e impedirles la autofertilización.
En la producción de semillas híbridas, la producción de polen y la diseminación del polen se pueden impedir en una planta original femenina para facilitar la polinización cruzada de la planta femenina en lugar de la autopolinización. Dicho impedimento se puede lograr, por ejemplo, mediante eliminación manual de las estructuras que contienen polen (por ejemplo, mediante despanojado manual o mecánico del maíz), el uso de un medio genético de control de la polinización (por ejemplo, mediante el uso de tecnología de androesterilización citoplásmica o nuclear), el uso de un agente químico o cualquier combinación de estos. Este proceso puede requerir mucha mano de obra y, por lo tanto, resulta costoso. En el maíz, por ejemplo, el despanojado se realiza, típicamente, en dos etapas: despanojado mecánico seguido por despanojado manual. La producción comercial de semillas híbridas utilizando únicamente gametocidas químicos está limitada principalmente por su falta general de selectividad para los gametos y su efecto sobre las otras partes de la planta. Por lo tanto, los procedimientos para mejorar la eficacia de la producción de semillas híbridas son altamente deseables.
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones que se adjunta.
Otras realizaciones específicas de la invención se describen en la siguiente descripción detallada. A lo largo de esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender" y sus variaciones, tales como, "comprende" o "que comprende", implican la inclusión de un número entero o elemento o etapa, o grupo de números enteros, elementos o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero, elemento o etapa, o grupo de números enteros, elementos o etapas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Ilustración de las etapas de desarrollo de borla V7 en T2, V8/V9 en T4, V10/V11 en T5, V12 en T6 y VT en T7 que muestran un tamaño y morfología de borla con las fotografías de los paneles inferiores de las secciones transversales de las anteras que muestran la etapa de desarrollo de polen. Las etapas utilizadas anteriormente (V10/V11 y V12) en la técnica para aislar moléculas de ARN pequeñas para la identificación de moléculas de mts-ARNip están indicadas por una casilla con una línea sólida; las etapas (V7, V8/V9, V10/V11 y V12) descritas en el presente documento para aislar moléculas de ARN pequeñas están indicadas con una casilla con una línea punteada.
Figura 2. Representación gráfica de alineamiento de secuencias de mts-ARNip sobre la secuencia de ADNc proporcionada como SEQ ID NO: 17. La secuencia de ADNc está indicada desde el nucleótido 1 al 1826 y las líneas cortas representan el alineamiento de la cadena complementaria de las secuencias de mts-ARNip individuales o los tramos de secuencias de mts-ARNip adyacentes o las secuencias de mts-ARNip superpuestas (líneas relativamente más largas) a la secuencia de ADNc. Las secuencias de mts-ARNip que tienen la misma cadena que ADNc no se muestran. El nivel de expresión relativa normalizada de mts-ARNip está indicado a la izquierda. El área dentro de la casilla representa una región de la secuencia de ADNc rica en dianas de mts-ARNip. Figura 3. Diagrama que ilustra mts-ARNip de cadena doble, mts-ARNip de cadena simple, secuencia diana de mts-ARNip dentro de un ARNm y una región de ARNm con una cantidad alta de secuencias diana de mts-ARNip útiles como un elemento diana de mts-ARNip.
Figura 4. Fotografía de borla de maíz R0 y polen teñido con tinta Alexandar de plantas transgénicas de copia doble que contienen una molécula de ADN recombinante que comprende un transgén codificante de una proteína de EPSPS tolerante a glifosato unida operativamente a un elemento diana de mts-ARNip (SEQ ID NO: 2). Los eventos de 1 a 4 se pulverizaron con 0,75 lb ae/acre de herbicida de glifosato en V5 seguido de la etapa V8 y mostraron borlas con esterilidad masculina completa según lo definido por la ausencia de antesis y granos de polen no viables o sin granos de polen detectados en las anteras. Las plantas de control no recibieron una aplicación de glifosato y demostraron antesis normal y diseminación del polen y la observación microscópica detectó granos de polen normales.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que tiene el 95 % de identidad de secuencia con las posiciones de nucleótidos de 1429 a 1628 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 17.
SEQ ID NO: 2 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que tiene el 95 % de identidad de secuencia con las posiciones de nucleótidos de 1429 a 1628 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 17 y que tiene un único cambio de nucleótido (T69A) con respecto a SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que corresponde con las posiciones de nucleótidos de 239 a 433 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 18.
SEQ ID NO: 4 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que corresponde con las posiciones de nucleótidos de 477 a 697 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 18.
SEQ ID NO: 5 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que corresponde con las posiciones de nucleótidos de 239 a 433 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19.
SEQ ID NO: 6 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que corresponde con las posiciones de nucleótidos de 370 a 477 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19.
SEQ ID NO: 7 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que corresponde con las posiciones de nucleótidos de 1357 a 1562 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 20.
SEQ ID NO: 8 - Una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que corresponde con las posiciones de nucleótidos de 247 a 441 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 21.
SEQ ID NO: 9 - El complemento inverso de una secuencia de elemento diana de mts-ARNip que tiene el 99% de identidad de secuencia con las posiciones de nucleótidos de 191 a 490 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 22 con tres emparejamientos erróneos de nucleótidos (C314A, A350G y G408A).
SEQ ID NO: 10-16 - Secuencias de elementos diana de mts-ARNip recombinantes.
SEQ ID NO: 17 - Secuencia de ADNc que contiene al menos una región rica en secuencia diana de mts-ARNip. Contiene las secuencias del elemento diana de mts-ARNip representadas por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y se alinea con las secuencias de mts-ARNip SEQ ID NO: 23-31.
SEQ ID NO: 18 - Secuencia de ADNc que contiene al menos una región rica en secuencia diana de mts-ARNip. Contiene las secuencias del elemento diana de mts-ARNip representadas por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y se alinea con las secuencias de mts-ARNip SEQ ID NO: 32-42.
SEQ ID NO: 19 - Secuencia de ADNc que contiene al menos una región rica en secuencia diana de mts-ARNip. Contiene las secuencias del elemento diana de mts-ARNip representadas por SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 y se alinea con las secuencias de mts-ARNip SEQ ID NO: 43-52.
SEQ ID NO: 20 - Secuencia de ADNc que contiene al menos una región rica en secuencia diana de mts-ARNip. Contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 7 y se alinea con las secuencias de mts-ARNip SEQ ID NO: 53-60.
SEQ ID NO: 21 - Secuencia de ADNc que contiene al menos una región rica en secuencia diana de mts-ARNip. Contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 8 y se alinea con las secuencias de mts-ARNip SEQ ID NO: 61-69.
SEQ ID NO: 22 - Secuencia de ADNc que contiene al menos una región rica en secuencia diana de mts-ARNip. Contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 9 y se alinea con las secuencias de mts-ARNip SEQ ID NO: 70-87.
SEQ ID NO: 23-92 - Secuencias de ADN que corresponden a las secuencias de mts-ARNip de la invención, que se alinean con las secuencias de ADNc proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 17-22.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona una molécula de ADN recombinante que incluye un elemento diana de ARN interferente pequeño específico de tejido masculino (mts (male tissue-specifíc)-ARNip) que consiste en las SEQ ID NO: 1 o 2 o complementos de estas, unido operativamente a un polinucleótido transcribible heterólogo. Dicha molécula de ADN recombinante es útil para regular de forma selectiva la expresión de un polinucleótido transcribible heterólogo en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica. Las secuencias de ácido nucleico se pueden proporcionar como a Dn o como ARN, según lo especificado; la descripción de una define necesariamente a la otra, según lo sabe el experto en la técnica. Además, la descripción de una secuencia de ácido nucleico determinada define necesariamente e incluye el complemento de dicha secuencia, según lo sabe el experto en la técnica.
El ARN interferente pequeño (ARNip) es una clase de moléculas de ARN de aproximadamente 18-26 nucleótidos (nt) de longitud (por ejemplo, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 nt). Una secuencia de ARNip se puede representar utilizando la secuencia de nucleótidos de ARN que consiste en guanina (G), citosina (C), adenina (A) y uracilo (U) o utilizando la secuencia de nucleótidos de ADN equivalente de guanina (G), citosina (C), adenina (A) y timina (T). El ARNip funciona dentro de complejos de silenciamiento inducidos por ARN (RISC) para disparar la degradación específica de secuencia del a Rn mensajero (ARNm), lo que produce la alteración de la expresión génica y la regulación por disminución de la proteína codificada por el gen.
Un “ARNip específico de tejido masculino” o “ mts-ARNip” es un ARNip enriquecido o expresado específicamente en el tejido reproductor masculino (por ejemplo, la inflorescencia masculina) de una planta que, por ende, tiene un patrón de expresión específico de tejido masculino. Se ha identificado ARNip específico de tejido masculino en plantas y se puede detectar utilizando técnicas conocidas en la técnica, como análisis Northern de bajo peso molecular. Una “ secuencia de mts-ARNip” es la secuencia de ácido nucleico de un mts-ARNip. En el presente documento, las secuencias de mts-ARNip ejemplares en la forma de la secuencia de ADN correspondiente de la molécula de mts-ARNip de cadena doble se proporcionan como SEQ ID NO: 23-92.
En el presente documento, una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia de mts-ARNip se denomina “ diana de mts-ARNip” . La diana de mts-ARNip está contenida en la secuencia de ADN de un gen y está transcrita en la secuencia de ARN de la molécula de ARNm correspondiente. Una cadena simple de una molécula de mts-ARNip de cadena doble se puede unir o hibridar en condiciones fisiológicas típicas con la diana de mts-ARNip en la molécula de ARNm. Véase la figura 3. Una secuencia de ácido nucleico es complementaria de una secuencia de mts-ARNip si un alineamiento de las dos secuencias de ácido nucleico produce una coincidencia exacta (sin emparejamientos erróneos, es decir, complemento completo), uno, dos o tres emparejamientos erróneos a lo largo de toda la secuencia de mts-ARNip. Las secuencias complementarias pueden tener un emparejamiento de bases entre sí de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson-Crick estándar (es decir, pares de guanina con citosina (G:C) y pares de adenina con timina (A:T) o uracilo (A:U). Una “ secuencia diana de mts-ARNip” es la secuencia de ácido nucleico de una diana de mts-ARNip. En el presente documento, las secuencias diana de mts-ARNip ejemplares se proporcionan como SEQ ID NO: 23-92.
