BR112018001192B1 - Molécula de dna recombinante, método para regular seletivamente a expressão de uma proteína em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica, e uso de uma planta ou semente que compreende a referida molécula de dna recombinante - Google Patents
Molécula de dna recombinante, método para regular seletivamente a expressão de uma proteína em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica, e uso de uma planta ou semente que compreende a referida molécula de dna recombinante Download PDFInfo
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Abstract
métodos e composições para a regulação seletiva da expressão de proteínas. a presente invenção proporciona novas moléculas, composições e métodos de dna recombinante novos para regular seletivamente a expressão de uma molécula polinucleotídica transcritível ou proteína recombinante em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica. a invenção também proporciona plantas transgênicas, células vegetais, partes de plantas, sementes e produtos de commodities que compreendem tais moléculas e composições de dna.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório No. de Série US 62/195,546, depositado em 22 de julho de 2015 incorporado na íntegra neste documento por meio de referência.
[0002] A lista de sequências contida no arquivo chamado "MONS392WO_ST25.txt", que tem 26,3 kilobytes (medidos no sistema operacional MS-Windows), criada em 28 de junho de 2016, é arquivada e incorporada no presente documento por referência.
[0003] A invenção relaciona-se de modo geral com os campos da agricultura, da criação de plantas e da biologia molecular. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos e composições para regular seletivamente a expressão da proteína no tecido reprodutor masculino de plantas transgênicas e suas utilizações.
[0004] A semente híbrida é produzida por hibridação ou fertilização cruzada de plantas estreitamente relacionadas e pode ser cultivada em plantas híbridas de progenitura possuindo uma combinação desejável de características não possuídas por nenhuma das plantas primárias. As plantas híbridas podem apresentar características agronômicas superiores, como um aumento do tamanho da planta, rendimento, composição nutricional, resistência a doenças, tolerância a herbicidas, tolerância ao estresse, adaptação climática e outras características desejáveis. A produção eficiente de sementes híbridas exige que o próprio pólen de uma planta não possa autofertilizar a planta. Uma grande limitação na produção de sementes híbridas para muitas culturas é a falta de métodos simples, confiáveis e econômicos de fabricação de plantas esterilizadas e incapazes de autofertilização.
[0005] Na produção de sementes híbridas, a produção de pólen e o pólen eliminado podem ser evitados em uma planta parental feminina a fim de facilitar a polinização cruzada da fêmea em vez da autopolinização. Tal prevenção pode ser obtida, por exemplo, pela remoção manual das estruturas contendo pólen (por exemplo, por desminagem manual ou mecânica do milho), pelo uso de um meio genético de controle de polinização (por exemplo, usando tecnologia de esterilidade masculina citoplasmática ou tecnologia de esterilidade masculina nuclear), pelo uso de um agente químico ou qualquer combinação destes. Isso pode ser um processo intensivo em mão-de- obra e, portanto, caro. No milho, por exemplo, a desminagem costuma ser feita em duas etapas: a desminagem mecânica seguida da desminagem manual. A produção comercial de sementes híbridas utilizando exclusivamente gametocidas químicos é limitada principalmente pela sua falta geral de seletividade quanto a gametas e seu efeito nas outras partes da planta. Assim, métodos para melhorar a eficiência da produção de sementes híbridas são altamente desejáveis.
[0006] A invenção refere-se, em geral, a melhorias nos métodos de regulação seletiva da expressão da proteína no tecido reprodutor masculino de plantas transgênicas, moléculas de DNA recombinante úteis nesses métodos, bem como plantas, células e sementes transgênicas contendo tais moléculas de DNA recombinante. A invenção proporciona uma melhoria em relação à técnica ao proporcionar elementos alvos de siRNA específicos do tecido masculino (mts-siRNA) capazes de proporcionar uma regulação seletiva melhorada da expressão de uma proteína codificada por uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita e de proporcionar moléculas e composições de DNA recombinante compreendendo tais elementos alvos de Mts-siRNA e métodos de uso desses elementos alvos de Mts- siRNA para induzir a esterilidade masculina em plantas transgênicas para a produção de sementes híbridas.
[0007] Em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula de DNA recombinante compreendendo um elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita. Em uma modalidade, o elemento alvo de mts- siRNA está incluído em uma região não traduzida 3' ligada operacionalmente à molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita. Em outra modalidade, o elemento alvo do Mts-siRNA está localizado entre a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita e uma sequência de poliadenilação operacionalmente ligada que faz parte de uma região 3' não traduzida. Em uma modalidade, o elemento alvo do Mts-siRNA compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-16, 23-92 e seus complementos. Em outra modalidade, a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita confere tolerância a herbicidas, por exemplo: tolerância vegetativa a herbicidas, a uma planta. Em outra modalidade, a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita não confere tolerância a herbicidas a uma planta reprodutiva masculina. Em outra modalidade, a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita é uma 5-enolipiruvilchiquimato 3- fosfato sintase tolerante ao glifosato (EPSPS).
[0008] Em outro aspecto, a invenção proporciona um construto de DNA recombinante compreendendo um elemento alvo do Mts-siRNA operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica transcritível heteróloga.
[0009] Em um aspecto adicional, a invenção proporciona um método de produção de uma molécula de DNA recombinante compreendendo a ligação operacional de ao menos um elemento alvo de Mts-siRNA a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita. Em uma modalidade, o elemento alvo do Mts-siRNA compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-16, 23-92 e seus complementos.
[0010] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma planta transgênica que compreende um elemento alvo de mts-siRNA da invenção. Em uma modalidade, a planta transgênica compreende o elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita. Em outra modalidade, o elemento alvo do Mts-siRNA compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-16, 23-92 e seus complementos. Em outra modalidade, ainda, a planta transgênica é produzida pela transformação de uma planta com uma molécula de DNA recombinante ou com um construto de DNA compreendendo ao menos um elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita. Em um aspecto adicional, a invenção proporciona uma semente, célula ou parte dessa planta transgênica. Em uma modalidade, a planta é uma planta monocotiledônica. Em outra modalidade, a planta é uma planta de milho (Zea mays).
[0011] Em outro aspecto, a invenção também proporciona um método para regular seletivamente a expressão de uma proteína em um tecido reprodutor masculino de uma planta transgênica, expressando na planta transgênica uma molécula de DNA recombinante que compreende um elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita. Em uma modalidade, o elemento alvo do Mts-siRNA compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-16, 23-92 e seus complementos. Em outra modalidade, a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita confere tolerância a herbicidas, por exemplo: tolerância vegetativa a herbicidas, a uma planta. Em outra modalidade, a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita não confere tolerância a herbicidas a uma planta reprodutiva masculina. Em outra modalidade, a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita é um EPSPS tolerante ao glifosato.
[0012] Em outro aspecto, ainda, a invenção prevê um método de indução da esterilidade masculina em uma planta transgênica, incluindo a etapa de aplicação de herbicida a uma planta transgênica que tem no seu genoma uma molécula de DNA recombinante compreendendo um elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita que confere tolerância a pelo menos um primeiro herbicida à planta transgênica, em que o herbicida é aplicado antes do ou simultaneamente com o desenvolvimento do tecido reprodutivo masculino da planta transgênica, induzindo assim a esterilidade masculina na planta transgênica. Em uma modalidade, a molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita confere tolerância vegetativa a herbicidas, mas não confere tolerância a herbicidas à planta transgênica masculina reprodutiva. Em outra modalidade, a planta transgênica é uma planta de milho. Em outra modalidade, a aplicação do herbicida evita pelo menos um desenvolvimento de pólen, o derramamento de pólen ou a extrusão de antera na planta transgênica tratada. Em outra modalidade, o estágio de desenvolvimento do tecido reprodutivo masculino durante o qual o herbicida é aplicado é um estágio selecionado do grupo que consiste nas fases V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 e V14 do desenvolvimento da planta de milho. Em outra modalidade, o herbicida é selecionado do grupo que consiste na coenzima A da acetil carboxilase (ACCase), inibidores de acetolactato sintase (ALS), inibidores de fotossistema II (PSII), inibidores de protoporfirinogeno oxidase (PPO), inibidores de 4-hidroxifenil dioxigenase (HPPD), inibidores de 5-enolipuvil shiquimato 3-fosfato sintase (EPSPS), inibidores de glutamina sintetase (GS) e auxinas sintéticas. Em outra modalidade, o herbicida é o glifosato e o polinucleotídeo conversível heterólogo codifica um EPSPS tolerante ao glifosato.
[0013] Em um aspecto, a invenção também proporciona um método de produção de semente híbrida compreendendo a aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida a uma planta transgênica compreendendo no seu genoma uma molécula de DNA recombinante que compreende um elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita, em que o herbicida é aplicado antes do ou simultaneamente com o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino da planta transgênica, induzindo assim a esterilidade masculina na planta transgênica; fertilizando a planta transgênica com pólen de uma segunda planta; e permitindo formar uma semente híbrida a partir da planta transgênica. Em uma modalidade, a planta transgênica é o milho. Em outra modalidade, o herbicida é o glifosato e o polinucleotídeo conversível heterólogo é um EPSPS tolerante ao glifosato. Em outra modalidade, o glifosato é aplicado simultaneamente com o desenvolvimento em uma quantidade eficaz de cerca de 0.040375 quilograma (0,125 libra) de um equivalente de ácido por acre a cerca de 2.584 quilogramas (8 libras) de equivalente de ácido por acre. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma semente híbrida produzida por esse método. Em uma modalidade, a semente híbrida compreende a molécula de DNA recombinante.
[0014] Outras modalidades específicas da invenção estão descritas na seguinte descrição detalhada. Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações, a menos que o contexto requeira de outra forma, a palavra "compreender" e suas variações, tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro, elemento ou etapa ou grupo de números inteiros, elementos ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro, elemento ou etapa ou grupo de números inteiros, elementos ou etapas.
[0015] Figura 1. A ilustração dos estágios de desenvolvimento do pendão V7 em T2, V8/V9 em T4, V10/V11 em T5, V12 em T6 e VT em T7 mostrando o tamanho e a morfologia do pendão com as fotografias do painel inferior das seções transversais de anteras mostrando o estágio de desenvolvimento do pólen. Os estágios anteriores (V10/V11 e V12) utilizados na técnica para isolar moléculas de RNA pequenas para identificação de moléculas de mts-siRNA são indicados por uma caixa com uma linha contínua; as etapas (V7, V8/V9, V10/V11 e V12) aqui descritas para isolar moléculas de RNA pequenas são indicadas por uma caixa com linha tracejada.
[0016] Figura 2. A representação gráfica do alinhamento das sequências de mts-siRNA na sequência de cDNA fornecida como a SEQ ID NO: 17. A sequência de cDNA é indicada a partir do nucleotídeo 1 até o 1826 e as linhas curtas representam o alinhamento da cadeia complementar das sequências de mts-siRNA individuais ou trechos das sequências de mts-siRNA adjacentes ou das sequências de mts-siRNA sobrepostas (linhas relativamente mais longas) até a sequência de cDNA. As sequências de mts-siRNA que são da mesma cadeia que o cDNA não são mostradas. O nível de expressão relativa normalizado de mts-siRNA é indicado à esquerda. A área com caixa representa uma região da sequência de cDNA rica em alvos de mts-siRNA.
[0017] Figura 3. O diagrama que ilustra mts-siRNA de cadeia dupla, mts-siRNA de cadeia simples, sequência alvo de mts-siRNA em um mRNA e uma região de mRNA com um alto número de sequências alvo de mts-siRNA úteis como elemento alvo de mts-siRNA.
[0018] Figura 4. A fotografia de pendão de milho R0 e do pólen corado com corante Alexander de plantas transgênicas de cópia dupla contendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo um transgene que codifica uma proteína de EPSPS tolerante ao glifosato operacionalmente ligada a um elemento alvo de mts-siRNA (SEQ ID NO: 2). Os eventos de 1 a 4 foram pulverizados com herbicida de glifosato de 0,75 lb ae/acre em V5 seguido do estágio V8 e apresentaram pendões com esterilidade masculina completa, tal como definido pela ausência de sementes e grãos de pólen não viáveis ou ausência de grãos de pólen detectados nas anteras. As plantas de controle não receberam aplicação de glifosato e apresentaram ântese normal e derramamento de pólen, e a observação microscópica detectou grãos de pólen normais.
