UA126893C2 - Спосіб селективного регулювання експресії білка у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини - Google Patents
Спосіб селективного регулювання експресії білка у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини Download PDFInfo
- Publication number
- UA126893C2 UA126893C2 UAA201801481A UAA201801481A UA126893C2 UA 126893 C2 UA126893 C2 UA 126893C2 UA A201801481 A UAA201801481 A UA A201801481A UA A201801481 A UAA201801481 A UA A201801481A UA 126893 C2 UA126893 C2 UA 126893C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- mirna
- chto
- plant
- dna
- glyphosate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 title claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 147
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 118
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 67
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 37
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 254
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 211
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 74
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical group OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 74
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 64
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 50
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims description 40
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 38
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 24
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 claims description 8
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 8
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 4
- 230000010144 wind-pollination Effects 0.000 claims description 2
- 240000004520 Passiflora ligularis Species 0.000 claims 1
- 235000013744 Passiflora ligularis Nutrition 0.000 claims 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 claims 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 claims 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 claims 1
- 244000145841 kine Species 0.000 claims 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims 1
- 101150041594 soti gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 70
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 60
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 59
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 37
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 32
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 27
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 21
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 21
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 21
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 16
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 15
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 12
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 11
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 9
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 7
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 6
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 6
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 description 6
- 102000005135 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 4
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 4
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 4
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HWOWEGAQDKKHDR-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-6-(pyridin-3-yl)-2H-pyran-2-one Chemical compound O1C(=O)C=C(O)C=C1C1=CC=CN=C1 HWOWEGAQDKKHDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 3
- 102100028626 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Human genes 0.000 description 3
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108010081996 Photosystem I Protein Complex Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 244000275904 brauner Senf Species 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102200115907 rs121918081 Human genes 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- FHYAUNJNVMGZQN-NHCUHLMSSA-N (2r,3r)-5-iodo-3-(4-phenylpiperidin-1-yl)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-2-ol Chemical compound C1CN([C@@H]2CC3=C(I)C=CC=C3C[C@H]2O)CCC1C1=CC=CC=C1 FHYAUNJNVMGZQN-NHCUHLMSSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000005578 Mesotrione Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- -1 Rai and Bug) Chemical compound 0.000 description 1
- 238000012167 Small RNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101000951943 Stenotrophomonas maltophilia Dicamba O-demethylase, oxygenase component Proteins 0.000 description 1
- 101150015964 Strn gene Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical class C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N flumioxazin Chemical compound FC1=CC=2OCC(=O)N(CC#C)C=2C=C1N(C1=O)C(=O)C2=C1CCCC2 FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N mesotrione Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023409 microsporogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220282711 rs1452865935 Human genes 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
- A01H3/04—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria by treatment with chemicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
Description
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
0001) У даній заявці заявляється пріоритет попередньої заявки на патент США Мо 62/195 546, поданої 22 липня 2015 року, яка включена у даний документ за допомогою посилання у повному об'ємі.
ВКЛЮЧЕННЯ ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І0002| Перелік послідовностей міститься у файлі під назвою "МОМ5392УМО 57125, розміром 26,3 кілобайти (виміряно у операційній системі М5-УМіпдом/5), створений 28 червень 2016 року, поданий у даному документі та включений у даний документ за допомогою посилання.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
ІЇ0003| Даний винахід в цілому відноситься до галузей сільського господарства, селекції рослин та молекулярної біології. Більш конкретно, винахід відноситься до способів та композицій для селективного регулювання експресії білку у чоловічій репродуктивній тканині трансгенних рослин та їх застосуванням.
Опис попереднього рівня техніки
І0004| Гібридне насіння отримують шляхом гібридизації або перехресного запліднення близькоспоріднених рослин та воно може бути вирощено у гібридні рослини потомства, які мають бажану комбінацію ознак, якими не володіла жодна з батьківських рослин. Гібридні рослини можуть демонструвати кращі агрономічні характеристики, такі як покращення розмірів рослин, врожайності, складу поживних речовин, стійкості до хвороб, стійкості до гербіцидів, стійкості до стресу, адаптації до клімату та інші бажані властивості. Для ефективного отримання гібридного насіння необхідно, щоб власний пилок рослини не міг самозапилити рослину.
Основним обмеженням при отриманні гібридного насіння для багатьох сільськогосподарських культур є відсутність простих, надійних та економічних методів створення рослин, які є чоловічо-стерильними та нездатними до самозапилення.
ІЇ0005| При отриманні гібридного насіння виробленню пилку та скиданню пилку можна запобігти на жіночій батьківській рослині для того, щоб полегшити перехресне запилення жіночої рослини замість самозапилення. Таке запобігання може бути досягнуте шляхом,
Зо наприклад, ручного видалення структур, що містять пилок (наприклад, шляхом ручного або механічного видалення суцвіття-волоті у кукурудзі), використання генетичних засобів контролю запилення (наприклад, з використанням технології цитоплазматичної чоловічої стерильності або ядерної чоловічої стерильності), використання хімічного засобу або будь-якої їх комбінації.
Це може бути трудомістким та, отже, дорогим процесом. В кукурудзі, наприклад, видалення суцвіття-волоті зазвичай виконується у два етапи: машинне видалення суцвіття-волоті з наступним ручним видаленням суцвіття-волоті. Комерційне отримання гібридного насіння, використовуючи виключно хімічні гаметоциди, обмежено в основному їх загальною відсутністю селективності до гамет та їх впливом на інші частини рослини. Таким чином, способи підвищення ефективності отримання гібридного насіння дуже затребувані.
КОРОТКИЙ ОПИС СУТНОСТІ ВИНАХОДУ
0006) Винахід відноситься в цілому до вдосконалення способів селективного регулювання експресії білку у чоловічій репродуктивній тканині трансгенних рослин, молекул рекомбінантної
ДНК, які використовуються у таких способах, а також до трансгенних рослин, клітин та насіння, що містять такі молекули рекомбінантної ДНК. У винаході запропоновано покращення порівняно з існуючим рівнем техніки шляхом забезпечення цільових елементів чоловічих тканинноспецифічних міРНК, что-міРНК (что-міРНК), здатних забезпечувати покращену селективну регуляцію експресії білку, який кодується полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, та запропоновані молекули рекомбінантних ДНК та композиції, що містять такі цільові елементи что-міРНК, та способи використання таких цільових елементів что-міРНК для індукування чоловічої стерильності у трансгенних рослинах для отримання гібридного насіння.
І0007| В одному аспекті винаходу запропонована молекула рекомбінантної ДНК, що містить цільовий елемент что-міРНК, функціонально пов'язана з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції. В одному варіанті реалізації цільовий елемент что- міРНК включений у 3'-нсетрансльовану ділянку, функціонально пов'язану з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції. В іншому варіанті реалізації цільовий елемент что-міРНК розташований між гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, та функціонально пов'язаною поліаденілюючою послідовністю, яка є частиною 3'-нетрансльованої ділянки. В одному варіанті реалізації цільовий елемент что- міРНК містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 1-16, 23-92 та їх бо комплементарних ланцюгів. В іншому варіанті реалізації гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, забезпечує рослині стійкість до гербіцидів, наприклад, стійкість до вегетативного гербіциду. У додатковому варіанті реалізації гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, не забезпечує стійкості до гербіцидів репродуктивної чоловічої частини рослини. В іншому варіанті реалізації гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, є гліфосат-толерантною 5-енолпірувіл- шикимат З-фосфатсинтазою (ЕРБР5).
ІЇ0008| В іншому аспекті винаходу запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить цільовий елемент что-міРНК по винаходу, функціонально пов'язана з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції.
Ї0009| В додатковому аспекті винаходу запропонований спосіб отримання молекули рекомбінантної ДНК, який включає функціональне зв'язування, щонайменше, одного цільового елементу что-міРНК з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції. В одному варіанті реалізації цільовий елемент что-міРНК містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 1-16, 23-92 та їх комплементарних ланцюгів.
І0010| В іншому аспекті даний винахід відноситься до трансгенної рослини, яка містить цільовий елемент что-міРНК по винаходу. В одному варіанті реалізації трансгенна рослина містить цільовий елемент что-міРНК, функціонально пов'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції. В додатковому варіанті реалізації цільовий елемент что-міРНК містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ
МО: 1-16, 23-92 та їх комплементарних ланцюгів. В ще одному варіанті реалізації трансгенну рослину отримують шляхом трансформації рослини молекулою рекомбінантної ДНК або конструкцією ДНК, що містить щонайменше один цільовий елемент что-міР НК, функціонально пов'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції. В додатковому аспекті винаходу запропоновані насінина, клітина або частина такої трансгенної рослини. В одному варіанті реалізації рослина являє собою однодольну рослину. В іншому варіанті реалізації рослина являє собою рослину кукурудзи (7єа тауб).
ЇОО11| В додатковому аспекті винаходу також запропонований спосіб селективного регулювання експресії білку у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини шляхом експресії у трансгенній рослині молекули рекомбінантної ДНК, яка містить цільовий елемент
Зо что-міРНК, функціонально пов'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції.
В одному варіанті реалізації цільовий елемент что-міРНК містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 1-16, 23-92 та їх комплементарних ланцюгів. В іншому варіанті реалізації гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, забезпечує рослині стійкість до гербіцидів, наприклад, вегетативну стійкість до гербіциду. У додатковому варіанті реалізації гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, не забезпечує стійкості до гербіцидів репродуктивної чоловічої частини рослини. В іншому варіанті реалізації гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, являє собою гліфосат-толерантну ЕРБР5.
Ї0012| В ще одному аспекті винахід відноситься до способу індукування чоловічої стерильності у трансгенній рослині, включаючи етап застосування гербіциду до трансгенної рослини, яка має у своєму геномі молекулу рекомбінантної ДНК, що містить цільовий елемент что-міРНК, функціонально пов'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, яка забезпечує трансгенній рослині стійкість щонайменше до першого гербіциду, при цьому гербіцид застосовують до або одночасно з розвитком чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини, тим самим викликаючи чоловічу стерильність у трансгенній рослині. В одному варіанті реалізації гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, забезпечує вегетативну стійкість до гербіцидів, але не забезпечує репродуктивної стійкості до гербіцидів у чоловічої рослини. В іншому варіанті реалізації трансгенна рослина являє собою рослину кукурудзи. У додатковому варіанті реалізації застосування гербіциду запобігає, щонайменше, розвитку пилку, скиданню пилку або екструзії пильників в обробленій трансгенній рослині. В іншому варіанті реалізації етап розвитку чоловічої репродуктивної тканини, під час якого застосовується гербіцид, являє собою етап, вибраний з групи, яка складається з М4, М5, Мб, М7, М8, М9, М10, М11, М12, М13 та М14 етапів розвитку кукурудзи. В іншому варіанті реалізації гербіцид вибраний з групи, яка складається з інгібіторів ацетил-коферменту А карбоксилази (АСС), інгібіторів ацетолактат-синтази (АЇ 5), інгібіторів фотосистеми І! (РЗІЇ), інгібіторів протопорфіриногеноксидази (РРО), інгібіторів 4- гідроксифенілдиоксигенази (НРРО), інгібіторів 5-енолпірувіл-шикимат-3-фосфатсинтази (ЕРБР5Б), інгібіторів глутамінсинтетази (55) та синтетичних ауксинів. В іншому варіанті бо реалізації гербіцидом є гліфосат, а гетерологічний полінуклеотид, придатний для транскрипції,
кодує гліфосат-толерантну ЕРБР5.
Ї0013| В одному аспекті винахід також відноситься до способу отримання гібридного насіння, який включає застосування ефективної кількості гербіциду до трансгенної рослини, що містить у своєму геномі молекулу рекомбінантної ДНК, що містить цільовий елемент что-міР НК, функціонально пов'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, при цьому гербіцид застосовують до або одночасно з розвитком чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини, тим самим індукуючи чоловічу стерильність у трансгенній рослині; запліднення трансгенної рослини пилком з другої рослини; та можливість формування гібридного насіння з трансгенної рослини. В одному варіанті реалізації трансгенна рослина являє собою кукурудзу. В іншому варіанті реалізації гербіцидом є гліфосат, а гетерологічна полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, являє собою гліфосат- толерантну ЕРБР5. В іншому варіанті реалізації гліфосат застосовують одночасно з розвитком у ефективній кількості близько 0,125 фунти (0,057 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га) до близько 8 фунтів (3,6 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га). В іншому аспекті винаходу запропоноване гібридне насіння, отримане таким способом. В одному варіанті реалізації гібридна насінина містить молекулу рекомбінантної ДНК. 0014) Інші конкретні варіанти реалізації винаходу розкриті у наступному детальному описі.
У всьому даному описі винаходу та формулі винаходу, якщо контекст не потребує іншого, слово "містити" та його варіації, такі як "містить" та "що містить", будуть матися на увазі як включення заявленого цілого, елементу або етапу або групи цілих, елементів або етапів, але не виключення будь-якого іншого цілого, елементу або етапу або групи цілих, елементів або етапів.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
І0015) Фігура 1. Ілюстрація етапів розвитку китиці М7 при Т2, М8Л/9 при Т4, М10/Л/11 при Т5,
М12 при Т6 та МТ при Т7, яка демонструє розмір та морфологію китиці 3 нижньою панеллю фотографій поперечних перерізів пильників, які демонструють етап розвитку пилку. Описані етапи (М1ОЛ/11 та М12), які раніше використовувались у даній області для виділення малих молекул РНК для ідентифікації молекул что-міРНК, позначені прямокутником із суцільною лінією; етапи (М7, М8//9, М10/Л/11 та М12), описані у даному документі для виділення малих
Зо молекул РНК, позначені прямокутником з пунктирною лінією.
ЇО016| Фігура 2. Графічне зображення вирівнювання послідовностей что-міРНК по послідовності КДНК, представленої як 5ЕБО ІЮ МО: 17. Послідовність КДНК показана від нуклеотиду 1 до 1826, а короткі лінії являють собою вирівнювання комплементарного ланцюга індивідуальних послідовностей что-міРНК або фрагментів сусідніх послідовностей что-міРНК або послідовностей что-міРНК, що перекриваються, (відносно більш довгих ліній) до кДНК.
Послідовності что-міР НК, які є тим самим ланцюгом, що й кКДНК, не показані. Зліва показаний нормалізований відносний рівень експресії что-міРНК. Ділянку у прямокутнику являє собою ділянку послідовності КДНК, багату мішенями что-міР НК.
І0017| Фігура 3. Схема, яка ілюструє дволанцюгову что-міРНК, одноланцюгову что-міР НК, цільову послідовність что-міРНК в межах мРНК та ділянку мРНК з більшою кількістю цільових послідовностей что-міРНК, які використовуються у якості цільового елементу что-мігР НК.
ІЇО018| Фігура 4. Фотографія китиці та пилку кукурудзи КО, пофарбованої барвником
АІехапааг з подвійних копій трансгенних рослин, що містять молекулу рекомбінантної ДНК, що містить трансген, який кодує гліфосат-толерантний ЕР5Р5-білок, функціонально пов'язаний з цільовим елементом что-міРНК (ЗЕО ІЮ МО: 2). Трансформанти з 1 по 4 були обприскані 0,75 фунтів к.е./акр (0,84 кг к.е./га) гербіциду гліфосату на М5 з наступною стадією М8 та продемонстровані китиці з повною чоловічою стерильністю, як визначено за допомогою відсутності цвітіння та нежиттєздатних зерен пилку або відсутності пилкових зерен, виявлених у пильниках. Контрольні рослини не отримували застосування гліфосату та демонстрували нормальне цвітіння та скидання пилку, а мікроскопічне спостереження виявляло нормальні зерна пилку.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ї0019| 5ЕО 10 МО: 1 - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка має 9595 ідентичності послідовності з нуклеотидними позиціями від 1429 по 1628 послідовності кКДНК, представленої у даному документі як ХЕО ІЮ МО: 17. (0020 5ЕО 10 МО: 2 - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка має 9595 ідентичності послідовності з нуклеотидними позиціями від 1429 по 1628 послідовності кКДНК, представленої у даному документі як ЗЕО ІЮО МО: 17 та яка має одну нуклеотидну заміну (Т69А) відносно 5ЕО ІЮ МО: 1. 60 І(0021| 5ЕО 10 МО: З - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка відповідає нуклеотидним позиціям від 239 по 433 послідовності КДНК, представленої у даному документі як
ЗЕОІЮ МО: 18.
І0022| 5ЕО 10 МО: 4 - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка відповідає нуклеотидним позиціям від 477 по 697 послідовності КДНК, представленої у даному документі як
ЗЕОІЮ МО: 18.
І0023| 5ЕО 10 МО: 5 - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка відповідає нуклеотидним позиціям від 239 по 433 послідовності КДНК, представленої у даному документі як
ЗЕО ІЮ МО: 19.
І0024| 5ЕО 10 МО: 6 - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка відповідає нуклеотидним позиціям від 370 по 477 послідовності КДНК, представленої у даному документі як
ЗЕО ІЮ МО: 19.
І0025| 5ЕО 10 МО: 7 - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка відповідає нуклеотидним позиціям від 1357 по 1562 послідовності кДНК, представленої у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 20. 0026 5ЕО 10 МО: 8 - послідовність цільового елементу что-міРНК, яка відповідає нуклеотидним позиціям від 247 по 441 послідовності КДНК, представленої у даному документі як
ЗЕО ІЮ МО: 21.
І0027| ЗЕО ІЮ МО: 9 - Обернено комплементарний ланцюг послідовності цільового елементу что-міР НК, що має 99 95 ідентичності послідовності з нуклеотидними позиціями від 191 по 490 послідовності КДНК, представленої у даному документі як зЕО ІЮ МО: 22 з трьома неспареними нуклеотидами (С314А, АЗ50О та 54085А). 0028) 5ЕО ІЮ МО: 10-16 - Рекомбінантні послідовності цільових елементів что-міР НК.
І0029| 5ЕО І МО: 17 - послідовність КДНК, що містить, щонайменше, одну ділянку, насичену послідовностями мішеней что-міРНК. Містить послідовності цільових елементів что-мігРНК, представлені 5ЕО ІО МО: 1 та 5ЕО ІО МО: 2 та вирівнюється з послідовностями что-міРНК 5БЕО
ІО МО: 23-31.
Ї0ОЗОЇ 5ЕО І МО: 18 - послідовність КДНК, що містить, щонайменше, одну ділянку, насичену послідовностями мішеней что-міРНК. Містить послідовності цільових елементів что-мігРНК, представлені 5ЕО ІЮО МО: З та 5ЕО ІО МО: 4 та вирівнюється з послідовностями что-міРНК 5БЕО
Зо ІО МО: 32-42.
Ї00311| 5ЕО І МО: 19 - послідовність КДНК, що містить, щонайменше, одну ділянку, насичену послідовностями мішеней что-міРНК. Містить послідовності цільових елементів что-мігРНК, представлені 5ЕО ІЮО МО: 5 та 5ЕО ІО МО: 6 та вирівнюється з послідовностями что-міРНК 5БЕО
ІО МО: 43-52. 00321 ЗЕО І МО: 20 - послідовність КДНК, що містить, щонайменше, одну ділянку, насичену послідовностями мішеней что-міРНК. Містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого ЗЕО ІО МО: 7 та вирівнюється з послідовностями что-міРНК ЗЕО ІЮ МО: 53-60.
Ї0ОЗЗ| ЗЕО І МО: 21 - послідовність КДНК, що містить, щонайменше, одну ділянку, насичену послідовностями мішеней что-міРНК. Містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого ЗЕО ІО МО: 8 та вирівнюється з послідовностями что-міРНК ЗЕО ІЮО МО: 61-69. 00341 5ЕО І МО: 22 - послідовність КДНК, що містить, щонайменше, одну ділянку, насичену послідовностями мішеней что-міРНК. Містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого ЗЕО ІО МО: 9 та вирівнюється з послідовностями что-міРНК ЗЕО ІЮ МО: 70-87.
Ї0035| 5ЕО І МО: 23-92 - послідовності ДНК, які відповідають послідовностям что-міР НК по винаходу, які вирівнюються з послідовностями кКДНК, представленими у даному документі як
ЗЕО ІЮО МО: 17-22.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
0036) У винаході запропоновані молекули рекомбінантної ДНК, композиції та способи для селективного регулювання експресії білку, наприклад експресії гетерологічної полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини та їх застосування. В одному аспекті даний винахід відноситься до молекули рекомбінантної
ДНК, яка містить цільовий елемент чоловічої тканинноспецифічної малої інтерферуючої РНК (что-міРНК), функціонально пов'язаний з гетерологічним полінуклеотидом, придатним для транскрипції. Такі молекули рекомбінантної ДНК використовуються для селективного регулювання експресії гетерологічного полінуклеотиду, придатного для транскрипції, у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини. Послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути представлені як ДНК або як РНК, як вказано; розкриття однієї з них обов'язково визначає іншу, як відомо спеціалісту у даній області техніки. Крім того, розкриття даної послідовності нуклеїнової кислоти обов'язково визначає та включає комплементарний ланцюг цієї 60 послідовності, як відомо спеціалісту у даній області техніки.
