ES2231979T3 - Marcador de resitencia para plantas monocotiledoneas. - Google Patents
Marcador de resitencia para plantas monocotiledoneas.Info
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Abstract
La invención se refiere al empleo de genes resistentes a sulfonamidas como marcadores seleccionables para el trigo.
Description
Marcador de resistencia para plantas
monocotiledóneas.
El presente invento se refiere al uso de genes de
resistencia a las sulfonamidas como marcadores seleccionables en
trigo.
El uso de una tecnología de ADN recombinante en
el sector de la agricultura se está haciendo cada vez más
importante. Sin embargo, la aplicación de dicha tecnología a
especies de plantas monocotiledóneas, tales como trigo, maíz, arroz
y cebada, fue obstaculizada inicialmente por una carencia de
apropiadas técnicas de transformación. Gordon-Kamm y
colaboradores (Plant Cell. 2:603-618
(1990)) informaron acerca de una transformación estable de maíz
usando un suministro de ADN mediado por microproyectiles.
Subsiguientemente, Vasil y colaboradores
(Bio-technology,
10:667-674 (1992)) informaron acerca de la
transformación de trigo a continuación de un bombardeo con
microproyectiles de un callo embriogénico. El uso de embriones
inmaduros en calidad del tejido diana proporcionó métodos mejorados
de transformación para trigo (Weeks y colaboradores, Plant
Physiol. 102:1077-1084 (1993); documento
de solicitud de patente europea
EP-A-0709462 (de Monsanto)).
El gen nptII, que confiere resistencia al
antibiótico kanamicina, es el marcador seleccionable usado con la
máxima amplitud para la transformación de especies de plantas
dicotiledóneas. Sin embargo, la kanamicina es inapropiada como un
agente selectivo para la transformación de plantas monocotiledóneas,
debido a unos altos niveles de tolerancia al antibiótico en estas
especies. Además, han surgido inquietudes en el sector agrícola en
ciertas regiones en relación con el uso de tales marcadores, y con
el uso consiguiente de antibióticos para finalidades de selección.
Si bien dichas inquietudes pueden estar en cierto modo fuera de
lugar, subsiste el hecho de que, a escala comercial, es deseable
tener disponibles marcadores seleccionables que no estén basados en
antibióticos. Consiguientemente, ha sido necesario buscar en otro
sitio un gen marcador que sea apropiado para su uso en sistemas de
transformación de plantas monocotiledóneas (Wilmink & Dons
Plant Molecular Biology Reporter
11(2):165-185 (1993)).
El gen bar procedente de Streptomyces
hygroscopicus, que confiere resistencia a los herbicidas
bialafos y Basta basados en fosfinotricina (PPT), ha sido usado con
éxito como el marcador seleccionable para la transformación de maíz
(Gordon-Kamm y colaboradores, (1990), véase más
arriba) y, consiguientemente, ha constituido la primera opción como
un marcador seleccionable para el desarrollo de un sistema para la
transformación de trigo (Vasil y colaboradores,
Bio-technology,
11:1153-1158 (1993); Nehra y colaboradores,
The Plant Journal, 5(2):285-297
(1994) y Becker y colaboradores, The Plant Journal,
5(2):299-307 (1994)). Sin embargo, hay
problemas inherentes en el uso del gen bar como un marcador
seleccionable en trigo. En particular, la selección es ineficiente,
dando como resultado una alta frecuencia de vástagos sin
transformar, que se regeneran al efectuar una selección, y que
requieren una criba adicional (p.ej. por un análisis con PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) o un ensayo enzimático) de los
vástagos regenerados para identificar los que son portadores del gen
marcador.
Cierto número de factores pueden ser responsables
de las dificultades encontradas al aplicar una selección basada en
la PPT para la transformación de plantas monocotiledóneas,
particularmente para la transformación de trigo. La PPT actúa
inhibiendo a la sintetasa de glutamina, que es una enzima que tiene
un cometido regulador clave en el metabolismo del nitrógeno.
