KR100190253B1 - 식물 체액내에서 단백질을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전학적으로 형질전환된 체액-생산 식물을 생산하는 방법으로서, i) 목적 산물의 발현을 조절하는 유전자 또는 유전자 단편을 식물 조직속으로 삽입하고, ii) 상기 조직으로부터 식물, 즉 그 체액내에 목적 산물을 발현시킬 수 있는 유전학적으로 형질전환된 식물을 재생시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 염색체 삽입물을 그 세포내에 함유하여 목적 산물을 그 식물이 생산하는 체액내에 발현시키는 유전학적으로 형질전환시킨 체액-생산식물의 클론을 제공한다.

본 발명은 단백질 또는 기타 산물을 생산하는 방법으로서, i) 유전학적으로 형질전환시킨 체액-생산 나무 또는 식물, 또는 이것의 클론으로부터 체액을 채취하고, ii) 상기 체액으로부터 목적 단백질 또는 기타 산물을 회수하는 것을 포함하는 방법을 추가로 제공한다.

상기 식물은 고무(헤베아) 식물이고, 상기 유전자는 상기 식물이 생산하는 라텍스에서 채취될 수 있는 약학적으로 가치 있는 단백질 산물을 암호화하는 외래 유전자이면 가장 바람직하다.

Description

식물 체액 내에서 단백질을 생산하는 방법

제1도는 색원체 기질 X-gluc로 처리한 후의 헤베아(Hevea) 조직의 GUS활성을 나타낸다.

제2도는 충격을 가한 헤베아 배아형(T.E.)의 GUS 활성을 대조값(U.T.E.)과 비교하여 나타내는 막대 그래프이다.

제3도는 충격을 가한 헤베아 칼루스의 NPTⅡ 단백질의 대조값과 비교한 농도를 나타낸다.

제4도는 플라스미드 pDE10으로 사전에 충격을 가한 헤베아 조직의 CAT활성을 나타내는 방사선 사진이다.

제5도는 헤베아의 x주 지난 항생 물질 선별된 칼루스로부터 분리된 DNA의 gus 유전자의 증폭을 나타낸다.

제6도는 제1도에 도시한 입자 충격을 가한 조직으로부터 증식시킨 헤베아 소식물체(E), 대조용 뿌리(F) 및 형질 전화시킨 배아형(胚芽型)으로부터 재생된 뿌리(G)를 나타낸다.

제7도는 재생시킨 헤베아 브라질리엔시스(Hevea brasiliensis)소식물체로부터 분리된 게놈 DNA의 PCR에 의한 gus 유전자의 검출을 나타낸다.

제8도는 X-gluc에서 항온 처리한 잎 샘플의 표면 H 및 X-gluc에서 항온 처리한 잎 시료의 부분Ⅰ를 나타낸다.

본 발명은 목적하는 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 유전학적으로 형질 전환된 식물의 생산 방법 및 동일한 능력을 가지는 상기 유전학적으로 형질 전환된 식물의 클론들에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 말하면, 관련된 식물은 다량의 체액을 생성하는 종류이며, 상기 체액 내에서 표적 유전자 산물이 발현된다. 상기 식물은 고무(헤베아 : Hevea)식물이고, 상기 유전자는 약학적으로 가치 있는 단백질 산물을 암호화하는 이종 유전자이며, 이 단백질 산물은 상기 식물에 의해 생산된 라텍스(유액)에서 채취되고 이로부터 회수될 수 있는 것이 가장 좋다.

효모, 진균류 및 박테리아 등의 각종 미생물의 유전자를 형질 전환시키는 기술 및 외래 유전자의 발현을 통해 특이(特異) 단백질을 생산하기 위한 기술은 널리 알려져 있다. 그러나, 미생물은 생존과 증식을 위해 적절한 조건의 유지를 필요로 한다. 예를 들어, 영양물은 주의 깊게 조절한 사용량으로 배양 배지에 첨가하고, 배출 산물은 제거하면서 상온, pH값 및 통기 수준을 주의 깊게 조절할 필요가 있다. 외부 미생물에 의한 오염을 피하기 위해 엄격한 무균화 방법을 찾아야 한다. 따라서, 미생물은 보통 복잡한 발효기(醱酵器) 또는 바이오리액터(bioreactor)에서 배양되며, 그 설비들은 유지비가 많이 드는 공장에 설치된다. 이 비용은 단백질 최종 산물에 고가로 반영된다.

최근, 이종 유전자를 담배와 같은 식물체 내에 도입시키는 방법으로 주위를 돌리게 되었다. 이 유전자 형질 전환 기술을 응용하면, 각종 중요한 유전 형질을 도입시켜 수확량을 개선하고, 추출 가능하며 가치 있는 이종 단백질(예 : 항체)을 생물 공학적으로 생산할 수 있다. 미생물과는 달리, 식물은 스스로 환경에 대처하는 경향이 있어서, 광선, 물 및 기본적인 원예학적 투입량 정도의 조건만을 요하며, 비용면에서 효율적으로 쉽게 배양할 수 있다. 이종 유전자를 다양한 식물종 내에 도입시킬 수 있는 여러가지 상이한 기술이 개발되었는데, 예를 들면 다음과 같다.

- 이종 유전자가 삽입된 박테리아(Agrobacterium)로 식물 조직을 감염시키는 아그로박테리엄 벡터계. 아그로박테리엄으로 식물 세포를 형질 전환시키기 위한 다수의 방법이 널리 알려져 있다[밴캐네이트(Vancanneyt)등, 1990 ; 호르쉬(Horsch)등, 1985; 베번(Bevan), 1984 및 헤레라-에스트렐라(Herrera-Estrella) 등, 1983].