І0037| Мала інтерферуюча РНК (міРНК) являє собою клас молекул РНК довжиною близько 18-26 нуклеотидів (н) (наприклад, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або 26 н). Послідовність міРНК може бути представлена з використанням нуклеотидної послідовності РНК, яка складається з гуаніну (С), цитозину (С), аденіну (А) та урацилу (Ш) або з використанням еквівалентної нуклеотидної послідовності ДНК з гуаніну (С), цитозину (С), аденіну (А) та тиміну (Т). міРНнК функціонує в межах індукованих РНК комплексів сайленсингу (КІЗС) для ініціювання деградації специфічної послідовності інформаційної РНК (мРНК), що призводить до порушення експресії гену та регуляції у бік зниження білку, який кодується геном. (0038) "Чоловіча тканинноспецифічна міРНК" або "что-міРНК" являє собою мігРНК, широко або специфічно експресовану у чоловічій репродуктивній тканині (тканинах) (наприклад, чоловіче суцвіття) рослини, таким чином, що має тканинноспецифічний патерн експресії.
Чоловіча тканинноспецифічна міРНК була ідентифікована у рослинах та може бути виявлена з використанням методів, відомих у даній області, таких як низькомолекулярний нозерн аналіз.
Послідовність "что-міРНК" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти что-міРНК. Типові послідовності что-міРНК у формі відповідної послідовності ДНК молекули дволанцюгової что- міРНК наведені у даному документі як зЕО ІЮ МО: 23-92.
І0039| Послідовність ДНК, яка є комплементарною до послідовності что-міРНК, називається у даному документі "мішенню что-міР НК". Мішень что-міР НК міститься у послідовності ДНК гену та транскрибується у послідовність РНК відповідної молекули мРНК. Одноланцюгова та дволанцюгова молекула что-міРНК може потім зв'язуватись або гібридизуватись у типових фізіологічних умовах з мішенню что-міРНК у молекулі мРНК. Див. Фіг. 3. Послідовність нуклеїнової кислоти є комплементарною послідовності что-міРНК, якщо вирівнювання двох послідовностей нуклеїнових кислот дає точне співпадіння (без будь-яких невідповідностей, тобто повна комплементарність), одне неспівпадіння, два неспівпадіння або три неспівпадіння по довжині что-міРНК. Додаткові послідовності можуть бути пов'язані між собою у відповідності зі стандартними правилами комплементарності Уотсона-Кріка (наприклад, пари гуаніну з парами цитозину (5:С) та аденіну або з тиміном (А:Т), або з урацилом (А). "Цільова послідовність что-міРНК" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти мішені что-міР НК.
Типові цільові послідовності что-міР НК представлені у даному документі як БХЕО ІЮ МО: 23-92.
Зо (0040) Більше однієї мішені что-міРНК може бути згруповано разом або навіть перекриватися в межах однієї молекули ДНК. Молекула ДНК, що містить більше однієї мішені что-міР НК, згадується у даному документі як "цільовий елемент что-міРНК". Цільовий елемент что-міРНК містить щонайменше дві або більше мішеней что-міРНК в межах вікна 500 нуклеотидної послідовності. Цільовий елемент что-міР НК може бути будь-якої довжини, такої як близько 30 нуклеотидів (н), близько 40 н, близько 50 н, близько 60 н, близько 70 н, близько 80 н, близько 90 н, близько 100 н, близько 150 н, близько 200 н, близько 250 н, близько 300 н, близько 350 н, близько 400 н, близько 450 н або близько 500 н. "Послідовність цільового елементу что-міРНК" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти цільового елементу что- міРНК. Типові послідовності цільових елементів что-міРНК представлені у даному документі як
ЗЕО І МО: 1-16. 0041) Використаний у даному документі термін "рекомбінантна" молекула ДНК, поліпептид, білок, клітина або організм можуть бути не природного походження або штучним творінням з використанням інструментів генної інженерії та як такий є продуктом людської діяльності та у інших випадках зазвичай не зустрічаються у природі. "Молекула рекомбінантної ДНК" відноситься до молекули ДНК, що містить комбінацію послідовностей або молекул ДНК, які в природі не зустрічались би разом без втручання людини. Наприклад, молекула рекомбінантної
ДНК може бути молекулою ДНК, яка складається із щонайменше двох молекул ДНК, гетерологічних відносно одна одної, молекулою ДНК, яка містить ДНК-послідовність, яка відрізняється від ДНК-послідовностей, які існують у природі або молекулою ДНК, яка була вбудована у ДНК клітини-хазяїна шляхом генетичної трансформації. В одному варіанті реалізації молекула рекомбінантної ДНК по винаходу являє собою молекулу ДНК, що містить цільовий елемент что-міРНК, функціонально пов'язаний, щонайменше, з однією полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, наприклад, де молекула полінуклеотиду, придатного для транскрипції, є гетерологічною цільовому елементу что-міР НК.
Як використано у даному документі, "рекомбінантна" молекула або клітина або організм можуть відноситись до штучних. 00421 Використаний у даному документі термін "гетерологічний" відноситься до комбінації двох або більше молекул ДНК або білків, коли така комбінація зазвичай не зустрічається у природі або коли така комбінація надається в орієнтації або порядку, яка відрізняється від тієї, бо яка була знайдена у природі. Наприклад, дві молекули ДНК можуть бути отримані з різних видів або створені синтетично та/або дві молекули ДНК можуть бути отримані з різних генів, наприклад, різних генів одного й того ж виду або одних і тих же генів від різних видів. В одному прикладі регуляторний елемент або цільовий елемент что-міРНК може бути гетерологічним по відношенню до функціонально пов'язаної молекули полінуклеотиду, придатної для транскрипції, якщо така комбінація зазвичай не зустрічається у природі, тобто молекула полінуклеотиду, придатного для транскрипції, в природі не може бути функціонально пов'язана з регуляторним елементом або цільовим елементом что-міРНК. В одному варіанті реалізації така гетерологічна комбінація може містити цільовий елемент что-міР НК, який може бути синтезований на основі рослин або хімічно синтезований та може бути функціонально пов'язаний з полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, такою як бактеріальний трансген, який кодує білок для стійкості до гербіциду, такий як ср4-ЕРБР5 (наприклад, як показано у даному документі 5ЕО ІЮ
МО 93). Крім того, конкретна послідовність може бути "гетерологічною" по відношенню до клітини або організму, у який вона вводиться (наприклад, послідовність, яка не зустрічається в природі у цієї конкретної клітини або організму). 0043) Використаний у даному документі термін "виділений" означає відділений від інших молекул, зазвичай зв'язаних з ним у його природному стані. Наприклад, виділена молекула ДНК являє собою молекулу, яка присутня окремо або у комбінації з іншими композиціями, але не знаходиться у її природному геномному положенні або стані. В одному варіанті реалізації термін "виділений" відноситься до молекули ДНК, яка відділена від нуклеїнових кислот, які зазвичай фланкують молекулу ДНК у її природному стані. Наприклад, виділена молекула ДНК може бути молекулою ДНК, яка складається з щонайменше двох молекул ДНК, гетерологічних відносно одна одної. В іншому прикладі виділена молекула ДНК може бути молекулою ДНК, яка була включена у нове геномне положення у клітини-хазяїна шляхом генетичної трансформації.
Таким чином, молекула ДНК, злита або функціонально пов'язана з однієї або декількома іншими молекулами ДНК, з якими вона не пов'язана у природі, наприклад, в результаті методів рекомбінантної ДНК або трансформації рослин, вважається виділеною у даному документі. Такі молекули вважаються виділеними навіть при інтеграції у хромосому клітини-хазяїна або присутності в розчині нуклеїнової кислоти з іншими молекулами ДНК.
І0044| Термін "функціонально пов'язаний" відноситься до щонайменше двох молекул
Зо нуклеотидів, розташованих або зв'язаних таким чином, що можна впливати на функцію іншого.
Дві нуклеотидні молекули можуть бути частиною єдиної суміжної нуклеотидної молекули та можуть бути суміжними або розділеними. Наприклад, цільовий елемент что-міРНК може бути функціонально пов'язаний з полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції. В одному варіанті реалізації функціонально пов'язана молекула что-міРНК може впливати на транскрипцію, трансляцію або експресію полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції. Наприклад, цільовий елемент что-міРНК функціонально пов'язаний з полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, якщо після транскрипції у клітині чоловічої репродуктивної тканини присутність цільового елементу что-міРНК у молекулі мРНК призводить до регуляції експресії полінуклеотиду, придатного для транскрипції, у клітини, індукованої ендогенною что-міРНК та КІЗС-шляхом. Функціональний зв'язок цільового елементу что-міРНК та молекули полінуклеотиду, придатного для транскрипції, може бути досягнутий, наприклад, шляхом введення цільового елементу что-міРНК суміжно з молекулою полінуклеотиду, придатного для транскрипції (такого як розташованого у 5" або 3" положенні по відношенню до полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, але не обов'язково у безпосередньому зв'язку), у або суміжно з ділянкою, що не транслюється (СТЕ) цієї молекули полінуклеотиду (такого як розташованого у або суміжно з 5 ТК або 3" ТК) та/або у 3' положенні по відношенню до полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, та у 5" положенні до сигналу поліаденілювання. В одному варіанті реалізації цільовий елемент что- міРНК розташований між молекулою полінуклеотиду, придатного для транскрипції, та послідовністю поліаденілювання, яка собою розташована у 3" положенні до та суміжно з молекулою полінуклеотида, придатного для транскрипції. В іншому варіанті реалізації цільовий елемент что-міРНК знаходиться між стоп-кодоном полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, та послідовністю поліаденілювання. В іншому варіанті реалізації цільовий елемент что-міРНК знаходиться в межах 3-ИТК послідовності, суміжної з молекулою полінуклеотида, придатною для транскрипції.
ІЇ0045| Приклади ідентифікації что-міРНК, мішеней что-міРНК та цільових елементів что- міРНК наведені у даному документі та можуть бути ідентифіковані за допомогою методів, відомих спеціалістам у даній області, наприклад, шляхом біоінформаційного аналізу бібліотек малих РНК та кДНК рослин. Зокрема, что-міРНК можна ідентифікувати з бібліотек малих РНК та бо секвенувати. Виявлені послідовності что-міРНК можна порівнювати з колекціями кКДНК та/або геномної послідовності для ідентифікації мішеней что-міРНК та цільових елементів что-міР НК, які використовуються для розробки молекул та конструкцій рекомбінантних ДНК, як описано у даному документі. (0046) У деяких варіантах реалізації цільові елементи что-міРНК створюються, синтезуються або модифікуються іп міго. Наприклад, цільові елементи что-міРНК можуть бути модифіковані, щоб містити більше, менше або різні послідовності мішеней что-міРНК або перегруповано відносно положення однієї або декількох послідовностей мішеней что-міРНК. У деяких варіантах реалізації така модифікація може бути корисною при збільшенні або зменшенні впливу цільового елементу что-міРНК. Способи створення, синтезу або модифікації цільового елементу что-міРНК іп міго та для визначення оптимальної варіації бажаного рівня регулювання відомі спеціалістам у даній області техніки. Типові рекомбінантні цільові елементи что-міРНК можуть бути створені шляхом комбінування послідовностей ДНК або їх фрагментів з двох або більше мішеней что-міР НК, двох або більше цільових елементів что-міР НК, двох або більше областей кДНК, багатих мішенню чтсо-міР НК або однієї або декількох мішеней что-міР НК та фрагментів з двох або більше областей кКДНК, багатих мішенню чтсо-міРНК, наприклад, шляхом комбінування всіх або фрагментів двох або більш цільових елементів что-міРНК, представлених у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 1-9, шляхом комбінування двох або більше послідовностей что-міР НК, представлених у даному документі як 5ЕО ІЮ МО: 23-92 або шляхом комбінування всіх або фрагментів двох або більше цільових елементів что-міРНК, представлених у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 1-9 з однієї або декількома послідовностями что-міРНК, представленими у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 23-92. Такі типові рекомбінантні цільові елементи что-міР НК представлені у даному документі як БЕО ІЮО МО: 10-16.
І0047| Послідовність ДНК цільового елементу что-міРНК також може бути змінена шляхом включення 1-3 нуклеотидних невідповідностей у послідовність мішені что-міРНК (відносно даної послідовності что-міРНК). В іншому варіанті реалізації даний винахід включає молекули рекомбінантної ДНК або цільові елементи что-міРНК, які мають щонайменше близько 80 95 (у процентах) ідентичності послідовності, близько 85 95 ідентичності послідовності, близько 90 95 ідентичності послідовності, близько 91 95 ідентичності послідовності, близько 92 95 ідентичності послідовності, близько 93595 ідентичності послідовності, близько 9495 ідентичності послідовності, близько 95595 ідентичності послідовності, близько 9695 ідентичності послідовності, близько 9795 ідентичності послідовності, близько 9895 ідентичності послідовності та близько 99 95 ідентичності послідовності з будь-якою із ДНК молекул, цільових елементів что-міРНК (такі як ЗЕО ІЮО МО: 1-9), цільових елементів рекомбінантних что-міРнК (такі як БЕО ІЮ МО: 10-16) або послідовностями кКДНК (такі як БЕО ІЮ МО: 17-22) даного винаходу. (0048) В іншому варіанті реалізації даний винахід відноситься до фрагментів молекули ДНК, описаних у даному документі. Такі фрагменти можуть бути використані у якості цільових елементів что-міРНК або можуть бути комбіновані з іншими цільовими елементами что-мігРНК, послідовностями что-міРНК або їх фрагментами для конструювання цільових елементів рекомбінантних что-міРНК, як описано вище. У конкретних варіантах реалізації такі фрагменти можуть містити щонайменше близько 20, щонайменше близько 30, щонайменше близько 40, щонайменше близько 50, щонайменше близько 60, щонайменше близько 70, щонайменше близько 80, щонайменше близько 90, щонайменше близько 100, щонайменше близько 110, щонайменше близько 120, щонайменше близько 130, щонайменше близько 140, щонайменше близько 150, щонайменше близько 160, щонайменше близько 170, щонайменше близько 180, щонайменше близько 190, щонайменше близько 200, щонайменше близько 210, щонайменше близько 220, щонайменше близько 230, щонайменше близько 240, щонайменше близько 250, щонайменше близько 260, щонайменше близько 270, щонайменше близько 280, щонайменше близько 290, щонайменше близько 300, щонайменше близько 350, щонайменше близько 400,
БО щонайменше близько 450, щонайменше близько 500 суміжних нуклеотидів або довше, молекули ДНК, описаної у даному документі, такої як цільова мішень что-міРНК або послідовність КДНК, як описано у даному документі. Способи отримання таких фрагментів з вихідної молекули ДНК добре відомі у даній області.
І0049| Ефективність модифікацій, дуплікацій, делецій або перегрупувань, описаних у даному документі по відношенню до бажаних аспектів експресії конкретної полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, може бути випробувана емпірично у стабільних та тимчасових аналізах рослин, таких як описані у робочих прикладах у даному документі, щоб підтвердити результати, які можуть варіювати в залежності від виконаних змін та мети зміни вихідної молекули ДНК. бо ІЇ0050| Мішень чтсо-міРНК та цільовий елемент что-міРНК можуть функціонувати у будь-
якому напрямку, що означає, що вона ненаправлена, як така, може використовуватись або в орієнтації 5" або 3", або в орієнтації 3" на 5' у молекулі рекомбінантної ДНК або конструкції ДНК.
ІЇ0051| Використаний у даному документі термін "експресія полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції" або "експресія білка" відноситься до продукування білку з полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, та отриманого транскрипту (мРНК) у клітині. Таким чином, термін "експресія білка" відноситься до будь-якого патерну трансляції транскрибованої молекули РНК у молекулу білка. Експресія білку може характеризуватися його часовими, просторовими, пов'язаними з розвитком або морфологічними особливостями, а також кількісними або якісними показниками. В одному варіанті реалізації молекули рекомбінантної ДНК по винаходу можуть бути використані для селективного регулювання експресії білку або полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, у чоловічих репродуктивних тканинах трансгенної рослини. В такому варіанті реалізації експресія молекули рекомбінантної ДНК у трансгенній рослині може приводити до експресії функціонально пов'язаної полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, щонайменше у вегетативних тканинах, але не у чоловічих репродуктивних тканинах. У деяких варіантах реалізації така регуляція експресії білку відноситься до пригнічення або зменшення; наприклад, пригнічення або зменшення рівня білку, який продукується у клітині, наприклад, шляхом посттранскрипційної регуляції гену шляхом РНК-інтерференції.
ІЇ0052| Селективна регуляція експресії білку, яка використовується у даному документі, відноситься до зниження продукування білку у клітині або тканині порівняно з контрольною клітиною або тканиною щонайменше на близько 7595, щонайменше на близько 80 95, щонайменше на близько 85 95, щонайменше на близько 90 95, щонайменше на близько 95 95, щонайменше на близько 9995 або 10095 зниження (тобто повне зниження). Контрольною клітиною або тканиною може бути, наприклад, вегетативна клітина або тканина з тієї ж або подібної трансгенної рослини, яка експресує білок або клітина або тканина з трансгенної рослини, яка має аналогічний трансген, який кодує білок, але без функціонально пов'язаного цільового елементу что-міРНК. Регулювання експресії білюеу можна визначити з використанням будь-якого методу, відомого спеціалісту у даній області, наприклад, шляхом безпосереднього вимірювання накопичення білку у зразку клітини або тканини з використанням такої методики,
Зо як ЕГІЗА або вестерн-блот-аналіз, шляхом вимірювання ферментативної активності білку або шляхом фенотипічного визначення експресії білка. В одному варіанті реалізації селективна регуляція експресії білку відноситься до достатнього скорочення експресії білку, здатного надати гербіцидну стійкість у чоловічій тканині трансгенної рослини, що призводить до детектованого фенотипу зміненої чоловічої фертильності у трансгенній рослині, до якої був застосований гербіцид як індукований аерозоль стерильності. Таким чином, виявлення зміненої чоловічої фертильності у такій трансгенній рослині вказує на селективну регуляцію експресії білка. 0053) Використаний у даному документі термін "трансген, який кодує рекомбінантний білок" або "полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції" відноситься до будь-якої нуклеотидної молекули, здатної транскрибуватися у молекулу РНК, включаючи, але не обмежуючись ними, ті, які мають нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептидну послідовність. В залежності від умов нуклеотидна послідовність може бути або не бути фактично трансльована у молекулу поліпептида у клітині. Межі трансгену або полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, зазвичай позначаються стартовим кодоном трансляції на
Б'-кінці та стоп кодоном трансляції на 3'-кінці.
ІЇ0054| Термін "трансген" відноситься до молекули ДНК, штучно вбудованої у геном організму або клітини-хазяїна, у даному або будь-якому попередньому поколінні організму або клітини в результаті втручання людини, наприклад, методами трансформації рослин.
Використаний у даному документі термін "трансгенний" означає, який включає трансген, наприклад "трансгенну рослину" відноситься до рослини, що містить трансген у її геномі, та "грансгенна ознака" відноситься до характеристики або фенотипу, вираженого або забезпеченого присутністю трансгена, вбудованого у рослинний геном. В результаті таких геномних змін трансгенна рослина є чимось значно відмінним від спорідненої рослини дикого типу, а трансгенна ознака - це риса, яка в природі не виявляється у рослини дикого типу.
Трансгенні рослини по винаходу містять молекулу рекомбінантної ДНК, представлену винаходом.
