ES2217257T3 - Metodo para la produccion de proteinas en fluidos de plantas. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN METODO PARA PRODUCIR UNAS PLANTAS PRODUCTORAS DE FLUIDO GENETICAMENTE TRANSFORMADAS QUE COMPRENDE: I) INSERTAR DENTRO DEL TEJIDO DE LA PLANTA UN GEN O FRAGMENTO QUE CONTROLE LA EXTRESION DE UN PRODUCTO OBJETIVO, Y II) REGENERAR UNA PLANTA DESDE DICHO TEJIDO, LA PLANTA GENETICAMENTE TRANSFORMADA ES CAPAZ DE EXPRESAR EL PRODUCTO OBJETIVO EN EL FLUIDO QUE PRODUCE. TAMBIEN PROVISTOS CLONES DE PLANTAS PRODUCTORAS DE FLUIDO GENETICAMENTE TRANSFORMADAS QUE CONTIENEN EN SUS CELULAS UN CROMOSOMA INSERTO TAL QUE EL PRODUCTO OBJETIVO SE EXPRESA EN LOS FLUIDOS QUE PRODUCEN LAS PLANTAS. UN METODO PARA PRODUCIR LA PROTEINA U OTRO PRODUCTO OBJETIVO QUE COMPRENDE: I) COSECHAR EL FLUIDO DESDE UNA PLANTA O ARBOL PRODUCTOR DEL MISMO GENETICAMENTE TRANSFORMADO, O UNO DE SUS CLONES Y II) RECUPERAR LA PROTEINA OBJETIVO O EL OTRO PRODUCTO DE DICHO FLUIDO. MAS PREFERENTEMENTE, LAS PLANTAS SON DE CAUCHO (HERVEA) Y LOS GENES EXTERIORES CUYO CODIGO PARA PRODUCTOS DE PROTEINA FARMACEUTICAMNTE EVALUABLEPUEDE SER CULTIVADO EN EL LATEX PRODUCIDO POR LAS PLANTAS.

Description

Método para la producción de proteínas en fluidos de plantas.

Esta invención se refiere a un método para producir plantas transformadas genéticamente que son capaces de expresar un producto genético deseado, y a clones de dichas plantas transformadas genéticamente que tienen la misma capacidad. Más particularmente, las plantas implicadas son de un tipo que produce un fluido voluminoso, y el producto genético diana se expresa en dicho fluido. Lo más preferiblemente, las plantas son plantas de caucho (Hevea) y los genes son genes ajenos que codifican productos proteínicos farmacéuticamente valiosos, que después pueden ser recolectados en el látex producido por las plantas y recuperados de él.

Las técnicas para la transformación genética de diversos microorganismos, tales como levaduras, hongos y bacterias, para los propósitos de producir proteínas específicas mediante la expresión de genes "ajenos", son bien conocidas. Sin embargo, los microorganismos requieren el mantenimiento de condiciones adecuadas en las que sobrevivir y multiplicarse. Por ejemplo, usualmente se necesita que la temperatura ambiente, el valor del pH y el nivel de aireación sean controlados cuidadosamente, mientras que los nutrientes se deben añadir al medio de cultivo en dosis reguladas cuidadosamente, y retirar los productos de desecho. Se deben observar prácticas asépticas rigurosas, con el fin de evitar la contaminación por microbios ajenos. Los microorganismos se cultivan, por ello, normalmente en sofisticados fermentadores o biorreactores, que se alojan en fábricas mantenidas costosamente. Tales gastos generales se reflejan en el alto precio de los productos proteínicos finales.

Más recientemente, la atención se ha centrado en la introducción de genes ajenos en plantas, tales como las plantas del tabaco. Esta aplicación de las técnicas de transformación genética ha permitido la incorporación de diversos rasgos genéticos importantes para la mejora de las cosechas, y también para la producción biotecnológica de proteínas ajenas extraíbles, valiosas (tales como anticuerpos). A diferencia de los microorganismos, las plantas tienden a cuidarse a sí mismas, requiriendo poco más que luz solar, agua y aportación hortícola básica, y pueden cultivarse fácilmente en una base eficaz en costo. Se han desarrollado varias técnicas diferentes para permitir la introducción de genes ajenos en diversas especies de plantas, y estas incluyen:

- el sistema vectorial Agrobacterium, que implica la infección del tejido de la planta con una bacteria (Agrobacterium) en la cual se ha insertado el gen ajeno. Son bien conocidos varios métodos para transformar células de plantas con Agrobacterium (Vancanneyt et al., 1990; Horsch et al., 1985; Bevan, 1984 y Herrera-Estrella et al., 1983);