- 분열 조직 또는 배형성(胚形成) 칼루스(유합 조직)와 같은 재생성 조직을 DNA 피복의 미립자로 충격을 가함으로써 유전 물질을 손상되지 않은 세포 또는 조직 내부로 직접 전달하는 바이올리스틱(biolistic) 또는 입자총(particle gun)방법.

상기 미립자는 식물 세포로 침투하여, 도입시킬 유전 물질의 불활성 담체로 작용한다[고오던-캄(Gordon-Kamm)등, 및 샌포드(Sanford) 등, 1987.]

- 이종 유전자를 식물 조직 내부로 흡수시키는 방법[사이몬(Simon) : 1974].

- 일렉트로포레이션법(electroporation).

그러나, 이 방법을 적용할 때, 표적 산물의 회수는 전체 식물 또는 적어도 식물의 실질적인 부분의 채취 및 파괴를 필요로 한다. 식물이 완전히 파괴되지 않는 경우에도, 식물은 추가 채취가 가능하기 전에 재성장을 위한 긴 회복 기간을 필요로 한다. 더욱이, 담배와 같은 식물로부터(및 또한 상기 목적으로 통상 사용되는 대부분의 미생물로부터) 단백질 산물을 추출하기 위해서는 조직 고체를 균질화시켜야 한다. 이것은 비교적 문제가 있고 비효율적인 작업이다.

브라질 고무 나무인 헤베아 브라질레엔시스(Hevea brasiliensis)뮤엘-아르그(Muell-Arg)는 대극과(Euphorbiaceae科)에 속하며, 천연 고무의 생산에 약 1세기 동안 상업적으로 이용되어 왔다. 사실상, 속(屬)에는 9개의 종(種 : species)이 있으나, 헤베아 브라질리엔시스가 라치스를 고수율로 제공하기 때문에 가장 널리 재배되며, 상업적으로 가치가 있다.

라텍스는 전통적으로 태핑(tapping)으로 알려진 방법에 의해 고무 나무로 부터 추출된다. 수피 절제(bark excision) 기술, 즉 수피 조각을 나무 줄기로부터 절단하여 라텍스 유동을 개시하는 기술(계속적인 태핑은 동일한 절취물로부터 수피의 얇은 층을 잘라내어 수행함), 또는 수피 절개(bark incision)기술, 즉 수피 내부로 1개이상의 구멍을 뚫어 라텍스의 유동을 개시하는 기술로 라텍스를 추출할 수 있다. 따라서, 태핑은 비파괴적 라텍스 회수 방법이며, 반복해서 그리고 정기적으로, 일반적으로 격일로 수행할 수 있다. 천연 고무는 라텍스의 약 1/3을 구성하며, 원심 분리와 같은 다양한 분리 방법으로 쉽게 추출할 수 있다.

고무 나무는 대량의 수액 또는 삼출액, 즉 라텍스를 생산하는 능력에서 거의 독보적인 존재이며, 라텍스는 어떠한 유해 효과없이 연속적으로 채취할 수 있다. 본 발명자들은 유전 공학적 기술과 함께 고무 나무의 이러한 성질을 이용하여 약학적으로 가치 있는 단백질과 기타 목적 산물을 생산하기 위한 신규하고 유용한 경로를 제공한다.

본 발명은 유전학적으로 형질 전환된 체액 생성 식물을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 ⅰ) 식물 조직내에 표적산물의 발현을 조절하는 유전자 또는 유전자 단편을 삽입하는단계와 ⅱ) 상기 조직으로부터 식물, 즉 그 체액 내에 표적산물을 발현시킬 수 있는 유전학적으로 형질 전환된 식물을 재생시키는 단계로 이루어진다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 표적 산물의 발현을 조절하는유전자 또는 유전자 단편 및 프로모터를 포함하는 염색체 삽입물을 그 세포 내에 함유하여, 상기 표적 산물을 그 식물이 생산하는 체액에서 발현시키거나 또는 발현시킬 수 있는 식물 클론을 제공한다.

특히 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 표적 산물의 발현을 조절하는 유전자 또는 유전자 단편 및 프로모터를 포함하는 염색체 삽입물을 그 세포 내에 함유하여, 상기표적 산물을 라텍스 내에서 발현시키거나 또는 발현시킬 수 있는 헤베아 식물 클론을 제공한다.

본 발명은 또한 유전학적으로 적합하게 형질 전환시킨 식물의 눈 접붙임(芽接), 꽃꽂이 또는 기타 영양 번식 수행을 비롯하여 전술한 종류의 클론들을 생산하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 단백질 또는 기타 산물을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 ⅰ) 유전학적으로 형질 전환시킨 체액 생성목(生成木)또는 식물, 또는 이것의 클론으로부터 체액을 채취하는 단계와, ⅱ) 상기 체액으로부터 표적 단백질 또는 기타 산물을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 모든 헤베아종에 적용할 수 있고, 따라서 헤베아 식물 및 나무에 대한 본 명세서에 있는 문헌을 이해하여야 하지만, 헤베아 브라질리엔시스가 특히 바람직하다.

헤베아 식물은 생산하는 체액(즉, 라텍스)이 비파괴적이에서 채취하기가 용이하고 처리하기도 용이하며, 본래 단백질이 풍부(그러므로, 돌연변이 식물에서 이종 단백질 생산에 적합함)하기 때문에 본 발명에 사용하기 매우 적합하다. 그러나, 대량의 체액 또는 수액을 생산하는(즉, 보유하거나 삼출하는)기타 식물 역시 본 발명에 사용하기에 적합하다는 것을 이해하여야 한다. 이들의 예는 하기와 같다.