Ї0055| Трансген або полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, по цьому винаходу включає, але не обмежується ними, трансген або полінуклеотидну молекулу, придатну для транскрипції, яка забезпечує бажану характеристику, пов'язану з морфологією 60 рослин, фізіологією, ростом, розвитком, врожайністю, поживними властивостями, стійкістю до хвороб, стійкістю до шкідників, стійкістю до гербіцидів, стійкістю до стресів, стійкістю до стресів оточуючого середовища або хімічною стійкістю. В одному варіанті реалізації полінуклеотидна молекула, придатна для транскрипції, по винаходу кодує білок, який при експресії у трансгенній рослині забезпечує стійкість до гербіциду, щонайменше, у клітини та/або тканини, де зустрічається експресований білок; селективна регуляція білку толерантності до гербіциду у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини у поєднанні зі своєчасним застосуванням гербіциду приводить, щонайменше, до індукованого зниження чоловічої фертильності або індукованої чоловічої стерильності. 0056) Така здатна до індукції чоловіча стерильність у поєднанні з вегетативною стійкістю до гербіцидів може бути використана для підвищення ефективності, з якою отримують гібридне насіння, наприклад, шляхом усунення або зменшення необхідності фізично видаляти чоловічі статеві органи у рослини кукурудзи, яка використовується у якості жіночої рослини у даному схрещуванні під час отримання гібридного насіння. Гербіцид-індуковані системи чоловічої стерильності описані, наприклад, у патенті США Моб762344; патенті США 8618358; та публікації патента США 2013/0007908. Приклади гербіцидів, які використовуються при реалізації винаходу, включають, але не обмежуються ними, інгібітори ацетил-коферменту А-карбоксилази (АСС) (наприклад, їор та діт), інгібітори ацетолактатсинтази (А 5) (наприклад, сульфонілсечовини (5) та німідазолінони (ІМІ), інгібітори фотосистеми І (РБІЇ) (наприклад, траазини та фенілефіри), інгібітори протопорфіриногеноксидази (РРО) (наприклад, флуміоксазин та фомеафен), інгібітори 4-гідроксифенілпіруватдиоксигенази (НРРО)) (наприклад, ізоксафлутол та трикетони, такі як мезотрион), інгібітори 5-енолпірувіл-шикимат 3- фосфатсинтази (ЕРБР5) (наприклад, гліфосат), інгібітори глутамінсинтетази (55) (наприклад, глюфозинат та фосфінотрицин), синтетичні ауксини (наприклад, 2,4-О та дікамба). Приклади трансгенів або полінуклеотидних молекул, придатних для транскрипції, для використання при реалізації винаходу включають, але не обмежуються ними, гени, які кодують білки, які надають стійкість до інгібіторів НРРО (такі як несприйнятливий до гербіцидів НРРО), гени, які кодують білки, що надають стійкість до глюфосинату (такі як раї та Баг), гени, які кодують білки, які надають стійкість до гліфосату (наприклад, стійкі до гліфосату ЕРБР5Б, такі як ср4-ерзврв, представлені у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 93) та гени, які кодують білки, які надають
Зо стійкість до синтетичного ауксину, такого як дікамба (такий як дікамбамонооксигеназа (ОМО)) та 2,А-О (такий як ген (К)-дихлорпропдиоксигенази (гарА)). (00571 Рекомбінантні ДНК-конструкції по винаходу можуть включати молекули рекомбінантної ДНК по винаходу та виготовлені за допомогою методів, відомих у даній області техніки та у різних варіантах реалізації, включені у вектори трансформації рослин, плазміди або пластидну ДНК. Такі конструкції рекомбінантної ДНК використовуються для отримання трансгенних рослин та/або клітин та такі можуть також міститися у геномній ДНК трансгенної рослини, насіння, клітини або частини рослини. Таким чином, даний винахід включає варіанти реалізації, у яких конструкція рекомбінантної ДНК розташована в межах вектора трансформації рослин або на біолітичній частинці для трансформації рослинної клітини або в межах хромосоми або пластиди трансгенної рослинної клітини або в межах трансгенної клітини, трансгенної тканини рослини, трансгенного насіння рослин, трансгенного зерна пилку або трансгенної або частково трансгенної (наприклад, прищепленої) рослини. Вектор являє собою будь-яку молекулу ДНК, яка може бути використана для трансформації рослин, тобто введення
ДНК у клітину. Рекомбінантні ДНК-конструкції по винаходу можна, наприклад, вбудувати у вектор трансформації рослин та використати для трансформації рослин для отримання трансгенних рослин, насіння та клітин. Способи конструювання векторів трансформації рослин добре відомі у даній області. У відповідності з винаходом вектори трансформації рослин як правило включають, але не обмежуються ними: відповідний промотор для експресії функціонально пов'язаної ДНК, конструкцію функціонально пов'язаної рекомбінантної ДНК та сигнал поліаденілювання (який може бути включений у послідовність З'ЮТЕК) Промотори, які використовуються при реалізації винаходу, включають ті, які діють на рослині для експресії функціонально пов'язаного полінуклеотида. Такі промотори різноманітні та добре відомі у даній області та включають ті, які є індуцибельними, вірусними, синтетичними, конститутивними, регульованими по часу, просторово регульованими та/або регульованими просторово й по часу.
Додаткові необов'язкові компоненти включають, але не обмежуються, одну або декілька з наступних мішеней: 5" ТК, енхансер, цис-активуючу мішень, інтрон, сигнальну послідовність, транзитну пептидну послідовність та один або декілька селективних маркерних генів. В одному варіанті реалізації вектор трансформації рослини містить рекомбінантну конструкцію ДНК.
ІЇ0058| Конструкції рекомбінантної ДНК та вектори трансформації рослин по даному 60 винаходу виготовляють будь-яким способом, який підходить для передбачуваного застосування, з урахуванням, наприклад, типу бажаної експресії, трансгену або бажаної полінуклеотидної молекули, придатної для транскрипції, та зручності використання у рослині, у якій повинна бути експресована конструкція рекомбінантної ДНК. Загальні методи, які використовуються для маніпулювання молекулами ДНК для виготовлення та використання рекомбінантних ДНК-конструкцій та векторів трансформації рослин, добре відомі у даній області та детально описані, наприклад, у довідниках та лабораторних довідниках, включаючи Міспає!
А. ССтевеп апа дозерп ЗатргооКк, "МоІесшаг Сіопіпд: А ІГарогаїту Мапиа!" (Бошпй Еайіоп)
ІБВМ:978-1-936113-42-2, Соїа оргіпа Натог І арогаюгу Ргез5, МУ (2012).
Ї0059| Молекули та конструкції рекомбінантної ДНК по винаходу можуть бути модифіковані способами, відомими у даній області, повністю або частково, наприклад, для збільшення зручності маніпуляції з ДНК (такими як сайти розпізнавання рестрикційних ферментів або сайти клонування на основі рекомбінації) або для включення переважних послідовностей рослин (таких як використання рослинних кодонів або консенсусних послідовностей Козак) або включення послідовностей, застосованих для молекули рекомбінантної ДНК та дизайну конструкції (наприклад, спейсерних або лінкерних послідовностей). У деяких варіантах реалізації послідовність ДНК молекули та конструкції рекомбінантної ДНК включає послідовність ДНК, яка була оптимізована кодоном для рослини, у якій повинна бути експресована молекула або конструкція рекомбінантної ДНК. Наприклад, молекула або конструкція рекомбінантної ДНК, яка повинна бути експресована у рослині, може мати все або частини її кодон-оптимізованої послідовності для експресії у рослині способами, відомими у даній області. Молекули або конструкції рекомбінантної ДНК по винаходу можуть бути розміщені поруч з іншими молекулами рекомбінантної ДНК або трансгенними об'єктами для надання додаткових ознак (наприклад, у випадку трансформованих рослин, ознак, включаючи стійкість до гербіцидів, стійкість до шкідників, стійкість до холодного проростання, стійкість до дефіциту води), наприклад, шляхом експресії або регулювання інших генів. 0060) Аспект винаходу включає трансгенні рослинні клітини, трансгенні рослинні тканини та трансгенні рослини або насіння, які містять молекулу рекомбінантної ДНК по винаходу. Ще один аспект винаходу включає штучні або рекомбінантні хромосоми рослин, які включають молекулу рекомбінантної ДНК по винаходу. Відповідні способи трансформації клітин рослин-хазяїв для використання за даним винаходом включають практично будь-який спосіб, шляхом якого ДНК може бути введена у клітину (наприклад, коли молекула рекомбінантної ДНК стабільно інтегрована у рослинну хромосому) та добре відома у даній області техніки. Типовий та широко використаний спосіб введення молекули рекомбінантної ДНК у рослини являє собою систему трансформації Адгобрасіегішт, яка добре відома спеціалістам у даній області. юІншИМ типовим способом введення молекули рекомбінантної ДНК у рослини є вбудовування молекули рекомбінантної ДНК у рослинний геном у попередньо визначеному місці методами сайт- направленої інтеграції. Сайт-направлена інтеграція може бути виконана будь-яким способом, відомим у даній області, наприклад, з використанням нуклеаз по типу цинкових пальців, штучних або нативних мегануклеаз, ТАГЕ-ендонуклеаз або ендонуклеаз з РНК-управлінням (наприклад, системи СКІЗРЕК/Са59). Трансгенні рослини можуть бути регенеровані з трансформованої рослинної клітини методами культури рослинних клітин. Трансгенну рослину, гомозиготну по відношенню до трансгену, може бути отримано шляхом статевого схрещення (самозапліднення) незалежних трансгенних рослин, які містить одну екзогенну послідовність генів, наприклад, рослина КО або РО, з отриманням насіння К1 або Е1. Одна четверта частина отриманого насіння КІ або Е1 буде гомозиготною по відношенню до трансгену. Рослини, вирощені з проростаючого насіння КІ! або Е1, можуть бути піддані випробуванню на гетерозиготність, як правило, з використанням аналізу 5МР або аналізу термічної ампліфікації, який дозволяє розрізняти гетерозиготи та гомозиготи (тобто аналіз зиготності).
І0061| Винахід відноситься до трансгенної рослини, яка має у своєму геномі молекулу рекомбінантної ДНК по винаходу, включаючи, окрім іншого, люцерну, бавовну, кукурудзу, рапс, рис, сою та пшеницю. Винахід також забезпечує трансгенні рослинні клітини, частини рослин та потомство такої трансгенної рослини. Використаний у даному документі термін "потомство" включає будь-яку рослину, насіння, рослинну клітину та/або рослинну частину, отриману або регенеровану з рослини, насінини, рослинної клітини та/або рослинної частини, яка включає молекулу рекомбінантної ДНК по винаходу. Трансгенні рослини, клітини, частини, рослини потомства та насіння, отримане з таких рослин, можуть бути сгомозиготними або гетерозиготними для молекули рекомбінантної ДНК по винаходу. Частини рослини даного винаходу можуть включати, але не обмежуються ними, листя, стебла, корені, насіння, ендосперм, яйцеклітину та пилок. Частини рослин по даному винаходу можуть бути 60 життєздатними, нежиттєздатними, регенерованими або нерегенерованими. Винахід також включає та забезпечує трансформовані рослинні клітини, що містять молекулу ДНК по винаходу. Трансформовані або трансгенні рослинні клітини по винаходу включають регенеровані та нерегенеровані рослинні клітини.
І0062| Додатково у даному винаході представлені варіанти реалізації, у яких молекула рекомбінантної ДНК знаходиться у товарному продукті, отриманому з трансгенної рослини, насінини або рослинної частини даного винаходу; такі товарні продукти включають, але не обмежуються ними, зібрані частини рослини, подрібнені або цілі зерна або насіння рослини або будь-який харчовий або непродовольчий продукт, що містить молекулу рекомбінантної ДНК по даному винаходу. 0063) Винахід передбачає спосіб індукування чоловічої стерильності у трансгенній рослині, який включає (а) вирощування трансгенної рослини, що містить молекулу рекомбінантної ДНК, яка містить гетерологічну полінуклеотидну молекулу, придатну для транскрипції, яка надає гербіцидну стійкість, функціонально пов'язану з цільовим елементом что-міРНК, та (Б) застосування ефективної кількості гербіциду до трансгенної рослини для індукції чоловічої стерильності. Ефективна кількість гербіциду являє собою кількість, достатню для перетворення трансгенної рослини, що містить молекулу рекомбінантної ДНК по винаходу, на чоловічу стерильну. В одному варіанті реалізації ефективна кількість гліфосату складає близько 0,125 фунтів (0,057 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га) до близько 8 фунтів (3,6 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га). Застосування гербіциду може бути застосовано до або під час розвитку чоловічої репродуктивної тканини, наприклад, на етапі, вибраному з групи, яка складається з М4, М5, Мб, М7, М8, М9, М10, М11, М12, М13, та М14 етапі розвитку кукурудзи та може запобігти розвиток, як мінімум, пилку, скидання пилку або екструзію пильників. (0064) В одному варіанті реалізації запобігання розвитку пилку, скидання пилку або екструзії пильників може бути результатом чоловічої стерильності, та, а отже, відсутність розвитку пилку, скидання пилку або екструзії пильника можуть бути ознакою чоловічої стерильності. Однак у деяких випадках чоловічі стерильні рослини все ще можуть утворювати невелику кількість пилку. Тому у деяких варіантах реалізації присутність невеликої кількості пилку не обов'язково вказує, що це чоловічі фертильні рослини або відсутність чоловічої стерильності. 0065) Розвиток рослин часто визначається по шкалі етапів, на основі розвитку рослин. Для
Зо кукурудзи загальна шкала розвитку рослин, яка використовується у даній області техніки, відома як М-етапи. М-етапи визначаються у відповідності із самим верхнім листом, у якому видна листокова манжета. МЕ відповідає появі, МІ відповідає першому листку, М2 відповідає другому листку, М3 відповідає третьому листку, М(п) відповідає п-му листку. МТ відбувається, коли остання гілка китиці видна, але до появи шовку. При визначенні етапу поля кукурудзи кожний конкретний У-етап визначається тільки тоді, коли 50 процентів або більше рослин у полі знаходяться на цьому етапі або за її межами. Інші шкали розвитку відомі спеціалістам у даній області та можуть бути використані зі способами по винаходу. 0066) Іншим загальним інструментом для прогнозування та оцінки етапів росту та розвитку кукурудзи є Одиниці ступеня росту (530))). Фактором росту та розвитку кукурудзи є тепло. Тепло зазвичай вимірюється в один момент часу та виражається як температура, але його також можна виміряти протягом відповідного періоду часу та виражати у вигляді теплових одиниць. Ці теплові одиниці зазвичай називаються 500. БИ можна визначити як різницю між середньою денною температурою та вибраною базовою температурою з урахуванням відповідних обмежень. СИ розраховують з використанням наступного рівняння: Одиниця ступеня росту - (НАЦ Уг) - В, де Н - денний максимум (але не вище 86 "РЕ), І. - денний мінімум (але не нижче
Р), а В - базова температура 50 "РЕ. Оскільки ріст кукурудзи є незначним, коли температура перевищує 86 Р або менше 50 "ЕР, встановлюються межі щоденних високих та низьких температур, які використовуються у формулі. Більш низьке обмеження для добової температури також запобігає вичисленню негативних значень. Тому, якщо щоденна висока 50 температура перевищує 86 "Р, щоденна висока температура, яка використовується у формулі
СО, буде встановлена на 86 "Р. та навпаки, якщо щоденна низька температура опускається нижче 50 "ЕР, щоденна низька температура, яка використовується у 50 формула буде встановлена при 50 "Р. Якщо щоденна висока температура не перевищує 50 "Е, то на цей день
СО вне записується. Максимум ЗИ, який кукурудза може накопичувати за один день, дорівнює 36, мінімум дорівнює нулю. Оцінка зрілості рослини кукурудзи визначається сумою добових значень 50 за певний період часу. Вказаний період часу, який використовують більшість виробників насіння кукурудзи, являє собою час від моменту посадки до фізіологічної зрілості або моменту, при якому заповнення зерна практично завершено. Наприклад, у більшості штатів США накопичені 50 зберігаються для більшості географічних районів та 60 доступні від Служби звітів про врожаї ОБОБА або державних служб розповсюдження. Крім того,
інструмент для отримання інформації о 50 у певному місці також описаний у патенті США Мо 6967656, який включений у даний опис за допомогою посилання у всій його повноті. 0067) Інший спосіб прогнозування розвитку китиці для визначення термінів появи чоловічої стерильності, індукованої застосуванням гербіциду, описаний у патенті США Мо 8618358, який включений у даному документі у якості посилання у всій його повноті. (0068) Гербіциди для використання з винаходом включають будь-який гербіцид, включаючи ті, які діють проти ацетил-коферменту А-карбоксилази (АСС), інгібітори ацетолактат-синтази (АЇ 5), інгібітори фотосистеми ІІ (РЗІЇ), інгібітори протопорфіриногеноксидази (РРО), інгібітори 4- гідроксифенілпируватдиоксигенази (НРРБ), інгібітори 5-енолпірувіл-шикимат-3-фосфатсинтази (ЕРБРЗ5), інгібітори глутаминсинтетази (55) та синтетичні ауксини. Гербіциди добре відомі у даній області та описані, наприклад, у "Модет Сгор Ргоїесіоп Сотроипав5, МоЇштез 1 (бЗесопа
Еайіоп), еайеа Бу Ууойдапуд Кгатег, Шігіспй Зспіптег, Реїег УезспКе, Маййіаз УМії5спеї, ІЗВМ: 9783527329656, УМПеу-МСН Мепад СтрН 4 Со. КСаА, Септапу (2012). В одному варіанті реалізації гербіцидом є гліфосат.
ІЇ0069| Гібридне насіння може бути отримане з використанням способу, який включає (а) застосування гербіциду на трансгенній рослині, яка містить молекулу рекомбінантної ДНК, включаючи гетерологічну полінуклеотидну молекулу, придатну для транскрипції, яка надає гербіцидну стійкість, функціонально пов'язану з цільовим елементом что-міРНК, при цьому виконується застосування гербіциду під час розвитку чоловічої репродуктивної тканині трансгенної рослини, тим самим індукуючи чоловічу стерильність у трансгенній рослині; (Б) запліднення трансгенної рослини пилком з другої рослини; та (с) збір гібридного насіння з трансгенної рослини. В одному варіанті реалізації трансгенна рослина являє собою кукурудзу. В одному варіанті реалізації гербіцидом є гліфосат, а білок, який кодується гетерологічною полінуклеотидною молекулою, придатною для транскрипції, є стійким до гліфосату ЕРБР5. В одному варіанті реалізації гліфосат застосовують під час розвитку у ефективній кількості близько 0,125 фунти (0,057 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га) до близько 8 фунтів (3,6 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га). В іншому варіанті реалізації етап запліднення може бути реалізований шляхом природного запліднення, наприклад, шляхом запилення за допомогою вітру або може включати механічне або ручне запилення.
Зо І0070| Гібридне насіння можна збирати з чоловічої стерильної трансгенної рослини, яка запліднювалась пилком з другої рослини, при цьому чоловіча стерильна трансгенна рослина містить молекулу рекомбінантної ДНК, яка містить гетерологічний полінуклеотид, придатний для транскрипції, який надає гербіцидну стійкість, функціонально пов'язану з что-міРНК, та при цьому трансгенна рослина було індуковано до чоловічої стерильність шляхом застосування ефективної кількості гербіциду під час розвитку чоловічої репродуктивній тканини. В одному з прикладів гербіцид являє собою гліфосат та застосовується під час розвитку при ефективній кількості близько 0,125 фунтів (0,057 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га) до близько 8 фунтів (3,6 кг) кислотного еквіваленту на акр (0,4 га) та запобігає, щонайменше, розвиток пилку, скидання пилку або екструзії пильника.
Приклади 0071) Наступні приклади описують покращення отримання гібридного насіння порівняно з матеріалами, представленими у даній області техніки. Такі покращення включають нові мішені что-міРНК та цільові елементи что-міР НК для використання у молекулах рекомбінантної ДНК та трансгенних рослинах для забезпечення затримки розвитку пилку на ранніх етапах, що призводить до відсутності життєздатних зерен пилку у широкому діапазоні зародкової плазми та пов'язаних з ними методами використання. Наступні приклади представлені для демонстрації варіантів реалізації винаходу.
Приклад 1: Ідентифікація мішеней что-міРНК
І0072| Малу РНК виділяли з чотирьох окремих етапів росту кукурудзи та трьох окремих етапів росту колосу кукурудзи. Див. Таблицю 1. Малу РНК, широко представлену у китиці, виділяли на дуже ранніх етапах розвитку китиці (7, М8//9, М10Л/11 та М12) (Див. Фіг. 1). Таким чином отримано малу РНК з чоловічих тканин молодше, ніж раніше застосовувалось у даній області техніки для отримання послідовностей малих РНК, широко представлених у китиці.
І0073| Бібліотеки малих РНК були отримані з використанням виділеної малої РНК, та на бібліотеках було виконано високопродуктивне секвенування малої РНК. Біоінформаційний аналіз використовували для порівняння послідовностей у цих бібліотеках китиць та колосів з послідовностями у бібліотеках малих РНК, отриманих з інших тканин кукурудзи, включаючи листя, зібрані на різних етапах росту, цілий проросток, коріння, зібрані на різних етапах росту, ендосперм та ядро. Цей диференціальний біоінформаційний аналіз виявив тисячі бо послідовностей малих РНК, широко представлених у китицях, з нормалізованою експресією від
10 до 665 транскриптів на чверть міліонну (рада). Визначені послідовності малих РНК, широко представлених у китицях, вірогідно, являються міРНК через їх довжини (18-26 нуклеотидів) та їх очікуване походження з попередника дволанцюгової РНК. Внаслідок чоловічої тканинної специфічності, ця мала РНК, широко представлена у китицях, згадується у даному документі як чоловіча тканинноспецифічна міРНК (что-міР НК).
Таблиця 1
Опис бібліотек малих РНК китиці та колоса китиці/колоса -ЗсМ на М8-М9
Китиця на етапі раннього мейозу - без етапу мікроспори (рослина на М9- -ЗсМ (рослина на МТ) етапів до 10 антиподових клітин (рослина на МТ)
І0074| Метод ПЦЕР у реальному часі використовували для ідентифікації та підтвердження того, що послідовності что-міРНК були специфічно експресовані у китиці. Тотальна РНК, включаючи збагачену малу РНК, була виділена з тканин, вказаних у таблиці 1, та використана для синтезу КДНК з обробленими транскрипційними праймерами, які складаються з 8 н, комплементарних послідовностей что-міР НК на 3'-кінці, та універсальною послідовністю 35 н на 5" кінці. Після синтезу КДНК проводили ПЦР у реальному часі, при цьому послідовність (від 14 до 18 н) одного з прямих праймерів була ідентична 5'-концу послідовності что-міР НК, а зворотний праймер був універсальним праймером. В якості внутрішнього контролю 185 РНК була ампліфікована, та це було використано для нормалізації рівнів что-міРНК. Дані з ПЦР у реальному часі використовувались для звуження числа послідовностей что-міРНК, які були широко представлені у китиці.