- el método biolístico o de cañón de partículas, que permite que se administre material genético directamente a células o tejidos intactos bombardeando tejidos regenerables, tales como meristemas o callos embriogénicos, con micropartículas revestidas con ADN. Las micropartículas penetran en las células de la planta, actuando como vehículos inertes del material genético a introducir (Gordon-Kamm et al., 1990, y Sanford et al., 1987). El bombardeo de microproyectiles de cultivos embriogénicos en suspensión ha resultado ser exitoso para la producción de plantas transgénicas de álamo amarillo (Dayton et al., 1992), algodón (Finer y McMullen, 1990), maíz (Gordon-Kamm et al., 1990) y soja (McMullen y Finer, 1990). Se han definido diversos parámetros que influyen en la administración de ADN por el bombardeo de partículas (Klein et al., 1988; Wang et al., 1988).

- Por imbibición del gen ajeno en el tejido de la planta (Simon, 1974); y

- Electroporación.

Cuando se adopta este avance, sin embargo, la recuperación del producto diana implica la recolección y destrucción de la planta entera, o al menos de una parte sustancial de la planta. Incluso donde la planta no se destruye totalmente, requiere entonces un largo periodo de recuperación para su recrecimiento, antes de que sea posible otra recolección. Además, la extracción del producto proteínico a partir de plantas tales como el tabaco (e incluso también de la mayoría de los microorganismos que se usan comúnmente para tales propósitos) implica la homogeneización de los sólidos tisulares. Esto puede ser una operación relativamente problemática e ineficaz.

El árbol de caucho brasileño, Hevea brasiliensis Muell-Arg, pertenece a la familia Euphorbiaceae y ha sido explotado comercialmente para la producción de caucho natural durante alrededor de un siglo. Hay, de hecho, nueve especies en el género Hevea, pero el Hevea brasiliensis es el más ampliamente cultivado y valioso comercialmente, dado que da el rendimiento en látex más alto.

El látex se extrae tradicionalmente de los árboles de caucho por un método conocido como "sangrado". Esto se puede conseguir, o bien por una técnica de excisión de la corteza, en la que se corta una tira de corteza del tronco del árbol, con el fin de iniciar el flujo de látex (siendo llevados a cabo posteriores sangrados excindiendo una fina capa de corteza del mismo corte), o bien por una técnica de incisión en la corteza, según la cual se hacen una o más punciones en la corteza para iniciar el flujo de látex. El sangrado es, así, un método no destructivo de recuperación de látex, y se puede realizar repetidamente y a intervalos regulares, típicamente cada día alterno. El caucho natural constituye alrededor de una tercera parte del látex, y se puede extraer fácilmente por diversas técnicas de separación, tales como la centrifugación.

El árbol de caucho es casi único en ser capaz de producir una voluminosa savia o exudado, es decir, látex, que se puede recolectar de manera continua sin ningún efecto dañino. Los presentes inventores han utilizado esta propiedad del árbol de caucho, junto con técnicas de ingeniería genética, para proporcionar una nueva y ventajosa ruta para la producción de proteínas farmacéuticamente valiosas y otros productos diana.

Según la presente invención, se proporciona un método para producir una planta productora de fluido transformada genéticamente, que comprende:

i) insertar en el tejido de la planta un gen o un fragmento de gen que controla la expresión de un producto diana, y

ii) regenerar una planta a partir de dicho tejido, siendo la planta transformada genéticamente capaz de expresar el producto diana en el fluido que produce.

Según una realización más de la presente invención, se proporciona un clon de la planta que contiene en sus células un inserto cromosómico que incluye un promotor y un gen o un fragmento de gen que controla la expresión de un producto diana, de tal modo que dicho producto diana se expresa o es capaz de ser expresado en el fluido que produce.

En una realización particularmente preferida, la invención proporciona un clon de la planta de Hevea que contiene en sus células un inserto cromosómico que incluye un promotor y un gen o un fragmento de gen que controla la expresión de un producto diana, de tal modo que dicho producto diana se expresa o es capaz de ser expresado en el látex.

La presente invención proporciona además un método para producir clones de los tipos mencionados anteriormente, que comprende injertar un brote, hacer un esqueje o realizar de otro modo la propagación vegetativa de una planta transformada genéticamente de manera adecuada.

En aún otra realización más, la presente invención proporciona un método para producir una proteína u otro producto, que comprende:

i) recolectar el fluido de un árbol o planta productora de fluido transformada genéticamente, o de un clon suyo, y

ii) recuperar la proteína u otro producto diana de dicho fluido.

El método es aplicable a todas las especies de Hevea, y las referencias en la presente memoria a las plantas y árboles Hevea son para entenderse así, pero se prefiere particularmente la Hevea brasiliensis.