- 용설란 속(Agave 속) 식물. 이들의 일부 변종은 공벽(空壁) 고갱이로부터 하루에 최대 1리터의 삼출액을 생산할 수 있다.

- 코코넛 야자. 삼출액의 풍부한 유동을 유도하기 위해 이것의 꽃을 태핑할 수 있다.

- 삼출되지 않고 상당한 부피의 체액을 보유하는 식물 기관. 예를 들면, 어린 코코넛 열매의 배유액(즉, 물 또는 유액)을 대량으로 채취할 수 있다.

본 발명의 근본적인 방법은 다음 3가지 주단계로 이루어진다.

ⅰ) 식물의 유전자 형질 전환 단계.

이 단계에 의하여 표적 단백질 또는 기타 산물을 암호하는 유전자를 대표하는 DNA 분자는 식물 조직의 유전자 보체(complement)내부에 삽입시킨다. 또한, 유전자는 프로모터를 동반할 필요가 있다는 것을 인식하여야 한다. 소위 범용(汎用 : universal) 프로모터[조직 특이성이 없으며, 일반적으로 수액(樹液) 또는 체액을 포함하여 모든 식물 조직의 유전자 발현을 개시함]를 이용할 수 있지만, 프로모터는 체액 특이성이 있는것이 더 좋다. 고무 이물의 경우, 프로모터는 라텍스 특이성이 있는 것이 가장 바람직하다.

앞에서 확인된 바와 같이 유전자를 식물 내부에 도입시키는 다양한 기술이 공지되어 있으며, 이중 임의의 것을 이용할 수 있다. 아그로박테리엄 벡터계와 바이올리스틱법 또는 입자총법이 특히 바람직한데, 이그로박테리엄 벡터계는 표적 유전자가 이미 삽입된 아그로박테리엄으로 조직을 감염시키는 것을 요하며, 또한 바이올리스틱법 또는 입자총법은 표적 유전자를 미립자로서 조직 내부로 추진한다. 삽입된 유전자 또는 유전자 단편을 보유한 식물 조직은 형질 전환된 또는 돌연변이된 조직으로 알려져 있다. 고무 식물의 경우, 헤베아 식물의 꽃의 수술대로부터 취한 꽃밥에서 유도되는 칼루스 조직상에서 형질 전환을 수행한다.

형질 전환 기법에 의해 도입된유전자 또는 유전자 단편 및 프로모터는 관련된 식물에 대하여 본래의 것일 수도 이종의 것일 수도 있다. 프로모터를 변형시킴으로써 또는 본래의 유전자의 다중 카피(multiple copy)를 삽입함으로써 본래의 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 다양한 단백질계 산물, 가장 바람직하게는 약학적으로 가치 있는 단백질 산물을 암호화하는 외래 유전자를 도입시킬 수 있다.

ⅱ) 형질 전환시킨 조직으로부터의 식물의 재생과, 식재(稙栽) 및 영양 공급으로 성숙시키는 단계.

예를 들면, 조직 배양 기술을 통해, 헤베아의 형질 전환된 칼루스 조직을 배아단계(胚芽段階)를 경유하여, 돌연 변이체이고, 그 유전적 보체 내에 삽입된 유전자를 보유하는 소식물체(plantlet)로 재생시킨다. 소식물체는 곧 완전히 성장한 돌연변이 고무 나무로 성장하며, 삽입된 유전자에 의해 발현된 표적 단백질 또는 기타 산물이 그 식물의 라텍스 내에 존재한다.

ⅲ) 상기 식물 또는 나무에 의해 생산된 체액에서 표적 단백질 또는 기타 산물을 채취하고, 그로부터 회수하는 단계.

헤베아의 경우, 채취된 체액은 물론 라텍스로 이루어지게 된다, 돌연 변이된 고무 식물은 보통 2 내지 5 년 후 충분히 성숙하게 되며, 그것을 태핑하고, 정기적으로 라텍스를 채취한다. 이어서, 그 라텍스를 원심 분리하여 천연 고무로부터 수용성 C-유액 (C-serum) 및 소위 바닥 분획(bottom fraction)을 분리한다. 표적 단백질 또는 기타 산물은 라텍스의 임의 부분에 함유될 수 있으며, 통상의 수단(예컨대, 예비 컬럼 크로마트그래피)에 의해 추출하여 정제할 수 있다. 표적 단백질이 C-유액 또는 바닥 분획에 존재하는 것이 바람직하다. 바닥 분획은 주로 류토이드(lutoids)를 포함하며, 그들 자신의 유액(B-유액)을 함유하는 막결합 액포이다. B-유액은 트리톤 X-100과 같은 세척제를 사용하여 막을 파열시킴로써, 또는 냉동 및 해동을 거듭함으로써 류토이드로부터 방출시킬 수 있다. 라텍스 내의 생물학적막에 결합될 수 있는 표적 단백질 또는 기타 산물중 어느 것도 나트륨 도데실술페이트와 같은 세척제로 용해시켜 회수할 수 있다.

본 발명은 광범위한 단백질 산물 및 비단백질 산물의 합성을 위한 신규하고 유용한 경로를 제공한다. 그 경로는 약학적으로 가치 있는 단백질 산물의 생산에 특히 적합하다. 원칙적으로, 본 방법은 그 산물의 발현을 암호화하는 유전자를 안다면, 거의 모든 단백질계 산물의 합성에 적용될 수 있다. 삽입된 유전자에 의해 직접 암호화된 단백질 산물이 스스로 식물체 내에서 상이한 최종 산물의 생산을 촉매할 수도 있다는 것을 알 수 있게 된다. 상기 상이한 최종 산물(단백질계 또는 비단백잘계 산물)을 상업적으로 가치 있는 최종 산물로서 채취할 수 있다. 돌연 변이된 식물 또는 나무에 의해 생산될 수 있는 산물의 예는 다음과 같다.