І0075| Профілюючий мікроматричний аналіз міРНК проводили з використанням чипів
НРагайоФ МісгоПиідіє5, представлених С Зсіепсе5 ГЇС (Хьюстон, штат Техас, США) з 1200 послідовностями, вибраними з тисяч послідовностей что-міРНК, ідентифікованих з диференційного біоїінформаційного аналізу. Чипи мікроматриці містили потрійні зонди комплементарної послідовності для кожної з 1200 что-міРНК послідовностей. Тотальна РНК була виділена з 26 тканинних пулів кукурудзи (подвійні або потрійні пули тканин) з І Н244 (номер депозиту АТСС РТА-1173) або 010КО2 (1294213) (номер депозиту АТСС РТА-7859) інбредних рослин. Див. Таблицю 2. Кожний з 26 зразків РНК був гібридизований з чипами мікроматриці, які містять зонди для 1200 что-міРНК. Зображення гібридизації були зібрані з використанням лазерного сканера СепеРіх? 40008 (МоїІесшаг Оемісе5, Саннівейл, Каліфорнія) та оцифровані з використанням програмного забезпечення для аналізу зображень Аггау-РгоФ Апаїугег (Медіа
Зо Сурегпеїйїс5, Роквіл, Меріленд). Відносні значення сигналу були отримані шляхом віднімання фону та нормалізації. Значно виражені сигнали визначали і-критерієм з р «0,05. З мікроматричного аналізу близько 500 что-міРНК з 1200 були ідентифіковані як високо специфічні для китиць.
Таблиця 2
Опис зразків тканин, які використовуються у мікроматричному аналізі.
Таблиця 2
Опис зразків тканин, які використовуються у мікроматричному аналізі. 76 | щще44 | Листок | Мігоб'єднанихупул../: | У2 / 777. | щщеї4 | корінь | Маоб'єднанихупул../ | М 78 | щщеї4 | стебло | Маобєднанихупул../: | М 789 | щщНг44 | Раннійколос | «5смоб'єднанихупул../:/ | У / 715 | щЩще44 | корінь | Маоб'єднанихупул../ | М 16 | щнгеє4 | корінь | Маобєднанихупул../: | М
І0076| Потім був проведений біоінформаційний аналіз з використанням інструментів вирівнювання послідовностей, таких як Вабвіс І оса! АЇдптепі беагсп Тоо! (ВГА5Т) або 5НОоГгі
Кеада Марріпд РасКаде (ЗНЕКЇМР) (Китрбіє, 2009) для порівняння послідовностей 500 что-мігР НК, ідентифікованих як високоспецифічні для китиць проти колекції одногенних послідовностей
КДНК кукурудзи. В цьому ВГ А5Т аналізі були виявлені послідовності КДНК кукурудзи, до яких вирівнялись багато послідовностей что-міРНК, які призводили до ідентифікованих ділянок послідовності ДНК, які мають кластерні, вирівнювання, які перекриваються, декількох послідовностей что-міРНК з ідеальними або близькими до ідеальних співпадіннями. З цього аналізу були ідентифіковані шість послідовностей КДНК, що містять одну або декілька таких ділянок, багатих послідовностями мішеней что-міРнНК. Типові шість кКДНК послідовностей представлені у даному документі як зХЕО ІЮ МО: 17; 5ЕО І МО: 18; 5ЕО ІЮ МО: 19; 5БЕО ІО МО: 20; 5ЕО ІЮО МО: 21; та 5ЕО ІО МО: 22. В якості прикладу на Фіг.2 продемонстровано графічне зображення вирівнювання декількох послідовностей что-міРНК на кДНК, представленої як ЗЕО
ІО МО: 17. Множинні короткі лінії представляють відносне положення послідовностей мішеней что-міР НК (і, відповідно, розташування сайту зв'язування для что-міРНК у транскрибованій молекулі мРНК), які вирівнюються з КкДНК. Вісь У являє собою норовані рівні експресії что-міР НК у тканинах чоловічої статі, як це було виявлено у мікроматричному аналізі. Прямокутник являє собою ділянку КДНК 5ЕО ІЮ МО: 17, який відповідає послідовностям цільових елементів что- міРНК ЗЕО ІО МО: 1 та ЗЕО ІО МО: 2.
І0077| Вибрані послідовності что-міР НК, вирівняні з однією з шести послідовностей кКДНК, використовували для додаткового мікроматричного аналізу для визначення диференціальної експресії у тканинах кукурудзи. Мікроматричний аналіз для послідовностей что-міРнК нормованих значень сигналу для китиці М8-М9, китиці М10-М12 або комбінованих сигналів з іншої тканини для зародкової плазми кукурудзи І Н244 та 010КО2 представлені у Таблицях 3- 10. Кожна таблиця демонструє підмножину послідовностей что-міРНК, ідентифікованих як ті, що співпадають з однією з шести послідовностей кКДНК, представлених у даному документі як зЗЕО
ІО МО: 17; ЗЕ І МО: 18; 5ЕО ІЮ МО: 19; 5ЕО І МО: 20; 5ЕО ІО МО: 21; та 5ЕО ІЮО МО: 22.
Результати значень сигналу вимірюються як відносні значення сигналу, а стандартна помилка
Зо (р «0,05) представлена за допомогою (5ТОК). Результати мікроматричного аналізу ілюструють, що типові что-міР НК послідовності дають високий сигнал у китиці (М8-М9У та М10-М12) та низький сигнал у іншій тканині, що вказує на те, що ендогенна експресія цих что-міРНК широко представлена у китиці. Послідовність что-міРНК відповідає смисловому або антисмисловому ланцюгу відповідної послідовності мішені что-міРНК у послідовності КДНК. Послідовність что- міРНК може мати одненуклеотидне, двонуклеотидне або тринуклеотидне неспівпадіння з вирівняною частиною послідовності КкКДНК, а послідовність что-міРНК може варіювати у відповідності зі смисловим ланцюгом або антисмисловим ланцюгом послідовності кКДНК.
Представлені у даному документі послідовності что-міРНК виявляються у різних зародкових плазмах кукурудзи.
І0078| В таблиці З показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міР НК (наведені у даному документі як зЕО ІЮ МО: 23- 31), які вирівнюються з послідовністю кКДНК, представленої у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 17, яка містить послідовності цільових елементів что-міРНК, представлених БЕО ІЮО МО: 1 та
ЗЕО ІО МО: 2. Для обох зародкової плазми І Н2г44 та 010КО2 сигнали для цих послідовностей что-міР НК у китиці М8-У9 та китиці М10-М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Результати мікроматричного аналізу, наведені у таблиці 3, демонструють, що послідовність КДНК, представлена у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 17 можна використати у якості джерела для конструювання цільових елементів что-міРНК для молекул рекомбінантної ДНК.
Таблиця З
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 17 ши І Нг44 о1оКо2
ЗЕО ІС) М8-М9 китиця М10-м12 Інша тканина | М8-МУ9 китиця т Інша тканина
МО: (ТОВ) китиця (ЗТОК) (5ТОВ) (5ТОВ) ТОВ (5ТОВ) 183,5 (36,9) | 514 (105,2 2,6 (0,6 318 (46,5 4,3 (1,5 104,5(40,9) | 322 (77,5 7.7 (3,5 174 (32,3 289 (99 824,3 (146,6 2,6 (0,7 56 (9,1 440 (141 2,3 1,1 55,5 (4,5 175,7 (412 3,8 (1,1 10 (7,1 104 (26,3 3,8 (1,8 377,5(60,1) | 581,7 (76,8 1,1 (0,3 73 (10,1 405,5 (3,5 126,5 (32,8 248 (46,1 2,4 (1,4 29 11,1 134,5 (31,8 292,5 (25,8) | 886,7 (99,7 2,2(0,7 86 (11,1 535,5 (20,7 173,5 (52 495,7 (80,9 42 282 (20,2 6,5 (1,9 49 (15,8 12(04) | 000) | 265(6,6 2,8 (0,6
ІЇ0079| В таблиці 4 показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міРНК (приведені у даному документі як ХЕО ІО МО: 32- 38), які вирівнюються з послідовністю КДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮ МО: 18, яка містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого БЕО ІЮО МО: 3. Для зародкової плазми І Н244 сигнали для цих послідовностей что-міРНК у китиці М8-М9 та китиці
М10-М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Для зародкової плазми 010КО2 сигнали для цих послідовностей что-міРНК вище у китиці М10-М12, ніж сигнали для цих послідовностей что-міРНК для китиці У8-М9 або інших зразків тканини.
Таблиця 4
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 18 шк І Нг44 о1оКо2
ЗЕО | М8-М9 китиця М10-М12 Інша тканина | М8-МУ9 китиця М Інша тканина
ІО МО: (5ТОВ) китиця (ЗТОК) (5ТОВ) (5ТОВ) ТОВ (5ТОВ) 376,5 (320,7) | 118 (30,8 7,5 (3,5 516 (307,1 2,8 (0,9 111,5112,6) | 1032,7 (26,8) 1. 17,8 (13,1 4,5 (2,5 648,5 (174,3 848,5(675,3) | 572,7 (211,3 8,510,5 982 (389,9 3,513 437 (370,7 117,7 (22,8 1,6 (0,6 519 (319,2 2,8 (0,5 906,5 (668,2) | 606,7 (231,5 2,2(0,7 15,5(1,5). |1225,5 (480,3 4,3 (1,5 554 (370,7 553 (48,5 1,5 (0,4 9,5 (1,5 12245 (153 3,3 (1,4
Таблиця 4
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 18 шк І Нг44 о1оКо2 768,5 (480,3) | 1442,7 (17,2 1,4 (0,5 8,5 (2,5 1305,5 (10,6
І0080| В таблиці 5 показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міРНК (приведені у даному документі як ХЕО ІО МО: 39- 42), які вирівнюються з послідовністю кКДНК, представленої у даному документі як зЕО ІЮ МО: 18, яка містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого ЗЕО ІЮО МО: 4. Для зародкової плазми І Н2г44 сигнали для послідовностей что-міР НК у китиці М8-М9 та китиці М10-
М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Для зародкової плазми 010КО2 сигнали для послідовностей что-міРНК вище у китиці М10-М12, ніж сигнали для цих послідовностей что-міРНК для китиці М8-МУ або інших зразків тканини.
Результати мікроматричного аналізу, наведені у таблиці 4 та таблиці 5, демонструють, що послідовність КДНК, представлена у даному документі як БЗЕО ІЮ МО: 18 можна використати у якості джерела для конструювання цільових елементів что-міРНК для молекул рекомбінантної
ДНК.
Таблиця 5
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 18 ши І Нг44 о1оКо2
ЗЕО | М8-М9 китиця М10-м12 Інша тканина | М8-М9 китиця М Інша тканина
ІО МО: (5ТОВ) китиця (ЗТОК) (5ТОВ) (5ТОВ) ТОВ (5ТОВ) 442,5 (242,9) того 0,6 (0,2) 16(12и) 15145(525,8)). 1,515) 119 (2 448,7 (125,1 1,5 (0,5 7,5 (0,5 452 (97 2,8 (0,9 185,5(19,7) | 702,7(195,2)| 2 0,9(0,3 752 (225,3 143,5(7,6) | 564,3 (154,3 2,6 (0,8 588 (163,6 5,3 (1,5
І0081| В таблиці б показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міР НК (наведені у даному документі як зЕО ІЮ МО: 43- 46), які вирівнюються з послідовністю кКДНК, представленої у даному документі як зЕО ІЮ МО: 19, яка містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого БЕО ІЮО МО: 5. Для зародкової плазми І Н244 сигнали для послідовностей что-міР НК у китиці М8-М9 та китиці М10-
М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Для зародкової плазми 010КО2 сигнал для послідовностей что-міРНК (5ЕО ІЮ МО: 43-44) вище у китиці М10-М12, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для китиці М8-МУ або інших зразків тканини; та сигнали для послідовностей что-міРНК (ЗЕО ІО МО: 45-46) вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міР НК як у китиці У8-М9, так та у китиці М10-М12 порівняно з іншим зразком тканини.
Таблиця 6
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІЮО МО: 19 ши І Нг44 о1оКо2
ЗЕО ІО | М8-М9 китиця М10-м12 Інша тканина | МВ8-М9 китиця М Інша тканина
МО: (ТОВ) китиця (ЗТОК) (5ТОВ) (5ТОВ) ТОВ (5ТОВ) 52,5(29,8) | 147,3 (13,2 190,5 (2,5 4,3 (2,4 756 (548,5 1340 (75 1,8 (0,5 15,5(1,5) | 1443,5 (85,4 6,3 (1,7 1Щ|7901(18031)19982,3(2999)| 8,2 (5,4 253(11,1) 17195,5(759,1)| 5,8 (41 460 |до (42ав) Б63 8,4 (6,2) оБ2(9и) | 67781242) | 6,8(3,8)
І0082| В таблиці 7 показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міР НК (наведені у даному документі як зЕО ІЮ МО: 47- 52), які вирівнюються з послідовністю КДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮ МО: 19, яка містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого БЕО ІЮО МО: 6. Для зародкової плазми І Н244 сигнали для послідовностей что-міР НК у китиці М8-М9 та китиці М10-
М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Для зародкової плазми 010КО2 сигнали для послідовностей что-міРНК вище у китиці М10-М12, ніж сигнали для цих послідовностей что-міРНК для китиці У8-М9 або інших зразків тканини; сигнали для послідовностей что-міРНК 47 та 5ЕО ІО МО: 48) незначно вище у китиці М8-М9, порівняно з сигналом для цих послідовностей что-міРНК для іншого зразку тканини; сигнал для послідовності что-міРНК (ЗЕО ІО МО: 52) значно вище у китиці М8-МУ9, порівняно з сигналом для цієї послідовності что-міРНК для іншого тканинного зразку та сигнали для послідовностей что- міРНК (ЗЕО ІО МО: 49, 5ЕО ІО МО: 50, та 5ЕО ІЮО МО: 51) не значно відрізняються від сигналу для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Результати мікроматричного аналізу, наведені у таблиці 6 та таблиці 7, демонструють, що послідовність КДНК, представлена у даному документі як БЕО ІЮ МО: 19 можна використати у якості джерела для конструювання цільових елементів что-міРНК для молекул рекомбінантної ДНК.
Таблиця 7
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 19 ши І Нг44 о1оКо2
ЗЕО ІО | М8-МУ9 китиця М10-М12 Інша тканина | М8-МО китиця М Інша тканина
МО: (ТОВ) китиця (ЗТОК) (5ТОВ) (5ТОВ) ТОВ (5ТОВ) 157,5(5,6) | 900,7 (51,8 15,5 (7,4 12,5(1,5). |1051,5 (199,5 221 (106,1). | 720,3 (251,7 4,8 (2,7 9,5 (6,6 470,5 (571 340 (239,4). |1241,7 (105,7)! 16,3 (5,4 57,5 (10,6 867 (117,2 55,3 (11,6 296(228,3) | 722(2872)3 | 0(0) | 5,(5,6 326 (262,6 1,8 (1,8 158 (78,8 287 (46 34,3 (6,5 24,5 (0,5 275,5 (20,7 40 (31 4080(1829,)| (10 Б, (3,5) | 234(11и) |3286,5(33,8)) 35 (2)
Ї0083| В таблиці 8 показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міР НК (наведені у даному документі як зЕО ІЮ МО: 53- 60), які вирівнюються з послідовністю кКДНК, представленої у даному документі як БЗЕО ІЮ МО: 20, яка містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого ЗЕО ІЮО МО: 7. Для обох зародкової плазми І Н244 та 010КО02 сигнали для цих послідовностей что-міР НК у китиці
У8-У9 та китиці М10-М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Результати мікроматричного аналізу, наведені у таблиці 8, демонструють, що послідовність КДНК, представлена у даному документі як БЗЕО ІЮ МО: 20 можна використати у якості джерела для конструювання цільових елементів что-міРНК для молекул рекомбінантної
ДНК.
Зо
Таблиця 8
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 20 ши І Нг44 о1оКо2
ЗЕО ІО | М8-МУ9 китиця М10-М12 Інша тканина | М8-МО китиця М Інша тканина
МО: (ТОВ) китиця (ЗТОК) (5ТОВ) (5ТОВ) ТОВ (5ТОВ) 76,5 (1,5 145 (19,4 2,2 (0,8 1,5 (0,5 100,5 (3,5 172 (21,6 14,2(6,2 56 (22,2 231 (79,8 19,5 (4,7 377,5(60,1) | 581,7 (76,8 1,1 (0,3 73 (10,1 405,5 (3,5 261 (1 692 (59,7 49,5(30,4) | 138,5 (29,8) | 599,5 (41,9 19,3 (4,8 126,5(32,8) | 248 (461 2,4 (1,4 29 (11,1 134,5 (31,8 215,5414,6) | 349 (2941 0,7 (0,3 88,5 (2,5 327 (31,3 789(97) |1262,7(169,2)|. 41 (2,6 202 (24,2). | 811,5 (115,7 0,3 (0,3
Таблиця 8
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 20 ши І Нг44 о1оКо2 60 | 141,5(9,6) | 265,7 (30,1 5,8 (1,2 75,5 (5,6 303 (37,4 9,3 (1,8
І(0084| В таблиці 9 показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міРНК (наведені у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 61- 69), які вирівнюються з послідовністю кКДНК, представленої у даному документі як зЕО ІЮ МО: 21, яка містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого ЗЕО ІЮО МО: 8. Для обох зародкової плазми І Н244 та О10КО2 сигнали для послідовностей что-міР НК у китиці М8-М9 та китиці М10-М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини. Результати мікроматричного аналізу, наведені у таблиці 9, демонструють, що послідовність КДНК, представлена у даному документі як 5ЕО ІЮО МО: 21 можна використати у якості джерела для конструювання цільових елементів что-міРНК для молекул рекомбінантної
ДНК.
Таблиця 9
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 21 в І Нг44 о1оКо2
ЗЕО ІЮ |МУ8-М9 китиця китиця. Інша тканина | М8-М9 китиця китиця. Інша тканина
МО: (ТОВ) стоВ (5ТОВ) (5ТОВ) стоВ (5ТОВ) 850,5 (8,6). | 334,7 (222,3 9,4 (3,4 461 (154,6 454 (1 44,5 (5,6 11,3 (3,9 1,8 (0,7 13,5 (5,6 15,5 (6,6 34,5 (4,5 117 (22 14,5(1,5 1,5(0,5 23 (В 13,7 (4,6 13,5 (13,6 1,3 (0,9 811,5 (169,2) | 260,3 (103,2 5,8 (2,7 444,5 (4,5 454,5 (45 12 (8,4 66 | 199,5 (54 48 (20,6 1,9 (0,7 61 (44,4 55,5 (34,9 2,8 (1,8 216 (18,2 62 (16,6 123,5 (0,5 107 (17,2 4,3 (2,6 68 | 265(86,9 85,3 (204 98 (62,6 96 (56,6 2,5 (2,2 69 | 516(82,8 185 (82,1 11,2 (41 309,5 (19,7) | 282,5 (2,5 9,8 (5,5
І0085| В таблиці 10 показані результати відносного мікроматричного сигналу для репрезентативних послідовностей что-міР НК (наведені у даному документі як зЕО ІЮ МО: 70- 87), які вирівнюються з послідовністю КДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮ МО: 22, яка містить послідовність цільового елементу что-міРНК, представленого 5ЕО ІЮО МО: 9. Для зародкової плазми І Н244 сигнали для послідовностей что-міРНК (5ЕО ІЮ МО: 70, 71, 73, 75-81, 83-87) у китиці М8-М9 та китиці М10-М12 вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міРНК для інших зразків тканини; та сигнали для послідовностей что-міРНК (ЗЕО ІО МО: 72, 74, 82) у іншій тканині було вище, ніж сигнал для цих послідовностей что-міР НК у рівній мірі у китиці М8-МОУ або китиці М10-М12. Для зародкової плазми 010КО2 сигнали для послідовностей что-міР НК (ЗЕО ІЮ
МО: 70-87) вище у китиці М10-М12, ніж сигнал для цих послідовностей что-міР НК у китиці М8-М9 або у інших зразках тканини. Результати мікроматричного аналізу, наведені у таблиці 10, демонструють, що послідовність КДНК, представлена у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 22 можна використати у якості джерела для конструювання цільових елементів что-міРНК для молекул рекомбінантної ДНК.