Las plantas de Hevea son muy adecuadas para el uso en la presente invención, dado que el fluido que producen (es decir, látex) es fácil de recolectar no destructivamente, fácil de procesar, y es naturalmente rico en proteínas (y por consiguiente, tratable para la producción de proteínas ajenas en la planta transgénica).

El avance que subyace en esta invención se divide en tres etapas principales:

i) el procedimiento de transformación genética de la planta, por el cual la molécula de ADN que representa el gen que codifica la proteína u otro producto diana se inserta en el complemento genético de los tejidos de la planta. Se apreciará que el gen también necesitará estar acompañado por un promotor. Aunque se pueden emplear los llamados promotores "universales" (que no son específicos de tejidos y que generalmente activan la expresión de genes en todos los tejidos de la planta, incluyendo la savia o fluido), el promotor es, más preferiblemente, específico del fluido. En el caso de la planta de caucho, el promotor es, lo más preferiblemente, específico del látex.

Se conocen diversas técnicas para introducir genes en plantas, como se reconoció anteriormente, y se puede emplear cualquiera de éstas. Particularmente preferidos son el sistema vectorial de Agrobacterium, que implica la infección del tejido con un Agrobacterium en el cual se ha insertado ya el gen deseado, y el método biolístico o de cañón de partículas, según el cual el gen deseado se propele en el tejido sobre una micropartícula. El tejido de la planta que lleva el gen o fragmento de gen insertado se conoce como tejido transformado o transgénico. En el caso de la planta del caucho, la transformación se realiza en tejido de callo derivado de la antera, tomado de la columna estaminal de una flor de la planta de Hevea.

El promotor y el gen o fragmento de gen introducidos por la técnica de transformación pueden ser o bien nativos o bien ajenos a la planta implicada. Es posible potenciar la expresión de un gen nativo modificando el promotor o insertando múltiples copias de ese gen. Se pueden introducir genes ajenos, que codifican diversos de productos basados en proteínas, lo más preferiblemente productos proteínicos farmacéuticamente valiosos.

ii) la regeneración de una planta a partir del tejido transformado, el transplante y la cría hasta la madurez. Por ejemplo, mediante la técnica de cultivo tisular, se regenera el tejido de callo transformado de la Hevea, por vía de una etapa embrionaria, en una pequeña planta, que es transgénica y lleva el gen insertado en su complemento genético. Con el tiempo, la pequeña planta madura en un árbol de caucho transgénico maduro, y la proteína u otro producto diana expresado por el gen insertado está presente en su látex.

iii) La recolección de la proteína u otro producto diana en el fluido producido por la planta o árbol, y la recuperación de la misma de ellos. En el caso de la Hevea, el fluido recolectado será, por supuesto, látex. Una vez que la planta del caucho transgénica ha crecido hasta una madurez suficiente, usualmente después de dos a cinco años, se sangra y el látex se recolecta a intervalos regulares. Después, el látex se centrifuga usualmente para separar el caucho natural, el suero-C acuoso y la llamada "fracción de fondo". La proteína u otro producto diana pueden estar contenidos en cualquier parte del látex, y pueden extraerse y purificarse por medios convencionales (tal como cromatografía en columna preparativa). Preferiblemente, está presente en el suero-C o en la fracción de fondo, comprendiendo ésta última principalmente lutoides, que son vesículas unidas por la membrana que contienen su propio suero

\hbox{(suero-B).}

El suero-B puede ser liberado de los lutoides rompiendo sus membranas usando detergentes, tales como Tritón

\hbox{X-100,}

o congelando y descongelando alternativamente. Cualquiera de las proteínas u otros productos diana que pueden estar unidos a membranas biológicas en el látex puede recuperarse solubilizando con detergentes tales como el dodecilsulfato sódico.

La presente invención proporciona una nueva y ventajosa ruta para la síntesis de un amplio intervalo de productos proteínicos y no proteínicos. Es particularmente adecuada para la producción de productos proteínicos farmacéuticamente aceptables. En principio, la técnica debe ser aplicable a la síntesis de virtualmente cualquier producto basado en proteínas, a condición de que se conozca el gen que codifica su expresión. Se apreciará que el producto proteínico que es codificado directamente por el gen insertado puede catalizar por sí mismo, dentro de la planta, la producción de un producto final diferente. Este último producto (proteínico o no proteínico) puede después ser recolectado como el producto final comercialmente valioso. Los ejemplos de productos que pueden ser producidos por las plantas o árboles transgénicos son los siguientes:

(a)

Insulina para el tratamiento de la diabetes

(b)

Factores de la coagulación sanguínea para el tratamiento de la hemofilia

(c)

Activadores de la disolución de coágulos sanguíneos para el tratamiento cardiaco

(d)

Factores necróticos de tumores para el tratamiento del cáncer

(e)

Eritropoyetina para el tratamiento de la anemia

(f)

Proteínas de cubiertas virales para la producción de vacunas

(g)

"PHB", un plástico similar al polipropileno que se usa para la fabricación de botellas, envoltorios, etc.