Más de una diana de mts-ARNip se puede agrupar o incluso superponer dentro de una única molécula de ADN. En el presente documento, una molécula de ADN que comprende más de una diana de mts-ARNip se denomina “ elemento diana de mts-ARNip” . Un elemento diana de mts-ARNip comprende al menos dos o más dianas de mts-ARNip dentro de una ventana de secuencia de 500 nucleótidos. Un elemento diana de mts-ARNip puede tener cualquier longitud, por ejemplo, aproximadamente 30 nucleótidos (nt), aproximadamente 40 nt, aproximadamente 50 nt, aproximadamente 60 nt, aproximadamente 70 nt, aproximadamente 80 nt, aproximadamente 90 nt, aproximadamente 100 nt, aproximadamente 150 nt, aproximadamente 200 nt, aproximadamente 250 nt, aproximadamente 300 nt, aproximadamente 350 nt, aproximadamente 400 nt, aproximadamente 450 nt o aproximadamente 500 nt. Una “ secuencia de elemento diana de mts-ARNip” es la secuencia de ácido nucleico de un elemento diana de mts-ARNip. En el presente documento, las secuencias de elementos diana de mts-ARNip ejemplares se proporcionan como SEQ ID NO: 1-16.
Según se utiliza en el presente documento, una molécula de ADN “ recombinante", polipéptido, proteína, célula u organismo puede ser no natural o una creación hecha por el hombre utilizando las herramientas de la ingeniería genética y, como tal, es el producto de la actividad humana y, normalmente, no se encuentra en la naturaleza. Una "molécula de ADN recombinante” se refiere a una molécula de ADN que comprende una combinación de secuencias de ADN o moléculas que no se encuentran en la naturaleza juntas sin la intervención del hombre. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante puede ser una molécula de ADN que está compuesta por al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí, una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que se desvía de las secuencias de ADN que existen en la naturaleza o una molécula de ADN que se ha incorporado en el ADN de una célula hospedadora mediante transformación genética. En una realización, una molécula de ADN recombinante de la invención es una molécula de ADN que comprende un elemento diana de mts-ARNip unido operativamente a al menos una molécula de polinucleótido transcribible, por ejemplo, en la que la molécula de polinucleótido transcribible es heteróloga al elemento diana de mts-ARNip. Según se utiliza en el presente documento , una molécula, célula u organismo “ recombinante” puede ser sintético.
Según se utiliza en el presente documento, el término “ heterólogo” se refiere a la combinación de dos o más moléculas de ADN o proteínas cuando dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza o cuando dicha combinación se proporciona en una orientación u orden que es diferente del que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, se pueden derivar las dos moléculas de ADN de especies diferentes o crear de forma sintética y/o las dos moléculas de ADN se pueden derivar de genes diferentes, p. ej., genes diferentes de las mismas especies o los mismos genes de diferentes especies. En un ejemplo, un elemento regulador o elemento diana de mts-ARNip puede ser heterólogo con respecto a una molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, la molécula de polinucleótido transcribible no se encuentra en la naturaleza unida operativamente al elemento regulador o el elemento diana de mts-ARNip. Dicha combinación heteróloga puede comprender un elemento diana de mts-ARNip que puede ser derivado de planta o sintetizado químicamente y puede estar unido operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible, como un transgén bacteriano codificante de una proteína para la tolerancia a herbicidas, como un cp4-EPSPS (por ejemplo, como se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 93). Además, una secuencia particular puede ser “ heteróloga” con respecto a una célula u organismo en el cual se introduce (por ejemplo, una secuencia que no se encuentra naturalmente en esa célula u organismo particular).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" significa separado de otras moléculas que, típicamente, se encuentran asociadas con ella en estado natural. Por ejemplo, una molécula de ADN aislada es una molécula que está presente sola o combinada con otras composiciones, pero no se encuentra en su ubicación genómica natural o estado. El término “aislado” puede referirse a una molécula de ADN que está separada de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean la molécula de ADN en su estado natural. Por ejemplo, una molécula de ADN aislada puede ser una molécula de ADN que está compuesta por al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí. En otro ejemplo, una molécula de ADN aislada puede ser una molécula de ADN que se ha incorporado en una ubicación genómica novedosa en una célula hospedadora por transformación genética. Por ende, una molécula de ADN fusionada o unida operativamente a una o más moléculas de ADN diferentes con las cuales no se encontraría asociada en la naturaleza, por ejemplo, como consecuencia de técnicas de transformación de plantas o ADN recombinante, se considera aislada en el presente documento . Estas moléculas se consideran aisladas incluso cuando están integradas en el cromosoma de una célula hospedadora o presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN.
La expresión “ unido operativamente” se refiere a al menos dos moléculas de nucleótidos dispuestas o unidas de una forma de modo que una pueda afectar la función de la otra. Las dos moléculas de nucleótidos pueden formar parte de una molécula de nucleótidos contigua única y puede estar adyacentes o separadas. Por ejemplo, un elemento diana de mts-ARNip puede estar unido operativamente con una molécula de polinucleótido transcribible. Una molécula de mts-ARNip unida operativamente puede afectar a la transcripción, a la traducción o a la expresión de la molécula de polinucleótido transcribible. Por ejemplo, un elemento diana de mts-ARNip está unido operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible si, después de la transcripción en célula de tejido reproductor masculino, la presencia del elemento diana de mts-ARNip en la molécula de ARNm provoca la regulación de la expresión de la molécula de polinucleótido transcribible en la célula inducida por el mts-ARNip endógeno y la vía de RISC. La unión operativa del elemento diana de mts-ARNip y la molécula de polinucleótido transcribible se puede lograr, por ejemplo, a través de la incorporación de un elemento diana de mts-ARNip adyacente a la molécula de polinucleótido transcribible (por ejemplo ubicado 5’ o 3’ con respecto a la molécula de polinucleótido transcribible, pero no necesariamente en unión contigua), o adyacente a una región no traducida (UTR) de la molécula de polinucleótido (por ejemplo ubicado en o al lado de la 5’ UTR o la 3’ UTR), y/o 3’ con respecto a la molécula de polinucleótido transcribible y 5’ con respecto a la señal de poliadenilación. Un elemento diana de mts-ARNip puede ubicarse entre la molécula de polinucleótido transcribible y la secuencia de poliadenilación, es decir 3’ y adyacente a la molécula de polinucleótido transcribible. Un elemento diana de mts-ARNip puede ubicarse entre el codón de detención de la molécula de polinucleótido transcribible y la secuencia de poliadenilación. En otra realización, un elemento diana de mts-ARNip está ubicado dentro de la 3’ secuencia de UTR adyacente a la molécula de polinucleótido transcribible.
En el presente documento se proporcionan ejemplos de la identificación de mts-ARNip, dianas mts-ARNip y elementos diana de mts-ARNip y estos pueden identificarse a través de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, a través de análisis bioinformático de bibliotecas de ARNs y ADNc de plantas. En particular, el mts-ARNip puede identificarse a partir de bibliotecas de ARNs y puede secuenciarse. Las secuencias de mts-ARNip identificadas se pueden comparar con ADNc y/o colecciones de secuencias genómicas para identificar dianas de mts-ARNip y elementos diana de mts-ARNip útiles para el desarrollo de moléculas y construcciones de ADN recombinante tal como se describe en el presente documento.
Los elementos diana de mts-ARNip pueden crearse, sintetizarse o modificarse in vitro. Por ejemplo, los elementos diana de mts-ARNip pueden ser modificados para contener más, menos o diferentes secuencias diana de mts-ARNip o para volver a disponer la posición relativa de una o más secuencias diana de mts-ARNip. Dicha modificación puede ser beneficiosa para aumentar o disminuir el efecto del elemento diana de mts-ARNip. Los procedimientos para la creación, síntesis o modificación in vitro de un elemento diana de mts-ARNip y para determinar la variación óptima para el nivel deseado de regulación, son conocidos por los expertos en la técnica. Los elementos diana de mts-ARNip ejemplares pueden ser creados mediante la combinación de las secuencias de ADN, o fragmentos de este, de dos o más dianas de mts-ARNip, dos o más elementos diana de mts-ARNip, dos o más regiones de ADNc ricas en diana de mts-ARNip, o una o más dianas o de mts-ARNip o fragmentos de dos o más regiones de ADNc ricas en diana de mtsARNip, por ejemplo mediante la combinación de todos o fragmentos de dos o más elementos diana de mts-ARNip proporcionados en el presente documento como SEQ ID NO: 1-9, mediante la combinación de dos o más de las secuencias de mts-ARNip proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 23-92, o mediante la combinación de todos o fragmentos de dos o más elementos diana de mts-ARNip proporcionados en el presente documento como SEQ ID NO: 1-9 con una o más de las secuencias de mts-ARNip proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 23-92. Dichos elementos diana de mts-ARNip recombinante ejemplares son proporcionados en el presente documento como SEQ ID NO: 10-16.
La secuencia de ADN del elemento diana de mts-ARNip también puede modificarse mediante la incorporación de 1-3 emparejamientos erróneos de nucleótidos en una secuencia diana de mts-ARNip (con respecto a una secuencia de mts-ARNip determinada). En el presente documento se describen moléculas de ADN recombinante o elementos diana de mts-ARNip que tienen al menos aproximadamente el 80 % (por ciento) de identidad de secuencia, aproximadamente el 85 de identidad de secuencia, aproximadamente el 90 % de identidad de secuencia, aproximadamente 91 de identidad de secuencia, aproximadamente el 92 % de identidad de secuencia, aproximadamente 93 de identidad de secuencia, aproximadamente el 94 % de identidad de secuencia, aproximadamente 95 de identidad de secuencia, aproximadamente el 96 % de identidad de secuencia, aproximadamente 97 de identidad de secuencia, aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia y aproximadamente el 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las moléculas de ADN, los elementos diana de mts-ARNip (por ejemplo SEQ ID NO: 1-9), los elementos diana de mts-ARNip recombinante (por ejemplo SEQ ID NO: 10-16) o las secuencias de ADNc (por ejemplo SEQ ID NO: 17-22.
También se describen fragmentos de una molécula de ADN descrita en el presente documento. Dichos fragmentos pueden ser útiles como elementos diana de mts-ARNip o se pueden combinar con otros elementos diana de mts-ARNip, secuencias de mts-ARNip o fragmentos de estos para la construcción de elementos diana de mts-ARNip recombinante, tal como se describió anteriormente. En realizaciones específicas, dichos fragmentos pueden comprender al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 110, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 130, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 170, al menos aproximadamente 180, al menos aproximadamente 190, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 210, al menos aproximadamente 220, al menos aproximadamente 230, al menos aproximadamente 240, al menos aproximadamente 250a al menos aproximadamente 260, al menos aproximadamente 270, al menos aproximadamente 280, al menos aproximadamente 290, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 350, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450, al menos aproximadamente 500 nucleótidos contiguos, o más largos, de una molécula de ADN descrita en el presente documento , por ejemplo un elemento diana de mts-ARNip o secuencia de ADNc descrita en el presente documento . En la técnica se conocen procedimientos para producir dichos fragmentos a partir de una molécula de ADN inicial.