Dekeyser y colaboradores (Plant Physiol.,
90:217-223 (1989)) informaron acerca de que
ciertos aminoácidos en el medio de cultivo permitían el crecimiento
de callos de arroz sin transformar en presencia de la PPT. Ellos
encontraron que la glutamina y otros aminoácidos se deben omitir
desde el medio de cultivo para que sea eficaz una selección basada
en la PPT. Sin embargo, estos componentes de medios se pueden
requerir para una regeneración satisfactoria de vástagos.
Además, el gen bar confiere resistencia a
herbicidas basados en PPT por codificación de una enzima, la acetil
transferasa de fosfinotricina (PAT), que desintoxica a la PPT por
acetilación. Un problema que se presenta con sistemas de selección
basados en este tipo de mecanismos de resistencia, consiste en que
un tejido sin transformar puede ser protegido por células
transformadas circundantes (Wilmink & Dons, (1993) véase más
arriba). Por desintoxicación, se disminuye la concentración efectiva
del herbicida en la vecindad de las células transformadas. Dicha
"protección cruzada" permite la regeneración de células sin
transformar, conduciendo a fugas. Christou y colaboradores
(Biotechnology, 9:957-962 (1991))
observaron un tejido de arroz sin transformar con una capacidad de
regeneración igual a la de un tejido transformado, como un resultado
de la desintoxicación del agente selectivo por células
trans-
formadas.
formadas.
Finalmente, ciertos sistemas marcadores con
Basta, y desde luego la resistencia a Basta como un medio para la
represión de malezas, se usan extensamente en plantas útiles de
colza de semillas oleaginosas, que se plantan con frecuencia en
rotación con plantas útiles de trigo. Dicho con claridad, estarán
con frecuencia presentes en el suelo semillas de la planta útil
precedente y éstas representan el potencial de crecimiento de
"malezas" durante el siguiente ciclo de cultivo de plantas
útiles. Si la resistencia a Basta hubiera sido tratada por
ingeniería genética tanto en la colza como en el trigo, entonces el
uso del herbicida no sería eficaz contra dichas "malezas".
Una ventaja adicional del recurso de usar un gen
de resistencia a las sulfonamidas como un gen marcador seleccionable
en trigo, consiste en que el número de sitios observados de
inserción es menor que el de los que se observan cuando se usa la
resistencia a bialafos como el marcador seleccionable. Esto es
ventajoso para la comercialización de plantas transgénicas.
Es deseable comercializar plantas transgénicas
que tengan solamente el gen que interesa integrado en el genoma de
la planta y sin ninguna otra secuencia de ADN asociada con el
proceso de transformación. Estas otras secuencias incluyen el gen
marcador seleccionable que se requiere durante el proceso de
transformación para obtener una recuperación eficiente de agentes
regeneradores transgénicos. La ausencia de secuencias ajenas desde
la planta útil transgénica comercial es importante para la
aceptación por el público. También, si se usan varios genes de
resistencia a herbicidas para producir un trigo transgénico, cuando
éstos son desregulados y usados en convencionales programas de
cruce, el trigo múltiplemente resistente puede presentar un problema
de malezas.
El sitio de integración de los transgenes es
aleatorio. El marcador seleccionable puede ser integrado en un sitio
unido con el gen que interesa, o distante de él. Es ventajoso tener
el marcador seleccionable en pocos sitios, puesto que entonces hay
una mayor probabilidad de que existan sitios que estén desvinculados
con el gen de interés y por lo tanto se segreguen fuera de éste al
producirse la meiosis.
Por lo tanto, existe una continua necesidad de
proporcionar marcadores seleccionables apropiados para usarse en
sistemas de transformación de trigo. Actualmente, hay disponibles
muy pocos marcadores de esta índole y esto, a fin de cuentas, limita
el número de transformaciones genéticas que se pueden llevar a cabo
con un trigo. Es decir, cada vez que se introduce una nueva
modificación genética, se requerirá un marcador separado, p.ej. un
marcador de resistencia.
