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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung von genetisch transformierten Pflanzen, die ein
gewünschtes
Genprodukt exprimieren können,
und Klone dieser genetisch transformierten Pflanzen mit der gleichen
Fähigkeit.
Genauer gehören
die Pflanzen zu einer Art, die eine voluminöse Flüssigkeit erzeugt, und das Zielgenprodukt
wird in der Flüssigkeit
exprimiert. Am meisten bevorzugt sind die Pflanzen Kautschuk-(Hevea)-Pflanzen
und die Gene sind fremde Gene, die pharmazeutisch wertvolle Proteinprodukte
codieren, die im Latex, der von diesen Pflanzen erzeugt wird, geerntet
werden können
und daraus gewonnen werden können.
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Techniken zur genetischen Transformation
verschiedener Mikroorganismen, wie Hefen, Pilze und Bakterien, für die Zwecke
zur Erzeugung spezifischer Proteine durch Expression von "fremden" Gene sind wohl bekannt.
Mikroorganismen erfordern jedoch die Aufrechterhaltung geeigneter
Bedingungen, in denen sie überleben
und sich vermehren können.
Die Umgebungstemperatur, der pH-Wert und der Belüftungsgrad müssen z.
B. gewöhnlich
sorgfältig
kontrolliert werden, während
Nährstoffe
dem Kulturmedium in sorgfältig
dosierten Mengen zugegeben werden müssen und Abfallprodukte entfernt
werden müssen.
Rigorose aseptische Bedingungen müssen beachtet werden, um eine
Kontamination durch äußere Mikroben
zu vermeiden. Mikroorganismen werden daher normalerweise in ausgeklügelten Fermentern
oder Bioreaktoren gezüchtet
und sind in teuer aufrechtzuerhaltenden Betrieben untergebracht.
Solche Bedingungen spiegeln sich im hohen Preis der Proteinendprodukte
wider.
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Kürzlich
wurde der Einführung
fremder Gene im Pflanzen, wie Tabakpflanzen, Aufmerksamkeit zugewandt.
Diese Anwendung von genetischen Transformationstechniken hat den
Einbau einer Vielzahl wichtiger genetischer Eigenschaften zur Verbesserung
der Ernte zugelassen und auch die biotechnologische Erzeugung von
extrahierbaren wertvollen fremden Proteinen (wie Antikörper). Anders
als Mikroorganismen neigen Pflanzen dazu, sich selbst zu versorgen,
was wenig mehr als Sonnenlicht, Wasser und gärtnerische Grundversorgung
erfordert und sie können
leicht auf kosteneffizienter Basis gezüchtet werden. Mehrere verschiedene Techniken
wurden entwickelt, um die Einführung
fremder Gene in verschiedene Pflanzenarten zu ermöglichen, und
diese schließen
ein:
- – das
Agrobacterium-Vektorsystem, das die Infektion des Pflanzengewebes
mit einem Bakterium (Agrobacterium) beinhaltet, in das das fremde
Gen insertiert wurde. Eine Anzahl von Methoden zur Transformierung von
Pflanzenzellen mit Agrobacterium sind wohl bekannt (Vancanneyt et
al., 1990; Horsch et al., 1985; Bevan, 1984 und Herrera-Estrella et al.,
1983);
- – die
biolistische oder Particle-gun-Methode, die es zulässt, genetisches
Material direkt in intakte Zellen oder Gewebe abzugeben, indem regenerierbares
Gewebe, wie Meristem oder embryogener Callus mit DNA-beschichteten
Mikroteilchen bombardiert wird. Die Mikroteilchen durchdringen die
Pflanzenzellen, wobei sie als inerte Träger für das einzuführende genetische
Material dienen (Gordon-Kamm et al., 1990 und Sanford et al., 1987).
Mikroprojektilbombardierung von embryogenen Suspensionskulturen
hat sich als erfolgreich erwiesen zur Herstellung von transgenen
Pflanzen von Gelbpappeln (Dayton et al., 1992), Baumwolle (Finer
und McMullen, 1990), Mais (Gordon-Kamm et al., 1990) und Soja (McMullen
und Finer, 1990). Verschiedene Parameter, die die DNA-Abgabe durch
Teilchenbombardierung beeinflussen, wurden gefunden (Klein et al.,
1988; Wang et al., 1988);
- – durch
Aufsaugen des fremden Gens in das Pflanzengewebe (Simon, 1974) und
- – Elektroporation.