Таблиця 10
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 22 ши І Нг44 о1оКо2
ЗЕО ІД М8-М9 китиця М10-М12 Інша тканина | М8-МО китиця М Інша тканина
МО: (5ТОВ) китиця (ЗТОК) (5ТОВ) (5ТОВ) ТОВ (5ТОВ) 56,5(23,7) | 694 (256,9 1,8 (0,4 873 (308,1
Таблиця 10
Результати аналізу мікрочипів для КДНК ЗЕО ІО МО: 22 1 щнея4 71711111 олокогСССсСсС 80 | 138(83,8) | 383,3(44,6) | 0,7(0,39) | 25(1,5) | 230(43,4) | 0,5(0,5) 81 | 20701131) | 4703(5523| 16011) | 103 | з2го(697) | 0(0) 84 | 1305) | з57(т7и) | 440,5) | 00) | госпо) | 1045 86 | 173,5(621) |241,7(1012)| 24(0,7) | 30) | 2565(7,6) | з3(09) (0086) Ці аналізи підтвердили, що шість послідовностей КДНК (5ЕО ІО МО: 17-22) були багаті послідовностями мішеней что-міРНК та що відповідна что-міРНК продемонструвала високу специфічність для китиці. Таким чином, ці послідовності КДНК містять послідовності, які можна використати за допомогою методів молекулярної біології для створення молекул рекомбінантної ДНК, які містять цільові елементи что-міРНК, які можуть забезпечувати опосередкований через что-міР НК сайленсинг трансгена.
І0087| Аналіз відповідної геномної послідовності, що містить цільові елементи что-міР НК, проводили для тридцяти двох різних зародкових плазм кукурудзи (з відносною зрілістю (КМ) в межах від 80 до 120 днів), зазвичай які використовуються у якості жіночої рослини у гібридному схрещуванні для підтвердження присутність та будь-якого зміни послідовності цільових елементів что-міРНК. Для цільових елементів что-міРНК, представлених як 5ЕО ІЮО МО: 1 та
ЗЕО ІЮ МО: 2, три набори пар праймерів для термічної ампліфікації були сконструйовані, щоб ампліфікувати відповідну послідовність в межах послідовності КДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮ МО: 17. Ці праймери використовували для отримання ПЦР-амплікону у геномної ДНК, виділеної з тканини кожної зародкової плазми. Амплікони були отримані зі всіх тестованих зародкових плазм. Послідовність амплікону через тридцять дві зародкові плазми була або на 10095 ідентична послідовності цільового елементу что-міРНК, або містила мінімальну кількість однонуклеотидних поліморфізмів (до 9595 ідентичних). Ці дані демонструють, що трансгенні рослини, отримані з рекомбінантної ДНК-конструкцією, що містить трансген, який кодує рекомбінантний білок, функціонально пов'язаний з цільовим елементом что-міРНК, представленій як ЗЕО ІО МО: 1 або 5Е6О ІЮО МО: 2 мала би чоловічу тканинну специфічну регуляцію експресії рекомбінантного білку у більшості зародкових плазм кукурудзи.
Якщо трансген кодує рекомбінантний білок, який надає гліфосатну толерантність, тоді у китиць більшості із зародкових плазм кукурудзи буде гліфосат-індукована чоловіча стерильність.
Приклад 2: Рекомбінантні ДНК-конструкції та вектори трансформації рослин (0088) Рекомбінантні ДНК-конструкції та вектори трансформації рослин були створені з використанням послідовностей ДНК, відповідних ділянкам шести послідовностей кДНК, ідентифікованих як багаті послідовностями мішеней что-міР НК. Конструкції рекомбінантної ДНК
Зо та вектори трансформації рослин були сконструйовані так, щоб бути використаними для отримання трансгенних рослин, у яких специфічний для китиць сайленсинг трансгена, функціонально пов'язаного з цільовим елементом что-міРНК, відбувався би через что-міР НК- опосредований сайленсинг. 0089) Дев'ять цільових елементів что-міРНК були розроблені з використанням результатів аналізу шести послідовностей КДНК. Кожний цільовий елемент что-міРНК був сконструйований так, щоб мати послідовність ДНК, що містить велику кількість послідовностей, що перекриваються, мішеней что-міР НК, до яких може зв'язуватись різна что-міР НК. Послідовність цільового елементу что-міРНК, представлена у даному документі як ЗЕО ІО МО: 1, має 95 95 ідентичності послідовності з нуклеотидним положенням від 1429 до 1628 послідовності кКДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮ МО: 17. Послідовність цільового елементу что- міРНК, представлена у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 2 має заміну одного нуклеотиду (Т69А) відносно ЗЕО ІЮО МО: 1. Послідовність цільового елементу что-міРНК, представлена у даному документі як зЕО ІЮО МО: З відповідає нуклеотидному положенню 239-443 послідовності кДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮ МО: 18. Послідовність цільового елементу что- міРНК, представлена у даному документі як ЗЕО ІО МО: 4 відповідає нуклеотидному положенню 477-697 послідовності КДНК, представленої у даному документі як ЗЕО ІО МО: 18. Послідовність цільового елементу что-міРНК, представлена у даному документі як зЕО ІО МО: 5 відповідає нуклеотидному положенню 239-443 послідовності КДНК, представленої у даному документі як
ЗЕО ІЮО МО: 19. Послідовність цільового елементу что-міР НК, представлена у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: б відповідає нуклеотидному положенню 370-477 послідовності кДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮ МО: 19. Послідовність цільового елементу что- міРНК, представлена у даному документі як ЗЕО ІО МО: 7 відповідає нуклеотидному положенню 1357-1562 послідовності КДНК, представленої у даному документі як 5ЕБЕО ІЮО МО: 20.
Послідовність цільового елементу что-міР НК, представлена у даному документі як ЗЕО ІО МО: 8 відповідає нуклеотидному положенню 247-441 послідовності КДНК, представленої у даному документі як ЗЕО ІЮ МО: 21. Обернено комплементарний ланцюг послідовності цільового елементу что-міРНК, представленого ЗЕО ІЮ МО: 9, має 99 95 ідентичності послідовності з нуклеотидним положенням від 191 до 490 послідовності КДНК, представленої у даному документі як БЕО ІЮО МО: 22 з трьома нуклеотидними неспівпадіннями (С314А, АЗ50О та 5408А)
ЗЕО ІЮ МО: 22 відносно послідовності оберненого комплементарного ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 9.
Додаткові цільові елементи что-міРНК можуть бути створені шляхом комбінування послідовностей ДНК різних цільових елементів что-міРНК або фрагментів з двох або більше ділянок КДНК, багатих мішенню что-міРНК, таким шляхом як комбінування всіх або фрагментів двох або більше цільових елементів что-міРНК, представлених у даному документі як ХЕО ІЮ
МО: 1-9, та/або однієї або декількох послідовностей что-міРНК, представленими у даному документі як БЕО ІЮ МО: 23-92. Різні фрагменти цих цільових елементів что-мРНК довжиною від
Зо 21 до 170 нуклеотидів були комбіновані та були отримані нові цільові елементи что-міРНК з використанням способів синтезу ДНК, відомих у даній області, та представлені у вигляді ЗЕО ІЮ
МО: 10-16. (0090) Цільові елементи что-міРНК були субклоновані у конструкції рекомбінантної ДНК з цільовим елементом что-міРНК, функціонально пов'язаним з 3'-кінцем відкритої рамки зчитування гену ср4-ерер5 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 93), який кодує білок СР4-ЕРЗР5 для стійкості гліфосату та 5" до функціонально пов'язаної 3'-нетранслюючої ділянки (3'-0ТК). Рекомбінантні
ДНК-конструкції також містять функціонально пов'язані комбінації однієї з трьох комбінацій промотору/інтрону/енхансеру та послідовності транзитного пептиду хлоропласту. Конфігурації експресійної касети містяться у векторах трансформації для перевірки ефективності мішені что- міРНК.
Приклад 3: Тестування трансформації рослин та ефективності
ІЇ0091| Трансформаційні вектори, що містять рекомбінантні ДНК-конструкції, використовували з методом трансформації на основі Адгобасіегішт та незрілими ембріонами кукурудзи та методами, відомими у даній області. Збирали зразки листків рослин КО та проводили молекулярний аналіз для відбору трансгенних рослин, що містять єдину копію (одну вставку) або подвійну копію (дві незалежні вставки) рекомбінантної ДНК-конструкції та без векторної основи. Трансформанти з однократною копією не були обприскані гліфосатом та були самозапилені та просунулись для збору насіння КІ, у той час як трансформанти з подвійною копією використовувались для розприскування гліфосатом КО для оцінки вегетативної стійкості та індукованої чоловічої стерильності. Трансгенні рослини, які не були оприскані гліфосатом, мали нормальне цвітіння, нормальне скидання пилку та нормальний розвиток пилку, яке визначалось фарбуванням Аїехапааг та мікроскопічним спостереженням.
І0092| Трансформанти КО з подвійною копією використовували при тестуванні, щоб наблизитися до гомозиготного трансформанта з однієї копією. Рослини обприскували гліфосатом на двох різних етапах росту, щоб визначити, чи забезпечує присутність цільового елементу что-міРНК у конструкції рекомбінантної ДНК вегетативну гліфосатну стійкість та індуковану гліфосатом стерильність китиць. Рослини обприскували у теплиці з 1Х гліфосатом (0,75 фунти к.е./акр(0,84 кг к.е./га, к.е. - кислотний еквівалент)), який застосовували на етапі М5, з наступним додаванням 1Х гліфосату (0,75 фунти к.е./акр (0,84 кг к.е./га)), який застосовували бо на етапі М8. Через сім днів після застосування гліфосату на етапі М5 рослини були оцінені по вегетативному пошкодженню з оцінкою «10 95 травми, що вважається свідченням вегетативної стійкості до гліфосату (96 вегетативної толерантності). Чоловіча стерильність вимірювалась двома способами. Рослини, які демонстрували вегетативну стійкість до гліфосату, були оцінені після застосування гліфосату на етапі М8 для повноїгліфосат-індукованої чоловічої стерильності, виміряної як відсутність екструзії пильника на етапі 590-412 (90 Повної чоловічої стерильності). Потім пильники збирали та розсікали для мікроскопічного спостереження за розвитком пилку. Пильники для кожного трансформанта тестували на відсутність життєздатних пилкових зерен, отриманих як виявлено фарбуванням АІехапдаг под мікроскопічним спостереженням, та оцінювались як не продукуючі життєздатного пилку (96 Без пилку). В рослинах, не обприсканих гліфосатом, розвиток китиць, екструзія пильників та розвиток пилку були нормальними.
І0093| Цільові елементи что-міРНК були випробувані у декількох конфігураціях вектору трансформації. Кожний вектор трансформації використовували для отримання декількох рослин КО з кожною рослиною КО, яка являла собою унікальний трансгенний об'єкт, створений з використанням того ж вектора трансформації. Дані для трьох різних конфігурацій векторів трансформації представлені у Таблицях 11 та 12. (0094) Цільові елементи дванадцяти что-міРНК тестували у першій векторній конфігурації (А) з результатами, показаними у таблиці 11. Дивно, що процент рослин, які демонструють вегетативну толерантність до гліфосату, варіював від 80 до 100 95, але процентна доля, яка демонструвала повну індуковану гліфосатом чоловічу стерильність (індукована чоловіча стерильність, включала як нежиттєздатний пилок, так і відсутність продукування пилку) коливалась від 0 до 100 95. Див. Таблицю 11. Наприклад, рослини, отримані з використанням вектору трансформації, що містить цільовий елемент что-міР НК, який кодується БЕО ІЮО МО: 13,
ЗЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІО МО: 15 мали високі показники, які були свідченням вегетативної стійкості до гліфосату (в межах від 90 до 100 95 тестованих рослин), але у жодного з трансгенних об'єктів не було виявлено повної індукованої гліфосатом чоловічої стерильності; рослини, отримані з використанням вектора трансформації, що містить цільовий елемент что- міРНК, який кодується 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕБО ІО МО: 9 мали високі показники, які були свідченням вегетативної стійкості до гліфосату (від 90 до 100 95 тестованих рослин) та помірні
Зо показники, які демонструють чоловічу стерильність, викликану гліфосатом (в межах від 50 до 40 956 тестованих рослин); та рослини, отримані з використанням вектора трансформації, що містить цільовий елемент что-міРНК, закодований 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІЮ МО: 8 мали високі показники, які вказують на вегетативну стійкість до гліфосату (в межах від 88 до 10095 тестованих рослин) та високі показники, які демонструють чоловічу стерильність, викликану гліфосатом (82-100 95 тестованих рослин). Розвиток пилку оцінювали по фарбуванню
АІехапааг. Було виявлено, що рослини, що містять чотири трансформанта, виконані з вектором трансформації, що містять цільовий елемент что-міР НК, представлений у вигляді 5ЕО ІЮ МО: 2, та оприскані гліфосатом для індукування чоловічої стерильності, мають дуже мало абортованих зерен пилку або у них не було виявлено пилкових зерен. Рослини, які не отримували гліфосат, мали нормальний пилок. Див. Фіг. 4.
Таблиця 11
Оцінка рослин КО
МО: вектора й стійкості стерильності пилку рослин 73 | А 7777107 17777790 17711110 10 4 | А 717177 2 щЩ | 86 | 7 | 0 5 | А ЇЇ 70790 2 | ющ 50 | 0 6 | А ! щ9 | 9 | 8 | 0 77 | 777 А 71777717 9 71788 |. 700 | 44 78 ГА 77 Ї77771771о07 Ї77771179077711717717111700 1150 79 | А Щ(! 70 | 700 | 4 | 0 13 | А 7 17777117 17711170 Ї7771711101117ї10 14 | А 7 Ї77777ло | 901 17111010 15 | А |! ло | 9 | 0 | 0 16 | А ! ло | 80 | 5 |! 0
І0095| Чотири інших цільових елементи что-міРНК були випробувані у другій та третій векторній конфігурації (В та С відповідно) з результатами, показаними у таблиці 12. Різниця як у процентах рослин, які демонструють вегетативну стійкість до гліфосата, так і у процентах, які демонструють повну чоловічу стерильність, викликану гліфосатом, спостерігались між двома векторними конфігураціями. Векторна конфігурація В забезпечувала підвищений процент рослин, які демонструють вегетативну стійкість до гліфосату для всіх тестованих цільових елементів что-міРНК. Для проценту, який демонструє повну гліфосат-індуковану чоловічу стерильність, два протестованих цільових елементи что-міРНК (ЗЕО ІО МО: 10 та 5ЕО ІО МО: 11) краще виконувались у векторної конфігурації С, один з цільових елементів что-міРНК (ЗЕО
ІО МО: 12) краще виконувався у векторної конфігурації В, та один з цільових елементів что- міРНК (ЗЕО ІО МО: 1) забезпечив100 95 повну гліфосат-індуковану чоловічу стерильність у обох конфігураціях В та С.
Таблиця 12
Оцінка рослин КО сереши век рчкшяе ЕЕ Ген , в : чоловічої Фо Без пилку
МО: вектора рослини стійкості . стерильності 171777в'7 17711179 111117167 1777100 77710011 70 ЇЇ 7в'/ 77777707 1777117901771111155...ЙЮДЩДЙ | щ 22 71в'/17171111121117111111ло0 11111150 1101 712 | В | 70 ! л00 | 50 | 20 Ф НН) 17177713 171111381111111711111л1оо 17111161 70 Її с 716 ЇЇ 83 | 100 | 0 " 71с111171111111917111111155 17777780 11 южщЮ0 712 | с 715 Її 87 1 28 | 0
І0096| З рослин, які демонструють вегетативну стійкість до гліфосату, процент рослин з індукованою гліфосатом чоловічої стерильністю без життєздатного пилку складав від 0 до 100 95. Для рослин, отриманих з використанням вектора трансформації, у якого було більш бО бо тестованих рослин, які демонструють вегетативну стійкість до гліфосату та повну, викликану гліфосатом, чоловічу стерильність, процент рослин, у яких немає життєздатного пилку, складав від 0 до 100 95. Два цільових елементи что-міРНК (5ЕО ІЮ МО: 1 у векторній конфігурації В та 5ЕО ІЮО МО: 2 у векторній конфігурації А) мали відповідно 100 95 та 82 95 нежиттєздатного пилку. Ці два цільових елементи что-міРНК (5ЕО ІЮ МО: 1 та 5ЕО ІО МО: 2) відрізняються на один нуклеотид та отримані з однієї й тієї ж послідовності КДНК (ЗЕО ІЮ МО: 17).
Приклад 4. Імунолокалізація білку СР4А-ЕРЗРЗ5 у китиці
І0097| Імунолокалізація білюу СР4А-ЕРЗР5З у китиці трансгенних рослин використовувалась для аналізу експресії білку на рівні клітин та тканин, щоб підтвердити втрату експресії білку
СРА-ЕРБРЗ у пилку через присутність функціонально пов'язаного цільового елементу что-
Зо міРнНК. КЗ покоління трансгенних рослин, що містять трансген ср4-ерзр5, функціонально пов'язаний з 5ЕО ІЮ МО: 1 або у якості контролю трансген ср4-ерзр5 без функціонально пов'язаного цільового елементу что-міРНК вирощували у теплиці. Рослини обприскували 1Х гліфосатом (0,75 фунти к.е./акр (0,84 кг к.е./га)) на етапі М2 для підтвердження вегетативної стійкості. Китиці розміром від 1 см до 17 см збирали на етапах У8-М12, коли тканина пильника знаходилась у материнській клітині мікроспорі та на етапах вільної мікроспори. Пильники видаляли з колоску китиці з використанням розсікаючи щипців та одразу фіксували у 3,7 Фо формальдегіду у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5) у м'якому вакуумі.
Після промивки у РВ5 тканини поміщали у середовище для заливки та негайно заморожували.
Заморожені тканинні блоки зберігали при -80 "С до тих пір, поки вони не розділялись на зрізи у мікротомі -20 "С та не збирались на заряжених слайдах. 0098) Зрізи тканин блокували блокуючим агентом (10 95 нормальної козячої сиворотки, 5 95 альбуміну бичачої сиворотки, 0,1 95 Тийоп Х-100 у РВ5) протягом двох годин. Зрізи інкубували з анти-СР4А-ЕРБРБ5 антитілом (1/500 у РВ5). Після промивки зрізів три рази у РВ5 зрізи тканин інкубували з вторинним антитілом, козячим антимишачим Ідс, кон'югованим з Аїеха Ріоиге 488 (Іпийгодеп, Юджин, Орегон). Негативний контроль був приготований шляхом виключення інкубації антитіл СРА-ЕРБР5. Як первинні, так і вторинні антитіла інкубували при кімнатній температурі протягом двох-чотирьох годин, а потім додатково інкубували протягом ночі при 4 "С. Після промивання тканини були візуалізовані за допомогою конфокального мікроскопу з використанням лазерного скануючого мікроскопу 7еї55 (І ЗМ) 510 МЕТА з використанням 488 нм лазера для збудження та 500-550 нм (зелений канал) для набору фільтрів емісії. Один і той самий параметр зображення використовували у всіх зразках, включаючи контролі.
Люмінісцентні та яскраві зображення полів були відскановані з кожного зрізу та потім об'єднані з використанням програмного забезпечення І ЗМ для відображення структурної інформації. Дані для негативних контролів продемонстрували очікувану відсутність сигналу. Дані для трансгенних рослин, що містять трансген ср4-ерзр5, функціонально пов'язаний з ЗЕО ІЮО МО: 1 продемонстрували низький сигнал флуоресценції, який вказує на низьку експресію білку СР4-
ЕРБЗРЗ у стінці пильника, тапетумі та розвиток мікроспор пилку пильника. Дані для контрольних трансгенних рослин (ті, які містять трансген ср4-ерзр5 без функціонально пов'язаного цільового елементу что-міРНК) показали високий сигнал флуоресценції, який вказує на високу експресію білку СР4А-ЕРБРЗ у стінці пильника, тапетумі та розвиток мікроспор пилку пильника.
ІЇ0099| Зниження експресії білью»лу СРА-ЕРБРО у пилку у рослин, що містять трансген ср4- ерзр5, функціонально пов'язаний з цільовим елементом что-міРНК, представленим як 5ЕО ІЮ
МО: 1 корелює з спостереженою повною гліфосат-індукованою чоловічою стерильністю на цих рослинах. Ці дані підтверджують, що спостережена повна гліфосат-індукована чоловіча стерильність є результатом втрати експресії білюу СР4-ЕРЗР5 у пилку через присутність функціонально пов'язаного цільового елементу что-міР НК, представленого 5ЕО ІЮО МО: 1.
Приклад 5. Польові випробування
І00100| Для оптимального використання при отриманні гібридів бажано мати дуже низьку екструзію пильників у польових умовах після застосування гербіциду у поєднанні з вегетативною стійкістю до гербіцидів (що вимірюється низьким врожаєм сільськогосподарських культур). Інші аспекти отримання гібридної кукурудзи також можуть бути бажаними, такі як висота та врожайність рослин. Щоб оцінити це, трансгенні рослини, що містять трансген ср4- ерзр5, оперативно пов'язаний з цільовим елементом что-міРНК, були протестовані на просунутих поколіннях у польових умовах та були виміряні декілька параметрів.
Зо ІЇ00101| Польові випробування рослин покоління КЗ, що містять трансген ср4-ерзрв, функціонально пов'язаний з цільовим елементом что-міРНК, представленим як 5ЗЕО ІЮ МО: 1 були проведені у декількох місцях для оцінки вегетативної стійкості до гліфосату та специфічної для китиці чутливості до гліфосату. У польових випробуваннях були випробувані рослини покоління КЗ, що містять одну й ту саме трансгенну вставку у різних геномних місцях.