El documento
EP-A-0369637 describió genes de
resistencia a herbicidas del tipo de sulfonamidas, y su utilidad en
sistemas de transformación de plantas tanto dicotiledóneas como
monocotiledóneas. Las especies particulares de plantas
monocotiledóneas enumeradas incluían al trigo. Sin embargo, los
únicos ejemplos que se proporcionaban en relación con las especies
dicotiledóneas y, a pesar del comentario hecho en esa publicación
concerniente al uso en plantas monocotiledóneas, una persona experta
podría no haber conocido, en la fecha de presentación de esta
solicitud, los problemas asociados con sistemas de transformación de
plantas monocotiledóneas. Dado que, como ya se ha debatido
anteriormente, está claro ahora que el uso de un sistema marcador de
plantas dicotiledóneas en una especie de planta monocotiledónea
puede dar como resultado, en el mejor de los casos, una ineficiencia
de algún tipo, está claro que esta solicitud anterior no era creíble
en el contexto de las plantas monocotiledóneas. Desde luego, está
claro que, hasta la fecha, no ha habido ningún informe acerca del
uso de un sistema marcador de resistencia a las sulfonamidas en una
especie de planta monocotiledónea.
Por lo tanto, el presente invento hace posible
usar un gen de resistencia a las sulfonamidas como un marcador
seleccionable en una especie de trigo. Apropiadamente, el gen de
resistencia a las sulfonamidas es proporcionado como una
construcción (estructura artificial) de ADN que codifica una sintasa
de dihidropterato (DHPS) modificada, que tiene p.ej. una secuencia
de aminoácidos como la que se describe en el documento de patente
europea EP-B-0369637 (como se
muestra en la Figura 1 del actual documento) o una secuencia
modificada por una o más inserciones y/o supresiones de aminoácidos,
con tal de que se confiera a una célula una resistencia a por lo
menos una sulfonamida, cuando el gen sea expresado en ella. Además,
se pueden utilizar los denominados genes sintéticos para resistencia
a las sulfonamidas. Éstos pueden ser secuencias modificadas o hechas
a medida para un uso particular en codones de especies de plantas,
asegurando con ello una expresión eficiente.
Preferiblemente, el gen de resistencia a las
sulfonamidas comprende también secuencias reguladoras suficientes
como para asegurar una expresión correcta, por ejemplo un apropiado
promotor de planta. Ejemplos de apropiados promotores incluyen el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), los
promotores Adh1 y Emu de maíz, el promotor de actina
de arroz Act1 y el promotor de ubiquitina de maíz Ubi.
El gen de resistencia a las sulfonamidas puede comprender además una
secuencia que codifique un péptido de tránsito, que sea disociable
desde la DHPS modificada, fusionada directamente con el extremo 5'
del gen de resistencia. Un ejemplo de un apropiado péptido de
tránsito es el correspondiente a
ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa/oxigenasa.
Por lo tanto, el invento hace posible usar una
construcción génica, que comprende:
- (a)
- un promotor de planta;
- (b)
- un gen de resistencia a las sulfonamidas, que codifica una DHPS modificada; y
- (c)
- una secuencia que codifica un péptido de tránsito disociable desde la DHPS modificada, fusionada directamente al extremo 5' del gen de resistencia;
- como un marcador seleccionable en una especie de trigo.
El presente invento proporciona un material que
se propaga en plantas monocotiledóneas, que comprende por lo menos
una célula transformada con una construcción de ADN como aquí se
define, en que el material que se propaga procede de trigo.
El presente invento proporciona una planta de
trigo transgénica, p.ej. una planta de trigo que contiene en sus
células una construcción de ADN como la que aquí se define.
En un aspecto adicional, el presente invento hace
posible reprimir malezas en un locus en el que una o más
plantas transgénicas del invento están siendo cultivadas, que
comprende la operación de aplicar al locus una cantidad
eficaz de un herbicida que actúa inhibiendo a la DHPS, p.ej. el
Asulam.