[0019] SEQ ID NO: 1 - Sequência de um elemento alvo de mts- siRNA com identidade de sequência de 95% com as posições nucleotídicas de 1429 a 1628 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 17.
[0020] SEQ ID NO: 2 - Sequência de elementos alvos de mts-siRNA com identidade de sequência de 95% com as posições nucleotídicas de 1429 a 1628 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO:17 e tendo uma única alteração de nucleotídeo (T69A) em relação à SEQ ID NO:1.
[0021] SEQ ID NO: 3 - Uma sequência de elementos alvos de mts- siRNA que corresponde às posições nucleotídicas de 239 a 433 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 18.
[0022] SEQ ID NO: 4 - Uma sequência de elementos alvos de mts- siRNA que corresponde às posições nucleotídicas de 477 a 697 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 18.
[0023] SEQ ID NO: 5 - Uma sequência de elementos alvos de mts- siRNA que corresponde às posições nucleotídicas de 239 a 433 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 19.
[0024] SEQ ID NO: 6 - Uma sequência de elementos alvos de mts- siRNA que corresponde às posições nucleotídicas de 370 a 477 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 19.
[0025] SEQ ID NO: 7 - Uma sequência de elementos alvos de mts- siRNA que corresponde às posições nucleotídicas de 1357 a 1562 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 20.
[0026] SEQ ID NO: 8 - Uma sequência de elementos alvos de mts- siRNA que corresponde às posições nucleotídicas de 247 a 441 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 21.
[0027] SEQ ID NO: 9 - O complemento reverso de uma sequência de elemento alvo de mts-siRNA com 99% de identidade de sequência com as posições nucleotídicas de 191 a 490 da sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 22 com três desajustes nucleotídicos (C314A, A350G e G408A).
[0028] SEQ ID NOs: 10-16 - Sequências de elementos alvos de mts- siRNA recombinante.
[0029] SEQ ID NO: 17 - Sequência de cDNA contendo pelo menos uma região rica em sequências alvo de mts-siRNA. Contém as sequências de elementos alvos de mts-siRNA representadas pelas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 e alinham-se às sequências de mts-siRNA da SEQ ID NO: 23-31.
[0030] SEQ ID NO: 18 - Sequência de cDNA contendo pelo menos uma região rica em sequências alvo de mts-siRNA. Contém as sequências de elementos alvos de mts-siRNA representadas pelas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e alinha-se às sequências de mts-siRNA da SEQ ID NO: 32-42.
[0031] SEQ ID NO: 19 - Sequência de cDNA contendo pelo menos uma região rica em sequências alvo de mts-siRNA. Contém as sequências de elementos alvos de mts-siRNA representadas pelas SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e alinha-se às sequências de mts-siRNA da SEQ ID NO: 43-52.
[0032] SEQ ID NO: 20 - Sequência de cDNA contendo pelo menos uma região rica em sequências alvo de mts-siRNA. Contém a sequência de elementos alvos de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO: 7 e alinha-se às sequências de mts-siRNA das SEQ ID NOs: 53-60.
[0033] SEQ ID NO: 21 - Sequência de cDNA contendo pelo menos uma região rica em sequências alvo de mts-siRNA. Contém a sequência de elementos alvos de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO: 8 e alinha-se às sequências de mts-siRNA das SEQ ID NOs: 61-69.
[0034] SEQ ID NO: 22 - Sequência de cDNA contendo pelo menos uma região rica em sequências alvo de mts-siRNA. Contém a sequência de elementos alvos de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO: 9 e alinha-se às sequências de mts-siRNA das SEQ ID NOs: 70-87.
[0035] SEQ ID NO: 23-92 - Sequências de DNA correspondents às sequências de mts-siRNA da invenção que se alinham às sequências de cDNA aqui apresentadas como SEQ ID NO: 17-22.
[0036] A invenção proporciona moléculas, composições e métodos de DNA recombinante para regular seletivamente a expressão da proteína, por exemplo, a expressão de uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita, em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica e suas utilizações. Em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula de DNA recombinante que inclui um elemento alvo de RNA de interferência pequeno (mts-siRNA) específico do tecido masculino ligado operacionalmente a um polinucleotídeo heterólogo que pode ser transcrito. Essas moléculas de DNA recombinante são úteis para regular seletivamente a expressão de um polinucleotídeo heterólogo que pode ser transcrito em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica. As sequências de ácido nucleico podem ser fornecidas como DNA ou como RNA, conforme especificado; a divulgação de um define necessariamente a do outro, como é sabido por aqueles versados na técnica. Além disso, a divulgação de uma determinada sequência de ácido nucleico define necessariamente e inclui o complemento dessa sequência, como é sabido por aqueles versados na técnica.
[0037] O RNA de interferência pequeno (siRNA) é uma classe de moléculas de RNA de cerca de 18-26 nucleotídeos (nt) de comprimento (por exemplo, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 nt). Uma sequência de siRNA pode ser representada utilizando a sequência de nucleotídeos de RNA consistindo em guanina (G), citosina (C), adenina (A) e uracil (U) ou utilizando a sequência de nucleotídeos de DNA equivalente de guanina (G), citosina (C), adenina (A) e timina (T). O siRNA funciona dentro dos complexos de silenciamento induzidos por RNA (RISCs) para desencadear a degradação específica da sequência de RNA mensageiro (mRNA), o que resulta na ruptura da expressão do gene e na redução da proteína codificada pelo gene.
[0038] Um "siRNA específico do tecido masculino" ou "mts-siRNA" é um siRNA enriquecido ou expresso especificamente no(s) tecido(s) reprodutivo(s) masculino(s) (por exemplo, inflorescência masculina) de uma planta, tendo assim um padrão de expressão específico do tecido masculino. O siRNA específico do tecido masculino foi identificado em plantas e pode ser detectado usando técnicas conhecidas na técnica, como a análise por northern de baixo peso molecular. Uma "sequência de mts-siRNA" é a sequência de ácido nucleico de um mts-siRNA. Exemplos de sequências de mts-siRNA na forma da sequência de DNA correspondente da molécula de mRNA de cadeia dupla são aqui apresentados como SEQ ID NOs: 23-92.
[0039] Uma sequência de DNA que é complementar a uma sequência de mts-siRNA é aqui referida como um "alvo de mts-siRNA". O alvo de mts-siRNA está contido na sequência de DNA de um gene e é transcrito na sequência de RNA da molécula de mRNA correspondente. Uma única cadeia de uma molécula de mts-siRNA de cadeia dupla pode então se ligar ou se hibridizar sob condições fisiológicas típicas ao alvo de mts-siRNA na molécula de mRNA. Vide a Figura 3. Uma sequência de ácido nucleico é complementar a uma sequência de mts-siRNA se um alinhamento das duas sequências de ácido nucleico produzir uma correspondência exata (sem desajustes, isto é, complemento completo), um desajuste, dois desajustes ou três desajustes ao longo da sequência de mts-siRNA. As sequências complementares podem se unir entre si de acordo com as regras de complementaridade de Watson-Crick convencionais (isto é, pares de guanina com pares de citosina (G:C) e adenina com timina (A:T) ou uracil (A:U). Uma "sequência de mts-siRNA" é a sequência de ácido nucleico de um alvo de mts-siRNA. Exemplos de sequências de alvo de mts-siRNA são apresentadas aqui como SEQ ID NOs: 23-92.
[0040] Mais de um alvo de mts-siRNA pode ser agrupado ou até se sobrepor dentro de uma única molécula de DNA. Uma molécula de DNA compreendendo mais de um alvo de mts-siRNA é aqui referida como um "elemento alvo de mts-siRNA". Um elemento alvo de mts-siRNA compreende pelo menos dois ou mais alvos de mts-siRNA dentro de uma janela de sequência de 500 nucleotídeos. Um elemento alvo de mts-siRNA pode ter qualquer comprimento, como cerca de 30 nucleotídeos (nt), cerca de 40 nt, cerca de 50 nt, cerca de 60 nt, cerca de 70 nt, cerca de 80 nt, cerca de 90 nt, cerca de 100 nt, cerca de 150 nt, cerca de 200 nt, cerca de 250 nt, cerca de 300 nt, cerca de 350 nt, cerca de 400 nt, cerca de 450 nt ou cerca de 500 nt. Uma "sequência de elementos alvo de mts-siRNA" é a sequência de ácido nucleico de um elemento alvo de mts-siRNA. Exemplos de sequências de um elemento alvo de mts-siRNA são apresentadas aqui como SEQ ID NOs: 1-16.
[0041] Tal como aqui utilizado, uma molécula, polipeptídeo, proteína, célula ou organismo de DNA "recombinante" pode ser uma criação não natural ou criada pelo homem, utilizando as ferramentas da engenharia genética e, como tal, é produto da atividade humana e normalmente não ocorreria na natureza. Uma "molécula de DNA recombinante" refere-se a uma molécula de DNA compreendendo uma combinação de sequências de DNA ou moléculas que não ocorreriam juntamente na natureza sem intervenção humana. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante pode ser uma molécula de DNA que é composta por pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas em relação umas às outras, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que se desvia das sequências de DNA que existem na natureza, ou uma molécula de DNA que foi incorporada no DNA de uma célula hospedeira por transformação genética. Em uma modalidade, uma molécula de DNA recombinante da invenção é uma molécula de DNA que compreende um elemento alvo de mts-siRNA ligado operacionalmente a pelo menos uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita, por exemplo, uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita ao elemento alvo de mts-siRNA. Tal como aqui utilizada, uma molécula ou célula ou organismo "recombinante" pode se referir àqueles produzidos pelo homem.
[0042] Tal como aqui utilizado, o termo "heterólogo" refere-se à combinação de duas ou mais moléculas ou proteínas de DNA quando tal combinação não é encontrada normalmente na natureza ou quando tal combinação é proporcionada em uma orientação ou ordem que é diferente da encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de espécies diferentes ou criadas sinteticamente e/ou as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, os genes diferentes da mesma espécie ou os mesmos genes de espécies diferentes. Em um exemplo, um elemento regulador ou um elemento alvo de mts-siRNA pode ser heterólogo em relação a uma molécula polinucleotídica transcritível operacionalmente ligada se tal combinação não for encontrada normalmente na natureza, isto é, a molécula polinucleotídica transcritível não ocorre naturalmente ligada operacionalmente ao elemento regulador ou ao elemento alvo de mts-siRNA. Em uma modalidade, essa combinação heteróloga pode compreender um elemento alvo de mts-siRNA que pode ser um derivado da planta ou sintetizado quimicamente e pode estar operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita, tal como um transgene bacteriano que codifica uma proteína para tolerância a herbicidas, como uma cp4-EPSPS (por exemplo, conforme apresentada aqui, como SEQ ID NO: 93). Além disso, uma sequência específica pode ser "heteróloga" em relação a uma célula ou organismo em que ela é introduzida (por exemplo, uma sequência que não ocorre naturalmente na célula ou organismo específicos).
[0043] Tal como aqui utilizado, o termo "isolado" significa separado de outras moléculas tipicamente associadas a ela no seu estado natural. Por exemplo, uma molécula de DNA isolada é aquela que está presente isoladamente ou em combinação com outras composições, mas não está em sua localização ou estado genômico natural. Em uma modalidade, o termo "isolado" se refere a uma molécula de DNA que é separadora de ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam a molécula de DNA em seu estado natural. Por exemplo, uma molécula de DNA isolada pode ser uma molécula de DNA que é composta por pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas umas em relação às outras. Em outro exemplo, uma molécula de DNA isolada pode ser uma molécula de DNA que foi incorporada a um novo local genômico em uma célula hospedeira por transformação genética. Assim, uma molécula de DNA fundida ou operacionalmente ligada a uma ou mais moléculas de DNA com as quais não estaria associada na natureza, por exemplo, como resultado de técnicas de transformação de DNA recombinante ou de plantas, é considerada isoladamente aqui. Essas moléculas são consideradas isoladas mesmo quando integradas no cromossomo de uma célula hospedeira ou presentes em uma solução de ácido nucleico com outras moléculas de DNA.