El uso de los árboles de caucho, en particular en la presente invención, tiene varias ventajas significativas, de las cuales las siguientes son especialmente dignas de mención:

- La producción es continua, dado que el látex que contiene la proteína u otro producto diana es recolectado a intervalos regulares, y la recuperación del producto es simple. Como el látex es un fluido, la recuperación del producto diana no implica homogeneización de los tejidos.

- El avance es respetuoso con el medio ambiente. El procedimiento es dirigido por el sol y es, así, eficaz en energía, y esencialmente libre de polución.

- Los árboles de caucho no requieren especial atención más allá del mantenimiento hortícola rutinario. Su uso es, así, muy eficaz en costes.

- La técnica es aplicable para el uso para un amplio intervalo de productos diana.

- El látex que fluye del árbol de caucho está completamente libre de bacterias y virus animales. Esto está en contraste con las rigurosas prácticas asépticas que se necesitan adoptar cuando se emplean microorganismos o animales transformados genéticamente.

- Los árboles de caucho son susceptibles a la propagación clonal o vegetativa, lo más comúnmente por injerto de brotes. Otros avances incluyen hacer un esqueje, "marcotting", o cultivo de tejidos. Así, se puede regenerar un número ilimitado de plantas genéticamente idénticas (clones) a partir de una única planta transgénica - todas las cuales seguirán expresando el producto deseado en su látex.

- Los árboles de caucho tienen una vida económica de alrededor de treinta años. Durante este tiempo, además de producir el producto diana, el árbol transformado genéticamente continuará, por supuesto, produciendo caucho natural en su látex, que es un artículo valioso por derecho propio. Cuando al final es talado, el árbol también da una valiosa madera tropical (madera de caucho) que es muy apreciada para exportación y fabricación de muebles.

Algunas de estas ventajas son compartidas por otras plantas productoras de fluidos adecuadas para el uso en esta invención.

Esta invención será ilustrada ahora además por los siguientes ejemplos. El Ejemplo 1 se refiere a la transformación genética de Hevea brasiliensis usando el método de cañón de partículas, mientras que los Ejemplos 2 y 3 muestran el uso del sistema vectorial Agrobacterium y la técnica de imbibición, respectivamente. La enzima glucuronidasa se usa como un ejemplo de proteína diana, pero se aplicarán, de manera general, los mismos procedimientos para otros productos, siendo sustituido el gen que controla la producción de glucuronidasa por el gen apropiado para la proteína diana. Las siguientes abreviaturas se citan en los Ejemplos:

MB = medio de cultivo de iniciación de antera de Hevea

GUS/gus = \beta-glucuronidasa

NPTII/nptII = neomicina fosfotransferasa

CAT/cat = cloramfenicol acetiltransferasa

PCR = reacción en cadena de la polimerasa

ELISA = ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

CaMV = virus del mosaico de la coliflor

Ejemplo 1 Material de la planta y cultivo tisular

Se inició un callo de antera de Hevea embriogénico a partir de anteras individuales de la columna estaminal. El callo se inició y se mantuvo a 25ºC en medio MB (Chen et al., 1984) y se usó para la transformación después de cuatro semanas en este medio. Todos los procedimientos de cultivo tisular siguieron esencialmente el protocolo descrito en Chen et al., (1984).

Vectores de expresión de la planta

Se usaron los siguientes plásmidos para la transformación: pB1221.1 (Jefferson, 1987) conteniendo el gen de la \beta-glucuronidasa (gus), pMON9793 (Gasser, Monsanto Company, sin publicar) conteniendo los genes gus y nptII, pDE10(Rhodes, Norwich, RU) conteniendo los genes cat y nptII, y pHP23 (Paszkowski y Saul, 1988) conteniendo nptII. Estos genes estuvieron bajo el control del fuerte promotor CaMV 35S. Los plásmidos recombinantes se hicieron crecer en E. coli, se aislaron por lisis alcalina y se purificaron por centrifugación en gradiente de densidad en cloruro de cesio/bromuro de etidio (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989). El ADN del plásmido se cuantificó por su absorbancia a 260 nm y por electroforesis en gel.