(a) 당뇨병 치료용 인슐린

(b) 혈우병 치료용 혈액 응고 인자

(c) 심장병 치료용 혈괴 용해성 활성화 인자

(d) 암 치료용 종양 괴사 인자

(e) 빈혈 치료용 에리트로포이에틴

(f) 백신 제조용 비루스 외피형 단백질

(g) 병, 포장재 등의 제조에 사용되며 폴리프로필렌과 유사한 플라스틱 'PHB'

본 발명에서 고무 나무의 사용은 여러 가지 중요한 장점을 제공하는데, 특히 주목할 만한 것은 다음과 같다.

- 표적 단백질 또는 기타 산물을 함유하는 라텍스가 정기적으로 채취되므로 생산이 연속적이며, 생성물의 회수가 간단하다. 라텍스는 체액이므로, 표적 생성물의 회수는 조직 균질화를 요하지 않는다.

- 이 방법은 환경 친화적이다. 이 방법은 태양에 의해 추진되며, 따라서 에너지면에서 효율적이며, 본질적으로 오염이 없다.

- 고무 나무는 통상의 원예학적 관리 이상의 특별한 주의가 필요 없다. 따라서 고무 나무의 사용은 비용 효율성이 매우 높다.

- 이 기술은 광범위한 표적 산물에 사용하기에 적합하다.

- 고무 나무로부터 흘러 나오는 라텍스는 박테리아와 동물 비루스가 전혀 없다. 이것은 유전학적으로 형질 전환시킨 미생물 또는 동물을 이용할 때 적용할 필요가 있는 엄격한 무균 방법과 대조적이다.

- 고무 나무는 가장 통상적으로는 눈 접붙임에 의한 영양 번식 또는 클론 번식에 적합하다. 기타 방법으로는 꽃꽂이, 고취법(marcotting) 또는 조직 배양법이 있다. 따라서, 무한한 숫자의 유전학적으로 동일한 식물(클론)을 하나의 돌연변이된 식물로부터 생성시킬 수 있으며, 그 클론은 모두 라텍스 내에서 표적 산물을 발현시키게 된다.- 고무 나무의 경제 수명은 약 30년이다. 이 기간 동안, 표적 산물을 생산 하는 것 외에도, 유전학적으로 형질 전환고.듀」 나무의 경제 수명은 약 30 년이다. ')1 .기간 동안, 표적 산물을 생산

하는 것 외에도, 유전학적으.로 형길 전환시킨 나무 역시 그 라텍스 중의 천연 고무환를 계속 생산할 것이며, 나무 그 자체로서 상품 가치가 있다. 상기 나무가 결국 벌채되면, 이 나무 역시 가치 있는 열대성 목재(고무 목재)를 생산하여 수출 및 가구제조에 많이 이용된다.

이들 장점 중의 일부는 본 발명에 사용하기에 적합한 기타 체액 생산 식물에도 적용된다.

이제 본 발명을 후술하는 실시예에 따라 구체적으로 설명하겠다. 실시예 1은 입자총 방법을 사용한 헤베아 브라질리엔시스의 유전자 형질 전환에 관한 것이며, 실시예 2 및 3은 각각 아그로박테리엄 벡터계 및 흡수 기술을 사용한 것이다.

효소 글루쿠르니다제가 표적 단백질의 일례로 사용되고 있지만, 일반적으로 동일한 절차가 표적 단백질을 위해 적합한 유전자로 치환된 글루쿠로니다제의 생산을 조절하는 유전자를 사용한 기타 산물에도 적용할 수 있다. 실시예에서는 다음 약어들을 사용한다.

MB = 헤베아 꽃밥 배양 개시 배지

Gus/gus =β-글루쿠로니다제

NPTⅡ/nptⅡ = 네오마이신 포스포트랜스퍼라제

CAT/cat = 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제르제

PCR = 폴리머라제 연쇄 반응

ELISA = 효소 결합 면역 흡착 분석

CaMV = 콜리플라워 모자이크 비루스

실시예 1

식물 재료 및 조직 배양

배아(胚芽)를 형성할 헤베아 꽃밥 칼루스를 그의 수술대의 각 꽃밥으로부터 채취하였다. 칼루스를 채취하고, MB 배지[쳰(Chen) 등, 1984]에서 25℃를 유지하고, 이 배지 내에서 4주 후 형질 전환에 사용하였다. 모든 조직 배양 절차는 쳰 등의 문헌(1984)에 기술된 프로토콜을 기본적으로 따랐다.

식물 발현 벡터

다음의 플라스미드, 즉 β-글루코로니다제(gus) 유전자를 함유하는 pBI221.1(Jefferson, 1987), gus 및 nptⅡ 유전자를 함유하는 pMON9793(Gasser, 몬산토사, 비공개), cat와 nptⅡ 유전자를 함유하는 pDE10(Rhodes, 노르윅, 영국) 및 nptⅡ를 함유하는 pHP23(Paszkowski와 Saul, 1988)을 형질전환에 사용하였다. 이들 유전자는 강한 CaMV 35S 프로모터의 조절하에 있었다.

재조합 플라스미드는 대장균(학명 : 이.콜리 : Escherichia coli)에서 증식시키고, 알칼리 용균에 의해 분리하고, 염화세슘/에씨듐 브로마이드 밀도 구배 원심 분리에 의해 정제하였다(Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, 1989). 플라스미드 DNA는 260nm에서의 흡광도 및 겔 전기 영동법에 의해 정량화하였다.