En un aspecto final, el presente invento
proporciona un método de producir una planta de trigo que es
resistente a por lo menos una sulfonamida, el cual comprende:
- (a)
- transformar o transfectar una o más células derivadas de una planta de trigo con una construcción de ADN como aquí se define;
- (b)
- propagar las células transformadas o transfectadas procedentes de la operación (a) para producir una o más plantas transgénicas;
- y
- (c)
- seleccionar las plantas que son resistentes a uno o más herbicidas del tipo de sulfonamidas.
Características preferidas de cada uno de los
aspectos del invento son mutatis mutandis para cada otro de
los aspectos.
El invento se describirá ahora con referencia a
los siguientes Ejemplos, que no se deberán considerar de ninguna de
las maneras como restrictivos del invento.
Se mencionan aquí unas Figuras en las que:
La figura 1: muestra la secuencia de aminoácidos
de una DHPS modificada preferida; y
La figura 2: muestra y describe las operaciones
en la construcción del plásmido pWP258.
El protocolo de cultivo de tejidos era
esencialmente igual al método de Weeks y colaboradores (Plant
Physiol., 102:1077-1084 (1993)). Plantas
donantes del linaje de trigo de primavera de América del Sur
denominado NB1, obtenidas de Nickerson Seeds Limited, se hicieron
crecer en un invernadero en condiciones controladas. Las espigas
inmaduras se cosecharon a los 14-20 días después de
la antesis, y las cariopsis inmaduras se retiraron desde la espiga y
se descascararon usando tenazas. Las cariopsis se esterilizaron en
su superficie con etanol al 70% durante 2 minutos y con Domestos® al
20% (de Lever, Reino Unido [RU]) durante 20-30
minutos, y luego se lavaron con agua destilada estéril. Los
embriones inmaduros se aislaron asépticamente usando un microscopio
de disección estérea y se colocaron con los escudillos situados en
la parte superior sobre un medio W3 (MS suplementado con 20 g/l de
sacarosa y 2 mg/l de 2,4-D, y solidificado con 6 g/l
de agarosa del Tipo I [de Sigma, Poole, RU]). Los cultivos se
mantuvieron a 25ºC con un fotoperíodo de 16 h durante 5 días antes
del bombardeo.
Después del bombardeo, los embriones se
transfirieron a un medio de selección W31B (W3 más 1 mg/l de
bialafos [de Meija Seika Kaisha Ltd., Yokohama]). Los embriones se
transfirieron a un medio W31B de nueva aportación cada 2 semanas. A
las seis semanas después del bombardeo, todos los embriones con
callo embriogénico se transfirieron al medio de regeneración WR1B
(MS suplementado con 20 g/l de sacarosa y 1 mg/l de bialafos, y
solidificado con 6 g/l de agarosa del Tipo I [de Sigma, Poole, RU]).
Los vástagos regenerados se transfirieron a un medio de arraigo que
consistía en un MS de ½ concentración con 1 mg/l de bialafos (1/2 de
MS1B). Los vástagos que habían producido raíces en 1/2MS1B fueron
transferidos a un MS20 (medio MS con 20 g/l de
saca-
rosa).
rosa).
Las plántulas se transfirieron desde el MS20 a
turba. Se tomaron muestras del tejido de hojas a partir de estas
plántulas para el análisis del ADN mediante una reacción en cadena
de la polimerasa (PCR). Una vez establecidas, las plantas se
transfirieron al invernadero y se tomó una cantidad adicional de
tejido de hojas para el análisis del ADN por transferencia de
borrones Southern.
Se utilizó un sistema de transformación
concomitante en el que el gen marcador seleccionable y el gen que
interesaba estaban presentes en plásmidos separados. El gen
bar procedente de Streptomyces hygroscopicus, que
confería resistencia al herbicida bialafos, se llevó al plásmido
pDM302 (Cao y colaboradores, Plant Cell Reports,
11:586-591 (1992)) bajo el control del
promotor de actina 1 (Act1) del arroz (McElroy y
colaboradores, Mol. Gen. Genet.,
231:150-160 (1991)).