La eficacia de las modificaciones, duplicaciones, eliminaciones o redisposiciones descritas en el presente documento en los aspectos de expresión deseados de una molécula de polinucleótido transcribible particular, puede ser evaluada empíricamente en ensayos de plantas estables y transitorios, por ejemplo, los descritos en los ejemplos de trabajo del presente documento , para validar los resultados, los cuales pueden variar dependiendo de los cambios hechos y el objetivo del cambio en la molécula de ADN inicial.
Una diana de mts-ARNip y un elemento diana de mts-ARNip pueden funcionar en cualquier dirección, lo que significa que es no direccional, y como tal se puede utilizar en cualquiera de la orientación 5’ a 3’ o de la orientación 3’ a 5’ en una molécula de ADN recombinante o construcción de ADN.
Tal como se utiliza en el presente documento, "expresión de una molécula de polinucleótido transcribible” o "expresión de una proteína" se refiere a la producción de una proteína a partir de una molécula de polinucleótido transcribible y la transcripción resultante (ARNm) en una célula. Por lo tanto, la frase "expresión de proteína", se refiere a cualquier patrón o traducción de una molécula de ARN transcrita en una molécula de proteína. La expresión de proteína puede estar caracterizada por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo o morfológicas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas. Las moléculas de ADN recombinante de la invención pueden utilizarse para regular selectivamente la expresión de una proteína o molécula de polinucleótido transcribible en tejidos reproductores masculinos de una planta transgénica. La expresión de la molécula de ADN recombinante en una planta transgénica puede provocar la expresión de una molécula de polinucleótido unida operativamente en al menos tejidos vegetativos, pero no en tejidos reproductores masculinos. La regulación de la expresión de proteína puede referirse a suprimir o reducir; por ejemplo, suprimir o reducir el nivel de proteína producida en una célula, por ejemplo, a través de la regulación genética postraduccional mediada por ARNi.
Regulación selectiva de la expresión de proteína, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una reducción de producción de proteína en una célula o tejido en comparación con una célula o tejido de referencia en al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de reducción (es decir, una reducción completa). Una célula o tejido de referencia puede ser, por ejemplo, una célula o tejido vegetal de la misma planta transgénica o una similar que expresa la proteína o una célula o tejido de una planta transgénica que tiene un transgén similar que codifica la proteína pero carece de un elemento diana de mts-ARNip unido operativamente. La regulación de la expresión de proteína puede ser determinada utilizando cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, por ejemplo a través de la medición directa de la acumulación de proteína en una muestra de célula o tejido utilizando una técnica tal como ELISA o análisis de transferencia Western, mediante la medición de la actividad enzimática de la proteína o mediante la determinación fenotípica de la expresión de proteína. La regulación selectiva de la expresión de proteína puede referirse a la reducción suficiente en la expresión de una proteína que puede conferir tolerancia al herbicida en el tejido masculino de una planta transgénica para producir un fenotipo detectable de fertilidad masculina alterada en una planta transgénica a la cual se aplica herbicida como un aerosol de esterilidad inducida. La detección de fertilidad masculina alterada en dicha planta transgénica, por lo tanto, indica la regulación selectiva de la expresión de proteína.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "transgén que codifica una proteína recombinante” o "molécula de polinucleótido transcribible" se refiere a cualquier molécula de nucleótido que puede transcribirse en una molécula de ARN, incluso, entre otros, las que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos. Dependiendo de las condiciones, la secuencia de nucleótidos se puede traducir o no a una molécula de polipéptidos en una célula. Los límites de un transgén o molécula de polinucleótido transcribible son trazados comúnmente por un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de detención de traducción en el extremo 3'.
El término "transgén” se refiere a una molécula de ADN incorporada artificialmente en el genoma de un organismo o célula hospedadora, en la generación actual o cualquier generación anterior del organismo o célula, como resultado de la intervención humana, por ejemplo, a través de procedimientos de transformación de plantas. Tal como se utiliza en el presente documento , el término "transgénico” significa que comprende un transgén, por ejemplo una "planta transgénica” se refiere a una planta que comprende un transgén en su genoma y un "rasgo transgénico” se refiere a una característica o fenotipo transportado o conferido por la presencia de un transgén incorporado en el genoma de la planta. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta transgénica es algo claramente diferente de la planta silvestre relacionada y el rasgo transgénico es un rasgo que no se encuentra naturalmente en la planta silvestre. Las plantas transgénicas de la invención comprenden la molécula de ADN recombinante proporcionada por la invención.
Un transgén o molécula de polinucleótido transcribible de la invención incluye, entre otros, un transgén o molécula de polinucleótido transcribible que proporciona una característica deseable asociada con la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, propiedades nutricionales, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, tolerancia a herbicidas, tolerancia al estrés, tolerancia al estrés ambiental o tolerancia química de la planta. En una realización, una molécula de polinucleótido transcribible de la invención codifica una proteína que cuando se expresa en una planta transgénica confiere tolerancia a herbicidas al menos en una célula y/o tejido donde se produce la proteína expresada; la regulación selectiva de la proteína de tolerancia a herbicidas en el tejido reproductor masculino de la planta transgénica junto con la aplicación oportuna de herbicida provoca al menos una fertilidad masculina reducida inducida o esterilidad masculina inducida.
Dicha esterilidad masculina inducible combinada con una tolerancia a herbicidas vegetativos se puede utilizar para aumentar la eficiencia con la cual se produce la semilla híbrida, por ejemplo, mediante la eliminación o reducción de la necesidad de emascular físicamente la planta de maíz utilizada como una planta femenina en un cruzamiento determinado durante la producción de semillas híbridas. En la patente estadounidense N.° 6.762.344; la patente estadounidense N.° 8.618.358; y la publicación de patente estadounidense 2013/0007908, por ejemplo, se han descrito sistemas de esterilidad masculina inducibles por herbicidas. Algunos ejemplos de herbicidas útiles para la práctica de la invención incluyen, entre otros, inhibidores de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) (por ejemplo, fops y dims), inhibidores de acetolactato sintasa (ALS) (por ejemplo, sulfonilureas (SU) e imidazolinonas (IMI)), inhibidores de fotosistema II (PSII) (por ejemplo, traiazinas y éteres de fenilo), inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa (PPO) (por ejemplo, flumioxazsin y fomesafen), inhibidores de 4-hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) (por ejemplo, isoxaflutol ytricetonastal como mesotriona), inhibidores de 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSpS) (por ejemplo, glifosato), inhibidores de glutamina sintasa (GS) (por ejemplo, glufosinato y fosfinotricina), auxinas sintéticas (por ejemplo, 2,4-D y dicamba). Algunos ejemplos de transgenes o moléculas de polinucleótidos que se pueden transcribir para su uso en la práctica de la invención incluyen, entre otros, genes que codifican proteínas que confieren tolerancia a inhibidores de HPPD (por ejemplo HPPD sensible a herbicidas), genes que codifican proteínas que confieren tolerancia a glufosinato (por ejemplos pat y bar), genes que codifican proteínas que confieren tolerancia a glifosato (por ejemplo un EPSPS tolerante a glifosato, tal como cp4-epsps, proporcionado en el presente documento como SEQ ID NO: 93), y genes que codifican proteínas que confieren tolerancia a una auxina sintética tal como dicamba (por ejemplo dicamba monooxigenasa (DMO)) y 2,4-D (por ejemplo gen (RJ-diclorprop dioxigenasa (rdpA)).
Las construcciones de ADN recombinante de la invención pueden incluir las moléculas de ADN recombinante de la invención y se realizan a través de técnicas conocidas en la técnica y en diversas realizaciones se incluyen en vectores de transformación de plantas, plásmidos o ADN plástido. Dichas construcciones de ADN recombinante son útiles para producir plantas y/o células transgénicas y, como tal, también pueden estar contenidas en el ADN genómico de una planta, semilla, célula o parte de planta transgénica. Por lo tanto, el presente documento invención incluye realizaciones en las que la construcción de ADN recombinante está ubicada dentro de un vector de transformación de plantas, en una partícula biolística para transformar una célula de planta, dentro de un cromosoma o plástido de una célula de planta transgénica, dentro de una célula transgénica, tejido de planta transgénica, semilla de planta transgénica, grano de polen transgénico o una planta transgénica o parcialmente transgénica (por ejemplo, con injerto). Un vector es cualquier molécula de ADN que se puede utilizar para el objetivo de transformar la planta, es decir, la introducción de un ADN en una célula. Las construcciones de ADN recombinante de la invención, por ejemplo, pueden insertarse en un vector de transformación de plantas y utilizarse para la transformación de plantas para producir plantas, semillas y células transgénicas. Los procedimientos para construir vectores de transformación de plantas son conocidos en la técnica. Los vectores de transformación de plantas de la invención, en general, incluyen, entre otros: un promotor adecuado para la expresión de un ADN unido operativamente, una construcción de ADN recombinante unido operativamente y una señal de poliadenilación (que se puede incluir en una secuencia 3’UTR). Los promotores útiles para la práctica de la invención incluyen los que funcionan en una planta para la expresión de un polinucleótido unido operativamente. Dichos promotores son variados y conocidos en la técnica e incluyen los que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos, regulados temporalmente, regulados espacialmente y/o regulados espaciotemporalmente. Algunos componentes opcionales adicionales incluyen, entre otros, una o más de las siguientes dianas: 5’ UTR, potenciador, diana que actúa en cis, intrón, secuencia de señal, secuencia de péptido de tránsito y uno o más genes marcadores seleccionables. En una realización, un vector de transformación de plantas comprende una construcción de ADN recombinante.
Las construcciones de ADN recombinante y los vectores de transformación de plantas de la presente invención, se realizan a través de cualquier procedimiento adecuado para la aplicación pretendida, teniendo en cuenta, por ejemplo, el tipo de expresión deseada, el transgén o molécula de polinucleótido transcribible, y la conveniencia de su uso en la planta en la cual se expresa la construcción de ADN recombinante. Los procedimientos generales útiles para manipular moléculas de ADN para realizar y utilizar construcciones de ADN recombinante y vectores de transformación de plantas son conocidos en la técnica y se describen detalladamente, por ejemplo, en guías y manuales de laboratorio que incluyen Michael R. Green y Joseph Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (cuarta edición) ISBN:978-1-936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2012).