미소 투사체 충격

플라스미드 DNA를 전술한 바와 같이 텅스텐 입자 표면에 침전시켰다(고오던-캄(Gordo-Kamm)등, 1990). 침전 혼합물은 1.30㎎의 텅스텐 입자, 25㎍의 플라스미드 DNA, 1,1M CaCl₂·2H₂O 및 8,.7mM 스퍼미딘을 함유하고, 전체 부피는 575㎕의 텅스텐 현탁액을 미소 투사체상에 적재하고, 바이오리스틱 입자총(스피어라인 프리시젼 엔지니어링 리미티드, 영국)으로 표적을 향해 가속시켰다. 꽃밥 칼루스를 워트먼(Whattman)1호 여과지 디스크(7㎝)의 중앙에 놓고, 충격을 가하기전에 MB 배지를 함유하는 플라스틱 페트리 접시(직경 9㎝)의 중앙에 배치하였다. 칼루스 배양체를 미소 투사체 정지판 5㎝ 아래에 놓고, 100㎛ 메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 정지판과 조직 사이의 중간에 배치하여 텅스텐 입자의 분산을 도왔다. 각 평판판에 1회 충격을 가하고, 그 후 암실의 25℃ 증식 챔버에서 증식시키면서 단시간 동안 항온 처리하였다.

형질 전환체의 선별

암소(暗所)에서 25℃로 충격 후에 항온 처리한 다음, 칼루스를 여과지로부터 부드럽게 제거하고, MB배지를 함유하는 새로운 평판 위에 올려놓고, 암소에서 25℃로 10일 동안 더 항온 처리하였다. 이어서, 충격을 가한 칼루스 및 대조물을 카나마이신 술페이트 100㎍/mL을 함유하는 MB 선별 배지에 옮겼다. 항생 고질 내성 콜로니를 충격 후 4주 후에 분리하고, 카나마이신 술페이트 100㎍/mL를 함유하는 분별 배지에 옮기고, 광선(250μE m^-2s^-1)하에 25℃에서 항온 처리하였다. 이것은 새순 및 뿌리의 발육을 촉진하였다. 그러나, 항생 물질을 선별하지 않더라도 소량(3%)의 체세포배(체體細胞胚)만이 소식물체로 분화한다(쳰 등, 1981 b.)

효소 분석

NPTⅡ : 형질 전환시킨 조직에서의 NPTⅡ 활성은 ELISA 키트(5-프라임-3 프라임 인코오포레이티드, 영국 CP 래보러터리즈를 통해 입수)를 사용하여 측정하였다. 분석시에 약 400㎍의 추출된 단백질을 사용하였다.

GUS : 헤베아의 형질 전환된 꽃밥 칼루스, 배아형 및 뿌리에서의 β-글루쿠로니다제 활성의 조직 화학적 분석은 제퍼슨(1987)의 프로토콜에 따라 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 글루쿠로나이드(X-gluc)를 사용하여 수행하였다. X-gluc을 첨가한 지 18∼36시간 후에, 청색으로 염색된 세포에 대해 조직을 검사하였아. 코다칼라 텅스텐 160T 필름으로 니콘 SZM-U 1:10 줌 쌍안 현미경을 사용하여 광학 현미경 사진을 찍었다. GUS 활성의 형광 분석은 기질 4-메틸-움벨리페릴-베타-D-글루쿠로나이드를 사용하여 수행하였다(제퍼슨 등, 1987).

CAT : CAT 활성은 고오먼(Gorman) 등의 문헌(1982)에 기술된 방법에 따라 측정하였다. 양성 대조물을 1단위의 박테리아 CAT 효소(시그마)를 사용하여, 충격을 가한 조직 시료와 평행으로 진행시켰다. 음성 대조물은 CAT 완충액 시료와 충격을 가하지 않은 배아형으로부터의 추출물을 포함하였다.

DNA 분리 및 PCR

DNA 분리 : 게놈 DNA는 드레이퍼(Draper)등의 문헌(1988)에 기재된 프로테아제법을 사용하여 분리하였다. 동결 건조된 헤베아 조직 50㎎을 막자와 막자사발을 사용하여 미세한 분말로 분쇄하였다. 이어서, 분말화된 조직을 40㎕의 프로테아제 완충액(100mM Tris-HCl pH 8.5, 100mM NaCl, 50mM EDTA pH 8,0, 2,0% SDS, 0.1㎎ 프로티나제 K mL^-1)과 완전히 혼합하고, 가끔 가볍게 뒤집으며 37℃에서 1∼2시간 동안 항온 처리하였다. 조직/완충액 균질물을 80㎕의 페놀 및 80㎕의 24:1(v/v)클로로포름/이소아밀알코올로 추출하였다. 수성층을 원심 분리로 분리하고, 추출 과정을 반복하였다. 두번째 추출 후에 수집한 수성층을 0.54 부피의 이소프로판올을 사용하여 -20℃에서 밤새 침전시켰다. 다음 날, 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, 50㎖ TE 완충액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 1,0mM EDTA pH 8.0)에 재현탁시켰다. 헤베아 게놈 DNA의 제한 효소 처리를 위해, 2㎕의 10×BSA/스퍼미딘(2.5㎎ BSA mL^-1, 40mM 스퍼미딘)은 대개 불순물의 존재에 기인하는 문제점을 극복하기 위해 제한 완충액에 항상 포함시켰다.