Випробувані рослини містили одну копію одного з чотирьох унікальних трансгенних об'єктів, створених з використанням того ж вектора трансформації рослин, який містить трансген ср4- ерзр5, функціонально пов'язаний з цільовим елементом что-міРНК, представленим як 5ЕО ІЮ
МО: 1. Випробування проводились з використанням рандомізованої повної блокової розробки.
Велика кількість показників ефективності та агрономічних параметрів були оцінені протягом всього сезону польових випробувань, та у кінці сезону була визначена врожайність. Польові випробування для оцінки ефективності проводились шляхом застосування гербіциду гліфосату при 0,75 фунти к.е./акр (0,84 кг к.е./га) на етапі М7, потім 0,75 фунти к.е./акр (0,84 кг к.е./га) на етапі МО та оцінки процентного співвідношення урожаю на етапі МТ (СІРМТ), середнього проценту екструзії пильників на етапі 590-8 (АЕБОЕ) та врожайності (що вимірювалась у бушелях на акр (бу/акр)) у кінці сезону. Польові випробування включали стійкий до гліфосату трансгенний об'єкт МКбОЗ (номер депозиту АТСС РТА-24780) у якості негативного контролю для викликаної гліфосатом чоловічої стерильності та у якості позитивного контролю для вегетативної стійкості до гліфосату. Рослини, що містять трансформант МКбО3З, демонструють вегетативну стійкість до гліфосату на комерційному рівні та забезпечують повністю стійку китицю до гліфосату. Всі дані були піддані аналізу дисперсії та середньому (50), розділеному при р «0,05.
Таблиця 13
Результати ефективності властивостей для польових випробувань з рослинами, що містять 5БЕО ІЮ МО: 1 о Трансформанті! | 725 | 0 о Трансформант3 | 0 2 | 400
Трансформант4 | 0 2 ЮБКк| 1775
І00102| Середній врожай на етапі МТ для контрольних рослин, що містять трансформант
МКбО3, складав 1,25. Середній врожай для рослин, що містять трансформант 1, трансформант 2, трансформант З та трансформант 4, складав 1,25, 3,75, 0 та 0 відповідно. Найменш значима різниця у врожаї (150) при 0,05 була 10,25 для всіх провірених трансформантів. Ці результати демонструють, що рослини, що містять чотири трансгенних об'єкти, що містять цільовий елемент что-міРНК 5ЕО ІО МО: 1 мали від нульового до дуже низького вегетативного пошкодження з застосуванням 0,75 фунти к.е./акр (0,84 кг к.е./га) гліфросату у М7, потім МУ, аналогічно контрольним рослинам, що містять трансформант МКбО3.
І00103| Середня екструзія пильників на етапі 590-8 для контрольних рослин, що містять трансформант МКбОЗ, складала 95. Середня екструзія пильника на 590-8 для рослин, що містять трансформант 1, трансформант 2, трансформант З та трансформант 4, складала 0, 3,25, 4 та 1,75 відповідно. Середня екструзія пильника при 590-8 І 50 при 0,05 склала 42,71 для всіх тестованих трансформантів. Ці результати демонструють, що рослини, що містять чотири трансгенних об'єкти, що містять цільовий елемент что-міРНК ЗЕО ІЮО МО: 1 мали нульову або дуже низьку екструзію пильника із застосуванням 0,75 фунти к.е./акр (0,84 кг к.е./га) гліфосату у М7, за яким слідує МОУ, на відміну від контрольних рослин, що містять трансформант
МКбО3, які були чоловічими повністю фертильними, після застосування гліфосата.
Ї00104| В кінці сезону кукурудзу збирали з цих польових випробувань та визначали врожайність. Середня врожайність для контрольних рослин, що містять трансформант МКбОЗ, склала 96,74 бу/акр (6,06 т/га). Середня врожайність для рослин, що містять трансформант 1, трансформант 2, трансформант З та трансформант 4, склала 102,17 бу/акр (6,40 т/га), 96,48 бу/акр (6,05 т/га), 97,59 бу/акр (6,12 т/га) та 95,8 бу/акр (6,00 т/га) відповідно. Врожай І 50 при 0,05 склав 26,25 бу/акр (1,65 т/га) для всіх протестованих трансформантів. Див. Таблицю 14. Ці результати демонструють, що рослини, що містять чотири трансгенних об'єкти, що містять цільовий елемент что-міРНК 5ЕО ІО МО: 1 мали паритет врожайності з МКбО03.
Таблиця 14
Результати врожайності для польових випробувань з рослинами, що містять ЗЕО ІЮ
МО: 1
Середня врожайність (ушельтак (па)
Зо 00105) Польові випробування інбредних рослин К2 або більш високих поколінь, що містять трансген ср4-ерзр5, функціонально пов'язаний з різними цільовими елементами что-міРНК, проводились у декількох місцях для оцінки вегетативної стійкості до гліфосату та специфічної для китиці чутливості до гліфосату. У польових випробуваннях тестувались інбредні рослини К2 або більш високого покоління, що містять єдину копію трансгену ср4-ерзр5, функціонально пов'язаного з цільовим елементом что-міРНК ЗЕО ІО МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5, 5ЕО
ІО МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІЮ МО: 8, кожний у конфігурації А вектора трансформації. випробування проводились з використанням групового блоку з коефіцієнтом групування, який є або вектором трансформації, або групою векторів специфічної для китиці чутливості до гліфосату, якщо номери трансформантів для конкретного вектору трансформації були низькими. Велика кількість показників ефективності та агрономічних параметрів були оцінені протягом всього сезону польових випробувань, та у кінці сезону була визначена врожайність.
Польові випробування для оцінки ефективності проводились шляхом застосування гліфосату на 1,5 фунти к.е./акр (1,68 кг к.е./га), нанесеного на кукурудзу на етапі М2 з наступним гліфосатом при 0,75 фунти к.е/акр (0,84 кг к.е/га), нанесеного на кукурудзу при М8 (875 днів зі збільшенням), а потім гліфосат при 0,75 фунти к.е./акр (0,84 кг к.е./га), який застосовувався до
М10 кукурудзи (1025 днів росту). Оцінки процентного коефіцієнту врожаю на етапі МТ (СІРМТ), середній процент екструзії пильників на етапі 590-8 (АЕ5О90-8), середня висота рослини (в дюймах) та врожайність (що вимірюється у бушелях на акр (бу/акр)) у кінці сезону. Польові випробування включали стійкий до гліфосату трансгенний об'єкт МКбОЗ у якості негативного контролю для гліфосат-індукованої чоловічої стерильності та у якості позитивного контролю для вегетативної стійкості до гліфосату. Стійку до гліфосату суміш чоловічих опилювачів, яка складається з трьох гібридних основ зародкової плазми, поміщали на кожну третю ділянку та оточували все випробуване, щоб служити джерелом пилку для тестових записів. Обробку гербіцидами застосовували з використанням рюкзака СО2 або розприскувача, встановленого на тракторі, який був відкалібрований для доставки 15 галонів (57 літрів) на акр (0,4 га) (СРА) з використанням вдуваючих форсунок Тее)екю ТТІ (Теєуеї ТесппоЇодіє5, Спрингфілд, Ілінойс) з водою у якості носія гербіциду. Всі дані були піддані аналізу дисперсії та середньому (І 50), розділеному при р «0,05. Результати наведені у таблиці 15. 00106) Ніяких суттєвих розбіжностей у процентах врожаю при МТ (СІРМТ) або середньої висоти рослини порівняно з контролем МКбОЗ не спостерігалось для тестованих рослин, що містять цільовий елемент что-міРНК ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5, БЕО ІЮ МО: 6,
ЗЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІЮ МО: 8. Рослини, що містять цільовий елемент что-міРНК ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 6 або 5ЕО ІЮО МО: 7 також не мали значного зниження врожайності насіння порівняно з контролем МКбО03. Рослини, що містять цільовий елемент что-міРНК 5ЕО ІЮ
Зо МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 7 мали дуже низьку або не мали взагалі екструзію пильника з АЕ590ж8 значеннями 0-2.75 95 та 0-1.5 95, відповідно. Рослини, що містять цільовий елемент что-міРНК
ЗЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО ІО МО: 5, ЗЕО ІЮО МО: 6 або 5ЕО І МО: 8 мали значно зменшену екструзію пильників порівняно з контрольними рослинними, причому значення АЕ5З90-8 варіювали від 10 95 до 25 9».
Таблиця 15
Різні что-міР НК у тій самій конфігурації А вектора трансформації
Врожайність Середня висота
ЕО ІЮ МО: Ж протестованих СІРМТ АЕБЗ90-8 насіння бу/ рослини (дюйми : п улакр об'єктів (50-81) (50-10) (т/га) (80-24 7) (метри)) ' І 50-6,9 11171778 111100 25-6б2595| 0-275965 |97-99(608-621)| 8475(215) 7776. 7 | 3756 | 2596 | л20(752) | В8гл(гов) 28771117 Ї7717171112 11111 | 252 0П5Б-17,859680-90(502-5,64)| 801(203) Щ
Приклад 6. Отримання гібридного насіння
І00107| Трансгенні рослини та насіння по винаходу можуть бути використані для цілей розведення, у тому числі для отримання гібридного насіння. Трансгенні рослини кукурудзи, що містять рекомбінантну конструкцію ДНК, що містить трансген, який кодує гліфосат-толерантний
ЕРБРО-білок, функціонально пов'язаний з цільовим елементом что-міРНК, висаджують у області, такій як відрите поле. Інша батьківська рослина (рослини) кукурудзи може знаходитись або не знаходитись у одній й тій самій області. Для боротьби із бур'янами при отриманні насіння гліфосат може бути нанесений на трансгенні рослини кукурудзи на вегетативних етапах, як вказано на етикетках сільськогосподарських продуктів Коипаире). 00108) Отримання гібридного насіння може бути проведено шляхом застосування гліфосату до трансгенних рослин кукурудзи (жіноча рослина), починаючи безпосередньо перед або під час розвитку китиці на етапах вегетативного росту кукурудзи від 7 до М13. Застосування гліфосату викликає індукований чоловічий стерильний фенотип через тканинно-селективну стійкість до гліфосату у трансгенних рослинах кукурудзи. Індуковані чоловічі стерильні трансгенні рослини кукурудзи можуть бути запилені іншими рослинами-донорами пилку (чоловіча рослина), в результаті чого життєздатне гібридне насіння кукурудзи переносить конструкцію рекомбінантної
ДНК для тканинно-селективної стійкості до гліфосату. Рослини-донори пилку можуть бути присутніми або не присутніми у одній й тій самій області та можуть бути або не бути трансгенними рослинами кукурудзи. Запилення може бути здійснено будь-якими способами, відомими у даній області, у тому числі шляхом близького розміщення рослин або шляхом запилення вручну. Гібридне насіння збирають з трансгенних рослин кукурудзи. 00109) Ілюструючи та описуючи принципи даного винаходу, спеціалістам у даній області техніки повинно бути очевидно, що винахід може бути модифіковано при компоновці та деталізації без відходу від таких принципів. Ми заявляємо всі зміни, які знаходяться в межах сутності та об'єму доданої формули винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Мопвапро Тесппо1іоду ІІС «1205 СПОСОБИ ТА КОМПОЗИЦІЇ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОЇ РЕГУЛЯЦІЇ ЕКСПРЕСІЇ БІЛКІВ «1305 МОоМ85:392М0 «1505 62/195,546 «1515 2015-07-22
Зо «1605 93 «1705 РабепесІпПп версії 3.5 «2105 1 «2115 201 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 1 ачасчдасдас сдєдсаєдуадє даєдааєсас адасдасдаа сасадсаєдеЕс дсаєсассає бо ссссЕссдса сСсасасадса Ссассссссс сдссссасса сссссссдад саассассда 120 ссаасаасас саассаєссаа ссісссссдс сдссдссдсс сссассддєсс сссссосаса 180 ссабадаасе дсаааєдесс д 201 «2105 Ж «2115 201 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність бо «4005 2 ачасчдасдас сдєдсаєдуадє даєдааєсас адасдасдаа сасадсаєдеЕс дсаєсассає бо сссссссдаа Ссасасадса Ссассссссс сдссссасса сссссссдад саассассда 120 ссаасаасас саассаєсаа ссссссссуєЄ сдссдссудсс ЄсСсассддрсс Ессссесаса 180 ссаєадаасе дсаааєдєсс д 201 «2105 З «2115 195 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 З
Есгадссаса суддссасдєє Содасчдасса агбгаасаддсеє Єдсаасссеєс сааасєдеєвЧе бо ссаєсадссе сссаасудєдс абаєссдссає сссстгусеЕеєс деЕдссссаєсд ссассассеос 120 сасссеЕсєссеЕ сссвасаєдс аасдсаааса аадсадаєсс аасдєодаєд аддачедааєс 180 зчзчаєдеЕєсдад чЕдад 195 «2105 4 «2115 221 «2125 ДНК «213» йеа шаув
Зо «4005 4 асчадоаоадаає деЕСсаєєдуадєс даєчдчадссда аддсдссааа Сдсадасааа дссасаассс бо ссаєсдсддад даєсдассдсуд асдссдсддс адасессаєсс астасадесда дадестаддва 120 аадсаєдаад ссдаєєдсду асаєсчаєсдеЕ содсдЕСаад дасеЕсасбада єдссаєдев 180 чдададсаас саєсддсасда бадеЕсааддс дсаадддтає с 221 «2105 15 «2115» 108 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 55
ЄдосЕдсеЕЄєсС єЕДЕєЧ9одсуоєд ааадсссдад Сдсссссааа СоддссдЯассдає ассадсесдає бо асдасаєсва сссудаєдсаа бадаєаасає судсеЕсасасу сдєдадеЕс 108 «2105 6 «2115» 108 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 б
Есдссдадаа додадеадса дсаєсассстд асаєссстаєсдс сааєсєєссаддає дасдсдаєссд бо
Єгадсвтасьсє сааєсддадесд ддеЕєсадаас аєссаададеЕє єсаєдед9д 108 бо
«2105 17 «2115» 206 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 17 чддаассоддед ассадсєдса сдасчдаєдаа Сссграсаада сдассаєсдса абасасадед бо
ЄЕсЧдЄссЕСсСЕЕ соєеєсСвраста сеЕсаасадад садссдссда ссаасаасда асддадсаєсс 120 аєсеЕСсСЕдеЕсс ЕєСсСассевас ассаваєссса сассасадаа ссдсаааєсдс ссдаддгасс 180 аасєаасаєс доасассеєесу дсаєда 206 «2105 8 «2115 195 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 8 ачаєєддеєса басасврадає аддодссадає сасссдддсс дссасаадсс даадааєсдса бо аачадеЕдеЕсс асаєчаєєеєс аєддеєдаєда асадедаєеєє гаєдадсааа страдсааадд 120 аєааєсадеє дсаєаєаєдеЕ даєдаадасс даєссадессс сддадсаааді адсаааєдад 180
Есаєсдаадс бЄдЕса 195
Зо «2105 13 «2115 300 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 13 ддасаасаад сассЕєссеЕвда ссеЕєЄдсаадд сссссссссс ссасддсадсес сасеєсдадед бо чаєчасеєса ссеЕєааадсе аєєдассссс саадсдссад асасаасадда стагбасаєєсс 120
ЕсЕСєдудєдоа саасааєдад ссаєєстдуає содЕЧДЕЧДЧдєта дЕСтаєсаєе дадесеЕсьсяє 180
Еддсассудвба сеЕсссаєдда дадсадаада сааасеЕсееєс ассаєєднад єСсЧЯоєтдває9чо 240 баєєдоаєдуає дасдасасєсс сСедчоасоосдса Сдсастдчуаєд адеЕсасеЕдеЕс десасесддасд Зоо «2105 10 «2115 90 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична послідовність «4005 10 ачасчдасдас сдєдсаєдуадє даєдааєсас адасдасдаа сасадсаєдеЕс дсаєсассає бо ссеЕсссасас сагадаасвд саааєдессд 90 бо
«2105 11 «2115» 165 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 11 адасчдасчдас суасдсасдує даєдааєсас адасудасудаа сасдсаєсдеЕс дсаєсдссде бо ссссссасас сасадаассд сааасдсссуд асаасаадса сссссссдсс ссдвсадсаєсєс 120 чаєдадєЕдасд асаєссєвду ЕдеЕдсаєдса седдЕДдадес аседе 165 «2105 12 «2115 170 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 12 ачасчдасдас сдєдсаєдуадє даєдааєсас адасдасдаа сасадсаєдеЕс дсаєсассає бо ссссссасас сасадаассд сааасдсссуд ссссссассдя ЄСсдсадессдяс Єдаєсддсаєсс 120
Зо чаєдадєдасуд асаєсссєєдуа єдЕЯдсаєдса ссддеЕДдадеЕс асеєдеЕєдсас 170 «2105 13 «2115 82 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 13 асдєдЧчаєаас ЕЄСТтТаєдсед дсеЕЧеЕЧаєвд стадеЕєдаад аааадаасад агаєдаєдас бо аєсаадеЕсес сасеЕдсдеЕда сд 82 «2105 14 «2115» 106 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 14 сссаасдсдс асассдассає сссссдссас дадддааєсдІ сассддессдса Єдадаєсєдадд бо чЧЕдааєсдда ЄдЕсЕЕдадуєд дсасдаєбадеі гааддсдсаа доадеає 106 60 «2105 15
«2115 80 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична послідовність «4005 15
ЕсдеЕсСсааас деЕдассуєЧдЕ додсгадаадс ададчаєддс дагаєдсасу Ерардсеес бо сЕадасеєссс асеЕдеадесд во «2105 16 «2115» 264 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична послідовність «4005 16 часаасаадс ассЕссеЕєдс сеЕєдсадтає єддеЕдЧдеєдас дасаєсстєва деЕдедсаєдс бо асєдчдоаєдадс сассдеєЕсдта содоєдаєсаасеЕ Єсстаєдсьод сеЕдеЧчассодс садссддаада 120 ааачаасада баєддеєдаса ЄсаадеЕсєссс ассдсдєдас дссаасаєдс асаєссассає 180 сссссдссас дадддаасдс сассддссдса Сдадаєдада десдааєсєсода ЄДдЕсдадаєд 240
Зо чдсасчдаєадеЕ Сааддсдсаа даде 264 «2105 17
З5 «2115» 1826 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 17 ассоусссдсс соосссуссддс сЕЕсддсадуда басадсаадс асассссддсес сеЕєсасссає бо счадссссад Ссадсассєс садссадсесс ссссссасдуає ссадсессса асааєсссаєс 120
ЧдЕСЕСЕєдсад десадссадса дасассасес сасаадсада асдасааєдча ассаддессаєс 180 чЧЕсЕЕєдссад ддеЕсссадсс сраєдааадс дсаєсасаєє сасоасадесдс СсеЕсессесодсе 240 чдассаасеєєд єСсСЕдсудЕдодс єсасоудсдада даассуураєса єсагаєтасе гадсдсадсд Зоо чаддсаасдсс содссдЕСасу деЕдЧчассодду седЕсСссоосду дсссачаєдуа Сдсєдасаає 3З6о
БадссавасеЕ єЕЄсСЕеЕЧЯваєдЕ ЄЄссСсСЧдєЄдодс саєдссааса сссассодєЄда ссасаєсссаа 420
ЧЕєЧчааєдас содасадаааєє саєддсассд соадоаєЄдаєЄда ссоадесдаада ССоусссЕсее 480
ЕдеадчЧдеєсєдЕ ЄЄСЕЄСсСЕЄСсСЕ сеЕСаВоддЕєдудЄ Єссаєссояде Єддаєсдааа сссасоаддваа 5340 ааєєдсдсад дЕєЄЧддадсад доадсасєєсєсе єдсасессад сеЕсаєдеЕсса ссаєаачаєсс 60 бо баєсасасад седааєсаса ааєсаєдсда дассаассеєс даадааадде асаєсссоаоєде 6б6о
Зо сЕєСсдсааєс ЕСЕЯДЕсСасьд ссаєссесас аЕсеЕсеЕдоода Еєдасаднає єсСЕЄсЄДдадеся 720 ааадеЕсєєдсс дадеЕдеЕсддс асаасаєдда дсесаєсдеєс ассасааєча Сдассасессесе 78о0 саєсаєучдєсєдЕ дсадесеєсас гааєсдеЕссаа додссаасааа ЄСЕЕЄСсСавєдуа адсседсатєе 840 ааєгєєдЧдедодад басодстасеє єсагаєдссе дсгадсдаєє асаадедаас седадессадд 900 аєдсдасаєд ааасдсааад саддеєссадад ЄдседЧоаєЄсоЯЯд Єсаассаксєє ссесеесевсоє 960 7 ЕЕСЕдддасес сЕСдсастд ЕЕЄвасеєсьдс ЕсЕсСаствтаєд ддсаєсуддеєс асаааєднгас 1020 асдааасасд ЄЕддадессоду аадасааєдЕ ассагаєдудд басудеЕєеее єеЕСВаєЕсССЯЕ 1080 сЕєЄСаєдеЕСЯ ддссдсаєсдеЕ асеЕсєддаає дасзчсеЕсучЄєЕ дссеєдддаса сасаєсаєсас 1140 саєддаадає аасдасасьд седдссадаа СЄЕсСЕддоддадеі аддседдсес саасасеєссс 1200