Bombardeo de microproyectiles

El ADN plásmido fue precipitado sobre partículas de tungsteno como se describe previamente (Gordon-Kamm et al., 1990). La mezcla de precipitación incluyó 1,30 mg de partículas de tungsteno, 25 \mug de ADN plásmido, de CaCl_{2}.2H_{2}O 1,1 M y espermidina 8,7 mM en un volumen total de 575 \mul. Después de la adición de los componentes en el orden anterior, la mezcla se llevó a un vortex a 4ºC durante 10 minutos, se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos, y después se descartaron 550 \mul del sobrenadante. El pelet se resuspendió en los restantes 25 \mul de sobrenadante y, de este, 1 \mul de la suspensión de tungsteno se cargó en un microproyectil y se aceleró hacia la diana con una cañón biolístico de partículas (Spearline Precision Engineering Ltd., RU). Los callos de antera se colocaron en el centro de un disco de papel de filtro Whatman Nº 1 (7 cm) que se colocó después en el centro de una placa Petri de plástico (9 cm de diámetro) que contenía medio MB, antes del bombardeo. Los cultivos de callo se colocaron 5 cm por debajo de la placa de detención de los microproyectiles, y se colocó un tamiz de acero inoxidable de 100 \mum de malla a medio camino entre la placa de detención y el tejido, para ayudar a la dispersión de las partículas de tungsteno. Cada placa fue bombardeada una vez, y los callos se incubaron después durante un rato en una cámara de crecimiento a 25ºC en la oscuridad.

Selección de transformantes

Después de la incubación post-bombardeo a 25ºC en la oscuridad, los callos se retiraron suavemente del papel de filtro y se colocaron sobre una nueva placa que contenía medio MB, y se incubó adicionalmente durante 10 días a 25ºC en la oscuridad. Los callos bombardeados y los controles se transfirieron después a un medio MB de selección, que contenía sulfato de kanamicina 100 \mug ml^{-1}. Las colonias resistentes a los antibióticos fueron aisladas cuatro semanas después del bombardeo, y transferidas a un medio de diferenciación que contenía sulfato de kanamicina 100 \mug ml^{-1},y se incubaron a 25ºC a la luz (250 \muE m^{-2} s^{-1}). Esto estimuló el desarrollo de retoños y raíces; sin embargo, incluso sin selección antibiótica, sólo un pequeño porcentaje (3%) de los embriones somáticos se diferenciaron en plantas pequeñas (Chen et al., 1981 ^{b}).

Ensayos enzimáticos

NPTII: la actividad de la NPTII en el tejido transformado se determinó usando un Kit ELISA (5 Prime-3 Prime, Inc., obtenido mediante CP Laboratories, RU). Se usaron aproximadamente 400 \mug de proteína extraída por cada ensayo.

GUS: El análisis histoquímico de la actividad de la \beta-glucuronidasa en el callo de antera transformado, embrioides y raíces de Hevea se realizó usando el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucurónido (X-gluc) según el protocolo de Jefferson (1987). Se examinaron las células del tejido manchadas de azul 18-36 horas después de la adición del X-gluc. Se tomaron microfotografías usando un microscopio binocular de zoom 1:10 Nikon SZM-U, con película Kodacolor Tungsten 160T. El ensayo fluorométrico de la actividad de la GUS se realizó usando el sustrato 4-metil-umbeliferil-beta-D-glucurónido (Jefferson et al., 1987).

CAT: La actividad de la CAT se determinó como se describe por Gorman et al., 1982. Se ejecutaron controles positivos en paralelo con las muestras de tejido bombardeadas usando 1 unidad de enzima CAT bacteriana (Sigma). Los controles negativos incluyeron muestras del tampón de la CAT y extractos de embrioides no bombardeados.

Aislamiento del ADN y PCR

Aislamiento del ADN: El ADN genómico se aisló usando el Método de la Proteasa como se describe por Draper
et al., (1988). Se molieron cincuenta mg de tejido de Hevea liofilizado hasta un polvo fino usando una mano de mortero y un mortero. El tejido en polvo se mezcló después minuciosamente con 400 \mul de tampón de proteasa (Tris-HCl 100 mM pH 8,5, NaCl 100 mM, AEDT 50 mM pH 8,0, 2,0% SDS, Proteinasa K 0,1 mg ml^{-1}) y se incubó a 37ºC durante 1-2 horas con una suave inversión ocasional. El homogeneizado tejido/tampón se extrajo con 80 \mul de fenol y 80 \mul de cloroformo/alcohol isoamílico 24:1 (v/v). La fase acuosa se separó por centrifugación y el procedimiento de extracción se repitió. La fase acuosa recogida después de la segunda extracción se dejó precipitar toda una noche a -20ºC usando 0,54 volúmenes de isopropanol. Al día siguiente, el precipitado se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 50 \mul de tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, AEDT 1,0 mM pH 8,0). Para la restricción del ADN genómico de la Hevea, se incluyeron de manera rutinaria 2 \mul de 10 x de BSA/espermidina (2,5 mg ml^{-1} de BSA, 40 mM espermidina) en el tampón de restricción para vencer los problemas debidos a la presencia de impurezas.