El ADN de plásmido se purificó a partir de
células lisadas en condiciones alcalinas por gradientes de CsCl, y
se almacenó en una concentración de 1 \mug/\mul en un tampón de
Tris-EDTA, de pH 8,0 (Sambrook y colaboradores,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: Un
manual de laboratorio]. Cold Spring Harbour Press, Cold Spring
Harbour, NY (1989)). Una mezcla 1:1 de los dos plásmidos, que se
habían de transformar concomitantemente, se preparó inmediatamente
antes de revestir a los microproyectiles.
Antes del bombardeo, partículas de wolframio
(M10; Sylvania, Towanda, PA, EE.UU.) se esterilizaron y revistieron
con un ADN de plásmido por un proceso adaptado a partir del de Finer
y colaboradores (Plant Cell Reports,
11:323-328 (1992)). 50 mg de partículas de
wolframio se esterilizaron en 500 \mul de metanol al 95%. Después
de 20 minutos, las partículas se sedimentaron en una
micro-centrífuga, se lavaron cuatro veces con agua
destilada estéril y luego se volvieron a suspender en 500 \mul de
agua destilada estéril. Se mezclaron 25 \mul de partículas
resuspendidas, 7 \mul de un ADN de plásmido (1 \mug/\mul), 25
\mul de CaCl_{2} 2,5 M y 10 \mul de espermidina 100 mM.
Después de haber transcurrido 5 minutos a 4ºC, se retiraron 25
\mul del material sobrenadante y se desecharon.
El bombardeo se realizó usando una pistola de
flujo entrante de partículas (PIG, de Particle Inflow Gun) como se
describió por Finer y colaboradores (véase más arriba) con la que
las partículas revestidas con el ADN son aceleradas usando helio a
presión en combinación con un vacío parcial. 2 \mul de la
suspensión de partículas se dispusieron sobre el tamiz de una unidad
de filtro de jeringa del aparato. Placas de embriones dianas se
colocaron sobre un estante situado a 17 cm por debajo de la unidad
de filtración de jeringa. Un obstáculo se colocó entre la unidad de
filtro de jeringa y el tejido diana. Se aplicó un vacío de 100 kPa y
las partículas se descargaron cuando se hubo liberado el helio (a 80
psi [5,6 kg/cm^{2}]) por activación del solenoide mediante el
relevador temporizador.
El análisis por PCR se realizó en un ADN genómico
extraído a partir de 1-2 cm^{2} de un material de
hojas recientemente recogido, usando un método miniprep descrito por
Stacey e Isaac (Methods in Molecular Biology, volumen 28: Protocols
for nucleic acid analysis by nonradioactive probes [Protocolos para
el análisis de ácidos nucleicos por sondas no radiactivas], páginas
9-15, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)). Las
reacciones de PCR se realizaron usando secadores diseñados para
amplificar un fragmento bar de 312 pb (pares de bases)(5'
TGCACCATCGTCAACCACTA 3' y 5' ACAGCGACCACGCTCTTGAA 3'). Las
condiciones de reacción fueron las siguientes: "arranque en
caliente" (a 94ºC, durante 3 min (minutos)) seguido por 30 ciclos
de desnaturalización (a 95ºC, durante 30 s (segundos)),
reanillamiento (a 55ºC, durante 30 s) y prolongación (65ºC, durante
1 min) seguido por 1 ciclo de 75ºC (durante 5 min) y luego se
mantuvieron a 24ºC.