[0044] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a pelo menos duas moléculas de nucleotídeos dispostas ou ligadas de uma maneira tal que uma possa afetar a função da outra. As duas moléculas de nucleotídeos podem ser parte de uma única molécula de nucleotídeo contígua e podem ser adjacentes ou separadas. Por exemplo, um elemento alvo de mts-siRNA pode estar operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica transcritível. Em uma modalidade, uma molécula de mts-siRNA operacionalmente ligada pode afetar a transcrição, a tradução ou a expressão da molécula polinucleotídica que pode ser transcrita. Por exemplo, um elemento alvo de mts-siRNA está operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita se, após a transcrição na célula do tecido reprodutivo masculino, a presença do elemento alvo de mts-siRNA na molécula de mRNA resulta na regulação da expressão da molécula polinucleotídica que pode ser transcrita na célula induzida pelo mts-siRNA endógeno e a via de RISC. A ligação operável do elemento alvo de mts-siRNA e a molécula polinucleotídica que pode ser transcrita podem ser obtidas, por exemplo, através da incorporação de um elemento alvo de mts-siRNA adjacente à molécula polinucleotídica que pode ser transcrita (por exemplo, localizado em 5' ou 3' na molécula polinucleotídica que pode ser transcrita, mas não necessariamente na ligação contígua), dentro de ou adjacente a uma região não traduzida (UTR) da molécula polinucleotídica (por exemplo, localizada em ou ao lado da UTR 5' ou UTR 3') e/ou 3' em relação à molécula polinucleotídica que pode ser transcrita e 5' em relação ao sinal de poliadenilação. Em uma modalidade, um elemento alvo de mts-siRNA está localizado entre a molécula polinucleotídica que pode ser transcrita e a sequência de poliadenilação, que está em 3' e é adjacente à molécula polinucleotídica que pode ser transcrita. Em outra modalidade, o elemento alvo de mts- siRNA está localizado entre o códon de parada da molécula polinucleotídica que pode ser transcrita e a sequência de poliadenilação. Em outra modalidade, um elemento alvo de mts-siRNA está localizado na sequência UTR 3' adjacente à molécula polinucleotídica que pode ser transcrita.
[0045] Exemplos de identificação de mts-siRNA, mts-siRNA e elementos alvo de mts-siRNA são aqui fornecidos e podem ser identificados por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo: através de análises bioinformáticas de bibliotecas de sRNA e cDNA. Em particular, o mts-siRNA pode ser identificado a partir de bibliotecas de sRNA e sequenciado. As sequências identificadas de mts-siRNA podem ser comparadas com coleções de sequência de cDNA e/ou de sequência genômica para identificar alvos de mts-siRNA e elementos alvo de mts-siRNA úteis para o desenvolvimento das moléculas e dos construtos de DNA recombinante, conforme descrito aqui.
[0046] Em algumas modalidades, os elementos alvo de mts-siRNA são criados, sintetizados ou modificados in vitro. Por exemplo, os elementos alvo de mts-siRNA podem ser modificados para conter mais ou menos sequências alvo de mts-siRNA, ou diferentes, para reorganizar a posição relativa de uma ou mais sequências alvo de mts- siRNA. Em algumas modalidades, essa modificação pode ser benéfica para aumentar ou diminuir o efeito do elemento alvo de mts-siRNA. Os métodos para criação, síntese ou modificação in vitro de um elemento alvo de mts-siRNA e para determinar a variação ideal ao nível de regulação desejado são conhecidos por aqueles versados na técnica. Podem ser criados exemplos de elementos recombinantes alvo de mts- siRNA, combinando-se as sequências de DNA, ou fragmentos destes, de dois ou mais alvos de mts-siRNA, dois ou mais elementos alvo de mts-siRNA, duas ou mais regiões de cDNA ricas em alvo de mts-siRNA ou um ou mais alvos de mts-siRNA e fragmentos de duas ou mais regiões de cDNA ricas em alvos de mts-siRNA, por exemplo, combinando todos ou fragmentos de dois ou mais dos elementos alvo de mts-siRNA aqui apresentados como SEQ ID NO: 1-9, pela combinação de duas ou mais das sequências de mts-siRNA aqui apresentadas como SEQ ID NO: 23-92 ou pela combinação de todos ou fragmentos de dois ou mais dos elementos alvo de mts-siRNA aqui apresentados como SEQ ID NO: 1-9 com uma ou mais das sequências de mts-siRNA aqui apresentadas como SEQ ID NO: 23-92. Tais exemplares de elementos de mts-siRNA recombinante são aqui apresentados como SEQ ID NO: 10-16.
[0047] A sequência de DNA do elemento alvo de mts-siRNA também pode ser variada incorporando-se 1-3 desajustes de nucleotídeos em uma sequência alvo de mts-siRNA (em relação a uma determinada sequência de mts-siRNA). Em outra modalidade, a presente invenção inclui moléculas de DNA recombinante ou elementos alvo de mts-siRNA tendo pelo menos cerca de 80% (por cento) de identidade de sequência, cerca de 85% de identidade de sequência, cerca de 90% de identidade de sequência, cerca de 91% de identidade de sequência, cerca de 92% identidade de sequência, cerca de 93% de identidade de sequência, cerca de 94% de identidade de sequência, cerca de 95% de identidade de sequência, cerca de 96% de identidade de sequência, cerca de 97% de identidade de sequência, cerca de 98% de identidade de sequência e cerca de 99% de identidade de sequência com qualquer uma das moléculas de DNA, elementos alvo de mts- siRNA (por exemplo, as SEQ ID NOs: 1-9), elementos alvo recombinantes de mts-siRNA (por exemplo, as SEQ ID NOs: 10-16) ou sequências de cDNA (por exemplo, as SEQ ID NOs: 17-22) da presente invenção.
[0048] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona fragmentos de uma molécula de DNA divulgada aqui. Esses fragmentos podem ser úteis como elementos alvo de mts-siRNA ou podem ser combinados com outros elementos alvo de mts-siRNA, sequências de mt-siRNA ou seus fragmentos para a construção de elementos alvo de mts-siRNA recombinantes, como descrito acima. Em modalidades específicas, tais fragmentos podem compreender pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 110, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 130, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 170, pelo menos cerca de 180, pelo menos cerca de 190, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 210, pelo menos cerca de 220, pelo menos cerca de 230, pelo menos cerca de 240, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 260, pelo menos cerca de 270, pelo menos cerca de 280, pelo menos cerca de 290, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 350, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500 nucleotídeos contíguos, ou mais, de uma molécula de DNA divulgada aqui, como um elemento alvo de mts-siRNA ou uma sequência de cDNA conforme divulgada aqui. Os métodos para a produção de tais fragmentos a partir de uma molécula de DNA de partida são bem conhecidos na técnica.
[0049] A eficácia das modificações, duplicações, exclusões ou reorganizações aqui descritas nos aspectos de expressão desejados de uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita específica pode ser testada empiricamente em ensaios de plantas estáveis e transientes, tais como os descritos nos exemplos de trabalho aqui descritos, de modo a validar os resultados, que podem variar dependendo das alterações feitas e o objetivo da mudança na molécula de DNA de partida.
[0050] Um alvo de mts-siRNA e um elemento alvo de mts-siRNA podem funcionar em qualquer direção, o que significa que não é direcional, e como tal pode ser usado na orientação 5' a 3' ou na orientação 3' a 5' em uma molécula de DNA recombinante ou um construto de DNA.
[0051] Tal como aqui utilizado, "expressão de uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita" ou "expressão de uma proteína" refere-se à produção de uma proteína de uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita e a transcrição resultante (mRNA) em uma célula. O termo "expressão da proteína", portanto, refere-se a qualquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrita em uma molécula da proteína. A expressão da proteína pode ser caracterizada pelas suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento, ou morfológicas, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas. Em uma modalidade, as moléculas de DNA recombinante da invenção podem ser utilizadas para regular seletivamente a expressão de uma proteína ou molécula polinucleotídica que pode ser transcrita em tecidos reprodutores masculinos de uma planta transgênica. Nessa modalidade, a expressão da molécula de DNA recombinante em uma planta transgênica pode resultar na expressão de uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita operacionalmente ligada no mínimo em tecidos vegetativos, mas não em tecidos reprodutores masculinos. Em certas modalidades, essa regulação da expressão da proteína refere-se à supressão ou à redução; por exemplo, suprimindo ou reduzindo o nível da proteína produzida em uma célula, por exemplo: através da regulação de genes pós-transcrição mediada por RNAi.
[0052] A regulação seletiva da expressão da proteína como aqui utilizada refere-se a uma redução da produção de proteínas em uma célula ou tecido em comparação com uma célula ou tecido de referência em pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de redução (isto é, redução completa). Uma célula ou tecido de referência pode ser, por exemplo, uma célula ou tecido vegetativo da mesma planta ou de uma planta transgênica semelhante que expressa a proteína ou uma célula ou tecido de uma planta transgênica com um transgene similar que codifica a proteína, mas que não tem uma molécula do elemento alvo de mts- siRNA. A regulação da expressão da proteína pode ser determinada utilizando qualquer técnica conhecida por alguém versado na técnica, por exemplo: medindo-se diretamente o acúmulo de proteínas em uma amostra de células ou tecido utilizando uma técnica tal como ELISA ou Western Blot, medindo a atividade enzimática da proteína ou determinando fenotipicamente a expressão da proteína. Em uma modalidade, a regulação seletiva da expressão da proteína refere-se a uma redução suficiente na expressão de uma proteína capaz de conferir tolerância a herbicidas no tecido masculino de uma planta transgênica para resultar em um fenótipo detectável de fertilidade masculina alterada em uma planta transgênica à qual foi aplicado herbicida como um spray de esterilidade induzida. A detecção de fertilidade masculina alterada nessa planta transgênica, portanto, indicaria a regulação seletiva da expressão proteica.
[0053] Tal como aqui utilizado, o termo "transgene que codifica uma proteína recombinante" ou "molécula polinucleotídica que pode ser transcrita" refere-se a qualquer molécula de nucleotídeo capaz de ser transcrita em uma molécula de RNA, incluindo, sem limitação, aquelas que têm uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência polipeptídica. Dependendo das condições, a sequência de nucleotídeos pode ou não ser realmente traduzida em uma molécula de polipeptídeo em uma célula. Os limites de uma molécula polinucleotídica de transgene ou que pode ser transcrita geralmente são delineadas por um códon de partida de tradução do terminal 5' e um códon de parada de tradução no terminal 3'.
[0054] O termo "transgene" refere-se a uma molécula de DNA incorporada artificialmente no genoma de um organismo ou célula hospedeira, na geração atual ou anterior do organismo ou célula, como resultado da intervenção humana, por exemplo: por métodos de transformação de plantas. Tal como aqui utilizado, o termo "transgênico" significa que compreende um transgene, por exemplo, uma "planta transgênica" refere-se a uma planta que compreende um transgene no seu genoma e um "traço transgênico" refere-se a uma característica ou fenótipo transmitida ou conferida pela presença de um transgene incorporado no genoma da planta. Como resultado dessa alteração genômica, a planta transgênica é algo distintamente diferente da planta de tipo selvagem relacionada e a característica transgênica é uma característica que não se encontra naturalmente na planta de tipo selvagem. As plantas transgênicas da invenção compreendem a molécula de DNA recombinante proporcionada pela invenção.