PCR: Cada reacción PCR se llevó a cabo en 50 \mul que contenían Tris-HCl 10 mM pH 8,8, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 50 \mul de aceite mineral, dATP 200 \muM, dTTP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, polimerasa Taq (0,5-1,0U), ADN (2-10 ng) e iniciadores oligonucleótidos: 5' GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG 3' y 5' GTTTACGCGTTGCTT- CCGCCA 3' (posiciones 400-420 y 1599-1579 respectivamente en el gen de la GUS, Jefferson et al., 1986). Se usaron 100 ng de cada iniciador en la reacción PCR. La polimerasa Taq se obtuvo de Amersham International plc. La temperatura de desnaturalización fue 92ºC (1 minuto de duración), la temperatura de templado fue 55ºC (1,5 minutos de duración) y la temperatura de extensión fue 72ºC (2,0 minutos de duración). Las reacciones fueron programadas para 30 ciclos, usando un controlador térmico programable (The Hybaid Thermal Reactor). El ADN se detectó en las muestras de ejecución sobre geles de 1,0% agarosa/bromuro de etidio usando TBE (tris-HCl 0,9 M, AEDT 25 mM, H3BO_{3} 0,9 mM) como tampón de ejecución.

Resultados Transformación y regeneración

El protocolo biolístico adoptado siguió el procedimiento establecido para la introducción de genes en embriones de cebada para estudiar la expresión de genes transitorios (M.G.K. Jones, Rothamsted, R.U.). Para el bombardeo de partículas el callo de antera usado era derivado de un clon de Hevea altamente embriogénico (accesión de clon Nº 11). Tras transferir el callo bombardeado al medio de selección, los microcallos resistentes a la kanamicina parecieron crecer muy lentamente, sin embargo, estos callos transformados aparecieron sanos y blancos entre la oscuridad y los callos moribundos no bombardeados (Fig. 1). El porcentaje de callos seleccionados con antibiótico y los embrioides que muestran coloración azul tras añadir X-gluc alcanzó 90% en el callo y 80% en los embrioides después del bombardeo usando plásmido pMON9793. Usando pB1221.2, pero sin selección con kanamicina, el porcentaje de coloración azul alcanzó el 60% en el callo y el 70% en los embrioides (Tabla 2). La mayor eficacia de transferencia exhibida en el callo y los embrioides bombardeados usando plásmido pMON9793 es probablemente debida a la selección con kanamicina.

TABLA 2 Porcentaje de callo y embriones que expresan actividad de la GUS

Plásmidos	10
Transformantes	10
Nº de callos	9
Nº de callos que expresan la GUS	8
Porcentaje	90
pMON9793	10
callo de antera	10

TABLA 2 (continuación)

embrioides	6
pB1221.2	7
callo de antera	60
embrioides	70

El ensayo histoquímico para la GUS demostró con frecuencia un patrón heterogéneo de la actividad enzimática en el callo mantenido sin selección con kanamicina, pero exhibió un patrón homogéneo en las células después de la selección con kanamicina. Ningún de los callos de antera de control (no bombardeados), embrioides o raíces se mancharon de azul cuando se usó X-gluc. Los resultados de estos experimentos se resumen en las microfotografías mostradas en la Fig. 1.

Los resultados obtenidos a partir del manchado histoquímico para la actividad de la GUS se confirmaron usando un ensayo fluorométrico (Fig.2). La actividad fluorométrica de la GUS fue evidente en el 90% de los embrioides transformados analizados y, en total, hubo un incremento en cuatro veces en la actividad de la GUS en los embrioides transformados comparado con los valores del control no bombardeado.

Los niveles de NPT II se cuantificaron en los callos transformados usando la técnica ELISA (Fig. 3). En total, los niveles de la proteína NPT II estuvieron aproximadamente cuatro veces por encima de los valores control de fondo y variaron de 28 a 32 ng de NPT II por mg de proteína total.

Además del uso del gus como gen mensajero, también usamos un gen cat para hacer un seguimiento de la administración del gen en la Hevea. Los resultados para estos experimentos se resumen en la auto-radiografía mostrada en la Fig. 4. Es claro que los plásmidos que contienen el gen cat pueden ser administrados por bombardeo, y se expresan eficazmente en el callo de la Hevea y el tejido del embrioide. Sólo se observó un nivel muy bajo de actividad CAT en los tejidos de control no bombardeados (Fig. 4, carril 3).