Las moléculas de ADN recombinante y las construcciones de la invención pueden modificarse a través de procedimientos conocidos en la técnica, ya sea completamente o en parte, por ejemplo, para aumentar la conveniencia de la manipulación de ADN (tal como la restricción de sitios de reconocimiento de enzimas o sitios de clonación basada en recombinación), o para incluir secuencias preferidas de plantas (tal como uso de codón de planta o secuencias de consenso Kozak) o para incluir secuencias útiles para el diseño de moléculas y construcciones de ADN recombinante (tales como secuencias espaciadoras o enlazadoras). En determinadas realizaciones, la secuencia de ADN de la molécula y la construcción de ADN recombinante incluye una secuencia de ADN que se ha optimizado con codones para la planta en la cual se expresa la molécula o la construcción de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula o construcción de ADN recombinante que se expresa en una planta puede optimizar por codones toda su secuencia o partes de esta para la expresión en una planta a través de procedimientos conocidos en la técnica. Las moléculas o construcciones de ADN recombinante de la invención se pueden apilar con otras moléculas de ADN recombinante o eventos transgénicos para impartir rasgos adicionales (por ejemplo, en el caso de plantas transformadas, los rasgos incluyen resistencia a herbicidas, resistencia a plagas, tolerancia a la germinación fría, tolerancia al déficit de agua) por ejemplo, expresando o regulando otros genes.
Un aspecto de la invención incluye células de plantas transgénicas, tejidos de plantas transgénicas y semillas o plantas transgénicas que incluyen una molécula de ADN recombinante de la invención. Un aspecto adicional de la invención incluye cromosomas de plantas artificiales o recombinantes que incluyen una molécula de ADN recombinante de la invención. Los procedimientos adecuados para la transformación de células de plantas hospedadoras para su uso con el presente documento invención incluyen prácticamente cualquier procedimiento a través del cual se puede introducir a Dn en una célula (por ejemplo, cuando una molécula de ADN recombinante está integrada en forma estable en un cromosoma de planta) y son conocidos en la técnica. Un procedimiento ejemplar y ampliamente utilizado para introducir una molécula de ADN recombinante en plantas es el sistema d transformación de Agrobacterium, el cual es conocido por los expertos en la técnica. Otro procedimiento ejemplar para introducir una molécula de ADN recombinante en plantas es la inserción de una molécula de ADN recombinante en un genoma de planta en un sitio predeterminado a través de procedimientos de integración dirigida al sitio. La integración dirigida al sitio se puede lograr a través de cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de nucleasas de dedos de cinc, meganucleasas modificadas genéticamente o naturales, TALE-endonucleasas o una endonucleasa guiada por ARN (por ejemplo, un sistema CRISPR/Cas9). Se pueden regenerar plantas transgénicas a partir de una célula de planta transformada a través de procedimientos de cultivo de células de plantas. Se puede obtener una planta transgénica homocigótica con respecto a un transgén mediante el apareamiento sexual (autofecundación) de una planta transgénica segregante independiente que contiene una única secuencia génica agregada por sí misma, por ejemplo, una planta R0 o F0, para producir semilla R1 o F1. Un cuarto de la semilla R1 o F1 producida es homocigótica con respecto al transgén. Las plantas cultivadas a partir de la germinación de semilla R1 o F1 se puede evaluar para detectar la heterocigocidad, típicamente utilizando un ensayo SNP o un ensayo de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigotas y homocigotas (es decir, un ensayo de cigosidad).
La invención proporciona una planta transgénica que tiene en su genoma una molécula de ADN recombinante de la invención, incluso, sin limitación, alfalfa, algodón, maíz, canola, arroz, soja y trigo, entre otros. La invención también proporciona células de plantas, partes de plantas y progenie de dicha planta transgénica. Tal como se utiliza en el presente documento , "progenie” incluye cualquier planta, semilla, célula de planta y/o parte de planta producida o regenerada a partir de una planta, semilla, célula de planta y/o parte de planta que incluye una molécula de ADN recombinante de la invención. Las plantas, células, partes, plantes de progenie y semillas transgénicas producidas a partir de dichas plantas pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para la molécula de ADN recombinante de la invención. Las partes de plantas del presente documento pueden incluir, entre otras, hojas, tallos, raíces, semillas, endosperma, óvulo y polen. Las partes de una planta de la invención pueden ser viables, no viables, regenerables o no regenerables. La invención también incluye y proporciona células de plantas transformadas que comprenden una molécula de ADN de la invención. Las células de plantas transformadas o transgénicas de la invención incluyen células de plantas regenerables y no regenerables.
También se describe un procedimiento para inducir esterilidad masculina en una planta transgénica que comprende (a) cultivar una planta transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga que confiere tolerancia a herbicidas unida operativamente a un elemento diana de mts-ARNip que consiste en la SEQ ID NO: 1 o 2 o su complemento y (b) aplicar una cantidad eficaz del herbicida a la planta transgénica para inducir la esterilidad masculina. Una cantidad eficaz de un herbicida es una cantidad suficiente para hacer que una planta transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante de la invención sea androestéril. En una realización, una cantidad eficaz de glifosato es de entre aproximadamente 0,125 libras de ácido equivalente por acre y aproximadamente 8 libras de ácido equivalente por acre. La aplicación de herbicida se puede aplicar antes o durante el desarrollo del tejido reproductor masculino, por ejemplo, en una etapa seleccionada del grupo que consiste en la etapa V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 y V14 del desarrollo de planta de maíz y puede evitar al menos el desarrollo de polen, la diseminación de polen y otra extrusión.
En una realización, la prevención del desarrollo de polen, la diseminación de polen y otra extrusión puede resultar de la esterilidad masculina y, por ende, la ausencia de desarrollo de polen, la diseminación de polen y otra extrusión pueden ser una indicación de esterilidad masculina. Sin embargo, en algunos casos, las plantas androestériles pueden seguir desarrollando pequeñas cantidades de polen. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la presencia de una pequeña cantidad de polen no indica necesariamente plantas fértiles masculinas o una carencia de esterilidad masculina.
El desarrollo de la planta suele determinarse a escala de etapas en función del desarrollo de la planta. Para el maíz, una escala de desarrollo de planta común utilizada en la técnica es conocida como etapas V. Las etapas V se definen de acuerdo con la hoja superior donde el collar de hojas es visible. VE corresponde a la aparición, V1 corresponde a la primera hoja, V2 corresponde a la segunda hoja, V3 corresponde a la tercera hoja, V(n) corresponde a la enésima hoja. VT se produce cuando la última rama de la borla es visible pero antes de la aparición de los estigmas. Cuando se organiza un campo de maíz, cada etapa V específica se define solamente cuando el 50 por ciento o más de las plantas en el campo se encuentran en esa etapa o más allá de esta. Otras escalas de desarrollo son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden utilizar con los procedimientos de la invención.
Otra herramienta común para predecir y estimar etapas de crecimiento y desarrollo de maíz son las unidades de grado de crecimiento (GDU). Un factor en el crecimiento y desarrollo de maíz es el calor. El calor se mide típicamente en un único momento y se expresa como temperatura, pero también se puede medir a través de un período y se puede expresar como unidades de calor. Estas unidades de calor se denominan comúnmente GDU. Las GDU pueden ser definidas como la diferencia entre la temperatura diaria promedio y una temperatura base seleccionada sujeta a determinadas restricciones. Las GDU se calculan utilizando la siguiente ecuación: Unidad de grado de crecimiento = {(H L ) / 2 } — B donde H es la alta diaria (pero superior a 86 °F), L es la baja diaria (pero no inferior a 50 °F) y B es la base de 50 °F. Debido a que el crecimiento de maíz es menor cuando las temperaturas son superiores a 86 °F o inferiores a 50 °F, los límites se establecen en las temperaturas alta diaria y baja diaria utilizadas en la fórmula. El corte inferior para la temperatura diaria también evita el cálculo de valores negativos. Por lo tanto, si la temperatura alta diaria supera 86 °F, la temperatura baja diaria utilizada en la fórmula de GDU se establece a 86 °F. Por el contrario, si la temperatura baja diaria cae por debajo de 50 °F, la temperatura baja diaria utilizada en la fórmula de GDU se establece a 50 °F. Si la temperatura alta diaria no supera 50 °F, no se registra ninguna GDU para ese día. La GDU máxima que una planta de maíz puede acumular en un día es 36, la mínima es cero. La clasificación de madurez de una planta de maíz se identifica por la suma de los valores de GDU diarios durante un lapso de tiempo especificado. El período que la mayoría de los productores de semilla de maíz utiliza es desde el momento de plantación hasta la madurez fisiológica o el momento en el cual el llenado de grano está prácticamente completo. En la mayoría de los estados de Estados Unidos, por ejemplo, las GDU acumuladas se mantienen para la mayoría de las zonas geográficas y se encuentran disponibles en USDa Crop Reporting Service o State Extension Services. Adicionalmente, en la patente estadounidense N.° 6.967.656 también se describe un instrumento para obtener información de GDU en una ubicación particular.
En la patente estadounidense N.° 8.618.358, se describe otro procedimiento para predecir el desarrollo de borla para la determinación del tiempo de aplicación de herbicida que induce la esterilidad masculina.
Los herbicidas para su uso con la invención incluyen cualquier herbicida, incluso los activos contra acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa), inhibidores de acetolactato sintasa (ALS), inhibidores de fotosistema II (PSII), inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa (PPO), inhibidores de 4-hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD), inhibidores de 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS), inhibidores de glutamina sintetasa (GS) y auxinas sintéticas. Los herbicidas son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Modern Crop Protection Compounds, volumen 1 (segunda edición), editado por Wolfgang Kramer, Ulrich Schirmer, Peter Jeschke, Matthias Witschel, ISBN: 9783527329656, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Alemania (2012). En una realización, el herbicida es glifosato.
Se puede producir una semilla híbrida a través del uso de un procedimiento que comprende (a) aplicar herbicida a una planta transgénica que incluye una molécula de ADN recombinante que incluye una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga que confiere tolerancia al herbicida de acuerdo con la invención, en el que la aplicación del herbicida se lleva a cabo durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta transgénica, induciendo así la esterilidad masculina en la planta transgénica; (b) fertilizar la planta transgénica con polen de una segunda planta; y (c) cosechar semilla híbrida de la planta transgénica. En una realización, la planta transgénica es maíz. En una realización, el herbicida es glifosato y la proteína codificada por la molécula de polinucleótido transcribible heteróloga es una EPSPS tolerante a glifosato. En una realización, el glifosato se aplica durante el desarrollo en una cantidad eficaz de aproximadamente 0,125 libras de ácido equivalente por acre y aproximadamente 8 libras de ácido equivalente por acre. En otra realización, la etapa de fertilización se puede lograr permitiendo una fertilización natural, por ejemplo, a través de polinización por el viento, o puede incluir polinización mecánica o manual.