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Wenn dieser Ansatz jedoch angewendet
wird, beinhaltet die Gewinnung des Zielproduktes das Ernten und
die Zerstörung
der gesamten Pflanze oder mindestens eines wesentlichen Teils der Pflanze.
Sogar wenn die Pflanze nicht vollständig zerstört wird, erfordert es einen
längeren
Erholungszeitraum für
ein erneutes Wachstum, bevor eine weitere Ernte möglich ist.
Außerdem
beinhaltet die Extraktion des Proteinprodukts aus Pflanzen, wie
Tabak (und tatsächlich
auch aus den meisten Mikroorganismen, die allgemein für solche
Zwecke verwendet werden), die Homogenisierung von Gewebefeststoffen.
Dies kann ein relativ problematischer und ineffizienter Arbeitsschritt
sein.
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Der Brasilianische Kautschukbaum,
Hevea brasiliensis Muell-Arg,
gehört
zur Familie der Euphorbiaceae und wurde etwa ein Jahrhundert lang
kommerziell zur Herstellung von natürlichem Kautschuk genutzt. Es
gibt in der Tat neun Arten der Gattung Hevea, aber Hevea brasiliensis
ist der am häufigsten
gezüchtete
und kommerziell wertvollste, da er die höchste Latexausbeute liefert.
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Latex wird traditionell aus Kautschukbäumen extrahiert
mit einer Methode, die als "Tapping" oder "Zapfen" bekannt ist. Dies
kann entweder erreicht werden mit einer Technik, bei der Rinde herausgeschnitten
wird, wobei ein Streifen Rinde aus dem Baumstamm herausgeschnitten
wird, um den Latexfluss zu starten (wobei nachfolgende Zapfvorgänge ausgeführt werden,
indem eine dünne
Schicht der Rinde vom gleichen Schnitt weggeschnitten wird) oder
durch Einschnitt der Rinde, wobei ein oder mehrere Punktionen in
die Rinde gemacht werden, um den Latexfluss zu starten. Das Zapfen
ist somit eine nicht zerstörende
Methode der Latexgewinnung und kann wiederholt und in regelmäßigen Intervallen
durchgeführt
werden, typischerweise jeden zweiten Tag. Natürlicher Kautschuk bildet etwa
ein Drittel des Latex und kann leicht mit verschiedenen Trenntechniken,
wie Zentrifugation, extrahiert werden.
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Der Kautschukbaum ist praktisch einzigartig
darin, einen voluminösen
Saft oder ein Exudat zu erzeugen, d. h. den Latex, der kontinuierlich
geerntet werden kann ohne schädliche
Wirkung. Die vorliegenden Erfinder haben diese Eigenschaft des Kautschukbaums
ausgenutzt zusammen mit Gentechnik, um einen neuen und vorteilhaften
Weg zur Erzeugung von pharmazeutisch wertvollen Proteinen und anderen
Zielprodukten zu liefern.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird eine Methode bereitgestellt, um eine genetisch transformierte Fluid
erzeugende Pflanze zu erzeugen, die umfasst:
- i)
dass in das Pflanzengewebe ein Gen oder Genfragment insertiert wird,
das die Expression eines Zielprodukts kontrolliert und
- ii) eine Pflanze aus diesem Gewebe regeneriert wird, wobei die
genetisch transformierte Pflanze das Zielprodukt in dem Fluid oder
der Flüssigkeit,
die es erzeugt, exprimieren kann.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Pflanzenklon bereitgestellt,
der in seinen Zellen ein chromosomales Insert enthält, das
einen Promotor und ein Gen oder Genfragment aufweist, das die Expression
eines Zielprodukts kontrolliert, so dass das Zielprodukt exprimiert
wird oder in dem Fluid, das erzeugt wird, exprimiert werden kann.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
liefert die Erfindung einen Hevea-Pflanzenklon, der in seinen Zellen
ein chromosomales Insert enthält,
das einen Promotor und ein Gen oder Genfragment aufweist, das die
Expression eines Zielprodukts kontrolliert, so dass das Zielprodukt
exprimiert wird oder in dem Latex exprimiert werden kann.