PCR : 10mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 50㎕ 광물 오일, 200μM dATP, 200μM dTTP, 200μM dCTP, 200μM dGTP, Taq 폴리머라제(0.5∼1.0 U), DNA(2∼10ng)및 올리고누클레오티드 프라이머 : 5'GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG3' 및 5'GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA3'(GUS 유전자 내 위치는 각각 400∼420 및 1599∼1579임, 제퍼슨 등, 1986)를 함유하는 50㎕에서 각각의 PCR 반응을 수행하였다. 100ng의 각 프라이머를 PCR반응에 사용하였다. Taq 폴리머라제를 아머샴 인터내셔널 피엘씨로부터 입수하였다. 변성 온도는 92℃(지속 시간 1분)이었으며, 어닐링 온도는 55℃(지속 시간 1.5분)이었고, 신장 온도는 72℃(지속 시간 2.0분)이었다. 반응은 프로그램된 온도 제어기[더 하이베이드 써어멀 리액터(The Hyoaid Thermal Reactor)]를 사용하여 30사이클로 프로그램하였다. 처리 완충액으로서 TBE(0.9 M Tris-HCl, 25mM EDTA, 0.9mM H₃BO₃)를 사용하여 1.0% 아가로즈/아티듐 브로바이드 겔에서 시료를 처리한 후에 DNA를 검출하였다.

결과

형질 전환 및 재생

채택된 바이오리스틱 프로토콜은 일시적 유전자 발현을 연구하기 위해 보리의 배아 내부로 유전자 도입에 대해 확립된 절차를 따랐다[엠. 지. 케이. 조운스(M. G. K. Jones), 로담스테드, 영국]. 사용된 꽃밥 칼루스를 배아 형성 특성이 큰 헤베아 클론(클론 수탁 번호 11)으로부터 유도하여 입자 충격용으로 이용하였다. 충격을 가한 칼루스를 선별 배지에 옮길 때, 카나마이신 내성의 미소칼루스가 매우 느리게 증식하는 것으로 보였으나, 이들 형질 전환된 칼루스는 충격을 가하지 않은 암색의 죽은 칼루스 사이에서 건강하고 백색으로 보였다(제1도). X-gluc의 첨가시 청색을 나타내는 항생 물질 선별 칼루스 및 배아형의 비율은 플라스미드 pMON9793을 사용하여 충격을 가한 후에는, 칼루스에서는 90%, 배아형에서는 80%에 이르렀다. pBI221.2를 사용하였지만, 카나마이신 선별을 행하지 않았을때, 청색으로 착색된 비율은 칼루스에서는 60%, 배아형에서는 70%에 이르렀다(표1). 플라스미드 pMON9793을 사용하여 충격을 가한 칼루스 및 배아형에서 나타난 더 높은 전이 효율은 카나마이신 선별에 기인할 가능성이 크다.

표 1 : GUS 활성을 나타내는 칼루스 및 배아형의 비율

플라스미드 10

형질 전환체 10

칼루스의 수효 9

GUS를 나타내는 칼루스의 수효 9

비율 90

pMON9793 10

꽃밥 칼루스 10

배아형 6

pBI221.2 7

꽃밥 칼루스 60

배아형 70

GUS에 대한 조직 화학적 분석은 종종 카나마이신을 선별함이 없이 배양시킨 칼루스에서의 효소 활성의 이질적인 유형을 입증하지만, 카나마이신 선별 후의 세포에서는 균질적인 유형을 나타내었다. 대조용(충격을 가하지 않은)꽃밥 칼루스, 배아형 또는 뿌리 중 어느 것도 X-gluc를 사용하였을 때 청색으로 염색되지 않았다. 이들 실험의 결과를 제1도에 나타낸 광학 현미경 사진에 요약한다.

GUS 활성에 대한 조직 화확적 염색으로부터 얻은 결과는 형광 분석법을 사용하여 확인하였다(제2도). GUS 형광 분석 활성은 분석한 형질 전환된 배아형의 90%에서 명백하였으며, 일반적으로 충격을 가하지 않은 대조값과 비교하여 형질 전환된 배아형에서 GUS활성이 4배 증가하였다.

ELISA 기법을 사용하여 형질 전환된 칼루스에서 NPTⅡ함량을 정량하였다(제3도). 일반적으로, NPTⅡ단백질 농도는 배경 대조값의 약 4배 이상이었고 총 단백질 1㎎ 당 28∼32ng NPTⅡ의 범위이었다.

리포터 유전자로서 gus를 사용하는 것 이외에도, 본원 발명자들은 cat 유전자를 사용하여 헤베아내로의 유전자 전달을 탐색하였다. 이 실험에 대한 결과는 제4도에 도시한 방사선 사진에 요약하였다. cat유전자를 함유하는 플라스미드는 충격에 의해 전달될 수 있고, 헤베아 칼루스 및 배아형 조직에서 효과적으로 형질 발현됨을 분명하다. 충격을 가하지 않은 대조 조직에서는 극히 낮은 정도의 CAT 활성이 확인되었다(제4도, 3레인).

헤베아 칼루스 내의 전이된 리포터 유전자의 존재에 대한 직접적인 조사는 PCR 기법을 사용하여 수행했다. 해밀 등의 방법(1991)을 사용하여 gus의 내부 서열을 증폭시켰다. 30주기의 증폭후에 0.8ng정도의 소량의 주형 DNA를 사용하여 아가로즈/에씨듐 브로마이드 겔상에서 단일의 밴드를 확인할 수 있었다. 이 증폭된 밴드는 크기 면에서 gus 유전자와 동일하였다.