[0055] Uma molécula polinucleotídica de transgene ou que pode ser transcrita da invenção inclui, mas não está limitada a, uma molécula polinucleotídica de transgene ou que pode ser transcrita que proporciona uma característica desejável associada à morfologia, à fisiologia, ao crescimento, ao desenvolvimento, ao rendimento, às propriedades nutricionais, à resistência a doenças, à resistência a pragas, à tolerância a herbicidas, à tolerância ao estresse, à tolerância ao estresse ambiental ou à tolerância química. Em uma modalidade, uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita da invenção codifica uma proteína que, quando expressa em uma planta transgênica, confere tolerância a herbicidas no mínimo em uma célula e/ou tecido em que a proteína expressa ocorre; a regulação seletiva da proteína de tolerância a herbicidas no tecido reprodutivo masculino da planta transgênica em conjunto com a aplicação atempada do herbicida resulta no mínimo em uma fertilidade masculina reduzida induzida ou na esterilidade masculina induzida.
[0056] Essa esterilidade masculina indutível combinada com a tolerância vegetativa a herbicidas pode ser utilizada para aumentar a eficiência com a qual a semente híbrida é produzida, por exemplo, eliminando ou reduzindo a necessidade de emascular fisicamente a planta de milho utilizada como fêmea em um determinado cruzamento durante a produção de sementes híbridas. Os sistemas de esterilidade masculina indutíveis com herbicidas foram descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.762.344; na Patente U.S. No. 8.618.358; e na Publicação de Patente U.S. 2013/0007908. Exemplos de herbicidas úteis na prática da invenção incluem, mas não estão limitados a, inibidores da coenzima A de acetil carboxilase (ACCase) (por exemplo, fops e dims), inibidores de acetolactato sintase (ALS) (por exemplo, sulfonilureias (SUs) e imidazolinonas (IMIs)), inibidores do sistema fotossensível II (PSII) (por exemplo, traiazinas e éteres fenílicos), inibidores de protoporfirinogênio oxidase (PPO) (por exemplo, flumioxazsina e fomesafeno), inibidores de 4-hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD) (por exemplo, isoxaflutol e tricetonas, tais como a mesotriona), inibidores de 5-enolipiruvilchiquimato 3-fosfato sintase (EPSPS) (por exemplo, glifosato), inibidores da glutamina sintetase (GS, por exemplo, glufosinato e fosfinotricina), auxinas sintéticas (por exemplo, 2,4- D e dicamba). Exemplos de transgenes ou moléculas polinucleotídicas que podem ser transcritas para utilização na prática da invenção incluem, mas não estão limitadas a, genes que codificam proteínas que conferem tolerância a inibidores de HPPD (tais como HPPD insensível a herbicidas), genes que codificam proteínas que conferem tolerância ao glifosinato (como pat e bar), genes que codificam proteínas que conferem tolerância ao glifosato (como um EPSPS tolerante ao glifosato, como cp4-epsps, aqui apresentado como SEQ ID NO: 93) e genes que codificam proteínas que conferem tolerância a uma auxina sintética, tal como dicamba (como a dicobam monoxigenase (DMO)) e 2,4-D (tal como (R)-diclorprop dioxigenase (rdpA)).
[0057] Os construtos de DNA recombinante da invenção podem incluir as moléculas de DNA recombinante da invenção e são feitas por técnicas conhecidas na técnica e em várias modalidades estão incluídas em vetores de transformação de plantas, plasmídeos ou DNA de plastídeo. Esses construtos de DNA recombinante são úteis para a produção de plantas e/ou células transgênicas e, desse modo, também podem ser contidas no DNA genômico de uma planta transgênica, semente, célula ou parte da planta. Esta invenção inclui, portanto, modalidades em que o construto de DNA recombinante está situado em um vetor de transformação da planta, em uma partícula biológica para transformar uma célula de planta ou em um cromossomo ou plastídeo de uma célula de planta transgênica ou em uma célula transgênica, tecido vegetal transgênico, sementes de plantas transgênicas, grãos de pólen transgênico ou uma planta transgênica ou parcialmente transgênica (por exemplo, enxertada). Um vetor é qualquer molécula de DNA que possa ser usada para fins de transformação de plantas, isto é, para a introdução de DNA em uma célula. Os construtos de DNA recombinante da invenção podem ser inseridos, por exemplo, em um vetor de transformação de plantas e utilizados para a transformação de plantas a fim de produzir plantas, sementes e células transgênicas. Os métodos para construir vetores de transformação de plantas são bem conhecidos na técnica. Os vetores de transformação de plantas da invenção geralmente incluem, mas não estão limitados a: um promotor adequado para a expressão de um DNA operacionalmente ligado, um construto de DNA recombinante operacionalmente ligado e um sinal de poliadenilação (que pode ser incluído em uma sequência 3'UTR). Promotores úteis na prática da invenção incluem aqueles que funcionam em uma planta para a expressão de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Esses promotores são variados e bem conhecidos no estado da técnica e incluem aqueles que são indutíveis, virais, sintéticos, constitutivos, temporalmente regulados, espacialmente regulados, e/ou espaço-temporalmente regulados. Os componentes opcionais adicionais incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes alvos: 5' UTR, um potencializador, um alvo de ação cis, íntrons, uma sequência de sinal, uma sequência peptídica de trânsito e um ou mais genes marcadores selecionáveis. Em uma modalidade, um vetor de transformação da planta compreende um construto de DNA recombinante.
[0058] Os construtos de DNA recombinante e os vetores de transformação de plantas da presente invenção são preparados por qualquer método adequado à aplicação desejada, levando em conta, por exemplo, o tipo de expressão desejada, a molécula polinucleotídica transcritível ou de transgene desejada e a conveniência do uso na planta em que o construto de DNA recombinante deve ser expresso. Os métodos gerais úteis para manipular moléculas de DNA para a produção e utilização de construtos de DNA recombinante e vetores de transformação de plantas são bem conhecidos na técnica e descritos em detalhes, por exemplo, em guias e manuais de laboratório, incluindo Michael R. Green e Joseph Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (quarta edição) ISBN: 978-1-936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2012).
[0059] As moléculas de DNA recombinante e os construtos da invenção podem ser modificadas por métodos conhecidos na técnica, tanto na totalidade quanto em partes, por exemplo, para aumentar a conveniência da manipulação do DNA (por exemplo, os locais de reconhecimento da enzima de restrição ou os locais de clonagem com base na recombinação) ou para incluir sequências preferidas em plantas (por exemplo, o uso de códons de plantas ou sequências de consenso de Kozak) ou para incluir sequências úteis para moléculas de DNA recombinante e para a concepção do construto (por exemplo, as sequências espaçadoras ou de ligação). Em certas modalidades, a sequência de DNA da molécula de DNA recombinante e o construto inclui uma sequência de DNA que foi otimizada por códon para a planta em que a molécula de DNA recombinante ou o construto devem ser expressos. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante ou construto para a serem expressos em uma planta podem ter sua totalidade ou sua sequência otimizada por códon em uma planta através de métodos conhecidos na técnica. As moléculas ou os construtos de DNA recombinante da invenção podem ser empilhados com outras moléculas de DNA recombinante ou eventos transgênicos para conferir características adicionais (por exemplo, no caso de plantas transformadas, características que incluem resistência a herbicidas, resistência a pragas, tolerância a germinação no frio e tolerância ao déficit hídrico), por exemplo, expressando ou regulando outros genes.
[0060] Um aspecto da invenção inclui células de plantas transgênicas, tecidos de plantas transgênicas e plantas ou sementes transgênicas que incluem uma molécula de DNA recombinante da invenção. Um outro aspecto da invenção inclui cromossomas vegetais artificiais ou recombinantes que incluem uma molécula de DNA recombinante da invenção. Os métodos adequados para a transformação de células de plantas hospedeiras para uso com a presente invenção incluem virtualmente qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula (por exemplo, em que uma molécula de DNA recombinante estável é integrada em um cromossomo de planta) e são conhecidos no estado da técnica. Um método exemplar e amplamente utilizado para a introdução de uma molécula de DNA recombinante em plantas é o sistema de transformação Agrobacterium, que é bem conhecido para aqueles versados na técnica. Outro método exemplificativo para a introdução de uma molécula de DNA recombinante em plantas é a inserção de uma molécula de DNA recombinante em um genoma de planta em um local pré-determinado por métodos de integração direcionada ao local. A integração direcionada ao local pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por meio de nucleases de dedo de zinco, meganucleases de modificação ou nativas, TALE-endonucleases ou uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, um sistema CRISPR/Cas9). Plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir de uma célula vegetal transformada pelos métodos de cultura de células vegetais. Uma planta transgênica homozigótica em relação a um transgene pode ser obtida por meio do acasalamento sexual (selfing) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma única sequência de genes exógenos, por exemplo, uma planta R0 ou F0, para produzir uma semente R1 ou F1. Um quarto da semente R1 ou F1 produzida será homozigótico em relação ao transgene. As plantas cultivadas a partir da germinação de sementes R1 ou F1 podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tipicamente utilizando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um teste de zigosidade).
[0061] A invenção proporciona uma planta transgênica tendo no seu genoma uma molécula de DNA recombinante da invenção, incluindo, sem limitação, alfafa, algodão, milho, canola, arroz, soja e trigo, entre outros. A invenção também fornece células de plantas transgênicas, partes de plantas e a progenitura de uma planta transgênica desse tipo. Tal como aqui utilizado, "progenia" inclui qualquer planta, semente, célula vegetal e/ou parte da planta produzida ou regenerada a partir de uma planta, semente, célula vegetal e/ou parte da planta que incluiu uma molécula de DNA recombinante da invenção. As plantas transgênicas, células, partes, plantas de progenia e as sementes produzidas a partir dessas plantas podem ser homozigóticas ou heterozigóticas para a molécula de DNA recombinante da invenção. As partes da planta da presente invenção podem incluir, mas não estão limitados a, folhas, caules, raízes, sementes, endospermas, óvulos e pólen. Partes de planta podem ser viáveis, não viáveis, regeneráveis ou não regeneráveis. A invenção também inclui e fornece células de plantas transformadas compreendendo uma molécula de DNA da invenção. As células de planta transformadas ou transgênicas da presente invenção incluem células de plantas regeneráveis e/ou não regeneráveis.
[0062] Incluem-se ainda nesta invenção modalidades em que a molécula de DNA recombinante está em um produto de base produzido a partir de uma planta transgênica, semente ou parte de planta desta invenção; tais produtos de commodities incluem, mas não estão limitados, a partes colhidas de uma planta, grãos ou sementes amassadas ou inteiras de uma planta ou qualquer alimento ou produto não alimentar que compreenda a molécula de DNA recombinante desta invenção.
[0063] A invenção proporciona um método para induzir esterilidade masculina em uma planta transgênica que compreende (a) o crescimento de uma planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante que compreende uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita heteróloga que confere tolerância a herbicidas ligada operacionalmente a um elemento alvo de mts-siRNA e (b) a aplicação de uma quantidade eficaz do herbicida na planta transgênica para induzir esterilidade masculina. Uma quantidade eficaz de um herbicida é uma quantidade suficiente para tornar uma planta transgênica, compreendendo uma molécula de DNA recombinante masculino estéril da invenção. Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de glifosato é de aproximadamente 0.040375 quilograma (0,125 libra) de equivalente de ácido por acre a cerca de 2.584 quilogramas (8 libras) de equivalente de ácido por acre. A aplicação de herbicida pode ser feita antes ou durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino, tal como em uma fase selecionada do grupo constituído pela etapa V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 e V14 do desenvolvimento da planta de milho e pode prevenir no mínimo o desenvolvimento de pólen, o derramamento de pólen ou a extrusão de antera.
[0064] Em uma modalidade, a prevenção do desenvolvimento de pólen, do derramamento de pólen ou da extrusão de antera podem resultar da esterilidade masculina e, portanto, a ausência de desenvolvimento de pólen, derramamento de pólen ou extrusão de antera pode ser uma indicação de esterilidade masculina. No entanto, em alguns casos, as plantas masculinas estéreis ainda podem desenvolver pequenas quantidades de pólen. Portanto, em certas modalidades, a presença de uma pequena quantidade de pólen não indica necessariamente plantas masculinas férteis ou falta de esterilidade masculina.