Se puede cosechar una semilla híbrida de una planta transgénica androestéril que se ha fertilizado con polen a partir de una segunda planta, en la que la planta transgénica androestéril comprende una molécula de ADN recombinante que incluye un polinucleótido transcribible heterólogo que confiere tolerancia al herbicida de acuerdo con la invención, y en la que la planta transgénica se ha inducido para ser androestéril mediante la aplicación de una cantidad eficaz de herbicida durante el desarrollo del tejido reproductor masculino. En un ejemplo, el herbicida es glifosato y se aplica durante el desarrollo a una cantidad eficaz de entre aproximadamente 0,125 libras de ácido equivalente por acre y aproximadamente 8 libras de ácido equivalente por acre y evita al menos el desarrollo de polen, la diseminación de polen u otra extrusión.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos describen mejoras a la producción de semillas híbridas sobre la proporcionada en la técnica. Dichas mejoras incluyen dianas de mts-ARNip novedosas y elementos diana de mts-ARNip para utilizar en las moléculas de ADN recombinante y las plantas transgénicas para proporcionar detención del desarrollo del polen en etapa temprana, lo que produce la ausencia de granos de polen viables en una amplia gama de germoplasma y los procedimientos de uso relacionados.
Ejemplo 1: identificación de dianas de mts-ARNip (Solo por referencia)
Se aisló ARN pequeño de cuatro etapas de crecimiento separadas de borla de maíz y tres etapas de crecimiento separadas de mazorca de maíz. Véase la tabla 1. Se aisló el ARN pequeño enriquecido por la borla en etapas del desarrollo de la borla muy tempranas (V7, V8/V9, V10/V11 y V12) (véase la figura 1). Esto produjo ARN pequeño de tejidos masculinos más jóvenes de los utilizados anteriormente en la técnica para obtener secuencias de ARN pequeñas enriquecidas por la borla.
Se prepararon genotecas de ARN pequeño utilizando el ARN pequeño aislado y se realizó secuenciamiento de ARN pequeño de alto rendimiento a las genotecas. Se utilizó análisis bioinformático para comparar las secuencias en estas genotecas de borlas y mazorcas con las secuencias en las genotecas de ARN pequeño preparadas a partir de otros tejidos de maíz, incluidas hojas recolectadas en diversas etapas de crecimiento, plántula completa, raíz recolectada en diversas etapas del crecimiento, endosperma y semilla. Este análisis bioinformático diferencial identificó miles de secuencias de ARN pequeño enriquecidas con borlas con expresión normalizada en el intervalo de 10 a 665 transcripciones por cuarto de millón (tpq). Las secuencias de ARN pequeño enriquecidas con borla identificadas son, probablemente, ARNip debido a su longitud (18-26 nucleótidos) y su origen esperado a partir de un precursor de ARNcd. Debido a la especificidad del tejido masculino, estos ARN pequeños enriquecidos con borla se denominan en el presente documento ARNip específico de tejido masculino (mts-ARNip).
Tabla 1. Descripción de genotecas de ARN pequeño de borla y mazorca
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Se utilizó un procedimiento de PCR en tiempo real para la identificación y la confirmación de que las secuencias de mts-ARNip se expresaron específicamente en la borla. El ARN total, incluido el ARN pequeño enriquecido, se extrajo de los tejidos indicados en la tabla 1 y se utilizó para sintetizar el ADNc con cebadores de transcripción inversa que consistían en 8 nt complementarios a las secuencias de mts-ARNip en el extremo 3’ y una secuencia universal de 35 nt en el extremo 5’ . Después de la síntesis de ADNc, se realizó PCR en tiempo real, en la que la secuencia (14 a 18 nt) de uno de los cebadores directos fue idéntica al extremo 5’ de una secuencia de mts-ARNip y el cebador inverso fue un cebador universal. Como control interno, se amplificó ARN 18S y se utilizó para normalizar los niveles de mts-ARNip. Los datos de la PCR en tiempo real se utilizaron para limitar la cantidad de secuencias de mts-ARNip que se enriquecieron en la borla.
Se realizó un ensayo de micromatriz de perfil de ARNip utilizando chips pParaflo® Microfluidics proporcionados por LC Sciences LLC (Houston, Texas, EUA) con 1.200 secuencias seleccionadas de las miles de secuencias de mts-ARNip identificadas a partir del análisis bioinformático diferencial. Los chips de micromatriz contenían sondas triplicadas de la secuencia complementaria para cada una de las 1.200 secuencias de mts-ARNip. Se purificó el ARN total a partir de 26 grupos de tejido de maíz (grupos de tejido duplicados o triplicados) de las plantas endogámicas LH244 (número de depósito de ATCC PTA-1173) o 01DKD2 (I294213) (número de depósito de ATCC PTA-7859). Véase la tabla 2. Se hibridó cada una de las 26 muestras de ARN con los chips de micromatriz que contenían sondas para las 1.200 mts-ARNip. Se recogieron imágenes de hibridación utilizando un escáner láser GenePix® 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se digitalizaron utilizando el software de análisis de imágenes Array-Pro® Analyzer (Media Cybernetics, Rockville, MD). Se derivaron valores de señales relativos mediante sustracción de fondo y normalización. Se determinaron las señales expresadas diferencialmente mediante prueba t con p< 0,05. A partir del análisis de micromatriz, aproximadamente 500 mts-ARNip de las 1.200 se identificaron como altamente específicos de borla.
Tabla 2. Descripción de las muestras de tejido utilizadas en el ensayo de micromatriz.
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Después se realizó el análisis bioinformático utilizando herramientas de alineamiento de secuencia como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) o SHort Read Mapping Package (SHRiMP) (Rumble, 2009) para comparar las 500 secuencias de mts-ARNip identificadas como altamente específicas de borla contra una recolección de unigenes de secuencias de ADNc de maíz. Este análisis BLAST reveló secuencias de ADNc de maíz con las cuales muchas secuencias de mts-ARNip se alinearon, lo que produjo regiones de secuencias de ADN identificables que tienen alineamientos agrupados, superpuestos de múltiples secuencias de mts-ARNip con coincidencias perfectas o casi perfectas. Se identificaron seis secuencias de ADNc a partir de este análisis como que contenían una o más de dichas regiones ricas en secuencias diana de mts-ARNip. Estas seis secuencias de ADNc se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. Como un ejemplo, la figura 2 muestra una representación gráfica del alineamiento de múltiples secuencias de mts-ARNip en el ADNc proporcionado como SEQ ID NO: 17. Las múltiples líneas cortas representan la posición relativa de las secuencias diana de mts-ARNip (y, por ende, la ubicación del sitio de unión para el mts-ARNip en la molécula de ARNm transcrita) que se alinean con el ADNc. El eje Y representa los niveles de expresión normalizados del mts-ARNip en los tejidos masculinos según lo detectado en el análisis de micromatriz. La casilla representa la región de ADNc SEQ ID No : 17 correspondiente a las secuencias del elemento diana de mts-ARNip SeQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Se utilizaron secuencias de mts-ARNip seleccionadas que se alinean con una de las seis secuencias de ADNc para otros análisis de micromatriz para determinar la expresión diferencial en los tejidos de maíz. Los análisis de micromatriz para las secuencias de mts-ARNip de los valores de señal normalizados para la borla de V8-V9, borla de V10-V12 o las señales combinadas de los otros tejidos para el germoplasma de maíz LH244 y 01DKD2 se presentan en las tablas 3-10. Cada tabla muestra un subconjunto de secuencias de mts-ARNip identificadas como que se alinean con una de las seis secuencias de ADNc proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. Los resultados de los valores de señal se miden como valores de señal relativa y el error estándar (p<0,05) está representado por (STDR). Los resultados de la micromatriz ilustran que las secuencias de mts-ARNip representativas dan una señal alta en la borla (V8-V9 y V10-V12) y una señal baja en otros tejidos, lo que indica que la expresión endógena de estos mts-ARNip está altamente enriquecida en la borla. La secuencia de mts-ARNip corresponde a la cadena sentido o antisentido de la secuencia diana de mts-ARNip correspondiente en la secuencia de ADNc. La secuencia de mts-ARNip puede tener un emparejamiento erróneo de un solo nucleótido, de dos nucleótidos o de tres nucleótidos con la parte alineada de la secuencia de ADNc y la secuencia de mts-ARNip se puede alinear con la cadena sentido de SEQ o antisentido de la secuencia de ADNc. Las secuencias de mts-ARNip proporcionadas en el presente documento se encuentran en diferentes germoplasmas de maíz.
La tabla 3 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 23 — 31) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 17, que contiene las secuencias del elemento diana de mts-ARNip representadas por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Para los germoplasmas LH244 y 01DKD2, las señales para estas secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Los resultados de micromatriz que se muestran en la tabla 3 indican que la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 17 se puede utilizar como una fuente para diseñar elementos diana de mts-ARNip para las moléculas de ADN recombinante.
Tabla 3. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 17
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La tabla 4 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 32 — 38) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 18, que contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 3. Para el germoplasma LH244, las señales para estas secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que las señales para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Para el germoplasma 01DKD2, las señales para estas secuencias de mts-ARNip son mayores en la borla de V10-V12 que las señales para estas secuencias de mts-ARNip para la borla de V8-V9 o las muestras de otros tejidos.
Tabla 4. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 18
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La tabla 5 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 39 — 42) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 18, que contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 4. Para el germoplasma LH244, las señales para las secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Para el germoplasma 01DKD2, las señales para las secuencias de mts-ARNip son mayores en la borla de V10-V12 que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para la borla de V8-V9 o las muestras de otros tejidos. Los resultados de micromatriz que se muestran en la tabla 4 y la tabla 5 indican que la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 18 se puede utilizar como una fuente para diseñar elementos diana de mts-ARNip para las moléculas de ADN recombinante.
Tabla 5. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 18
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La tabla 6 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 43-46) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19, que contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 5. Para el germoplasma LH244, las señales para las secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Para el germoplasma 01DKD2, la señal para las secuencias de mts-ARNip (SEQ ID NO: 43-44) es mayor en la borla de V10-V12 que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para la borla de V8-V9 o las muestras de otros tejidos; y las señales para las secuencias de mts-ARNip (SEQ ID NO: 45-46) son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 en comparación con la muestra de otro tejido.
Tabla 6. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 19
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La tabla 7 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 47-52) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19, que contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 6. Para el germoplasma LH244, las señales para las secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Para el germoplasma 01DKD2, las señales para las secuencias de mts-ARNip son mayores en la borla de V10-V12 que la señal para estas secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 o las muestras de otros tejidos; las señales para las secuencias de mts-ARNip (SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48) son moderadamente mayores en la borla de V8-V9 en comparación con la señal para estas secuencias de mts-ARNip para la otra muestra de tejido; la señal para la secuencia de mts-ARNip (SEQ ID NO: 52) es significativamente mayor en la borla de V8-V9 en comparación con la señal para esta secuencia de mts-ARNip para la muestra de otro tejido; y las señales para las secuencias de mts-ARNip (s Eq ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 y SeQ ID NO: 51) no son significativamente diferentes de la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Los resultados de micromatriz que se muestran en la tabla 6 y la tabla 7 indican que la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19 se puede utilizar como una fuente para diseñar elementos diana de mts-ARNip para las moléculas de ADN recombinante.