최종적으로 본원의 발명자들은 입자 충격 후에 2개의 헤베아 소식물체(무균성장된 것)를 재생시켰다(제6도). X-gluc로 처리한 후에 소식물체는 매우 정상적인 것으로 나타났고, 뿌리는 청색으로 염색되었다. 이들 소식물체 중 하나에서 gus 유전자의 존재는 칼루스로부터 유도된 DNA 상에 수행한 것과 동일한 PCR 프로토콜을 사용하여 확인했다. 제7도에 나타낸 바와 같이, 4.0ng 정도의 소량의 헤버아 잎 DNA를 사용하여 gus 유전자의 증폭을 성공적으로 달성하였다. 대조용(충격을 가하지 않은) 칼루스, 배아형 또는 소식물체에서는 전술한 바와 동일한 PCR조건을 사용하여 gus 유전자를 증폭시킬 수 없었다.

이러한 결과는 리포터 유전자 분석, 카나마이신 내성 형질 전환체의 회수 및 PCR 기법 사용으로써 확증되는 바와 같이, 미소 투사체/미립자가 외래 DNA를 헤베아 브라질리엔시스 세포 내로 전달할 수 있음을 보여준다. 세포 내로 전달된 DNA는 미소 투사체의 표면으로부터 분명하게 탈착하며, 일부 수동 또는 능동 메카니즘에 의해 핵으로 수송되며, 핵 중에서 그 유전자는 형질 발현될 수 있다.

실시예 2

I. 칼루스 조직 형질 전환

선택된 헤베아 재배종의 꽃을 5분 동안 클로록스(5.25% 활성 성분인 하이포염소산나트륨)로 소독한 후에 멸균 증류수로 수회 세척하였다. 꽃밥을 수술대로부터 절단하고, MB 배지에 접종시켰다(20 꽃밥/페트리 평판). 배양물을 암소에서 25℃로 항온 처리하였다.

아그로박테리엄을 경유한 유전자 형질 전환

4 주령(週令)의 헤베아 꽃밥 칼루스는 효소 글루쿠로니다제(GUS) 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 보유한 아그로박테리엄 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 감염시켰다. 네오마이신 포스프트랜스퍼라제는항생 물질 카나마이신에 대한 내성을 부여한다. 칼루스는, 7% 슈크로즈를 함유하되 호르몬을 추가하지 않은 액상 MB 배지로 회석시킨 아그로박테리엄 투메파시엔스 현탁액(pH 5.8)을 밤새 배양시킨 배양액에 1분 동안 침지시켜, 최종적으로 추정된 박테리아군이 3.7 × 10⁸세포/ml가 되도록 하였다. 군 밀도의 추정은 600nm에서 밤새 배양한 배양액의 흡광도를 측정함으로써 수행하였다. 과량의 박테리아 현탁액을 멸균 워트먼 1호 여과지를 사용하여 칼루스로부터 흡수시키고, 칼루스를 2일의 동시 배양 기간 동안 페트리 평판으로 옮겼다.

칼루스를 항생 물질 세포탁심(250㎍/ml) 및 Ticar(500㎍/ml)를 함유하는 MB 배지로 옮겨서 아그로박테리엄을 사멸시켰다.

1주 후에, 여전히 세포탁심(cefotaxime)과 Ticar를 보유하는 선별용 평판(MB, Km 100㎍/ml)표면에 칼루스를 놓았다. 세포탁심 및 Ticar의 농도는 1주 간격으로,계속되는 계대 배양에서 점차 감소되었다.

II. 형질 전환된 소식물체의 재생

칼루스 배양물을 MB 배지에서 평판 배양하고 1주 동안 항온 처리한 후에 7일마다 새로운 배지(MB)로 옮겼다. 3주 후에, 배양물을 선별용 분화 배지로 옮겼다. 이 단계들은 약 2 달간 지속하여, 30일 후에 새로운 배지로 옮겼다. 배양물을 재차 25℃의 암소에서 항온 처리하였다. 형질 전환된 세포를 선별하기 위해 초기 배지(MB) 및 분화 배지는 양쪽 모두다 카나마이신 술페이트(100㎍/ml)를 함유하였다.

분화 배지에서 약 60일 후에, 발생된 배아형을 새싹 및 뿌리를 형성시키기위한 발육 배지로 옮겼다. 소식물체를 토양에 이식(移植)한 옮겨심은 후에 영양 성분을 공급하여 순화시켰다.

헤베아 브라질리엔시스 소식물체는 아그로박테리엄의 매개에 의해 GUS 유전자를 삽입시킨 후에 성공적으로 재생되었다. 소식물체는 정상적인 것으로 나타났고, 시료 잎은 X-gluc로 처리한 후에 청색으로 염색되었는데, 이는 GUS 유전자의 형질 발현을 시사한다. 형질 전환시키지 않은 시험관내 배양된 헤베아 식물로부터 얻은 시료 잎은 유사하게 X-gluc로 처리했을 때 염색되지 않았다. 그 결과를 제8도에 도시하였다.

실시예 3

아그로박데리엄 벡터계 대신에 다음과 같은 흡수법에 의해 유전자 형질 전환을 수행하는 것을 제외하고는, 실시예 2 와 기본적으로 동일한 절차를 수행하였다.

4 주령의 헤베아 꽃밥 칼루스는 그 조직을 30분 동안 37℃항온 처리기에 넣어서 탈수시켰다. 칼루스를 글루쿠로니다제에 대한 유전자를 함유한 DNA 용액(멸균수 중 pBI 221.1 DNA 100㎍)중에서 30분동안 흡수시켰다. 배양물을 MB배지로 옮기고, 이어서 분화 배지로 옮겼다. 그러나 실시예 2와 달리 배지는 카나마이신 술페이트를 함유하지 않았다.