Есдсададає сеЕсЕдудааса даєдассадс Едсасддсда Єдааєсссає асдасдассд 1260 7 Едсаєддеєда єдаадссдад асдасдассуд єдсаєддеда ссаадссдад асдасдассд 1320 бдсаєдеЕєда сСдаадссудад асдасдассу Едсаєдудєда Есаадссдад асдасдасед 1380 бдсаєддєда Сдаасссдад ассасдасся єдсаєдудаєда єдааєссдад асдасдассд 1440 бдсаєддудєда сСдааєссасад асдасдааса сдсаєдеЕсас ассдсессуєсс ЄсеЕЕєдваєс 1500 асасадсдЕс дсссєссесу сесвбасврасе сссссдадса ссассдасса аєаасаєєда 1560 7 ссаєсаассе ссеЕСсСсдЕсСудс сдссусуєес ассуєссвсс ссесасасса гадааседса 1620 ааєдЕсСсдад агассаааса Есуддбасаєс Еддсаєдаає даададдадд асдаєдаєда 1680 сеаєаєсада даасоддада деЕдаасасає доассдсесєссу Єааєсаасаа сердраєсес 1740 часаєссасеі адсадаааад адсеЕсЕаадуд сддддсасьд дсоуддЕеЕссасс саасєдаасс 1800 чЧдЕсадеддаа аааааааааа аааааа 1826 «2105 18 «2115 757 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 18 аєсвтадеадеЕ Єдаєаастає дадЧдеєсєєдає аассаддада Єссоадсаєда дсасаєвавсає бо
Єдессаєсаєєс яєседеЕСоОсу адбрассеєЕєсд саааєстада аасдадеЕсста ассасасесе 120 сЕсадессаєд сдсдадасас содаддссас сааадссада аасасдєсда Ссассасаєгса 180
Ебааєдсада дсаєддадса аадседаєсеЕ єессаааасає асардеЕсрасс єссьтарєтвс 240 т Бадссасасуд десасдеєєвд дасдассаає аасаддсеєвд саасссеєсса аарєдедеЕсс Зоо аєсадсеєсс саасдєдсає аєсдссаєсс ЄссдсЕссЯаєЄ десссаєдес ассассссса 3З6о бо сЕССсССсСсссСЕ ссасасдсаа гдсааасааа дсадаєссаа сдЕддаєчад доасдааєссод 420 аєдеЕєЧчадЧадеЕ додддЕСЕєдсЕ аааєсєссса аасааєсааа Єдоадсоддсесдс аасаасасцва 480 чачааєдеЕса ЕЄЧдЧдЕСЧЧаєд адеЕсддаддс деЕсаааєдса дасааадсса саасесссає 5340 чЧЕддаддаєд ассдсдасє СдЕддсадас Єсаєссасса садесдададе сгаддааадс 60 аєдаадссда єєЧдеЕддасає счаєдеЕсуддеЕ деЕСааддасе гагадаєдеЕс аєдеЕєдодвад 6б6о адсаассаєд дсасдаєсаде Єааддсдсаа доадсаєсєдеЕ аасасссааа ассодсаєсаса 720 7 аддаасасає ададдесьсс саааааааа ааааааа 757 «2105 19 «211» 820 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 19 асдсодсстасдуд дсадеЕєсдста дЕЄсСадеЕсса ассаадссає доаосдЕєдааа сЕєДдассаса бо сЕсдссСссаа сСдадассссдд дадсдаасса аасдадсесса СдсссеЕсаса Єдассастсад 120 ссадаадесса дадсссадає дасддссдсс сседссдддсоя Сдааадсссд адсдсссста 180 7 ааєддеЕСсСцЧЕсС деаєсадсед асасдасаєс басссдаєдс аасадчаєаає ассоадєссаса 240 сдсдєдадесс саааассдєс доассЕссддас содадсадесс аасдсдадаа деЕдсаєссєстса Зоо
Зо ЄсасеЕсєсєда дедсаасссє єЕСсСЕСЕсаєса єсЕсСЕССсСдад сЕЄСЄДЧСсССсСЕС ЄЕдсатгавєде 3З6о
ЕдеадаєєсеЕ содссдадаад ддадсадсад бгаєстасседа гаєстаєрдсе ааєссадчачвд 420 чЕЧЕЧЧєСсСЧЯЄ бадстасеЕеєє ааєєдадеду деЕссадааса єссааддеЕве саєдедддес 480 7 чадчадчааад єддасдаєда асгсадаааад дасаєдадса дчЕдсеЕеЕеЕесса асасаєдаад 5340 чдссаєдедса ааєсеЕсєвсдЧчеЕ дсеЕдссдаад ЕЧ9ЕЧдЕСЧОєЧча саєєддааєє дсоддадеЕСТтад 60 аааагасаадс Есастадаєє ссеЕдаааааа саєсєстадаадс бассачасту деадсаєєесе 6б6о гЕЕєаадаєтс аааасеЕстає адаадесаєс асЕсеЕсуєеє асгддаадаа агаєєсеєв9 720 аадеєдаааа даєдсеЕстаа саєссаасса сдсааастає сеЕгбдсаасса сеЕсгаасасд 78о0 о авєєсоддеєаа сасдеЕесеєса Єдаааааааа аааааааааа 820 «2105 20 «211» 1814 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 20 дсесЕСадаєд сеадстадсеЕ сеЕЄСсССсссасу ЄССадсеесс аасссуєссса СсеЕСССвДса бо часедсаддЕ дадсдссага єсгаєсеєсаа єсааєстєдаа дсртадеаасєтє щсдеЕеватвас 120 аааєсвтасаа деааєсдаєс аєсадеЕсаас асаєчасаєс дасссасоаєєс осасессодаває 180 7 чаасаддодаде аєєєсеЕєдва деЕссадсеєса ЄдадеЕсссас аадасессає сасасоадеса 240 аасбасааає ЄдеЕдсдадас аааєсаддаєа ЄдсасдеЕсса ссассдеЕсєеєє аассдваєсста Зоо асеЕсадаааа счдЕдЕдеЕєса асдрасчдаде дасеєдеЕсаад ссчаєрддеЕєдд дсеЕєсеЧаєвд 3З6о і гЧЕЧЕЧЕЄсС ааассеєааєс аєдсаєддадса Єдссдаасаа аєсєсоаодЕсЯЧ даєсдасаєсаєса 420
Баєаєдсвад дасаєсєдад даєсаваєдеЕ дссааасгаде єгадссааєє аарєесьсас 480 аадсасдсад аєссадсадеЕ Сддассааас ЄсСдадаааса ссаькеєеєсаєє Єдчасссуєєсс 5340
Есавгаєсвєдс ддадеЕєдста дстадеЕсдчееє сеЕєддсаєвд дргадеЕсєсдад аасддаардес 60 сеЕсадаасає сссдадсаає Ссасадсдєд сааадесссда дасссдссда дЕСсавааєстдл 6б6о 7 аздеЕсадЕсеє дасєсесєсада Есаасесєеса адудєдставє сддеЕСсаараєс ддаєддаеєссд 720 чаєсдааєаа аєєстадедд єсссаєбаєда адассеЕсесєда ассссоаєсса дсадасесссе 78о0 баєддсддес ЄЕдЕЧЧастає ассдеЕєсоба одсеЕсаєдаєє єсеадасасс аєєседаєсад 840 чдЕєЕЕєдадає сеЕсСсасстаа аасеЕссєсає дсеЕдаааасе ЯдЕєДЯдоодЕЄЧа сЕсдЕСсСагас 900 сдачаддссс дасаєсссаса ссддаддаєд аддеєстаєєє гасесадсеся Ессдададес 960 7 ЕЕсваседає ссесессеєс сесаасесьд дсаєсеЕсссьу сЕдЕДЕСЕСЕ Есааааєсає 1020 басеЕдадерас аєсеЕссссас ааадеЕсадсуд Судсусасаде саседеЕСьЬсСт Есвагаєданта 1080
Зо асєдсдєддад аєсдаасааа аааасаєаад ссааааєсас ссададесдаа гассеєдЕсо9 1140 сЕСЕсаєеСса адЕеЕСсСЕЕсву ассдеєссдсе ЕдсеЕсвааєс саєдсаєраса ссааваєеєва 1200 гЕсЕдДЕСЕес асдсесдсааа сааааассаа сгагаєдсає басасасчєе дсодсодсаєва 1260 7 ЄдсеЕддсеЕва басеаасасеє єдсдеЕсваса дегадсдаєвас єдеЕєдассад ааєсеЕсодаа 1320 асааассддс Сссаасассе асеЕгдсааад асасеєсоддаа ссуддеЕдасса дсеєдсасдас 1380 чаєдааєссяї асаадасдас саєдеаасас асадсуєсує ссессеЕесуєє ссастасеса 1440 асадчдадсаде сдссдассаа аасдааєсдд адсаєстаєсе сеЕдеЕссеЕвса ссеЕсасасса 1500 баєєсасасс агадааседс аааєдеЕссда дудсбассаасе аасаєсдудбра ссЕсЕддсає 1560 о чааєдаєдаа Єдаададдас ддсдаєдассі агаєсадада аєдддааадеі даасаасесдс 1620
ЕсдаєсєдеЕсС ассаасааєсе Едеааєсеєсаа саєссададдс абаєсаавсе сЯастаєдаа 1680 асдЕєдсаає агадасдедс ссасоддеЕддс дЕСасуєсєєсд аєдеаєддає асодсеЕсдаса 1740 бадеаадаса ЄЯсЕсСарудє дсаєєсеЕвсе асссавраста сЕСЕсааада аагасаєданка 1800 бдсеЕдаєдда сдаа 1814 «2105 21 «2115 679 «212» ДНК бо «213» йеа шаув
«4005 21 аєдсеЕдадса асааадесєесє асдаасаєсдс даададдада Саааасєсдду саєсасааєссе бо
ЧдсЯдєдЕдсаа аєдеЕсвтаєда єєсдчаєссає асаддаєсддда Саддсаєсад даасссадає 120 аєдеЕСЕдддс єєЄсСтасаєса садоадааєсдд дсддаассаа сСссасдддаєс асдссадааа 180 ачадеЕєЧдеЕду асаєааєєса сасаєдеЕссдд сдадссаааа асаадсдеєєсд дссассаєсд 240 аадтасачасє гддссасаса сградасбаддад срадаєсасеЕ сдддєсєсдсса саадесєЄдаад Зоо ааєдсааада деЕдЕеЕСсСсасає даєєєсаєда сЄдаєсєдаасад Єдасєсєссаєсд адсааассад 3З6о саааддасаа Ссадссдсає асасдєдаєд аадассдаєс адрссссдад сааадсадса 420 ааєчадесає сдаадсеєдеЕс аєссаддаса аасссЯаєсдс сассодсбадає сСадасаасаа 480 часгаддаса єсаєссеєсад Єсдеєсадаєс аадсдаєдаа саасаасаєд дааєссддаад 5340 аєсаадаєаа ааддаасадеЕ адасасасаа СоОдДЕСЕЧЯУЄЄ Єдаваєсода ЕСсСасесааєс 60 чаєєдеЕддеєс сЕСЄааєсаєа єааачадесдча асадсаєсає сссадсадаа аасессессса 6б6о аааагааааа ааааааааа 679 «2105 122 «211» 631 «2125 ДНК
Зо «213» йеа шаув «4005 Д 22 аасеЕєсаєає адассаєаде бадедасадс ассааадессс дадасдссда асдссааааа бо асааєсадеЕс асаасгассдеЕ Сгадаєаааа ассєдадаєд Есддаддаад сеЕдссдаааа 120 аддеЕсаасеЕє баєсвтаєдоад асеаадсссс аасссоадсає ссссссасєсс сессадессеса 180 аєдеЕсСЯдЕеЕєдс содссдадесас аасадсдасс сассадсдса Сдсасассаа ддаєсдЕсдЕс 240 ассассааса ссаєсаасда сграсаасоддс даададзсссд ссссссасесс сссаєсодввад Зоо
Басддедсса ааасааасес аасаасадас сбассасасса ассаааасда сссассдєеєд 3З6о ссассадчада дааєдсаєсад сссаєсаєдс седдсасевса додааєсдає адсеЕссаад 420
Едаадеєсаєс сасеєсаадед дссбассасад ддаадддадд ссссдсаадд саадааддаед 480 сСЕКЯДЕЕдЕеЕСсСсС дЕЕдЕДЧДаєаа сассесесса асааєааєдеЕ Есасасссас асєсдеЕссдачтьс 5340 сдЕсЯдЕсЯдду бааааасаєе дсваваєсса Есравєеєеєса єсассавава сасаєвсаєва 60 авасЕвєесудє сеЕдссааааа аааааааааа а 631 «2105 23 «2115 22 «2125 ДНК «213» йеа шаув бо «4005 23 саєсассаєд сасддЕСдЕс де 22 «2105 24 «2115 18 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 24 аєсассаєдс асддеЕсде 18 «2105 25 «2115 18 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 25 асдассдєдс аєдаеєдає 18 «2105 26 «2115 22 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 26 сдсаєдеЕсас ассдссуєсс єс 22
Зо «2105 27 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув
З5 «4005 27 сададасаєєсу садесеЕСтаєвда де 22 40 «2105 28 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув 45 «4005 28 часаєєєдса дЕЄсСсаєсодде де 22 «2105 29 50 «2115 20 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 29 55 ссдеЕдсаєдуа Єдаєдааєссс 20 «2105 30 «2115 19 6о0 «2125» ДНК «213» йеа шаув
«4005 30 сассаєдсас дадЕСдЕСЧЕ 19 «2105 31 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 31 асасдсаєдеє сасаєсдссу єс 22 «2105 32 «2115 23 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 32 бадссасасуд дЕсасуаєєвсд дас 23 «2105 33 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 33
Зо ададеЕдааєс ддаєдеєдад діда 24 «2105 34 «2115 24 «2125» ДНК «213» йеа шаув «4005 34 асдеЕдсаває сдссаєрссєс гасе 24 «2105 35 «2115 24 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 35 бадссасасуд дЕСсасуєесу дасд 24 «2105 36 «2115 23 «212» ДНК «213» кукурудза «4005 36 сдєЕдсабаєс дссаєрссеєся дсе 23 60 «2105 37 «2115 24
Зб
«212» ДНК «213» йеа шаув «4005 37 сачзаддаєда сдасаєдсас де 24 «2105 38 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 38 сЕСаасаєсс даєссассся са 22 «2105 39 «2115 22 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 39 саєсдассаа Едасаєсессс єс 22 «2105 40 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув
Зо «4005 40 ссЕБгдсдссЕ ЕаастаєсдеЕ дес 22 «2105 41 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 41 асссЕєдсдс сЕсаассаєс десдс 24 «2105 42 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 42 асгасадєда дадеЕссадда аадс 24 «2105 43 «2115 24 «2125» ДНК «213» йеа шаув «4005 43 адсасеєсдад сЕсЕСасудсс ааса 24 60
«2105 44 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 44
ЄЕдодсодєдаа адсеЕсдадед сссес 24 «2105 45 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 45 баааєддєсдя Есдраєсадс дає 24 «2105 46 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005» 46 садссаасас дасдассаєє гад 24 «2105 47 «2115 23 «2125» ДНК «213» йеа шаув «4005 47
ЄодадЕдЕдЯдЕС дЕсСадсвасе Єва 23
З5 «2105 48 «2115 24 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 48 ааадсадсва асдассасас сасс 24 «2105 49 «2115 20 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 49 басврасвасе сссеЕсссс9у 20 «2105. ч50 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув 60 «4005 50 сЕдасаєсса Едссааєєсса 99 22
Зв
«2105 51 «2115 24 «2125» ДНК «213» йеа шаув «4005 ч,151 бдссдаадед ЄдЕСЯдЕдДаса Ес9д 24 «2105 чБ52 «2115 22 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 Д 52 сЕдасаєсса Едссааєєсса 99 22 «2105 53 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 53 ссаєдеЕааса сасадесдесдд єс 22
Зо «2105. «54 «2115 18 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 54 саєсдеЕСЯЧєд садседдЧе 18 «2105 щ55 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 Б55 сддасаєєсу садесеєсставда де 22 «2105 56 «2115 22 «2125» ДНК «213» йеа шаув «4005 МЯ56 басасадедеЕ сусссеЕсьсс де 22 «2105 57 «2115 22 «212» ДНК бо «213» йеа шаув
«4005 57 часаєєєдса дЕЄсСсаєсодде де 22 «2105 158 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 58 сдаддеасса асеаасаєсд де 22 «2105 59 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 59 агдссааадд гассчаєсЧчЕє ад 22 «2105 60 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 60 сдЕсдЕдсад седдЕсСассд де 22
Зо «2105 61 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 61 сЕдЕДдаєдса даадсссада с 21 «2105 562 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 62 саааєдадес ассдаадсвд Є 21 «2105 63 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 63 бадаєсасес додадЕСсдссас а 21 «2105 64 60 «2115 21 «212» ДНК
«213» йеа шаув «4005 64 чсаєаєсаєЧдс даєсдаадасс 4д 21 «2105 65 «2115 21 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 65 сдааєєдаєсе ссасссасес с 21 «2105 66 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 66 бддЕсаваса сгадаєаддад с 21 «2105 67 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув
Зо «4005 67 ссртаєссаде дсаєсдассаваа Є 21 «2105 68 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 68 даасачедає єЕсаєсдадса а 21 «2105 659 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 69 дсЕсаєаааа Єсасеєдесвса Є 21 «2105 70 «2115 23 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 70 саєдсаседу ЕдадеЕСсасвд ЕС 23 60 «2105 71
А
«2115 23 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 71 адстаєсдає сссссаадед сса 23 «2105 72 «2115 23 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 72 дассЕсСссСЕЕЄ сссвраєддуаєва дес 23 «2105 73 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 73 аадсваєсда ЄЕСсСсЕааді дсса 24 «2105 174 «2115 18 «212» ДНК
Зо «213» йеа шаув «4005 74 аддссЕсссеЕ Єссстсаєд 18
З5 «2105 175 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 75 асадеєдасес ассадедсає дсас 24 «2105 76 «2115 21 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 76 асадедасес ассадеЕдсає д 21 «2105 177 «2115 23 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 77 бо ааддсаадаа ЧдасдсЕсаєс дес 23
«2105 78 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 78 чдсаєдсасвд дЕДдадеЕСсасеЕ де 24 «2105 79 «2115 25 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 79 сааддсаада адддсдсеЕвдЕ вдеЕсс 25 «2105 80 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 80 саєсаасддас гасаасддед аа 22 «2105 81
Зо «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 81 ассаєсаасуд ассасаасдд Єдаа 24 «2105 82 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 82 аддссЕсссеЕ ЄссстсасудеЕ адсс 24 «2105 83 «2115 18 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 83 сааддсаада аддаєсдсее 18 «2105 84 «2115 18 «212» ДНК «213» йеа шаув 60 «4005 84 аадчзааддеЕдс ЄЕЕДЕСЧЕС 18 «2105 85 «2115 23 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 85 саачдсаада ададсдсевсає де 23 «2105 86 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 86 сааддсаада адзддсдсеЕсдеЕ єдЕС 24 «2105 87 «2115 24 «212» ДНК «213» 7еа тшаув «4005 87 ассааддаєд ЕсдЕСсассас саає 24
Зо «2105 88 «2115 24 «212» ДНК «213» йеа шаув
З5 «4005 88
Єсасдсадед дааасеЕєсєдає деса 24 «2105 89 «2115 23 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 89
Есасдсадед дааасеЕєдає дЕсС 23 «2105 90 «2115 22 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 90 садссадсає адаадесаєс ас 22 «2105 91 «2115 23 6о0 «2125» ДНК «213» йеа шаув
«4005 191 сасдсадеду ааасеЕєсєдаєда са 23 «2105 1392 «2115 24 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 92 аєсртаврєеєсьс сЕСЕсСсСаяаасье адса 24 «2105 93 «2115» 1368 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична послідовність «4005 93 аєдсеЕєсаєд дадсеєсаєс баддссадсс ассдссадда адссстадсдд дсесадсдас бо ассдеЕдсдса ЕЄсссЕддсда баааадсаєсс сСсасасадда дссссасдсс содаддассс 120 чЧдсЕадеддад адасдадаає сасєддсєссд ссесдадддсуд аадаєдессає саасассаде 180
Зо ааддсдаєдс аадсаасдудд Сдссадааєс сддаааачадудд дсдасасчєд даєссаєсдас 240 чдаЕЧдЧЕєдЧдва асодадчдаєє дсеЕсодссссс даадсдссас сСсдасессда даасдсадсео Зоо асддоаддеЕдсс дЕСЕвасвтає додассддса ддсодєсдсаєдд асссесдасесс бассессаєс 3З6о чдаєдасдсда дссеЕсассаа дадассаасд ддасдадсдс Сдааєсссссо дадддадаєд 420 чЧаєдЕССадд Єдаааєсєда дддваєддаєдає сдссссссод Єсассссдсд аддессссаад 480 асссссасус саассасдбра садддЕсссу агддсдеЕсад сасаддесаа дЕСадсддданга 5340 сеЕсссддсдд дссссаасас асссддааєс асаассдсєда Ссдаасссає саєсдассада 60 чассасасдд адаачаєдеЕє дсадоаодЕссс ддсдссааєсс сСаасддісда аассдасдсс 6б6о часоддсдєда ддасааєсся сЕєддадддс ададдсааас Сдассддсса адссаєсчає 720
ЧЕдссЕддад аєсссеЕсдЕс сасадсдєссс ссссосдсад ссдсЯдєсдсе сдассссгддва 78о0
ЕсЕЧчасдеєда счасєсссдаа СдЕсСсЕСаєуд ааєссаасса даассддссо сасссесаса 840
Еєдсаддача єдоддеЕдседа саєсдчаддес ассааєсєссста ддссддсадда Сддададчває 900 чЧчЕддссдаєс єдсдсодєдсЯя єЄсСсадсаса сссаааддсд Сдассдсссс сдаддаєсдс 960 дсЕссаєсса Єдаєсддасда дсассссавфе сеЕсдссдєсд сеЕдсЕдсуєЕ Едссддадодес 1020 чдсаасєдсаа ЄдаасудссеЕ ЕдаддачеЕвд аддудєєсаадчч ададедасад дсЕдЕссдасд 1080 бо дЧдЕддсдааєд дссеєдаадсеЕ ааасддсудеЕд дасеЕдсдасу ааддедааас дессссесвдага 1140
ЧдЕСссдЕєддЕС дсссадасоуд даадддуєєда додааєдсьсє сдоддадсєдс єдесЕддсдасд 1200 сассеєєдаєс асадааєсус саєдеЕсаєсє ссддєдаєддуд дасеедеЕсьс сдадааєссд 1260 дЕдассуєєд асдаєдстас саєдаєсдсес ассеЕсссеЕсс сеєдадеЕссає додассеєсаєд 1320 чсаддсЕеЕєдд доадссаадає сдадссдсєсс дасасеаадда ссдсєвда 1368
Claims (21)
1. Молекула рекомбінантної ДНК, що містить цільовий елемент что-міР НК, який містить ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 2 або їхні комплементарні ланцюги, при цьому цільовий елемент что-міРНК функціонально зв'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, яка транскрибується.