Tabla 7. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 19
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La tabla 8 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 53-60) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 20, que contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 7. Para los germoplasmas LH244 y 01DKD2, las señales para estas secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Los resultados de micromatriz que se muestran en la tabla 8 indican que la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 20 se puede utilizar como una fuente para diseñar elementos diana de mts-ARNip para las moléculas de ADN recombinante.
Tabla 8. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 20
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La tabla 9 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 61-69) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 21, que contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 8. Para los germoplasmas LH244 y 01DKD2, las señales para las secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos. Los resultados de micromatriz que se muestran en la tabla 9 indican que la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 21 se puede utilizar como una fuente para diseñar elementos diana de mts-ARNip para las moléculas de ADN recombinante.
Tabla 9. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 21
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La tabla 10 muestra resultados de señales de micromatriz relativos para secuencias de mts-ARNip representativas (proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 70-87) que se alinean con la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 22, que contiene la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representada por SEQ ID NO: 9. Para el germoplasma LH244, las señales para las secuencias de mts-ARNip (SEQ ID NO: 70, 71, 73, 75-81, 83-87) en la borla de V8-V9 y la borla de V10-V12 son mayores que la señal para estas secuencias de mts-ARNip para las muestras de otros tejidos; y las señales para las secuencias de mts-ARNip (SEQ ID NO: 72, 74, 82) en otro tejido fue mayor que la señal para estas secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 o la borla de V10-V12. Para el germoplasma 01DKD2, las señales para las secuencias de mts-ARNip (SEQ ID NO: 70-87) son mayores en la borla de V10-V12 que la señal para estas secuencias de mts-ARNip en la borla de V8-V9 o las muestras de otros tejidos. Los resultados de micromatriz que se muestran en la tabla 10 indican que la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como s Eq ID NO: 22 se puede utilizar como una fuente para diseñar elementos diana de mts-ARNip para las moléculas de ADN recombinante.
Tabla 10. Resultados de micromatriz para ADNc de SEQ ID NO: 22
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Estos análisis confirmaron que las seis secuencias de ADNc (SEQ ID NO: 17 — 22) eran ricas en las secuencias diana de mts-ARNip y que el mts-ARNip correspondiente mostró especificidad de borla alta. Por lo tanto, estas secuencias de ADNc contienen secuencias útiles con los procedimientos de la biología molecular para crear moléculas de ADN recombinante que contienen elementos diana de mts-ARNip que pueden conferir silenciamiento de transgenes mediado por mts-ARNip.
Se realizó un análisis de la secuencia genómica correspondiente que contenía los elementos diana de mts-ARNip para treinta y dos germoplasmas de maíz diferentes (con una madurez relativa (RM) en el intervalo de 80 y 120 días), típicamente, utilizada como una planta femenina en un cruzamiento híbrido para confirmar la presencia y cualquier variación de secuencia de los elementos diana de mts-ARNip. Para los elementos diana de mts-ARNip proporcionados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, se diseñaron tres conjuntos de pares de cebadores de amplificación térmica para amplificar la secuencia correspondiente dentro de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como s Eq ID NO: 17. Estos cebadores se utilizaron para generar un amplicón de PCR en el ADN genómico extraído del tejido de cada germoplasma. Se produjeron amplicones a partir de todos los germoplasmas evaluados. La secuencia del amplicón en los treinta y dos germoplasmas fue o bien 100 % idéntica a la secuencia del elemento diana de mts-ARNip o contenía una cantidad mínima de polimorfismos de nucleótido único (hasta una identidad del 95 %). Estos datos indican que las plantas transgénicas generadas con una construcción de ADN recombinante que comprende un transgén codificante de una proteína recombinante unida operativamente a un elemento diana de mts-ARNip proporcionado como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tendrían regulación específica de tejido masculino de la expresión de la proteína recombinante en la mayoría de los germoplasmas de maíz. Si el transgén codifica una proteína recombinante que confiere tolerancia al glifosato, entonces las borlas en la mayoría de los germoplasmas de maíz tendrían esterilidad masculina inducida por glifosato.
Ejemplo 2: construcciones de ADN recombinante y vectores de transformación de plantas
Se crearon construcciones de ADN recombinante y vectores de transformación de plantas utilizando las secuencias de ADN correspondientes a las regiones de las seis secuencias de ADNc identificadas como ricas en las secuencias diana de mts-ARNip. Las construcciones de ADN recombinante y los vectores de transformación de plantas se diseñaron para ser útiles para producir plantas transgénicas en las cuales el silenciamiento específico de borla de un transgén unido operativamente a un elemento diana de mts-ARNip se produce mediante el silenciamiento mediado por mts-ARNip.
Se diseñaron nueve elementos diana de mts-ARNip utilizando los resultados de los análisis de las seis secuencias de ADNc. Se diseñó cada elemento diana de mts-ARNip de modo que tuviera una secuencia de ADN que comprenda muchas secuencias diana de mts-ARNip superpuestas a las cuales se pueden unir diferentes mts-ARNip. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 1 tiene el 95 % de identidad de secuencia con la posición de nucleótidos de 1429 a 1628 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como s Eq ID NO: 17. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 tiene un único cambio de nt (T69A) con respecto a la SEQ ID NO: 1. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 3 corresponde a la posición de nucleótidos de 239 a 433 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 18. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 4 corresponde a la posición de nucleótidos de 477 a 697 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como s Eq ID NO: 18. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 5 corresponde a la posición de nucleótidos de 239 a 433 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 6 corresponde a la posición de nucleótidos de 370 a 477 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 19. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 7 corresponde a la posición de nucleótidos de 1357 a 1562 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 20. La secuencia del elemento diana de mts-ARNip proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 8 corresponde a la posición de nucleótidos de 247 a 441 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 21. El complemento inverso de la secuencia del elemento diana de mts-ARNip representado por SEQ ID NO: 9 tiene un 99 % de identidad de secuencia con la posición de nucleótidos de 191 a 490 de la secuencia de ADNc proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 22 con tres emparejamientos erróneos de nt (C314A, A350G y G408A) de SEQ ID NO: 22 con respecto a la secuencia del complemento inverso de SEQ ID NO: 9. Otros elementos diana de mts-ARNip se pueden crear mediante la combinación de las secuencias de ADN de diferentes elementos diana de mts-ARNip o fragmentos de dos o más regiones de ADNc ricas en diana de mts-ARNip, por ejemplo, mediante la combinación de la totalidad o fragmentos de dos o más de los elementos diana de mts-ARNip proporcionados en el presente documento como SEQ ID NO: 1­ 9 y/o una o más de las secuencias de mts-ARNip proporcionadas en el presente documento como SEQ ID NO: 23 -92. Se combinaron fragmentos diferentes de estos elementos diana de mts-ARNip que oscilan en longitud entre 21 y 170 nucleótidos y se produjeron elementos diana de mts-ARNip nuevos utilizando los procedimientos de síntesis de ADN conocidos en la técnica y se proporcionan como SEQ ID NO: 10-16.
Los elementos diana de mts-ARNip se subclonaron en construcciones de ADN recombinantes con el elemento diana de mts-ARNip unido operativamente al extremo 3’ del marco de lectura abierto del gen cp4-epsps (SEQ ID NO: 93), codificante de la proteína CP4-EPSPS para la tolerancia al glifosato y 5’ para la región no traducida 3’ unida operativamente (3’-UTR). Las construcciones de ADN recombinantes también contenían combinaciones unidas operativamente de una de tres combinaciones diferentes de promotor/intrón/potenciador y una secuencia de péptido de tránsito de cloroplasto. Las configuraciones de los casetes de expresión contenidos en los vectores de transformación para evaluar la eficacia de la diana de mts-ARNip.
Ejemplo 3: transformación de plantas y pruebas de eficacia
Se utilizaron vectores de transformación que contenían las construcciones de ADN recombinante con un procedimiento de transformación basado en Agrobacterium y embriones inmaduros de maíz y los procedimientos conocidos en la técnica. Se recogieron muestras de hojas de plantas R0 y se les realizó un análisis molecular para seleccionar las plantas transgénicas que contenían una copia única (una inserción) o una copia doble (dos inserciones independientes) de la construcción de ADN recombinante y sin presencia de estructura de vector. Los eventos de copia única no se pulverizaron con glifosato y se autofecundaron y avanzaron para la recolección de la semilla R1, mientras que los eventos de copia doble se utilizaron para la pulverización con glifosato de R0 para evaluar la tolerancia vegetativa y la esterilidad masculina inducida. Las plantas transgénicas que no se pulverizaron con glifosato tenían antesis normal, diseminación del polen normal y desarrollo del polen normal según lo determinado por tinción de Alexandar y observación microscópica.
Los eventos R0 de copia doble se utilizaron en las evaluaciones para calcular un evento homocigoto de copia única. Se pulverizaron las plantas con glifosato en dos etapas de crecimiento diferentes para determinar si la presencia del elemento diana de mts-ARNip en la construcción de ADN recombinante proporciona tolerancia al glifosato vegetativa y esterilidad de la borla inducida por glifosato. Se pulverizaron las plantas en un invernadero con 1X glifosato (0,75 lb ae/acre) aplicado en la etapa V5 seguido por 1X glifosato (0,75 lb ae/acre) aplicado en la etapa V8. Siete días después de la aplicación de glifosato en la etapa V5, se puntuaron las plantas para detectar lesiones vegetativas con puntajes de lesión de ^10 % considerados como muestra de tolerancia al glifosato vegetativa (% de tolerancia vegetativa). La esterilidad masculina se midió de dos formas. Las plantas que mostraron tolerancia al glifosato vegetativa se puntuaron después de la aplicación del glifosato de etapa V8 para la esterilidad masculina inducida por glifosato completa medida como la ausencia de extrusión de anteras hasta la etapa S90 12 (% de esterilidad masculina completa). Se recogieron las anteras y se disecaron para observar microscópicamente el desarrollo del polen. Se evaluaron las anteras para cada evento para los granos de polen no viables producidos según lo detectado por tinción de Alexandar bajo observación microscópica y se puntuaron como no productoras de ningún polen viable (% sin polen). En las plantas no pulverizadas con glifosato, el desarrollo de la borla, la extrusión de anteras y el desarrollo de polen fueron normales.