Las plantas que dieron un resultado positivo en
el ensayo por PCR se analizaron ulteriormente por una hibridación de
Southern. El análisis de Southern se realizó en un ADN procedente de
una extracción a plena escala (9 ml) de tejido triturado liofilizado
(Stacey e Isaac, véase más arriba). Las muestras de ADN se ajustaron
a 0,2 mg/ml y se digirieron con la enzima de restricción Xho I. La
digestión con la enzima de restricción, la electroforesis en gel y
la transferencia de borrón en vacío se llevaron a cabo tal como se
ha descrito por Stacey e Isaac (1994, véase más arriba). Una sonda
bar marcada con digoxigenina fue producida por una PCR de
acuerdo con el método de McCreery y Helentjaris (Methods in
Molecular Biology, volumen 28: Protocols for nucleic acid analysis
by non-radioactive probes [Protocolos para el
análisis de ácidos nucleicos por sondas no radiactivas], páginas
67-71, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)). Se
usaron cebadores para la región 5' del promotor 35S de CaMV y para
el extremo 3' de la región codificadora bar para marcar un
fragmento de 1.470 pb procedente de pBAR + INT, que es un plásmido
basado en pUC derivado de pJIT84, por inserción del intrón adh
1 de maíz entre el promotor 35S y el gen bar. La
hibridación de la sonda con el borrón de Southern y la detección por
quimio-luminiscencia se realizaron de acuerdo con el
método de McCreery y Helentjaris (Methods in Molecular Biology,
volumen 28: Protocols for nucleic acid analysis by
non-radioactive probes [Protocolos para el análisis
de ácidos nucleicos por sondas no radiactivas], páginas
107-112, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)).
Los números de linajes de plantas que contenían
el gen bar se registraron como un tanto por ciento del número
total de linajes regenerados.
Embriones inmaduros se aislaron tal como se
describe para el Ejemplo 1, se sembraron en placas sobre un medio W3
y se mantuvieron en la oscuridad. Después de 5-7
días, se transfirieron los embriones a un medio W3 suplementado con
Asulam (Rhone-Poulenc Agrochemicals, Ongar, RU) en
un intervalo de concentraciones comprendidas entre 0 y 5 mg/ml y se
mantuvieron a 25ºC con un fotoperíodo de 16 h. Los embriones y los
callos embriogénicos derivados de los embriones se transfirieron a
un medio selectivo de nueva aportación cada 2 semanas.
Los callos se calificaron en cuanto a su
respuesta embriogénica después de 6 semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto del Asulam sobre la producción de un
callo embriogénico por embriones inmaduros de NB1, ^{1} % de la
respuesta embriogénica = (nº de embriones con un callo
embriogénico/nº total de embriones sembrados en placas) x 100.
Se aislaron embriones tal como se ha descrito en
el Ejemplo 1 y luego se mantuvieron a 25ºC en la oscuridad durante 5
días antes del bombardeo. A continuación del bombardeo, los
embriones se cultivaron a 25ºC con un fotoperíodo de 16 h y se
mantuvieron en un medio W3 sin selección. Una semana después del
bombardeo, los embriones se transfirieron a un medio de selección
W32A (W3 más 2 mg/l de Asulam). Los embriones se transfirieron a un
medio W32A de nueva aportación cada 2 semanas. Después de
4-6 semanas en fase de selección, todos los
embriones que tenían un callo embriogénico se transfirieron a un
medio de regeneración WR (MS suplementado con 20 g/l de sacarosa, y
solidificado con 6 g/l de agarosa del Tipo I [de Sigma, Poole, RU]
que contiene Asulam en una concentración entre 0,1 y 2,0 mg/l.
Después de 2 semanas, todo el tejido sano se transfirió a un medio
de regeneración de nueva aportación. Después de 2 semanas
adicionales, cualesquiera de los vástagos con raíces bien
desarrolladas se transfirieron a un medio MS con 20 g/l de sacarosa
(MS 20).
Las plántulas se transfirieron desde el MS20 a la
turba en recipientes de cultivo Magenta GA7 (de Magenta Corp.
Chicago, EE.UU.) y se dejaron establecerse antes de la transferencia
al invernadero.