Una prueba directa para la presencia de genes mensajeros transferidos en el callo de la Hevea se realizó usando la técnica PCR. Se usó el método de Hamill et al. (1991) para amplificar la secuencia interna de la gus. Después de 30 ciclos de amplificación fue visible una única banda en geles de agarosa/bromuro de etidio usando sólo 0,8 ng de ADN templado (Figura 5). Esta banda amplificada fue idéntica en tamaño al gen gus.

Finalmente, pudimos regenerar dos plantas pequeñas de Hevea (crecidas asépticamente) después del bombardeo de partículas (Fig. 6). Las pequeñas plantas parecieron muy normales y las raíces se mancharon de azul después del tratamiento X-gluc. La presencia del gen gus en una de estas pequeñas plantas se confirmó usando el mismo protocolo PCR realizado en el ADN derivado del callo. Como se muestra en la Fig. 7, se consiguió una amplificación exitosa del gen gus con sólo 4,0 ng de ADN de hoja de Hevea. No pudimos amplificar el gen gus en ninguno de los callos control (no bombardeados), embrioides o pequeñas plantas usando las mismas condiciones PCR que las descritas anteriormente.

Estos resultados muestran que los microproyectiles/micropartículas pueden suministrar ADN ajeno en las células de la Hevea brasiliensis, como se determina por los ensayos de genes informantes, la recuperación de transformantes resistentes a la Kanamicina y el uso de la técnica PCR. El ADN llevado dentro de la célula se desorbe aparentemente de la superficie del microproyectil y es transportado por algún mecanismo pasivo o activo dentro del núcleo, donde se pueden expresar sus genes.

Ejemplo 2 I. Transformación del tejido del callo

Flores macho de cultivos de Hevea seleccionados se desinfectaron con Chlorox (ingrediente activo, hipoclorito sódico 5,25%) durante cinco minutos, seguido de varios lavados con agua destilada estéril. Las anteras fueron escindidas de la columna estaminal e inoculadas en medio MB (20 anteras/placa petri). Los cultivos se incuban a 25ºC en la oscuridad.

Transformación genética vía Agrobacterium

Se infectó callo de antera de Hevea de cuatro semanas con Agrobacterium tumefaciens, que lleva los genes para las enzimas glucuronidasa (GUS) y neomicina fosfotransferasa. Esta última confiere resistencia al antibiótico kanamicina. El callo se sumergió en un cultivo nocturno de suspensión de Agrobacterium tumefaciens, pH 5,8, durante un minuto, se diluyó con medio MB líquido que contenía 7% de sacarosa pero sin suplemento hormonal, para dar una población bacteriana final estimada de 3,7 x 10^{8} células/ml. La estimación de la densidad de población se llevó a cabo midiendo la absorbancia a 600 nm del cultivo nocturno. El exceso de suspensión bacteriana fue absorbido del callo usando papel de filtro Whatman Nº 1 estéril, y éste último fue transferido a la placa Petri durante un periodo de co-cultivo de dos días.

El callo fue transferido a un medio MB que contenía los antibióticos cefotaxima (250 \mug/ml) y Ticar (500 \mug/ml) para matar el Agrobacterium.

Después de una semana, el callo fue colocado en placas selectivas (MB, Km 100 \mug/ml) pero manteniendo aún cefotaxima y Ticar. Las concentraciones de cefotaxima y Ticar se redujeron gradualmente en sub-cultivos posteriores a intervalos semanales.

II. Regeneración de la planta pequeña trasformada

El cultivo del callo se colocó en medio MB y se incubó durante un periodo de una semana, y después se transfirió a medio nuevo (MB) cada siete días. Después de tres semanas, el cultivo se transfirió a un medio de diferenciación selectiva. Esta fase dura aproximadamente 2 meses, con los transferentes llevados a medio nuevo después de 30 días. Los cultivos se incubaron de nuevo en la oscuridad a 25ºC. Tanto el medio de iniciación (MB) como el medio de diferenciación contenían sulfato de kanamicina (100 \mug/ml) para seleccionar las células transformadas.

Después de un periodo de alrededor de 60 días en el medio de diferenciación, los embrioides desarrollados se transfirieron al medio de desarrollo para la formación de retoños y raíces. La planta pequeña fue transplantada al suelo y puede entonces criarse hasta la madurez.

Han sido regeneradas con éxito plantas pequeñas de Hevea brasiliensis después de la inserción del gen de la GUS por mediación de Agrobacterium. Las plantas pequeñas parecieron normales, y muestras de las hojas se mancharon de azul después del tratamiento con X-gluc, indicando la expresión del gen de la GUS. Muestras de hojas de plantas de Hevea cultivadas in vitro que no fueron transformadas no se mancharon cuando se trataron de manera similar con
X-gluc. Los resultados se muestran en la Figura 8.