Se evaluaron los elementos diana de mts-ARNip en múltiples configuraciones de vectores de transformación. Se utilizó cada vector de transformación para producir múltiples plantas de R0 con cada planta de R0 que representa un evento transgénico exclusivo hecho utilizando el mismo vector de transformación. Los datos para tres configuraciones de vectores de transformación diferentes se proporcionan como las tablas 11 y 12.
Se evaluaron doce elementos diana de mts-ARNip en una primera configuración de vector (A) con los resultados que se muestran en la tabla 11. Sorprendentemente, el porcentaje de plantas que muestran tolerancia al glifosato vegetativa osciló entre 80-100 %, pero el porcentaje que muestra esterilidad masculina inducida por el glifosato completa (la esterilidad masculina inducida incluyó el polen no viable y la ausencia de producción de polen) osciló entre 0-100 %. Véase la tabla 11. Por ejemplo, las plantas producidas utilizando un vector de transformación que contenía el elemento diana de mts-ARNip codificado por SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 tenían altas cantidades que mostraban tolerancia al glifosato vegetativa (en el intervalo del 90-100 % de las plantas evaluadas), pero ninguno de los eventos transgénicos mostró esterilidad masculina inducida por el glifosato completa; las plantas producidas utilizando un vector de transformación que contenía el elemento diana de mts-ARNip codificado por SEQ iD NO: 5 o SEQ ID NO: 9 tenían altas cantidades que mostraban tolerancia al glifosato vegetativa (en el intervalo del 90-100 % de las plantas evaluadas) y cantidades moderadas que mostraban esterilidad masculina inducida por el glifosato (en el intervalo del 50-40 % de las plantas evaluadas); y las plantas producidas utilizando un vector de transformación que contenía el elemento diana de mts-ARNip codificado por SEQ Id NO: 2, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 tenían altas cantidades que mostraban tolerancia al glifosato vegetativa (en el intervalo del 88-100 % de las plantas evaluadas) y cantidades altas que mostraban esterilidad masculina inducida por el glifosato (82-100% de las plantas evaluadas). Se evaluó el desarrollo del polen mediante tinción de Alexandar. Las plantas que contenían cuatro eventos hechos con el vector de transformación contenían el elemento diana de mts-ARNip proporcionado como SEQ ID NO: 2 y pulverizadas con glifosato para inducir la esterilidad masculina mostraron muy pocos granos de polen abortados o no se detectó ningún grano de polen. Las plantas que no recibieron aplicación de glifosato tuvieron polen normal. Véase la figura 4.
Tabla 11. Evaluación de plantas R0.
Figure imgf000020_0001
Se evaluaron otros cuatro elementos diana de mts-ARNip en una segunda y tercera configuración de vector (B y C, respectivamente) con los resultados que se muestran en la tabla 12. Las diferencias en el porcentaje de plantas que muestran tolerancia al glifosato vegetativa y el porcentaje que muestra esterilidad masculina inducida por el glifosato completa se observaron entre las dos configuraciones de vectores. La configuración del vector B proporcionó un porcentaje aumentado de plantas que muestran tolerancia al glifosato vegetativa para todos los elementos diana de mts-ARNip evaluados. Para el porcentaje que mostró esterilidad masculina inducida por el glifosato completa, dos de los elementos diana de mts-ARNip (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11) evaluados tuvieron mejores resultados en la configuración del vector C, uno de los elementos diana de mts-ARNip (SEQ ID NO: 12) tuvo mejores resultados en la configuración del vector B y uno de los elementos diana de mts-ARNip (SEQ ID NO: 1) proporcionó el 100 % de esterilidad masculina inducida por el glifosato completa en las configuraciones B y C.
Tabla 12. Evaluación de plantas R0
Figure imgf000020_0002
De las plantas que mostraban tolerancia al glifosato vegetativa, el porcentaje de plantas androestériles inducidas por glifosato sin polen viable osciló entre 0-100 %. Para las plantas producidas utilizando un vector de transformación que tenía más del 60 % de plantas evaluadas que mostraban tolerancia al glifosato vegetativa y esterilidad masculina inducida por glifosato completa, el porcentaje de plantas sin polen viable osciló entre 0-100 %. Dos elementos diana de mts-ARNip (SEQ ID NO: 1 en la configuración de vector B y SEQ ID NO: 2 en la configuración de vector A) tenían 100 % y 82 % sin polen viable, respectivamente. Estos dos elementos diana de mts-ARNip (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) difieren por un nucleótido y derivan de la misma secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 17).
Ejemplo 4. Inmunolocalización de proteína CP4-EPSPS en borla
Se utilizó inmunolocalización de proteína CP4-EPSPS en borla de plantas transgénicas para analizar la expresión de la proteína en el nivel de célula y tejido para confirmar la pérdida de expresión de proteína CP4-EPSPS en polen debido a la presencia de un elemento diana de mts-ARNip unido operativamente. Se cultivaron en un invernadero plantas transgénicas de generación R3 que contenían el transgén cp4-epsps unido operativamente a SEQ ID NO: 1 o como un control, el transgén cp4-epsps sin un elemento diana de mts-ARNip unido operativamente. Se pulverizaron las plantas con 1X glifosato (0,75 lb ae/acre) en la etapa V2 para confirmar la tolerancia vegetativa. Se cosecharon las borlas en 1 cm a 17 cm en las etapas de V8 a V12 cuando el tejido de las anteras se encuentra en las etapas de célula madre de microespora y microespora libre. Se retiraron las anteras de la espiguilla de la borla utilizando pinzas de disección y se fijaron inmediatamente en formaldehído al 3,7 % en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) con vacío suave. Después de lavar en PBS, se colocaron los tejidos en medio de incrustación y se congelaron inmediatamente. Se almacenaron los bloques de tejido congelados a -80 °C hasta seccionarse en un microtomo a -20 °C y se recogieron en portaobjetos cargados.
Se bloquearon las secciones de tejido con agente de bloqueo (suero de cabra normal al 10 %, albúmina de suero bovino al 5 %, Triton al 0,1 % X-100 en PBS) durante dos horas. Se incubaron las secciones con anticuerpo anti-CP4-EPSPS (1/500 en PBS). Después de lavar las secciones tres veces en PBS, se incubaron secciones de tejido con el anticuerpo secundario, IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Flour® 488 (Invitrogen, Eugene, Oregón). Se preparó un control negativo mediante la omisión de la incubación del anticuerpo CP4-EPSPS. Se incubaron los anticuerpos primario y secundario a temperatura ambiente durante dos a cuatro horas y después se incubaron adicionalmente durante la noche a 4 °C. Después del lavado, se obtuvieron imágenes de los tejidos con un microscopio confocal 510 META Zeiss Laser Scanning Microscope (LSM) utilizando un láser de 488 nm para la excitación y 500­ 550 nm (canal verde) para la configuración del filtro de emisión. Se aplicó el mismo parámetro de obtención de imágenes en las muestras que incluían controles. Se escanearon imágenes de campo brillantes y fluorescentes de cada sección y se fusionaron utilizando el software LSM después para mostrar la información estructural. Los datos para los controles negativos mostraron la ausencia de señal esperada. Los datos para las plantas transgénicas que contenían el transgén cp4-epsps unido operativamente a la SEQ ID NO: 1 mostraron una señal de fluorescencia baja, lo que indica baja expresión de proteína CP4-EPSPS en la pared de la antera, el tapete y las microesporas de polen en desarrollo de la antera. Los datos para las plantas transgénicas de control (las que contenían el transgén cp4-epsps sin un elemento diana de mts-ARNip unido operativamente) mostraron una señal de fluorescencia alta, lo que indica alta expresión de proteína CP4-EPSPS en la pared de la antera, el tapete y las microesporas de polen en desarrollo de la antera.
La pérdida de la expresión de proteína CP4-EPSPS en el polen en las plantas que contenían el transgén cp4-epsps unido operativamente al elemento diana de mts-ARNip proporcionado como SEQ ID NO: 1 se correlaciona con la esterilidad masculina inducida por glifosato completa observada en estas plantas. Estos datos confirmaron que la esterilidad masculina inducida por glifosato completa observada es el resultado de la pérdida de la expresión de proteína de CP4-EPSPS en el polen debido a la presencia del elemento diana de mts-ARNip unido operativamente proporcionado como SEQ ID NO: 1.
Ejemplo 5. Ensayos de campo
Para un uso óptimo en la producción de híbridos, es deseable tener extrusión de anteras muy baja en las condiciones de campo después de la aplicación del herbicida combinado con tolerancia a herbicidas vegetativos (según lo medido por la baja lesión del cultivo). Otros aspectos de la producción de maíz híbrido también pueden ser deseables, como altura y rendimiento de la planta. Para evaluar esto, se evaluaron plantas transgénicas que comprenden el transgén cp4-epsps unido operativamente a un elemento diana de mts-ARNip en generaciones avanzadas en condiciones de campo y se midieron múltiples parámetros.
Se realizaron ensayos de campo de plantas de generación R3 que contenían el transgén cp4-epsps unido operativamente al elemento diana de mts-ARNip proporcionado como SEQ ID NO: 1 en múltiples ubicaciones para evaluar la tolerancia al glifosato vegetativa y la sensibilidad al glifosato específica de la borla. Los ensayos de campo evaluaron las plantas de la generación R3 que contenían el mismo inserto transgénico en diferentes ubicaciones genómicas. Las plantas evaluadas contenían una copia única de uno de cuatro eventos transgénicos únicos creados utilizando el mismo vector de transformación de planta que contenía el transgén cp4-epsps unido operativamente al elemento diana de mts-ARNip proporcionado como SEQ ID NO: 1. Los ensayos se llevaron adelante utilizando un diseño de bloque completo aleatorio. Se puntuaron múltiples parámetros agronómicos y de eficacia de rasgos en la temporada de ensayos de campo y, al final de la temporada, se determinó el rendimiento. Se realizaron ensayos de campo de eficacia de rasgos mediante la aplicación de herbicida de glifosato a 0,75 Ib ae/acre en V7, seguido de 0,75 Ib ae/acre en V9 y calificando el porcentaje de lesión de cultivo en la etapa VT (CIPVT), el porcentaje de extrusión de anteras promedio en la etapa S90+8 (AES9E) y el rendimiento (medido como bushels por acre (bu/acre)) al final de la temporada. Los ensayos de campo incluyeron el evento transgénico tolerante a glifosato NK603 (número de depósito ATCC PTA-24780) como un control negativo para la esterilidad masculina inducida por glifosato y como un control positivo para la tolerancia vegetativa al glifosato. Las plantas que contenían el evento NK603 presentan tolerancia al glifosato vegetativa de nivel comercial y producen borlas completamente tolerantes al glifosato. Todos los datos se sometieron a análisis de varianza y promedio (LSD) separados a p< 0,05.