Se usó un sistema de transformación concomitante,
en el cual el gen marcador seleccionable y el gen que interesaba
estaban presentes en plásmidos separados. El rasgo de resistencia a
las sulfonamidas se llevó al plásmido pWP258 que comprendía el gen
sul procedente del plásmido R46, fusionado con una secuencia
directora hacia cloroplastos y bajo el control del promotor de
actina 1 (Act1) de arroz. El plásmido pWP258 se construyó por
el método siguiente, que está bosquejado en la Figura 2. El gen de
las sulfonamidas se aisló como un fragmento de NcoI (hecho romo por
relleno en el extremo usando la polimerasa de ADN de T4 y dNTP's),
fragmento de SalI procedente de pJIT92 (Guerineau y colaboradores,
Plant Molecular Biology, 15:127-136
(1990)). Este fragmento se clonó entre el sitio para SphI (hecho
romo con la polimerasa de ADN de T4) y el sitio para SalI de
pRPA-RD7 (documento
EP-A-0652286, de
Rhone-Poulenc). El plásmido formado (pWP251)
codifica, por lo tanto, el péptido de tránsito hacia cloroplastos
optimizado (OPT) (documento
EP-A-0652286, véase más arriba)
unido dentro de marco con el gen de Sul. La secuencia de
poliadenilación de CaMV del pJIT118 (Guerineau y colaboradores,
(1990) véase más arriba) se clonó seguidamente entre los sitios para
SalI y KpnI de pWP257. Finalmente, el fragmento de
OPT-Sul-CaMV PoliA NcoI, KpnI (hecho
romo con la polimerasa de ADN de T4) del pWP257 se clonó entre los
sitios para NcoI y EcoRV de pCOR112 (McElroy y colaboradores,
Mol. Gen. Genet., 231:150-160 (1991))
formando el
pWP258.
pWP258.
El ADN de plásmido se purificó tal como se
describe en el Ejemplo 1.
Como para el Ejemplo 1.
El análisis por PCR se realizó en un ADN genómico
extraído según el Ejemplo 1. Las reacciones PCR se realizaron usando
cebadores diseñados para amplificar un fragmento sul de 352
pb (5' TTGTGCGGTTCTTCGAGGC 3' y 5' TGCGCTTCGCAGATCTCCA 3'). Las
condiciones de reacción fueron las siguientes: arranque en caliente
(a 94ºC, durante 3 min) seguido por 30 ciclos de desnaturalización
(a 95ºC, durante 30 s), reanillamiento (a 55ºC, durante 30 s) y
prolongación (a 73ºC, durante 1 min) seguido por 1 ciclo de 73ºC (5
min) y luego se mantuvo a 24ºC.
El número de linajes de plantas que contenían el
fragmento de Sul se registró como un tanto por ciento del número
total de linajes regenerados.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis Southern de plantas transformadas con
bar se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. El
número de inserciones completas se determinó sondeando un ADN
genómico digerido con Xho 1 (el sitio para Xho 1 proporciona una
digestión en un sitio singular) y contando en el luminógrafo el
número de bandas resultantes. Cualquier fragmento igual o mayor que
el tamaño del casete de 2.210 pb debería contener el casete total, y
cualquier trozo de menor tamaño contendrá sólo casetes
parciales.
El análisis Southern de plantas transformadas con
sul se realizó de acuerdo con el método del Ejemplo 1, pero
usando una sonda sul marcada con digoxigenina, producida por
una PCR a partir del pWP258. El número de inserciones completas se
determinó sondeando el ADN genómico digerido con Xho 1 (el Xho 1
proporciona también una digestión en un sitio singular para la
casete de pWP258) y contando en el luminógrafo el número de las
bandas resultantes. Cualquier fragmento de tamaño igual o mayor que
el del casete, de 3.500 pb debería contener el casete total,
cualquier trozo de menor tamaño contendrá sólo casetes
parciales.