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Die vorliegende Erfindung liefert
weiterhin ein Verfahren, um Klone der vorher erwähnten Arten zu erzeugen, das
Okulieren, Gewinnung von Ablegern oder in anderer Weise die Durchführung von
vegetativer Vermehrung einer in geeigneter Weise genetisch transformierten
Pflanze umfasst.
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In einer noch weiteren Ausführungsform
liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren, um ein Protein oder
anderes Produkt herzustellen, das umfasst:
- i)
dass das Fluid aus einem genetisch transformierten Fluid produzierenden
Baum oder einer Pflanze oder einem Klon davon geerntet wird und
- ii) das Zielprotein oder ein anderes Produkt aus dem Fluid gewonnen
wird.
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Das Verfahren bzw. die Methode ist
für alle
Arten von Hevea anwendbar und Bezugnahmen auf Hevea-Pflanzen und
-Bäume
sind entsprechend zu verstehen, aber Hevea brasiliensis ist besonders
bevorzugt.
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Hevea-Pflanzen sind zur Verwendung
für die
vorliegende Erfindung besonders gut geeignet, da das Fluid, das
sie produzieren (d. h. Latex) leicht ohne Zerstörung geerntet werden kann,
leicht verarbeitet werden kann und natürlicherweise proteinreich ist
(und daher einer Produkt von Fremdprotein in der transgenen Pflanze
zugänglich
ist).
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Der dieser Erfindung zugrunde liegende
Ansatz besteht in drei Hauptstufen:
- i) Das
Verfahren der genetischen Transformation der Pflanze, wodurch das
DNA-Molekül,
das das Gen repräsentiert,
das für
das Zielprodukt oder ein anderes Produkt codiert, in das genetische
Komplement der Gewebe der Pflanze insertiert wird. Es versteht sich,
dass das Gen auch von einem Promotor begleitet sein muss. Während so
genannte "universelle" Promotoren (die
nicht gewebespezifisch sind und allgemein die Genexpression in allen
Geweben der Pflanze anschalten, einschließlich dem Saft oder dem Fluid)
angewendet werden kön nen,
ist der Promotor bevorzugter fluidspezifisch. Im Fall der Kautschukpflanze
ist der Promotor am meisten bevorzugt latexspezifisch.
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Verschiedene Techniken sind bekannt,
um Gene in Pflanzen einzuführen,
wie oben angegeben, und jede davon kann angewendet werden. Besonders
bevorzugt ist das Agrobacterium-Vektorsystem, das die Infektion
des Gewebes mit einem Agrobacterium beinhaltet, in das das gewünschte Gen
bereits insertiert wurde, und die biolistische oder Particle-gun-Methode,
wonach das gewünschte
Gen in das Gewebe auf einem Mikroteilchen getrieben wird. Pflanzengewebe,
das das insertierte Gen oder Genfragment trägt, ist als transformiertes
oder transgenes Gewebe bekannt. Im Fall der Kautschukpflanze wird
die Transformation an von Antheren abgeleitetem Callusgewebe, das
aus dem Filament bzw. dem Staubblattträger einer Blüte der Hevea-Pflanze entnommen
wurde, durchgeführt.
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Der Promotor und das Gen oder Genfragment,
das durch die Transformationstechnik eingeführt werden, kann/können entweder
nativ oder fremd für
die betreffende Pflanze sein. Es ist möglich, die Expression eines
nativen Gens zu verstärken,
indem der Promotor modifiziert wird oder indem mehrfache Kopien
dieses Gens insertiert werden. Fremde Gene können eingeführt werden, die für eine Vielzahl
von auf Protein basierenden Produkten codieren, am meisten bevorzugt
von pharmazeutisch wertvollen Proteinprodukten.