Tabla 13. Resultados de eficacia de rasgos para los ensayos de campo con plantas que contienen la SEQ ID NO: 1
Figure imgf000022_0002
La lesión del cultivo promedio en la etapa VT para las plantas de control que contenían el evento NK603 fue 1,25. La lesión del cultivo promedio para las plantas que contenían el evento 1, el evento 2, el evento 3 y el evento 4 fue 1,25, 3,75, 0 y 0, respectivamente. La diferencia estadística menos significativa (LSD) de la lesión del cultivo a 0,05 fue 10,25 para todos los eventos evaluados. Estos resultados indican que las plantas que contenían los cuatro eventos transgénicos que contenían el elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 1 tenían lesión vegetativa nula o muy baja con la aplicación de 0,75 lb ae/acre de glifosato en V7, seguido de V9, de forma similar a las plantas de control que contenían el evento NK603.
La extrusión de anteras promedio en la etapa S90+8 para las plantas de control que contenían el evento NK603 fue 95. La extrusión de anteras promedio en S90+8 para las plantas que contenían el evento 1, el evento 2, el evento 3 y el evento 4 fue 0, 3,25, 4 y 1,75, respectivamente. La extrusión de anteras promedio en S90+8 LSD a 0,05 fue 42,71 para todos los eventos evaluados. Estos resultados indican que las plantas que contenían los cuatro eventos transgénicos que contenían el elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 1 tenían extrusión de anteras nula o muy baja con la aplicación de 0,75 lb ae/acre de glifosato en V7, seguido de V9, contrariamente a las plantas de control que contenían el evento NK603, que resultaron completamente androfértiles después de la aplicación del glifosato.
Al final de la temporada, se cosechó el maíz de estos ensayos de campo y se determinó el rendimiento. El rendimiento promedio para las plantas de control que contenían el evento NK603 fue 96,74 bu/acre. El rendimiento promedio para las plantas que contenían el evento 1, el evento 2, el evento 3 y el evento 4 fue 102,17 bu/acre, 96,48 bu/acre, 97,59 bu/acre y 95,8 bu/acre, respectivamente. El LSD del rendimiento en 0,05 fue 26,25 bu/acre para todos los eventos evaluados. Véase la tabla 14. Estos resultados indican que las plantas que contenían los cuatro eventos transgénicos que contenían el elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 1 tenían paridad de rendimiento con NK603.
Tabla 14. Resultados de rendimiento para los ensayos de campo con plantas que contienen la SEQ ID NO: 1
Figure imgf000022_0001
Se realizaron ensayos de campo de R2 o plantas endogámicas de una generación posterior que contenían el transgén cp4-epsps unido operativamente a diversos elementos diana de mts-ARNip en múltiples ubicaciones para evaluar la tolerancia al glifosato vegetativa y la sensibilidad al glifosato específica de la borla. Los ensayos de campo evaluaron plantas endogámicas de R2 o una generación posterior que contenían una copia única del transgén cp4-epsps unido operativamente al elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, cada uno en la configuración A del vector de transformación. Se realizaron los ensayos utilizando un diseño de bloque de grupo con el factor de agolpamiento como el vector de transformación o un grupo de vectores de transformación si los números de evento para un vector de transformación específico eran bajos. Se puntuaron múltiples parámetros agronómicos y de eficacia de rasgos en la temporada de ensayos de campo y, al final de la temporada, se determinó el rendimiento. Se realizaron ensayos de campo de eficacia de rasgos mediante la aplicación de un glifosato a 1,5 lb ae/acre aplicado a maíz V2, seguido de glifosato a 0,75 lb ae/acre aplicado a maíz V8 (875 días de grado de crecimiento), seguido de glifosato a 0,75 lb ae/acre aplicado a maíz V10 (1025 días de grado de crecimiento). Las calificaciones de porcentaje de lesión de cultivo en la etapa de VT (CIPVT), porcentaje de extrusión de anteras promedio en la etapa S90+8 (AES90+8), altura de la planta promedio (en pulgadas) y rendimiento (medido como bushels por acre (bu/acre)) al final de la temporada. Los ensayos de campo incluyeron el evento transgénico tolerante a glifosato NK603 como un control negativo para la esterilidad masculina inducida por glifosato y como un control positivo para la tolerancia vegetativa al glifosato. Se colocó una mezcla tolerante a glifosato de polinizadores masculinos que consistía en tres bases de germoplasma híbridas cada tres parcelas y rodeando el ensayo completo para actuar como la fuente de polen para las entradas de prueba. Se aplicaron tratamientos de herbicida utilizando una mochila de CO2 o un pulverizador suspendido calibrado para administrar 15 galones por acre (GPA) utilizando boquillas Teejet® TTI inducidas por aire (TeeJet Technologies, Springfield, IL) con agua como el portador herbicida. Todos los datos se sometieron a análisis de varianza y promedio (LSD) separados a p< 0,05. Los resultados se proporcionan en la tabla 15.
No se observó diferencia significativa en el porcentaje de lesión de cultivo en VT (CIPVT) o en la altura de la planta promedio en comparación con el control NK603 para las plantas evaluadas que contenían el elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. Las plantas que contenían el elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 tampoco tenían disminución significativa en el rendimiento de semilla en comparación con el control NK603. Las plantas que contenían el elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7 tenían extrusión de anteras muy baja o ausente con valores de AES90+8 de 0-2,75 % y 0-1,5 %, respectivamente. Las plantas que contenían el elemento diana de mts-ARNip SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 tenían extrusión de anteras significativamente disminuida en comparación con las plantas de control, con valores de AES90+8 en el intervalo del 10% al 25%.
Tabla 15. mts-ARNip diferente en la misma configuración A del vector de transformación
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Ejemplo 6. Producción de semillas híbridas
Las plantas y las semillas transgénicas de la invención se pueden utilizar para fines de cultivo incluido en la producción de semillas híbridas. Las plantas de maíz transgénicas que comprenden una construcción de ADN recombinante que comprende un transgén codificante de una proteína de EPSpS tolerante a glifosato unida operativamente a un elemento diana de mts-ARNip se plantan en un área, por ejemplo, un campo abierto. Otras plantas de maíz originales pueden estar presentes o no en la misma área. Para el control de las malezas durante la producción de las semillas, se puede aplicar glifosato a las plantas de maíz transgénicas en las etapas vegetativas según lo indicado por las etiquetas de los productos agrícolas Roundup®.
La producción de semillas híbridas se puede realizar mediante la aplicación de glifosato a las plantas de maíz transgénicas (femeninas) comenzando justo antes o durante el desarrollo de la borla en las etapas de crecimiento vegetativo del maíz que van desde V7 a V13. La aplicación de glifosato producirá un fenotipo androestéril inducido mediante la tolerancia al glifosato selectiva de tejido en las plantas de maíz transgénicas. Las plantas de maíz transgénicas androestériles inducidas pueden polinizarse con otras plantas donantes de polen (masculinas), lo que produce una semilla de maíz híbrida viable que contiene la construcción de ADN recombinante para la tolerancia al glifosato selectiva de tejido. Las plantas donantes de polen pueden estar presentes en la misma área o no y pueden ser plantas de maíz transgénicas o no. La polinización se puede lograr a través de los medios conocidos en la técnica, incluido mediante colocación próxima de plantas o mediante polinización manual. La semilla híbrida se cosecha de las plantas de maíz transgénicas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento diana de mts-ARNip que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2 y complementos de estas, en la que el elemento diana de mts-ARNip está unido operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que puede transcribirse en una molécula de ARN.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que:
la molécula de polinucleótido heteróloga que puede transcribirse, codifica una proteína que confiere tolerancia a herbicidas en las plantas.
3. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 2, en la que dicho herbicida se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa), inhibidores de acetolactato sintasa (ALS), inhibidores de fotosistema II (PSII), inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa (PPO), inhibidores de 4-hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD), inhibidores de 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS), inhibidores de glutamina sintasa (GS) y auxinas sintéticas.
4. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de polinucleótido heteróloga que puede transcribirse, codifica una 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato.
5. Una planta transgénica, parte o semilla de la misma, que comprende en su genoma la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1.
6. La planta de la reivindicación 5, en la que dicha planta es una planta monocotiledónea.
7. La planta de la reivindicación 6, en la que dicha planta es una planta de maíz.
8. Un procedimiento para regular selectivamente la expresión de una proteína en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica, que comprende expresar en dicha planta transgénica la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha proteína comprende una 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato.
10. Un procedimiento para inducir esterilidad masculina en una planta transgénica que comprende:
(a) cultivar una planta transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento diana de mts-ARNip que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, y complementos de estas, en el que el elemento diana de mts-ARNip está unido operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que codifica una proteína que confiere tolerancia a al menos un primer herbicida; y
(b) aplicar una cantidad eficaz de dicho herbicida a dicha planta transgénica, en la que la aplicación de herbicida se lleva a cabo antes o de forma simultánea con el desarrollo del tejido reproductor masculino de dicha planta transgénica, induciendo así esterilidad masculina en la planta transgénica.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que:
(a) dicha molécula de polinucleótido heteróloga codifica una 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato; o
(b) dicho herbicida es glifosato; o
(c) dicha cantidad eficaz de herbicida se aplica en una etapa de desarrollo seleccionada del grupo que consiste en la etapa V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 y V14.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha cantidad eficaz de herbicida es de entre aproximadamente 0,125 libras de ácido equivalente por acre y aproximadamente 8 libras de ácido equivalente por acre de glifosato.
13. Una semilla híbrida producida mediante un procedimiento que comprende:
(a) aplicar una cantidad eficaz de herbicida a una planta transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento diana de mts-ARNip que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,2, y complementos de estas, en el que el elemento diana de mts-ARNip está unido operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que codifica una proteína que confiere tolerancia a al menos un primer herbicida, en el que dicha aplicación de herbicida se lleva a cabo antes o de forma simultánea con el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta transgénica, induciendo así esterilidad masculina en dicha planta transgénica;
(b) fertilizar dicha planta transgénica con polen de una segunda planta; y
(c) dejar que se forme una semilla híbrida a partir de dicha planta transgénica
en el que la semilla híbrida comprende dicha molécula de ADN recombinante.
14. La semilla híbrida de la reivindicación 13, en la que:
(a) dicha fertilización comprende dejar que se produzca una polinización por viento; o
(b) dicha molécula de polinucleótido transcribible heteróloga codifica una 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato; o
(c) dicho herbicida es glifosato, cuyo glifosato se aplica preferentemente de forma simultánea con el desarrollo en una cantidad eficaz de aproximadamente 0,125 libras de ácido equivalente por acre y aproximadamente 8 libras de ácido equivalente por acre.
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