[0065] O desenvolvimento das plantas muitas vezes é determinado por uma escala de etapas baseada no desenvolvimento da planta. Para o milho, uma escala comum de desenvolvimento da planta utilizada na técnica é conhecida como etapas V. As etapas V são definidas de acordo com a folha mais elevada em que o colar da folha está visível. VE corresponde à emergência, V1 corresponde à primeira folha, V2 corresponde à segunda folha, V3 corresponde à terceira folha, V(n) corresponde à folha de número n. VT ocorre quando o último ramo do pendão está visível, mas antes que as sedas surjam. Ao montar um campo de milho, cada etapa V é definida somente quando 50 por cento ou mais das plantas no campo estão naquela etapa ou em uma etapa avançada. Outras escalas de desenvolvimento são conhecidas pelos versados na técnica e podem ser utilizadas com os métodos da invenção.
[0066] Outra ferramenta comum para prever e estimar as etapas de crescimento e desenvolvimento do milho são as Unidades de Grau Crescente (GDU). Um fator no crescimento e desenvolvimento do milho é o calor. O calor geralmente é medido em um único ponto no tempo e é expresso como temperatura, mas também pode ser medido ao longo de um período de tempo e ser expresso como unidades de calor. Essas unidades de calor são comumente conhecidas como GDUs. A GDU pode ser definida como a diferença entre a temperatura diária média e uma temperatura base selecionada sujeita a certas restrições. As GDUs são calculadas usando a seguinte equação: Unidade de Grau Crescente = {(H + L)/2} - B, onde H é a máxima diária (mas não superior a 86°F), L é a mínima diária (mas não inferior a 50°F) e B é a base de 50°F. Uma vez que o crescimento do milho é menor quando as temperaturas são superiores a 86°F ou inferiores a 50°F, os limites são fixados nas temperaturas máximas e mínimas diárias utilizadas na fórmula. O corte mais baixo da temperatura diária também impede o cálculo de valores negativos. Portanto, se a temperatura máxima diária exceder 86°F, a temperatura máxima diária utilizada na fórmula da GDU seria ajustada a 86°F. Inversamente, se a temperatura mínima diária ficar abaixo de 50°F, a temperatura mínima diária utilizada na fórmula da GDU seria ajustada a 50°F. Se a temperatura máxima diária não exceder 50°F, então nenhuma GDU é registrada nesse dia. A GDU máxima que uma planta de milho pode acumular em um dia é de 36, o mínimo é zero. A classificação de maturidade de uma planta de milho é identificada pela soma dos valores diários da GDU durante um período de tempo especificado. O período de tempo que a maioria dos produtores de sementes de milho usa é desde o ponto de plantação até a maturidade fisiológica ou o ponto em que o preenchimento de grãos está praticamente completo. Na maioria dos estados dos EUA, por exemplo, as GDUs acumuladas são mantidas para a maioria das áreas geográficas e estão disponíveis no USDA Crop Reporting Service ou no State Extension Services. Além disso, um instrumento para obter informações sobre a GDU em um local em particular também é descrito na Patente U.S. No. 6.967.656, que é aqui incorporada aqui como referência em sua totalidade.
[0067] Outro método para prever o desenvolvimento do pendão para a determinação da temporização da aplicação dos herbicidas indutores de esterilidade masculina é descrito na Patente U.S. No. 8.618.358, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade aqui.
[0068] Os herbicidas para utilização com a invenção incluem qualquer herbicida que inclua aqueles ativos contra a coenzima A da acetil carboxilase (ACCase), inibidores da acetolactato sintase (ALS), inibidores do sistema fotossensível II (PSII), inibidores da protoporfirinogônio oxidase (PPO), inibidores de piruvato dioxigenase de 4-hidroxifenil (HPPD), inibidores de 5-enolipuvilchiquimato 3-fosfato sintase (EPSPS), inibidores de glutamina sintetase (GS) e auxinas sintéticas. Os herbicidas são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em "Modern Crop Protection Composes, Volume 1 (Segunda edição), editado por Wolfgang Kramer, Ulrich Schirmer, Peter Jeschke, Matthias Witschel, ISBN: 9783527329656, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Alemanha (2012). Em uma modalidade, o herbicida é glifosato.
[0069] A semente híbrida pode ser produzida usando um método que compreende (a) aplicação de herbicida a uma planta transgênica incluindo uma molécula de DNA recombinante que inclui uma molécula polinucleotídica que pode ser transcrita heteróloga que confira a tolerância a herbicidas operacionalmente ligada a um elemento alvo de mts-siRNA, em que a aplicação do herbicida é realizada durante o desenvolvimento do tecido reprodutivo masculino da planta transgênica, induzindo a esterilidade masculina na planta transgênica; (b) fertilização da planta transgênica com pólen de uma segunda planta; e (c) colheita de sementes híbridas da planta transgênica. Em uma modalidade, a planta transgênica é de milho. Em uma modalidade, o herbicida é o glifosato e a proteína codificada pelo polinucleotídeo transcritível heterólogo é um EPSPS tolerante ao glifosato. Em uma modalidade, o glifosato é aplicado durante o desenvolvimento em uma quantidade eficaz de cerca de 0.040375 quilograma (0,125 libra) de um equivalente de ácido por acre a cerca de 2.584 quilogramas (8 libras) de equivalente de ácido por acre. Em outra modalidade, a etapa de fertilização pode ser obtida permitindo-se a fertilização natural, por exemplo: através de polinização por vento, ou pode incluir a polinização mecânica ou manual.
[0070] A semente híbrida pode ser colhida a partir de uma planta transgênica macho estéril fertilizada com o pólen de uma segunda planta, em que a planta transgênica macho estéril compreende uma molécula de DNA recombinante que inclui um polinucleotídeo que pode ser transcrita heterólogo que confere tolerância a herbicidas operacionalmente ligada a um elemento alvo de mts- siRNA e em que a planta transgênica foi induzida a ser masculina estéril pela aplicação de uma quantidade eficaz de herbicida durante o desenvolvimento do tecido reprodutor masculino. Em um exemplo, o herbicida é glifosato e é aplicado durante o desenvolvimento em uma quantidade eficaz de cerca de 0.040375 quilograma (0,125 libra) de equivalente de ácido por acre até cerca de 2.584 quilogramas (8 libras) de equivalente de ácido por acre e previne pelo menos o desenvolvimento de pólen, o derramamento de pólen ou a extrusão de antera.
[0071] Os exemplos a seguir descrevem melhorias na produção de sementes híbridas em relação às previstas na técnica. Tais melhorias incluem novos alvos de mts-siRNA e elementos alvo de mts-siRNA para uso em moléculas de DNA recombinante e plantas transgênicas para proporcionar a contenção do desenvolvimento de pólen em estágio inicial, resultando na ausência de grãos de pólen viáveis em uma ampla gama de germoplasma e métodos relacionados de uso. Os exemplos a seguir são fornecidos para demonstrar as modalidades da invenção.
[0072] O RNA pequeno foi isolado a partir de quatro estágios de crescimento separados do pendão de milho e três estágios de crescimento separados da espiga de milho. Ver Tabela 1. O RNA pequeno enriquecido com pendão foi isolado em estágios de desenvolvimento de pendão muito precoces (V7, V8/V9, V10/V11 e V12) (ver Figura 1). Isso produziu um RNA pequeno a partir de tecidos masculinos mais jovens do que os usados anteriormente na técnica para obter sequências de RNA pequeno enriquecidos com pendão.
[0073] Bibliotecas de RNA pequeno foram preparadas usando o RNA pequeno isolado e um sequenciamento de RNA pequeno de alto rendimento foi realizada nas bibliotecas. Utilizou-se análise bioinformática para comparar as sequências nessas bibliotecas de pendões e espigas com as sequências em bibliotecas de RNA pequeno preparadas a partir de outros tecidos de milho, incluindo folhas coletadas em vários estágios de crescimento, mudas inteiras, raízes coletadas em vários estágios de crescimento, endosperma e semente. Essa análise bioinformática diferencial identificou milhares de sequências de RNA pequeno enriquecidas em pendão com expressão normalizada variando de 10 a 665 transcrições por quarto de milhão (tpq). As sequências de RNA pequeno enriquecidas com pendão identificadas são provavelmente de siRNA, devido ao seu comprimento (18-26 nucleotídeos) e à sua origem esperada a partir de um precursor de dsRNA. Devido à especificidade do tecido masculino, esse RNA pequeno enriquecido com pendão é referido aqui como RNA específico de tecido masculino (mts-siRNA).Tabela 1. Descrição das bibliotecas de RNA de pendões e espigas
[0074] Um método de PCR em tempo real foi usado para identificação e confirmação de que as sequências de mts-siRNA foram especificamente expressas no pendão. O RNA total, incluindo o RNA pequeno enriquecido, foi extraído dos tecidos indicados na Tabela 1 e utilizado para sintetizar o cDNA com iniciadores de transcrição reversa constituídos por 8 nt complementares às sequências de mts-siRNA na extremidade 3' e uma sequência universal de 35 nt na extremidade 5'. Após a síntese de cDNA, realizou-se PCR em tempo real onde a sequência (14 a 18 nt) de um dos iniciadores diretos era idêntica à extremidade 5' de uma sequência de mts-siRNA e o iniciador reverso era um iniciador universal. Como controle interno, o 18S RNA foi amplificado e isso foi usado para normalizar os níveis de mts-siRNA. Os dados da PCR em tempo real foram utilizados para reduzir o número de sequências de mts-siRNA que foram enriquecidas no pendão.
[0075] Um teste de microensaio do perfil do siRNA foi realizadousando chips μParaflo® Microfluidics fornecidas pela LC Sciences LLC (Houston, Texas, EUA) com 1.200 sequências selecionadas a partir das milhares de sequências de mts-siRNA identificadas a partir da análise bioinformática diferencial. Os chips do microensaio continham sondas triplicadas da sequência complementar para cada uma das 1.200 sequências de mts-siRNA. O RNA total foi purificado a partir de 26 conjuntos de tecido de milho (conjuntos de tecido duplicados ou triplicados) de plantas consanguíneas LH244 (número de depósito ATCC PTA-1173) ou 01DKD2 (I294213) (número de depósito ATCC PTA-7859). Ver tabela 2. Cada uma das 26 amostras de RNA foi hibridizada com chips de microensaios que contêm sondas para 1.200 mts-siRNA. As imagens de hibridação foram coletadas usando um scanner a laser GenePix® 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e digitalizadas usando o software de análise de imagem Array-Pro® Analyzer (Media Cybernetics, Rockville, MD). Os valores relativos do sinal foram derivados por subtração de fundo e normalização. Os sinais expressos diferencialmente foram determinados por teste t com p <0,05. A partir da análise de microensaios, cerca de 500 mts-siRNA dos 1.200 foram identificados como altamente específicos para pendões.Tabela 2. Descrição das amostras de tecido utilizadas no ensaio de microensaio.
[0076] Fez-se então uma análise bioinformática usando ferramentas de alinhamento de sequência, como a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST) ou o Pacote de Mapeamento de Leitura de SHort (SHRiMP) (Rumble, 2009) para comparar as sequências de 500 mts-siRNA identificadas como altamente específicas do pendão em comparação com uma coleção de unigenes de sequências de cDNA de milho. Esta análise BLAST revelou sequências de cDNA de milho às quais muitas sequências de mts- siRNA se alinharam, resultando em regiões de sequência de DNA identificáveis com alinhamentos sobrepostos e agrupados de várias sequências de mts-siRNA com pareamentos perfeitos ou quase perfeitos. Seis sequências de cDNA foram identificadas a partir desta análise como contendo uma ou mais dessas regiões ricas em sequências alvo de mts-siRNA. Estas seis sequências de cDNA são apresentadas aqui como SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; e SEQ ID NO: 22. Por exemplo, a Figura 2 mostra uma representação gráfica do alinhamento de várias sequências de mts-siRNA no cDNA fornecido como SEQ ID NO: 17. As várias linhas curtas representam a posição relativa das sequências alvo de mts-siRNA (e, portanto, a localização do local de ligação ao mts- siRNA na molécula de mRNA transcrito) que se alinham ao cDNA. O eixo Y representa os níveis de expressão normalizados de mts-siRNA nos tecidos masculinos, conforme detectado na análise de microensaios. A caixa representa a região da SEQ ID NO: 17 do cDNA correspondente às sequências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 do elemento alvo de mts-siRNA.