2. Молекула рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що гетерологічна полінуклеотидна молекула, яка транскрибується, кодує білок, який забезпечує стійкість до гербіцидів у рослин.
3. Молекула рекомбінантної ДНК за п. 2, яка відрізняється тим, що вказана гетерологічна полінуклеотидна молекула, яка транскрибується, кодує гліфосат-толерантну -(5- енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б).
4. Спосіб отримання молекули рекомбінантної ДНК, який включає функціональне зв'язування цільового елемента что-міРНК, який містить ЗЕБЕО І МО: 1, 5БО ІЮО МО: 2 або їхні комплементарні ланцюги, з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, яка транскрибується.
5. Трансгенна рослина або її частина, яка містить у своєму геномі молекулу рекомбінантної ДНК зап. 1.
6. Насінина трансгенної рослини за п. 5, що містить вказану молекулу ДНК.
7. Рослина за п. 5, яка відрізняється тим, що вказана рослина являє собою однодольну рослину.
8. Рослина за п. 7, яка відрізняється тим, що вказана рослина являє собою рослину кукурудзи.
9. Спосіб селективного регулювання експресії білка у чоловічій репродуктивній тканині Зо трансгенної рослини, який включає експресію у вказаній трансгенній рослині молекули рекомбінантної ДНК за п. 1.
10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що вказаний білок містить гліфосат-толерантну 5- енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б).
11. Спосіб індукування чоловічої стерильності у трансгенній рослині, який включає: а) вирощування трансгенної рослини, що містить молекулу рекомбінантної ДНК, яка містить цільовий елемент что-міР НК, який містить 5ЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО ІО МО: 2 або їхні комплементарні ланцюги, при цьому цільовий елемент что-міРНК функціонально зв'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, яка транскрибується, що кодує білок, який надає стійкості щонайменше одному гербіциду; і р) застосування ефективної кількості вказаного гербіциду до вказаної трансгенної рослини, при цьому застосування гербіциду проводять до або одночасно з розвитком чоловічої репродуктивної тканини вказаної трансгенної рослини, тим самим індукуючи чоловічу стерильність у трансгенній рослині.
12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що вказана гетерологічна полінуклеотидна молекула, яка транскрибується, кодує гліфосат-толерантну 5-енолпірувілшикімат-3- фосфатсинтазу (ЕРБР5Б).
13. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що вказаний гербіцид являє собою гліфосат.
14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що вказана ефективна кількість гербіциду складає від 0,125 фунта (0,057 кг) кислотного еквівалента на акр (0,4 га) до 8 фунтів (3,6 кг) кислотного еквівалента на акр гліфосату.
15. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що вказану ефективну кількість гербіциду застосовують на етапі розвитку, вибраному з групи, яка складається зі стадій М4, М5, Мб, М7, М8, М9, М10, М11, М12, М13 та 14.
16. Спосіб отримання гібридного насіння, який включає: а) застосування ефективної кількості гербіциду до трансгенної рослини, що містить молекулу рекомбінантної ДНК, яка містить цільовий елемент что-міРНК, який містить ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 2 або їхні комплементарні ланцюги, при цьому цільовий елемент что-міРнНК функціонально зв'язаний з гетерологічною полінуклеотидною молекулою, яка транскрибується, що кодує білок, який надає стійкості щонайменше до одного гербіциду, при цьому вказане 60 застосування гербіциду проводять до або одночасно з розвитком чоловічої репродуктивної тканини трансгенної рослини, тим самим індукуючи чоловічу стерильність у вказаній трансгенній рослині; р) запліднення вказаної трансгенної рослини пилком з другої рослини; і с) одержання гібридного насіння з вказаної трансгенної рослини.
17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вказане запліднення відбувається шляхом запилення вітром.
18. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вказана гетерологічна полінуклеотидна молекула, яка транскрибується, кодує гліфосат-толерантну 5-енолпірувілшикімат-3- фосфатсинтазу (ЕРБР5Б).
19. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вказаний гербіцид являє собою гліфосат.
20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що вказаний гліфосат застосовують одночасно з розвитком у ефективній кількості від 0,125 фунта (0,057 кг) кислотного еквівалента на акр (0,4 га) до 8 фунтів (3,6 кг) кислотного еквівалента на акр.
21. Гібридне насіння, отримане способом за п. 16, у якому гібридне насіння містить вказану рекомбінантну молекулу ДНК. и В ях Я «К ВЕ и МКК ЗИ КК м ЇЇ і: й ет ення а х ВИХ ЕН шо і . Я а Ка їх х ; я ще ПЕН ВН й. й ! я ія я їх |. НК я А І ! Б киш ння ООН г, ; о Шина о 5 | і в с 5 Е І . : | се п Б І ! В шо ке В ок С х 1585 ЕЕ ОО ЕНН 8 ШИ ї І бл В г ї ! Ні с ших щи а я нн п : ЇЇ нан о в / ; ефе В до НИ и ее ан ; Шин НН
"і - ОК А а В і о і ТЕО щ в р | ие б оте і. Її КЕ дл ШИ я у ЩЕ у Ї х ї ; ще ее г я я у Я. З ; Ін З є і з д ! ОО і КЕ 1 т З -о : і я ; я є . 1 ще : З и ї Е ез «Я я і З 4 я шк 4-8 г о : ке сс не с експресія
ФІГ. 2 чте-мігнкК ст ше у МІШЕеНЬ
Шк . т чте-мігнкК дк, Ї ню чте-МІРНК рення мРНК ії и: т М -о і КЕ пиття й Чажьдаки. : ши Е не щ з сн Е ї Е І і . - ' Ка------2---- 0... Цільовий Е ІРНК і : елемент что-МіІ Бо нь ви хм зви ль он змов КК ст НВ лк ев к ярих ліміт В на еслским і М І ПК втерти пиво соті Кс Х ІД ТК СД ПОВИ в ПК и и В КИ ки не ТИХЕ АЕН во КВ еи о ООН о ОН о в у МЕ ВВ и сн в ЕКО ЕІ ї ОК Оси ОН ї ув хо итя КО ДИ пи ПЕ ок вв и и а а Я Шо о МОН В о Мо и У КИ и ем и В я І М В ПОН ЕЕ КК оИ оо Не в и су ни в ня СОН о ниви пи В и і МИ па они я. КН До ех ОО ди Коко С ОВ МІ ОХ М в А ш ПОЗИ М в Ся ПН м І и и АКОТ ни. ДНО ВИ о ле М я КИ УК: НА ди м а СО ІЧ. нн КА и а ни Прим М и ЕХ ПОЛИВ хх НО сани те, ВК В ран ПЕ В в Мини хе тк хе ВК ж Де ВЕ п в Ж ЕК а ї КЕ о оо НІ ва а НН ри о Се. ес Ки Б а НК ОО ш- о Мер ОВ ВЕК Ко нет НК и ВК Мн КН ТЕО Вй о о Вс ев Песня ще ЕС м Ки ооо ВВ НК о тА вк ВИК ЗЕД о: ВАН и ік нах ша сн ня Уа Мох ТЕЗ Пес СА и: с ЗМ ее Во КК и ГІ А І Шия ЯНВ я Во о і Ме ле и в ОО я дея Я. Ван Ок Ве ПЕ НН вв СІВ КИ в в Оу нн п НИ мих ООН в о в 5: 38: : п А МОБ и В В ОО В ВИ я ЕК т УК КН В С В в и Ки КК 5 88 5 3 шия СН пока в о НЕ ни 5 5 ОН ех зе НО ВИКОН АК МИЙКИ В полиця В и в НИ ПЕН ОВ : Ем А З прое а ТВОЯ Е пок шо в в ННЯ ЩІ СЕМЕН ї ПУ ПОЕМА Ви Поу жи я ПН п ект Мел оя І ; Кен дн да о, о, ОО КЕШ вв : КІМ МК дк МО МАМ ев з ще і я п ШЕ хо, й У ОВ и є в : у - ПЕ МОЖ сова З 0 фе ВЕ ВЕК и й : » и з. ЗЕ КЕКС ПК НИ Зх ще ТЕКИ БУМ Ко ! ви й пору ння АН М А ше 0 ВН ПАЛ МОМКК УКИАИАКУЯ, ї Ка КИНЕ ев т ще в» МЕ пухких сххткку тт і ОЙ хлтехтркчнсх ВМО ШО Я жо МЕМ НИ пет ОД сотнях я а Я я ши : ж п Дн У БИК НЕ М релнчааоркн леж лнтьклтксь дети те ов маси ки кчві тк Ана нависла Ен Е.Л Трансформант 1 Трансформант 2 Трансформант З Трансформант 4 нні
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562195546P | 2015-07-22 | 2015-07-22 | |
| PCT/US2016/042217 WO2017015043A1 (en) | 2015-07-22 | 2016-07-14 | Methods and compositions for selective regulation of protein expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA126893C2 true UA126893C2 (uk) | 2023-02-22 |
Family
ID=57835207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201801481A UA126893C2 (uk) | 2015-07-22 | 2016-07-14 | Спосіб селективного регулювання експресії білка у чоловічій репродуктивній тканині трансгенної рослини |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10704057B2 (uk) |
| EP (1) | EP3324732B1 (uk) |
| JP (1) | JP6930960B2 (uk) |
| KR (1) | KR102689259B1 (uk) |
| CN (2) | CN114891758B (uk) |
| AR (2) | AR105374A1 (uk) |
| AU (3) | AU2016296468B2 (uk) |
| BR (1) | BR112018001192B1 (uk) |
| CA (1) | CA2992113A1 (uk) |
| CL (1) | CL2018000165A1 (uk) |
| CO (1) | CO2018000499A2 (uk) |
| EA (1) | EA037898B1 (uk) |
| EC (1) | ECSP18003799A (uk) |
| ES (1) | ES2938362T3 (uk) |
| HR (1) | HRP20230022T1 (uk) |
| HU (1) | HUE061144T2 (uk) |
| MA (1) | MA42497A (uk) |
| MX (2) | MX2018000890A (uk) |
| PE (1) | PE20180465A1 (uk) |
| PH (1) | PH12018500119A1 (uk) |
| PL (1) | PL3324732T3 (uk) |
| PT (1) | PT3324732T (uk) |
| RS (1) | RS63980B1 (uk) |
| UA (1) | UA126893C2 (uk) |
| WO (1) | WO2017015043A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201800175B (uk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013006472A1 (en) | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for selective regulation of protein expression |
| CN114891758B (zh) | 2015-07-22 | 2024-02-13 | 孟山都技术公司 | 用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物 |
| JP7219282B2 (ja) | 2018-02-02 | 2023-02-07 | モンサント テクノロジー エルエルシー | トウモロコシ事象ｍｏｎ８７４２９及びその使用方法 |
| MY195997A (en) * | 2018-04-18 | 2023-02-27 | Kimagri Corp Sdn Bhd | Recombinant Gene |
| WO2024059543A2 (en) * | 2022-09-14 | 2024-03-21 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for selective regulation of protein expression |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5583210A (en) | 1993-03-18 | 1996-12-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for controlling plant development |
| US5750868A (en) * | 1994-12-08 | 1998-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| US6271439B1 (en) | 1998-03-04 | 2001-08-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for regulating cell death and enhancing disease resistance to plant pathogens |
| CN1300324A (zh) | 1998-03-09 | 2001-06-20 | 孟山都公司 | 杀配子剂草甘膦 |
| CN1249133A (zh) * | 1998-12-25 | 2000-04-05 | 北京大学 | 获得雄性不育植物的分子方法 |
| AR044724A1 (es) | 2000-03-27 | 2005-10-05 | Syngenta Participations Ag | Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum |
| US20020062499A1 (en) | 2000-05-08 | 2002-05-23 | Conner Timothy W. | Methods for translational repression of gene expression in plants |
| US6646186B1 (en) | 2000-07-26 | 2003-11-11 | Stine Seed Farm Inc. | Hybrid soybeans and methods of production |
| GB0108048D0 (en) | 2001-03-30 | 2001-05-23 | Isis Innovation | Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants |
| US7977046B2 (en) * | 2002-05-10 | 2011-07-12 | Monsanto Technology Llc | Method of selecting DNA constructs for herbicide tolerance in plants |
| US7230168B2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-06-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase |
| US6967656B2 (en) | 2002-10-28 | 2005-11-22 | Syngenta Participations Ag | Growing degree unit meter and method |
| AU2003903132A0 (en) | 2003-06-20 | 2003-07-03 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd. | Plant promoter |
| CN101080419B (zh) | 2004-07-20 | 2014-07-02 | 健泰科生物技术公司 | 利用血管生成素样4蛋白的组合物和方法 |
| US7750207B2 (en) | 2004-09-01 | 2010-07-06 | Monsanto Technology Llc | Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter |
| US20060200878A1 (en) | 2004-12-21 | 2006-09-07 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression |
| ZA200803234B (en) * | 2005-10-13 | 2009-01-28 | Monsanto Technology Llc | Methods for producing hybrid seed |
| EP3339441A1 (en) | 2005-10-13 | 2018-06-27 | Monsanto Technology LLC | Methods for producing hybrid seed |
| WO2009085982A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Monsanto Technology Llc | Method to enhance yield and purity of hybrid crops |
| MX2010006941A (es) * | 2007-12-21 | 2010-08-16 | Du Pont | Plantas tolerantes a la sequia y constructos relacionados y metodos que envuelven genes que codifican mir827. |
| US20120017338A1 (en) * | 2008-01-15 | 2012-01-19 | Wei Wu | Isolated novel nucleic acid and protein molecules from corn and methods of using those molecules to generate transgenic plant with enhanced agronomic traits |
| CA2724425C (en) * | 2008-06-03 | 2016-09-13 | Nordsaat Saatzuchtgesellschaft Mbh | Process of producing male sterile monocotyledonous plants |
| WO2010099084A2 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Monsanto Technology Llc | Isolated novel nucleic acid and protein molecules from corn and methods of using those molecules |
| EP2503872B1 (en) | 2009-11-23 | 2018-05-09 | Monsanto Technology LLC | Transgenic maize event mon 87427 and the relative development scale |
| US9157084B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-13 | Gradalis, Inc. | Furin-knockdown bi-functional RNA |
| WO2013006472A1 (en) * | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for selective regulation of protein expression |
| CN114891758B (zh) | 2015-07-22 | 2024-02-13 | 孟山都技术公司 | 用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物 |
| JP7219282B2 (ja) | 2018-02-02 | 2023-02-07 | モンサント テクノロジー エルエルシー | トウモロコシ事象ｍｏｎ８７４２９及びその使用方法 |
-
2016
- 2016-07-14 CN CN202210491578.6A patent/CN114891758B/zh active Active
- 2016-07-14 HU HUE16828263A patent/HUE061144T2/hu unknown
- 2016-07-14 CA CA2992113A patent/CA2992113A1/en active Pending
- 2016-07-14 PT PT168282630T patent/PT3324732T/pt unknown
- 2016-07-14 MA MA042497A patent/MA42497A/fr unknown
- 2016-07-14 EA EA201890328A patent/EA037898B1/ru unknown
- 2016-07-14 BR BR112018001192-4A patent/BR112018001192B1/pt active IP Right Grant
- 2016-07-14 JP JP2018502662A patent/JP6930960B2/ja active Active
- 2016-07-14 CN CN201680042767.8A patent/CN107846856B/zh active Active
- 2016-07-14 UA UAA201801481A patent/UA126893C2/uk unknown
- 2016-07-14 ES ES16828263T patent/ES2938362T3/es active Active
- 2016-07-14 HR HRP20230022TT patent/HRP20230022T1/hr unknown
- 2016-07-14 AU AU2016296468A patent/AU2016296468B2/en active Active
- 2016-07-14 WO PCT/US2016/042217 patent/WO2017015043A1/en active Application Filing
- 2016-07-14 US US15/210,725 patent/US10704057B2/en active Active
- 2016-07-14 MX MX2018000890A patent/MX2018000890A/es unknown
- 2016-07-14 PE PE2018000106A patent/PE20180465A1/es unknown
- 2016-07-14 RS RS20230123A patent/RS63980B1/sr unknown
- 2016-07-14 EP EP16828263.0A patent/EP3324732B1/en active Active
- 2016-07-14 PL PL16828263.0T patent/PL3324732T3/pl unknown
- 2016-07-14 KR KR1020187004744A patent/KR102689259B1/ko active IP Right Grant
- 2016-07-15 AR ARP160102157A patent/AR105374A1/es unknown
-
2018
- 2018-01-10 ZA ZA2018/00175A patent/ZA201800175B/en unknown
- 2018-01-15 PH PH12018500119A patent/PH12018500119A1/en unknown
- 2018-01-18 EC ECIEPI20183799A patent/ECSP18003799A/es unknown
- 2018-01-19 CL CL2018000165A patent/CL2018000165A1/es unknown
- 2018-01-19 MX MX2021000869A patent/MX2021000869A/es unknown
- 2018-01-19 CO CONC2018/0000499A patent/CO2018000499A2/es unknown
-
2020
- 2020-04-09 US US16/844,949 patent/US11866721B2/en active Active
- 2020-11-19 AU AU2020273330A patent/AU2020273330B2/en active Active
- 2020-12-03 AR ARP200103370A patent/AR122346A2/es unknown
-
2023
- 2023-09-14 AU AU2023229538A patent/AU2023229538A1/en active Pending
- 2023-11-08 US US18/504,941 patent/US20240102042A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11441155B2 (en) | Transgenic maize event MON 87427 and the relative development scale | |
| JP5957447B2 (ja) | 遺伝子組換えアブラナ事象ｍｏｎ８８３０２および同使用方法 | |
| US7928295B2 (en) | Herbicide tolerant rice plants and methods for identifying same | |
| CN103597079B (zh) | 棉花转基因事件mon88701及其使用方法 | |
| US11866721B2 (en) | Methods and compositions for selective regulation of protein expression | |
| UA126903C2 (uk) | Об'єкт кукурудзи mon 87411 | |
| CN103827305B (zh) | 草甘膦耐受性玉米事件vco‑φ1981‑5及用于其检测的试剂盒和方法 | |
| UA121189C2 (uk) | Конструкція рекомбінантної днк, яка індукує чоловічу стерильність в трансгенній рослині, та спосіб її застосування | |
| CN106164254A (zh) | 用于诱导一种无融合生殖即孤雌繁殖的基因 | |
| UA122197C2 (uk) | Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах | |
| CN110144363A (zh) | 抗虫耐除草剂玉米转化事件 | |
| US20190017067A1 (en) | Glyphosate tolerant plants having modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene regulation | |
| CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
| WO2022094790A1 (zh) | 玉米事件2a-7及其鉴定方法 | |
| CN114514330A (zh) | 用于检测甘蓝型油菜中染色体易位的组合物和方法 | |
| BR122020010665B1 (pt) | Molécula de dna recombinante, método para regular seletivamente a expressão de uma proteína em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica, e uso de uma planta ou semente compreendendo a referida molécula de dna recombinante |