도면에 대한 범례

제1도에서 A는 대조용 칼루스이고, B는 충격을 가한 3 주령의 꽃밥 칼루스의 세포이며, C는 대조용 배아형이다. D는 입자 충격 후의 배아형을 나타낸다. 모든 사진은 25 배 확대 사진이다.

제2도에서, 결과는 평균 ± 표준 편차로 나타나 있고, n=20 배아형이다.

제3도에서, 결과는 nptⅡ 유전자를 보유하고 있는 3 개의 상이한 플라스미드(방법 설명 부분 참조)에 대해 나타낸 것이다. 값들은 평균 ± 표준 편차이고, n=χ 복제물이다.

제4도는 [¹⁴C]클로람페니콜(CAP), [¹⁴C]1-아세틸클로람페니콜(1-CAP) 및[¹⁴C]3-아세틸클로람페니콜(3-CAT)의 위치를 나타내고 있다. 레인 1:양성 대조용으로 사용된 상업용 CAT(시그마), 레인 2: 음성 대조용(완충액만을 함유함), 레인 3: 대조용(충격을 가하지 않은) 꽃밥 칼루스, 레인 4∼6: 카나마이신 술페이트상에서 선별한 지 3 주 후의 형질 전환된 상이한 꽃밥 칼루스, 레인 7: 카나마이신 술페이트의 존재하에 충격을 가한 칼루스로부터 재생된 배아 조직.

제5도에서, 레인 1은 1 Kb 래더(ladder), 레인 2는 500 ng DNA, 레인 3은 100 ng DNA, 레인 4는 20 ng DNA, 레인 5는 4 ng DNA, 레인 6은 0.8ng DNA를 나타낸다.

제6도는 색원체 기질 X-gluc로 처리한 후의 GUS 활성을 보여준다. 모든 사진은 25 배 확대사진이다.

제7도에서, 레인 1은 1 Kb 래더, 레인 2는 대조용(충격을 가하지 않은) 식물의 4.0ng DNA, 레인 3은 형질 전환된 칼루스의 4.0 ng DNA, 레인 4는 형질전환된 배아형의 4.0ng DNA, 레인 5는 형질 전환된 헤베아 소식물체의 홀잎[單葉]에서 분리된 4.0 ng DNA를 나타낸다.

제8도의 H에서, 형질 전환되지 않은 시료(위)는 염색되기 않았으며, 반면에 형질 전환된 시료(아래)는 청색으로 염색되었다. 사진 H는 10 배 확대 사진이다. I에서, 형질 전환된 시료(위)는 염색되지 않았으나, 반면에 형질 전환된 시료(아래)는 청색으로 염색되었다. 사진 I는 31 배 확대 사진이다.

인용 문헌

Claims (15)

1. ⅰ) 표적 산물의 발현을 조절하는 유전자 또는 그 유전자 단편을 식물 조직 내에 삽입하는 단계, ⅱ) 그 식물이 생성하는 체액 내에서 표적 산물을 발현시킬 수 있는 유전학적으로 형질 전환된 식물을 상기 조직으로부터 재생시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전학적으로 형질 전환된 체액 생성 식물을 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 식물은 헤베아 속(Hevea 屬)에 속하는 하나의 종(species)이며, 상기 표적 산물은 상기 식물의 라텍스(유액)에서 발현되는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 식물은 헤베아 브라질리엔시스(Hevea brasiliensis)인 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 또는 그 유전자 단편의 삽입은 아그로박테리엄(Agrobacterium) 벡터계를 사용하여 수행되는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 또는 그 유전자 단편의 삽입은 바이올리스틱(biolistic)방법 또는 입장총(particle gun)방법을 사용하여 수행되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 표적 산물은 단백질인 것인 방법.
7. 표적 산물의 발현을 조절하는 프로모터 및 유전자 또는 그 유전자 단편을 포함하는 염색체 삽입물을 그 세포 내에 함유함으로써써, 상기 표적 산물을 그 식물이 생성하는 체액 내에서 발현시키거나 또는 발현시킬 수 있는 체액 생성 식물 클론.
8. 제7항에 있어서, 상기 식물은 헤베아 속에 속하는 하나의 종이며, 상기 표적 산물을 라텍스 내에서 발현시키거나 또는 발현시킬 수 있는 체액 생성 식물 클론.
9. 제8항에 있어서, 상기 식물은 헤베아 브라질리엔시스인 것인 체액 생성 식물 클론.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 프로모터 및/ 또는 상기 유전자 또는 그 유전자 단편은 상기 식물에 대해 외래성인 것인 체액 생성 식물 클론.
11. 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 프로모터 및/또는 상기 유전자 또는 그 유전자 단편은 상기 식물 유래의 것인 체액 생성 식물 클론.
12. 제7항에 있어서, 상기 표적 산물은 단백질인 것인 체액 생성 식물 클론.
13. 유전자적으로 적절히 형질 전환시킨 식물의 눈 접붙임(芽接), 꽃꽂이 또는 기타 수행되는 영양 번식을 포함하는 것을 특징으로 하는 제7항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 기재된 체액 생성 식물 클론을 증식시키는 방법.
14. ⅰ) 유전자적으로 형질 전환시킨 체액 생성목(生成木) 또는 식물, 또는 이것의 클론으로부터 체액을 채취하는 단계와, ⅱ) 상기 체액으로부터 표적 단백질 또는 기타 산물을 회수하는 단계를 포함하는 것이 특징인 단백질 또는 기타 산물을 생산하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 식물은 헤베아 속에 속하는 하나의 종이며, 표적 단백질 또는 기타 산물은 상기 식물이 생성하는 라텍스로부터 회수되는 것이 특징인 단백질 또는 기타 산물을 생산하는 방법.