Número de sitios de inserción después de una
transformación con bar.
| Linaje N^{o} | N^{o} de insertos | |
| 1 | 7 | |
| 2 | 7 | |
| 3 | 3 | |
| 4 | 2 | |
| 5 | > 7 | |
| 6 | 2 | |
| 7 | 4 | |
| 8 | 4/6 | |
| 9 | 6 | |
| 10 | 5/6 | |
| 11 | 5/6 | |
| 12 | 1/2 |
Número de sitios de inserción a continuación de
una transformación con sul
| Linaje N^{o} | N^{o} de insertos | |
| 13 | 2 | |
| 14 | 5 | |
| 15 | 1 | |
| 16 | 5 | |
| 17 | 2/3 | |
| 18 | 2 | |
| 19 | 2 | |
| 20 | 2 | |
| 21 | 2 | |
| 22 | ½ |
Estos datos sugieren que se consigue un número de
sitios de inserción, cuando se usa la resistencia a las sulfonamidas
como el marcador seleccionable, menor que cuando se usa la
resistencia a bialafos.
Claims (12)
1. Un material que se propaga en plantas
monocotiledóneas, que comprende por lo menos una célula de planta
monocotiledónea transformada o transfectada con una construcción de
ADN que codifica una dihidropterato sintasa (DHPS) modificada, en
que la expresión de dicha DHPS confiere resistencia a por lo menos
una sulfonamida.
2. El material que se propaga en plantas
monocotiledóneas de la reivindicación 1, en el que dicha
construcción de ADN codifica una DHPS modificada que tiene una
secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la Figura 1, o una
que es sustancialmente homóloga con ésta.
3. El material que se propaga en plantas
monocotiledóneas de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el
que dicha construcción de ADN contiene además secuencias reguladoras
suficientes como para regular una expresión correcta, p.ej. con un
apropiado promotor.
4. El material que se propaga en plantas
monocotiledóneas de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el
que dicha construcción de ADN contiene además una secuencia que
codifica un péptido de tránsito disociable desde la DHPS modificada,
fusionado directamente con el extremo 5' del gen de resistencia.
5. El material que se propaga en plantas
monocotiledóneas de la reivindicación 4, en el que dicho péptido de
tránsito es el gen para
ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa/oxigenasa.
6. Una planta de trigo transgénico, que comprende
por lo menos una célula transformada o transfectada con una
construcción de ADN que codifica una dihidropterato sintasa
modificada (DHPS), en que la expresión de dicha DHPS confiere
resistencia a por lo menos una sulfonamida.
7. La planta de trigo transgénico de la
reivindicación 6, en la que dicha construcción de ADN codifica una
DHPS modificada que tiene una secuencia de aminoácidos como se
muestra en la Figura 1, o una que es sustancialmente homóloga con
ésta.
8. La planta de trigo transgénico de una
cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en la que dicha
construcción de ADN comprende además secuencias reguladoras
suficientes como para asegurar una expresión correcta, p.ej. un
promotor apropiado.
9. La planta de trigo transgénico de una
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que dicha
construcción de ADN comprende además unas secuencia que codifica un
péptido de tránsito disociable desde la DHPS modificada, fusionado
directamente con el extremo 5' del gen de resistencia.
10. La planta de trigo transgénico de la
reivindicación 9, en la que dicho péptido de tránsito es el
correspondiente a la
ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa/oxigenasa.
11. Una semilla obtenida a partir de una planta
de trigo transgénico como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en que dicha semilla comprende por lo menos
una célula transformada o transfectada con una construcción de ADN
como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12. Un método de producir plantas de trigo
transgénico que presentan una dihidropterato sintasa modificada
(DHPS) dentro de su genoma, que comprende las operaciones de:
- (a)
- transformar o transfectar una o más células procedentes de una planta de trigo con una construcción de ADN como define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
- (b)
- propagar las células transformadas o transfectadas procedentes del párrafo (a) para producir una o más plantas transgénicas; y
- (c)
- seleccionar las plantas que tienen integradas en dicha construcción de ADN dentro de su genoma.
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