[0077] As sequências de mts-siRNA selecionadas que se alinharam em uma das seis sequências de cADN foram utilizadas para análises de microensaios adicionais para determinar a expressão diferencial entre os tecidos de milho. A análise de microensaios das sequências de mts- siRNA de valores de sinal normalizados para o pendão V8-V9, pendão V10-V12 ou os sinais combinados do outro tecido para o germoplasma de milho LH244 e 01DKD2 é apresentada nas Tabelas 3-10. Cada tabela mostra um subconjunto de sequências de mts-siRNA identificadas como o alinhamento a uma das seis sequências de cDNA apresentadas aqui como SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; e SEQ ID NO: 22. Os resultados do valor do sinal são medidos como valores relativos do sinal e o erro padrão (p <0,05) é representado por (STDR). Os resultados dos microensaios ilustram que as sequências representativas de mts-siRNA dão um sinal alto no pendão (V8-V9 e V10-V12) e um sinal baixo em outros tecidos, o que indica que a expressão endógena desses mts- siRNA é altamente enriquecida no pendão. A sequência de mts-siRNA corresponde à cadeia senso ou antisenso da sequência alvo de mts- siRNA correspondente na sequência de cDNA. A sequência de mts- siRNA pode ter um único nucleotídeo, um desalinhamento de dois ou três nucleotídeos com a porção alinhada da sequência de cDNA e a sequência de mts-siRNA pode alinhar-se na cadeia senso ou na cadeia antisenso da sequência de cDNA. As sequências de mts-siRNA fornecidas aqui são encontradas em diferentes germoplasmas de milho.
[0078] A Tabela 3 mostra os resultados de sinal dos microensaios relativos das sequências representativas de mts-siRNA (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 23 - 31) que se alinham com a sequência de cDNA aqui apresentada como SEQ ID NO: 17, que contém as sequências de elementos alvo de mts-siRNA representadas pela SEQ ID NO: 1 e pela SEQ ID NO: 2. Tanto para o germoplasma LH244 como para 01DKD2, os sinais dessas sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 e no pendão V10-V12 são maiores do que o sinal dessas sequências de mts-siRNA para as demais amostras de tecido. Os resultados dos microensaios apresentados na Tabela 3 indicam que a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 17 pode ser utilizada como fonte para designar elementos alvo de mts-siRNA para moléculas de DNA recombinante.Tabela 3. Resultados do microensaio para o cDNA da SEQ ID NO: 17
[0079] A Tabela 4 mostra os resultados relativos do sinal dos microensaios das sequências representativas de mts-siRNA (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 32-38) que se alinham com a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 18, que contém a sequência de elemento alvo de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO: 3. Para o germoplasma LH244, os sinais dessas sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 e no pendão V10-V12 são maiores do que os sinais para essas sequências de mts-siRNA para as outras amostras de tecido. Para o germoplasma 01DKD2, os sinais para essas sequências de mts-siRNA são maiores no pendão V10-V12 do que os sinais para essas sequências de mts-siRNA para o pendão V8V9 ou para as outras amostras de tecido.Tabela 4. Resultados do microensaio para o cDNA da SEQ ID NO: 18
[0080] A Tabela 5 mostra os resultados relativos do sinal de microensaios para as sequências representativas de mts-siRNA (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 39 - 42) que se alinham na sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 18, que contém a sequência de elemento alvo de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO: 4. Para o germoplasma LH244, os sinais para as sequências de mts- siRNA no pendão V8-V9 e no pendão V10-V12 são maiores do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA para as demais amostras de tecido. Para o germoplasma 01DKD2, os sinais para as sequências de mts-siRNA são maiores no pendão V10-V12 do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA para o pendão V8-V9 ou outras amostras de tecido. Os resultados de microensaios mostrados na Tabela 4 e na Tabela 5 indicam que a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 18 pode ser usada como fonte para designar elementos alvo de mts-siRNA para moléculas de DNA recombinantes.Tabela 5. Resultados do microensaio para o cDNA da SEQ ID NO: 18
[0081] A Tabela 6 mostra resultados de sinal dos microensaios relativos às sequências representativas de mts-siRNA (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 43 - 46) que se alinham com a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 19, que contém a sequência de elementos alvo de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO:5. Para o germoplasma LH244, os sinais para as sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 e no pendão V10-V12 são maiores do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA para as demais amostras de tecido. Para o germoplasma 01DKD2, o sinal para as sequências de mts-siRNA (SEQ ID NO: 43 - 44) é maior no pendão V10-V12 do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA para o pendão V8-V9 ou as outras amostras de tecido; e os sinais para as sequências de mts-siRNA (SEQ ID NO: 45 - 46) são maiores do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA tanto no pendão V8-V9 quanto no pendão V10-V12 em comparação com a outra amostra de tecido.Tabela 6. Resultados dos microensaios para o cDNA da SEQ ID NO: 19
[0082] A Tabela 7 mostra resultados do sinal dos microensaios relativos para sequências de mts-siRNA representativas (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 47-52) que se alinham à sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 19, que contém a sequência do elemento alvo de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO:6. Para o germoplasma LH244, os sinais para as sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 e no pendão V10-V12 são maiores do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA para as demais amostras de tecido. Para o germoplasma 01DKD2, os sinais para as sequências de mts-siRNA são maiores no pendão V10-V12 do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 ou nas outras amostras de tecido; os sinais para as sequências de mts- siRNA (SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48) são moderadamente superiores no pendão V8-V9 em comparação com o sinal para essas sequências de mts-siRNA para a outra amostra de tecido; o sinal para a sequência de mts-siRNA (SEQ ID NO: 52) é significativamente maior no pendão V8-V9 em comparação com o sinal para essa sequência de mts-siRNA para a outra amostra de tecido; e os sinais para as sequências de mts-siRNA (SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51) não são significativamente diferentes do sinal para essas sequências de mts-siRNA para as outras amostras de tecido. Os resultados dos microensaios mostrados na Tabela 6 e na Tabela 7 indicam que a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 19 pode ser usada como fonte para designar elementos alvo de mts- siRNA para moléculas de DNA recombinante.Tabela 7. Resultados dos microensaios para o cDNA da SEQ ID NO: 19
[0083] A Tabela 8 mostra resultados do sinal dos microensaios relativos para as sequências representativas de mts-siRNA (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 53 - 60) que se alinham à sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 20, que contém a sequência de elemento alvo de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO:7. Tanto para o germoplasma LH244 como para 01DKD2, os sinais dessas sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 e no pendão V10-V12 são maiores do que o sinal dessas sequências de mts- siRNA para as demais amostras de tecido. Os resultados dos microensaios mostrados na Tabela 8 indicam que a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 20 pode ser usada como fonte para designar elementos alvo de mts-siRNA para moléculas de DNA recombinante.Tabela 8. Resultados do microensaio para o cDNA da SEQ ID NO: 20
[0084] A Tabela 9 mostra os resull ados do sinal de microensaios relativos para as sequências representativas de mts-siRNA (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 61-69) que se alinham na sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 21, que contém a sequência de elementos alvo de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO:8. Para o germoplasma LH244 e 01DKD2, os sinais para as sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 e V10-V12 são maiores do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA para outras amostras de tecido. Os resultados de microensaios mostrados na Tabela 9 indicam que a sequência de cDNA apresentadas aqui como SEQ ID NO: 21 pode ser usada como fonte para designar elementos alvo de mts- siRNA para moléculas de DNA recombinante.Tabela 9. Resultados dos microensaios para o cDNA da SEQ ID NO: 21
[0085] A Tabela 10 mostra os resultados do sinal de microensaios relativos para as sequências representativas do mts-siRNA (apresentadas aqui como SEQ ID NO: 70-87) que se alinham com a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 22, que contém a sequência do elemento alvo de mts-siRNA representada pela SEQ ID NO: 9. Para o germoplasma LH244, os sinais para as sequências mts-siRNA (SEQ ID NO: 70, 71, 73, 75 - 81, 83-87) no pendão V8-V9 e no pendão V10-V12 são maiores do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA para as outras amostras de tecido; e os sinais para as sequências de mts-siRNA (SEQ ID NO: 72, 74, 82) em outro tecido foi maior do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 ou no pendão V10-V12. Para o germoplasma 01DKD2, os sinais para as sequências de mts-siRNA (SEQ ID NO: 70-87) são maiores no pendão V10-V12 do que o sinal para essas sequências de mts-siRNA no pendão V8-V9 ou nas demais amostras de tecido. Os resultados de microensaios mostrados na Tabela 10 indicam que a sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 22 pode ser usada como fonte para designar os elementos alvo do mts-siRNA para as moléculas de DNA recombinante.Tabela 10. Resultados dos microensaios para o cDNA da SEQ ID NO: 22
[0086] Essas análises confirmaram que as seis sequências do cDNA (SEQ ID NO: 17-22) foram ricas em sequências alvo de mts- siRNA e que o mts-siRNA correspondente apresentou alta especificidade de pendão. Assim, essas sequências de cDNA contêm sequências úteis com os métodos de biologia molecular para a criação de moléculas de DNA recombinante que contêm elementos alvo de mts- siRNA que podem conferir silenciamento de transgene mediado pelo mts-siRNA.
[0087] A análise da sequência genômica correspondente contendo os elementos alvo de mts-siRNA foi realizada para trinta e dois germoplasmas de milho diferentes (com maturidade relativa (RM) variando de 80 a 120 dias) normalmente usados como uma fêmea em um cruzamento híbrido para confirmar a presença e qualquer variação de sequência dos elementos alvo de mts-siRNA. Para os elementos alvo de mts-siRNA apresentados como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, foram criados três séries de pares de iniciadores de amplificação térmica para amplificar a sequência correspondente dentro da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 17. Esses iniciadores foram utilizados para gerar um amplicon de PCR no DNA genômico extraído do tecido de cada germoplasma. Os amplicons foram produzidos a partir de todos os germoplasmas testados. A sequência do amplicon nos trinta e dois germoplasmas foi 100% idêntica à sequência de elementos alvo de mts-siRNA ou continha um número mínimo de polimorfismos de nucleotídeos únicos (até 95% idênticos). Esses dados indicam que as plantas transgênicas geradas com um construto de DNA recombinante compreendendo um transgene que codifica uma proteína recombinante ligada operacionalmente a um elemento alvo de mts-siRNA apresentado como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 teria regulação específica do tecido masculino da expressão da proteína recombinante na maioria dos germoplasmas de milho. Se o transgene codifica uma proteína recombinante que confere tolerância ao glifosato, então os pendões na maioria dos germoplasmas de milho teriam esterilidade masculina induzida por glifosato.
[0088] Os construtos de DNA recombinante e os vetores de transformação de plantas foram criados usando sequências de DNA correspondentes a regiões das seis sequências de cDNA identificadas como ricas nas sequências alvo de mts-siRNA. Os construtos de DNA recombinante e os vetores de transformação de plantas foram concebidos para serem úteis para a produção de plantas transgênicas, nas quais o silenciamento específico do pendão de um transgene operacionalmente ligado a um elemento alvo de mts-siRNA ocorreria através do silenciamento mediado pelo mts-siRNA.