Ejemplo 3

Se siguió esencialmente el procedimiento del Ejemplo 2 excepto que, en lugar del sistema vectorial Agrobacterium, la transformación genética se realizó por imbibición, como sigue:

Un callo de antera de Hevea de cuatro semanas se deshidrató colocando los tejidos en un incubador a 37ºC durante 30 minutos. El callo se imbibió durante 30 minutos en una disolución de ADN que contenía el gen para la glucuronidasa (100 \mug de pBI221.1 de ADN en agua estéril). El cultivo se transfirió a un medio MB y posteriormente a un medio de diferenciación. A diferencia del Ejemplo 2, sin embargo, los medios no incluyeron sulfato de kanamicina.

Leyendas a las figuras

Figura 1. Actividad de la GUS en tejido de Hevea después del tratamiento con el sustrato cromogénico X-gluc. (A) callo control. (B) células de un callo de antera bombardeado de 3 semanas. (C) embrioide control. (D) embrioides después del bombardeo de partículas. Todas las fotografías están aumentadas x25.

Figura 2. Un gráfico de barras que muestra la actividad de la GUS en embriones de Hevea bombardeados (E. T.) comparada con los valores de control (E. N. T.). Los resultados se presentan como mediana \pm d.e.; n = 20 embriones.

Figura 3. Niveles de proteína NPT II en callo de Hevea bombardeado comparados con los valores de control. Los resultados se presentan para 3 plásmidos diferentes (véase la metodología) que albergan el gen de la npt II. Los valores se presentan como mediana \pm d.e.; n = x replicados.

Fig. 4. Auto-radiografía que muestra la actividad del CAT en tejido de Hevea previamente bombardeado con plásmido pDE10.

Se indican las posiciones de [^{14}C]cloramfenicol (CAF), [^{14}C]1-acetilcloramfenicol (1-CAF), y [^{14}C]3-acetilcloramfenicol (3-CAF). Carril 1: CAT comercial (Sigma) usado como control positivo. Carril 2: control negativo (conteniendo sólo tampón). Carril 3: callo de antera (no bombardeado) de control. Carriles 4-6: diferentes callos de antera transformados, tres semanas después de la selección en sulfato de kanamicina. Carril 7: tejido de embrioide regenerado a partir de callo bombardeado en presencia de sulfato de kanamicina.

Figura 5. Amplificación del gen de la gus a partir de ADN aislado de callo de Hevea seleccionado con antibiótico de x semanas. Carril 1: escalera de 1 kb. Carril 2: 500 ng de ADN. Carril 3: 100 ng de ADN. Carril 4: 20 ng de ADN. Carril 5: 4 ng de ADN. Carril 6: 0,8 ng de ADN.

Figura 6. (E) planta pequeña de Hevea crecida a partir del tejido bombardeado con partículas mostrado en la Figura 1. Actividad de la GUS después del tratamiento con el sustrato cromogénico X-gluc. (F) raíz control. (G) raíces regeneradas a partir de embrioides transformados. Todas las fotografías están aumentadas x 25.

Figura 7. Detección del gen gus por PCR de ADN genómico aislado de una planta pequeña de Hevea brasiliensis regenerada.

Carril 1: escalera de 1 kb. Carril 2: 4,0 ng de ADN de una planta control (no bombardeada). Carril 3: 4,0 ng de ADN de un callo transformado. Carril 4: 4,0 ng de ADN de un embrioide transformado. Carril 5: 4,0 ng de ADN aislado de una única hoja de una planta pequeña de Hevea transformada.

Figura 8. (H) superficies de muestras de hojas incubadas en X-gluc. La muestra no transformada (parte superior) no está manchada; mientras que la muestra transformada (abajo) está manchada de azul. La fotografía está aumenta-
da x 10. (I) secciones de muestras de hojas incubadas en X-gluc. La muestra no transformada (parte superior) no está manchada; mientras que la muestra transformada (abajo) está manchada de azul. La fotografía está aumentada x 31.

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Claims (5)

1. Un método para producir una proteína diana a partir de una planta de Hevea transformada genéticamente, que comprende:

(i) transformar el tejido de la planta por inserción de un gen o un fragmento de gen que controla la expresión de una proteína diana,

(ii) regenerar una planta a partir de dicho tejido, expresando la planta de Hevea transformada genéticamente la proteína diana en el látex que produce dicha planta,

(iii) recolectar el látex de dicha planta de Hevea, o de un clon suyo, y

(iv) recuperar la proteína diana de dicho látex.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la planta es Hevea brasiliensis.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la inserción del gen o fragmento de gen se realiza usando el sistema vectorial Agrobacterium.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la inserción del gen o fragmento de gen se realiza usando el método biolístico o de cañón de partículas.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que la recolección del látex es no destructiva y se realiza repetidamente y a intervalos regulares.