[0089] Foram criados nove elementos alvo de mts-siRNA utilizando os resultados da análise das seis sequências de cDNA. Cada elemento alvo de mts-siRNA foi concebido para ter uma sequência de DNA compreendendo muitas sequências alvo de mts-siRNA sobrepostas com as quais diferentes mts-siRNA podem se ligar. A sequência de elementos alvo de mts-siRNA aqui contida como SEQ ID NO: 1 tem identidade de sequência de 95% com a posição de nucleotídeo 1429 a 1628 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 17. A sequência de elementos alvo de mts-siRNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 2 tem uma única alteração de nt (T69A) em relação à SEQ ID NO: 1. A sequência de elementos alvo de mts-siRNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 3 corresponde à posição nucleotídica de 239 a 433 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 18. A sequência de elementos alvo de mts-siRNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 4 corresponde à posição nucleotídica de 477 a 697 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 18. A sequência de elementos alvo de mts-siRNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 5 corresponde à posição nucleotídica de 239 a 433 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 19. A sequência de elementos alvo de mts-siRNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 6 corresponde à posição nucleotídica de 370 a 477 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 19. A sequência de elementos alvo de mts-siRNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 7 corresponde à posição nucleotídica de 1357 a 1562 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 20. A sequência dos elementos alvo mts-siRNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 8 corresponde à posição nucleotídica de 247 a 441 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 21. O complemento inverso da sequência de elementos alvo de mts-siRNA representado pela SEQ ID NO: 9 tem uma identidade de sequência de 99% com a posição de nucleotídeo de 191 a 490 da sequência de cDNA apresentada aqui como SEQ ID NO: 22 com desníveis de três nt (C314A, A350G e G408A) da SEQ ID NO: 22 em relação à sequência do complemento inverso da SEQ ID NO: 9. Podem ser criados elementos alvo de mts-siRNA adicionais combinando as sequências de DNA de diferentes elementos alvo de mts-siRNA ou fragmentos de duas ou mais regiões de cDNA ricas em alvo de mts-siRNA, como, por exemplo, combinando-se a totalidade ou fragmentos de dois ou mais dos elementos alvo de mts-siRNA apresentados aqui como SEQ ID NO: 1-9 e/ou uma ou mais das sequências mts-siRNA apresentadas aqui como SEQ ID NO: 23-92. Foram combinados diferentes fragmentos desses elementos alvo de mts-siRNA variando em comprimento de 21 a 170 nucleotídeos e novos elementos alvo de mts-siRNA foram produzidos usando métodos de síntese de DNA conhecidos na técnica e são apresentados como SEQ ID NO: 10-16.
[0090] Os elementos alvo de mts-siRNA foram subclonados em construtos de DNA recombinante com o elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado à extremidade 3' do quadro de leitura aberta do gene cp4-epsps (SEQ ID NO: 93), codificando a proteína CP4- EPSPS para tolerância ao glifosato e 5' para a região 3' não traduzida operacionalmente ligada (3'-UTR). Os construtos de DNA recombinantes também continham combinações operacionalmente ligadas de uma das três combinações diferentes de promotor/íntron/potencializador e uma sequência peptídica de trânsito de cloroplasto. As configurações de cassete de expressão contidas nos vetores de transformação para testar a eficácia do alvo de mts-siRNA. Exemplo 3: Transformação de plantas e teste de eficácia
[0091] Os vetores de transformação contendo os construtos deDNA recombinante foram utilizados com um método de transformação baseado em Agrobacterium e técnicas e embriões imaturos de milho conhecidos na técnica. Foram coletadas amostras foliares de plantas R0 e foram realizadas análises moleculares para selecionar plantas transgênicas contendo uma única cópia (uma inserção) ou uma cópia dupla (duas inserções independentes) do construto de DNA recombinante e nenhuma presença na estrutura vetorial. Os eventos de cópias únicas não foram pulverizados com glifosato e foram autossuficientes e avançados para a coleta de sementes R1, enquanto que os eventos de cópia dupla foram utilizados para o spray de glifosato R0 para avaliar a tolerância vegetativa e a esterilidade masculina induzida. As plantas transgênicas que não foram pulverizadas com glifosato apresentaram antítese normal, derramamento normal de pólen e desenvolvimento normal de pólen, conforme determinado pelo corante de Alexander e por observação microscópica.
[0092] Os eventos R0 de cópia dupla foram utilizados no teste para se aproximar de um evento homozigoto de cópia única. As plantas foram pulverizadas com glifosato em duas etapas de crescimento diferentes para determinar se a presença do elemento alvo de mts-siRNA no construto de DNA recombinante proporcionava tolerância vegetativa ao glifosato e esterilidade induzida por glicose. As plantas foram pulverizadas em uma estufa com glifosato 1X (0,75 lb ae/acre) aplicado na etapa V5 seguido de glifosato 1X (0,75 lb ae/acre) aplicado na etapa V8. Sete dias depois da aplicação do glifosato da etapa V5, as plantas foram classificadas quanto à lesão vegetativa com pontuação de < 10% de lesão considerada como mostrando tolerância vegetativa ao glifosato (% Tolerante Vegetativo). A esterilidade masculina foi medida de duas maneiras. As plantas que apresentaram tolerância vegetativa ao glifosato foram marcadas após a aplicação do glifosato do estágio V8 para a esterilidade masculina induzida por glifosato completo medida como sem extrusão de antera até a etapa S90 +12 (% completamente esterilizada masculina). As anteras foram então coletadas e dissecadas para observar microscopicamente o desenvolvimento do pólen. As anteras para cada evento foram testadas quanto a nenhum grão de pólen viável produzido conforme detectado pelo corante de Alexander sob observação microscópica e marcado como não produzindo pólen viável (% sem pólen). Nas plantas não pulverizadas com glifosato, o desenvolvimento do pendão, da extrusão da antera e o desenvolvimento do pólen foram normais.
[0093] Os elementos alvo de mts-siRNA foram testados em várias configurações de vetores de transformação. Cada vetor de transformação foi utilizado para produzir várias plantas R0 com cada planta R0 representando um evento transgênico único feito usando o mesmo vetor de transformação. Os dados de três configurações de vetores de transformação diferentes são fornecidos através das tabelas 11 e 12.
[0094] Doze elementos alvo de mts-siRNA foram testados em uma primeira configuração vetorial (A) com os resultados mostrados na Tabela 11. Surpreendentemente, a porcentagem de plantas que apresentaram tolerância vegetativa ao glifosato variou de 80-100%, mas a porcentagem mostrando esterilidade masculina induzida por glifosato completo (esterilidade masculina induzida incluiu pólen não viável e ausência de produção de pólen) variou de 0-100%. Ver Tabela 11. Por exemplo, as plantas produzidas usando um vetor de transformação contendo um elemento alvo de mts-siRNA codificado pela SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou pela SEQ ID NO: 15 apresentaram números elevados que mostram tolerância vegetativa ao glifosato (variando de 90 a 100% das plantas testadas), mas nenhum dos eventos transgênicos mostrou esterilidade masculina induzida por glifosato completo; as plantas produzidas usando um vetor de transformação contendo o elemento alvo de mts-siRNA codificado pela SEQ ID NO: 5 ou pela SEQ ID NO: 9 apresentaram números elevados que mostram tolerância vegetativa ao glifosato (variando de 90 a 100% das plantas testadas) e números moderados que apresentaram esterilidade masculina induzida por glifosato (variando de 50 a 40% das plantas testadas); e as plantas produzidas usando um vetor de transformação contendo o elemento alvo de mts-siRNA codificado pela SEQ ID NO: 2, pela SEQ ID NO: 7 ou pela SEQ ID NO: 8 apresentaram números elevados que apresentaram tolerância vegetativa ao glifosato (variando de 88-100% das plantas testadas) e números elevados mostrando esterilidade masculina induzida por glifosato (82-100% das plantas testadas). O desenvolvimento do pólen foi avaliado pelo corante de Alexandre. As plantas contendo quatro eventos feitos com o vetor de transformação contendo o elemento alvo de mts-siRNA apresentado como SEQ ID NO: 2 e pulverizadas com glifosato para induzir esterilidade masculina apresentaram muito poucos grãos de pólen abortados ou nenhum grão de pólen detectado. As plantas que não receberam aplicação de glifosato apresentaram pólen normal. Ver a Figura 4.Tabela 11. Avaliação de plantas R0.
[0095] Quatro outros elementos alvo de mts-siRNA foram testados em uma segunda e terceira configuração vetorial (B e C, respectivamente) com os resultados mostrados na Tabela 12. As diferenças na porcentagem de plantas que apresentam tolerância vegetativa ao glifosato e a porcentagem de esterilidade masculina induzida por glifosato completo foi observada entre as duas configurações vetoriais. A configuração do vetor B proporcionou uma porcentagem aumentada de plantas que mostram tolerância vegetativa ao glifosato para todos os elementos alvo de mts-siRNA testados. Para a porcentagem que apresenta esterilidade masculina induzida por glifosato completo, dois dos elementos alvo de mts-siRNA (SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11) tiveram um desempenho melhor no teste na configuração de vetor C, um dos elementos alvo de mts-siRNA (SEQ ID NO: 12) melhorou a configuração vetorial B e um dos elementos alvo de mts-siRNA (SEQ ID NO: 1) proporcionou 100% de esterilidade masculina induzida por glifosato completo nas duas configurações B e C.Tabela 12. Avaliação de plantas R0
[0096] Das plantas que apresentam tolerância vegetativa ao glifosato, a porcentagem de plantas esterilizadas masculinas induzidas com glifosato sem pólen viável variou de 0 a 100%. Para as plantas produzidas usando um vetor de transformação que possuía mais de 60% de plantas testadas apresentando tolerância vegetativa ao glifosato e esterilidade masculina induzida por glifosato completo, a porcentagem de plantas sem pólen viável variou de 0 a 100%. Dois elementos alvo de mts-siRNA (SEQ ID NO: 1 na configuração vetorial B e SEQ ID NO: 2 na configuração vetorial A) tinham 100% e 82% de ausência de pólen viável, respectivamente. Esses dois elementos alvo de mts-siRNA (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) diferem por um nucleotídeo e são derivados da mesma sequência de cDNA (SEQ ID NO: 17).
[0097] A imunolocalização da proteína CP4-EPSPS no pendão de plantas transgênicas foi utilizada para analisar a expressão proteica no nível celular e tecidual para confirmar a perda da expressão da proteína CP4-EPSPS no pólen devido à presença de um elemento alvo de mts- siRNA operacionalmente ligado. As plantas transgênicas de geração R3 contendo o transgene cp4-epsps operacionalmente ligado à SEQ ID NO: 1 ou, como controle, o transgene cp4-epsps sem um elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado foi cultivado na estufa. As plantas foram pulverizadas com glifosato 1X (0,75 lb ae/acre) na etapa V2 para confirmar a tolerância vegetativa. Os pendões de 1 cm a 17 cm foram colhidos nas etapas V8 a V12 quando o tecido da antera estaria na célula mãe do microesporo e nas etapas de microsporos livres. As anteras foram removidas da espinha do pendão usando fórceps de dissecação e imediatamente fixadas em formaldeído a 3,7% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sob vácuo suave. Após a lavagem em PBS, os tecidos foram colocados em meio de incorporação e congelados imediatamente. Os blocos de tecido congelado foram armazenados a -80°C até serem seccionados em micrótomo a -20°C e coletados em lâminas carregadas.
[0098] As seções de tecido foram bloqueadas com agente bloqueador (10% de soro de cabra normal, 5% de albumina de soro bovino, 0,1% de Triton X-100 em PBS) durante duas horas. As seções foram incubadas com anticorpo anti-CP4-EPSPS (1/500 em PBS). Após a lavagem das seções três vezes em PBS, as seções de tecido foram incubadas com o anticorpo secundário, IgG anti-camundongo de cabra conjugado com Alexa Flour® 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon). Um controle negativo foi preparado pela omissão da incubação do anticorpo CP4-EPSPS. Ambos os anticorpos primário e secundário foram incubados à temperatura ambiente de duas a quatro horas e depois incubados adicionalmente durante a noite a 4°C. Após a lavagem, os tecidos foram fotografados com o microscópio confocal Zeiss Laser Scanning Microscope (LSM) 510 META usando um laser de 488 nm para excitação e 500-550 nm (canal verde) para o conjunto de filtros de emissão. O mesmo parâmetro de imagem foi aplicado em todas as amostras, incluindo nos controles. As imagens de campo fluorescente e brilhante foram digitalizadas em cada seção e foram mescladas usando o software LSM posteriormente para mostrar informações estruturais. Os dados para os controles negativos mostraram a ausência esperada de sinal. Os dados das plantas transgênicas contendo o transgene cp4- epsps operacionalmente ligado à SEQ ID NO: 1 mostrou um baixo sinal de fluorescência, que indica baixa expressão da proteína CP4-EPSPS na parede da antera, tapetum e desenvolvimento de microsporos de pólen da antera. Os dados para o controle de plantas transgênicas (aqueles que contêm o transgene cp4-epsps sem um elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado) mostraram um alto sinal de fluorescência, que indica alta expressão da proteína CP4-EPSPS na parede da antera, tapetum e desenvolvimento de microsporos de pólen da antera.
[0099] A perda da expressão da proteína CP4-EPSPS no pólen em plantas que contêm o transgene cp4-epsps operacionalmente ligado ao elemento alvo de mts-siRNA apresentado como SEQ ID NO: 1 correlaciona-se com a esterilidade masculina induzida por glifosato completo observada nessas plantas. Esses dados confirmaram que a esterilidade masculina induzida por glifosato completo observada é o resultado da perda da expressão da proteína CP4-EPSPS no pólen devido à presença do elemento alvo de mts-siRNA operacionalmente ligado fornecido como SEQ ID NO: 1.
[00100] Para uma utilização ótima na produção híbrida, é desejável ter uma extrusão de antera muito baixa em condições de campo após a aplicação de herbicidas combinada com a tolerância vegetativa ao herbicida (medida pelo baixo dano à colheita). Outros aspectos da produção de milho híbrido também podem ser desejáveis, tais como altura e rendimento da planta. Para avaliar isso, as plantas transgênicas que compõem o transgene cp4-epsps operacionalmente ligado a um elemento alvo de mts-siRNA foram testadas em gerações avançadas em condições de campo e vários parâmetros foram medidos.
[00101] Os ensaios de campo de plantas de geração R3 contendo o transgene cp4-epsps operacionalmente ligado ao elemento alvo de mts- siRNA fornecido como SEQ ID NO: 1 foram conduzidos em diversos locais para avaliar a tolerância vegetativa do glifosato e a sensibilidade ao glifosato específico do pendão. Os ensaios de campo testaram plantas de geração R3 contendo a mesma inserção transgênica em diferentes locais genômicos. As plantas testadas continham uma única cópia de um dos quatro eventos transgênicos únicos criados usando o mesmo vetor de transformação da planta contendo o transgene cp4-epsps operacionalmente ligado ao elemento alvo de mts-siRNA fornecido como SEQ ID NO: 1. Os ensaios foram conduzidos usando uma concepção de bloco completo randomizada. A eficácia de várias características e parâmetros de agronomia foram avaliados ao longo da temporada de ensaios de campo e ao fim do rendimento da estação foi determinado. Os ensaios de campo de eficácia das características foram realizados aplicando-se herbicida de glifosato a 0,75 lb ae/acre em V7 seguido de 0,75 lb ae/acre em V9 e classificando-se a porcentagem de dano à colheita na etapa VT (CIPVT), a porcentagem média de extrusão de antera na etapa S90 +8 (AES9E) e o rendimento (medido como bushels por acre (bu/acre)) no fim da estação. Os ensaios de campo incluíram o evento transgênico tolerante ao glifosato NK603 (número de depósito ATCC PTA-24780) como um controle negativo para a esterilidade masculina induzida por glifosato e como um controle positivo para a tolerância vegetativa ao glifosato. As plantas que contêm o evento de NK603 apresentam tolerância vegetativa ao glifosato vegetativo e produzem pendão totalmente tolerante ao glifosato. Todos os dados foram submetidos à análise de variância e média (LSD) separada em p <0,05.Tabela 13. Resultados da eficácia de característica para ensaios de campo com plantas contendo a SEQ ID NO: 1
[00102] O dano médio à colheita na etapa VT para as plantas de controle contendo o evento de NK603 foi de 1,25. O dano médio à colheita para plantas contendo o Evento 1, Evento 2, Evento 3 e Evento 4 foi de 1,25, 3,75, 0 e 0, respectivamente. A diferença de menor significância do dano à colheita (LSD) em 0,05 foi de 10,25 para todos os eventos testados. Esses resultados indicam que as plantas que contêm os quatro eventos transgênicos contendo o elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 1 apresentaram dano vegetativo de zero a muito baixo com a aplicação de 0,75 lb ae/acre de glifosato em V7 seguido de V9, de forma semelhante às plantas de controle contendo o evento de NK603.
[00103] A extrusão média de antera na etapa S90 +8 para as plantas de controle contendo o evento de NK603 foi de 95. A extrusão média de antera em S90 +8 para plantas contendo o Evento 1, Evento 2, Evento 3 e Evento 4 foi de 0, 3,25, 4 e 1,75, respectivamente. A extrusão média de antera em S90 +8 LSD em 0,05 foi de 42,71 para todos os eventos testados. Esses resultados indicam que as plantas que contêm os quatro eventos transgênicos que contêm o elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 1 apresentaram extrusão de antera de zero a muito baixa com a aplicação de 0,75 lb ae/acre de glifosato em V7 seguido de V9 em contraste com as plantas de controle contendo o evento de NK603, que foram totalmente férteis em depois da aplicação do glifosato.
[00104] No final da temporada, o milho foi colhido a partir desses ensaios de campo e o rendimento foi determinado. O rendimento médio para as plantas de controle contendo o evento de NK603 foi de 96,74 bu/acre. O rendimento médio para plantas contendo o Evento 1, Evento 2, Evento 3 e Evento 4 foi de 102,17 bu/acre, 96,48 bu/acre, 97,59 bu/acre e 95,8 bu/acre, respectivamente. O rendimento de LSD em 0,05 foi de 26,25 bu/acre para todos os eventos testados. Ver a Tabela 14. Esses resultados indicam que as plantas contendo os quatro eventos transgênicos que contêm o elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 1 tiveram paridade de rendimento com NK603.Tabela 14. Resultados de rendimento para ensaios de campo com plantas contendo a SEQ ID NO: 1
[00105] Os ensaios de campo de plantas consanguíneas de geração R2 ou de maior geração contendo o transgene cp4-epsps operacionalmente ligados a vários elementos alvo de mts-siRNA foram conduzidos em vários locais para avaliar a tolerância vegetativa ao glifosato e a sensibilidade ao glifosato específico do pendão. Os ensaios de campo testaram plantas consanguíneas de R2 ou de geração mais alta contendo uma única cópia do transgene de cp4-epsps operacionalmente ligado ao elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, cada uma na configuração de vetor de transformação A. Os ensaios foram conduzidos usando uma concepção de bloco de grupo com o fator de agrupamento sendo o vetor de transformação ou um grupo de vetores de transformação se os números de eventos para um vetor de transformação específico forem baixos. A eficácia de várias características e parâmetros de agronomia foram avaliados ao longo da temporada de ensaios de campo e ao fim do rendimento da estação foi determinado. Os ensaios de campo de eficácia de característica foram realizados aplicando-se um glifosato a 1,5 lbs ae/acre em milho em V2 seguido de glifosato a 0,75 lbs ae/acre aplicado em milho em V8 (875 dias de grau crescente) seguido de glifosato a 0,75 lbs ae/acre aplicado ao milho em V10 (1025 dias de grau crescente). As classificações da porcentagem de danos à colheita na etapa VT (CIPVT), a porcentagem média de extrusão de antera na etapa S90 +8 (AES90 +8), a altura média da planta (em polegadas) e o rendimento (medido como bushels por acre (bu/acre) no final da temporada. Os ensaios de campo incluíram o evento transgênico tolerante ao glifosato NK603 como controle negativo para a esterilidade masculina induzida por glifosato e como controle positivo para tolerância vegetativa ao glifosato. Uma mistura tolerante ao glifosato de polinizadores masculinos constituída por três fundos de germoplasma híbrido foi colocada de três em três terrenos e em volta de todo o ensaio para servir como fonte de pólen para inscrições no teste. Os tratamentos com herbicidas foram aplicados usando uma mochila de CO2 ou um pulverizador montado em trator calibrado para fornecer 15 galões por acre (GPA) usando injetores Tjet® TTI induzidos por ar (TeeJet Technologies, Springfield, IL) com água como transportador de herbicidas. Todos os dados foram submetidos à análise de variância e média (LSD) separada em p <0,05. Os resultados são fornecidos na Tabela 15.
[00106] Não foi observada diferença significativa na porcentagem de lesão da cultura em VT (CIPVT) ou na altura média da planta em comparação com o controle NK603 para as plantas testadas contendo o elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou da SEQ ID NO: 8. As plantas que contêm o elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou da SEQ ID NO: 7 também não apresentaram diminuição significativa no rendimento de semente em comparação com o controle NK603. As plantas contendo o elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 7 apresentaram extrusão de antera muito baixa ou sem extrusão de antera com valores de AES90 +8 de 02,75% e 0-1,5%, respectivamente. As plantas que contêm o elemento alvo de mts-siRNA da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou da SEQ ID NO: 8 tiveram diminuição significativa da extrusão de antera em comparação com plantas de controle, com valores de AES90 +8 variando de 10 % a 25%.Tabela 15. Diferentes mts-siRNA na mesma configuração de vetor de transformação A
[00107] As plantas e sementes transgênicas da invenção podem ser usadas para fins de reprodução, inclusive na produção de sementes híbridas. As plantas de milho transgênico que compreendem um construto de DNA recombinante compreendendo um transgene que codifica uma proteína EPSPS tolerante ao glifosato ligada operacionalmente a um elemento alvo de mts-siRNA são plantadas em uma área, tal como um campo aberto. Outra planta de milho mãe pode ou não estar presente na mesma área. Para o controle de ervas daninhas durante a produção de sementes, o glifosato pode ser aplicado às plantas de milho transgênico em etapas vegetativas conforme indicado nas etiquetas de produtos agrícolas Roundup®.
[00108] A produção de sementes híbridas pode ser realizada aplicando-se glifosato às plantas de milho transgênico (feminino) começando apenas antes ou durante o desenvolvimento do pendão em etapas de crescimento vegetativo de milho variando de V7 a V13. A aplicação de glifosato produzirá um fenótipo masculino estéril induzido através da tolerância ao glifosato seletivo para tecido nas plantas de milho transgênico. As plantas de milho transgênico masculino estéril induzidas podem ser polinizadas por outras plantas doadoras de pólen (masculino), resultando em sementes de milho híbridas viáveis que transportam o construto de DNA recombinante para tolerância de glifosato seletivo para tecido. As plantas doadoras de pólen podem ou não estar presentes na mesma área e podem ou não ser plantas de milho transgênico. A polinização pode ser realizada por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo a colocação de proximidade de plantas ou polinização manual. A semente híbrida é colhida das plantas de milho transgênico.
[00109] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para as pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada no arranjo e nos detalhes, sem se desviar de tais princípios. Reivindicamos todas as modificações que estão dentro do espírito e do escopo das reivindicações anexas.
Claims (4)
1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um elemento alvo de mts-siRNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e seus complementos, sendo que o elemento alvo de mts-siRNA está operacionalmente ligado a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita que codifica uma 5- enolipiruvilchiquimato 3-fosfato sintase tolerante ao glifosato (EPSPS).
2. Método para regular seletivamente a expressão de uma proteína em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) produzir uma molécula de DNA recombinante compreendendo ligar operacionalmente um elemento alvo de mts- siRNA a uma molécula polinucleotídica heteróloga que pode ser transcrita, sendo que o referido elemento alvo de mts-siRNA compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e seus complementos; e (b) expressar a referida molécula de DNA recombinante na referida planta transgênica.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida proteína compreende uma 5- enolipiruvilchiquimato 3-fosfato sintetase (EPSPS) tolerante ao glifosato.
4. Uso de uma planta ou semente que compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido uso é para cultivar um campo de plantas de milho transgênicas ou plantar um campo de sementes de milho transgênicas.
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| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
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