- ii)
Die Regeneration einer Pflanze aus dem transformierten Gewebe, das
Auspflanzen und das Aufziehen bis zur Reife. z. B. wird durch die
Technik der Gewebekultur das transformierte Callusgewebe von Hevea über eine
Embryostufe zu einem Pflänzchen,
das transgen ist und das insertierte Gen in seinem genetischen Komplement
trägt,
regeneriert. Zur rechten Zeit reift das Pflänzchen zu einem voll ausgewachsenen transgenen
Kautschukbaum und das Zielprotein oder andere Produkt, das durch
das insertierte Gen exprimiert wird, ist in dem Latex vorhanden.
- iii) Das Ernten des Zielproteins oder anderen Produkts in dem
von der Pflanze oder dem Baum erzeugten Fluid und Gewinnung desselben
daraus. Im Fall von Hevea wird das geerntete Fluid natürlich der
Latex sein. Sobald die transgene Kautschukpflanze zu ausreichender
Reife gewachsen ist, gewöhnlich
nach zwei bis fünf
Jahren, wird gezapft und der Latex in regelmäßigen Intervallen geerntet.
Der Latex wird dann gewöhnlich
zentrifugiert, um den natürlichen
Kautschuk, das wässrige
C-Serum und die
so genannte "Bodenfraktion" abzutrennen. Das
Zielprotein oder andere Produkt kann in irgendeinem Teil des Latex
enthalten sein und kann mit üblichen
Mitteln extrahiert und gereinigt werden (z. B. mit präparativer
Säulenchromatographie).
Bevorzugt ist es in dem C-Serum oder der Bodenfraktion vorhanden,
wobei letztere hauptsächlich Lutoide
aufweist, die membrangebundene Vesikel sind, die ihr eigenes Serum
enthalten (B-Serum). Das B-Serum kann aus den Lutoiden freigesetzt
werden, indem die Membranen aufgerissen werden unter Verwendung
von Detergenzien, wie Triton X-100 oder durch aufeinander folgendes
Einfrieren und Auftauen. Das Zielprotein oder andere Produkt, das
in dem Latex an biologische Membranen gebunden sein kann, kann gewonnen
werden, indem mit Detergenzien, wie Natriumdodecylsulfat, solubilisiert
wird.
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Die vorliegende Erfindung liefert
einen neuen und vorteilhaften Weg zur Synthese eines breiten Bereichs
an proteinhaltigen und nicht proteinhaltigen Produkten. Sie ist
besonders geeignet für
die Produktion von pharmazeutisch wertvollen Proteinprodukten. Im
Prinzip könnte
die Technik für
die Synthese von praktisch jedem auf Protein basierendem Produkt
verwendet werden, vorausgesetzt, dass das Gen, das für seine
Expression codiert, bekannt ist. Es versteht sich, dass das Proteinprodukt,
das direkt durch das insertierte Gen codiert wird, selbst innerhalb
der Pflanze die Produktion eines anderen Endprodukts katalysieren
kann. Das letztere (proteinhaltige oder nicht proteinhaltige) Produkt
kann dann als kommerziell wertvolles Endprodukt geerntet werden.
Beispiele für
Produkte, die durch transgene Pflanzen oder Bäume erzeugt werden können, sind die
folgenden:
- (a) Insulin zur Diabetesbehandlung
- (b) Blutgerinnungsfaktoren für
die Behandlung von Hämophilie
- (c) Gerinnsel lösende
Aktivatoren für
die Herzbehandlung
- (d) Tumornekrosefaktor zur Krebsbehandlung
- (e) Erythropoietin für
die Behandlung von Anämie
- (f) Virushüllproteine
zur Impfstofferzeugung
- (g) "PBH", ein Kunststoff ähnlich Polypropylen,
der zur Herstellung von Flaschen, Umhüllungen etc. verwendet wird.
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Die Verwendung von Kautschukbäumen insbesondere
in der vorliegenden Erfindung hat eine Anzahl erheblicher Vorteile,
von denen die folgenden besonders bemerkenswert sind:
- – Die
Erzeugung ist kontinuierlich, da der Latex, der das Zielprotein
oder andere Produkte enthält,
in regelmäßigen Intervallen
geerntet wird und die Produktgewinnung einfach ist. Da der Latex
ein Fluid ist, beinhaltet die Gewinnung des Zielproduktes nicht
die Gewebehomogenisierung.
- – Der
Ansatz ist umweltfreundlich. Das Verfahren wird von der Sonne angetrieben
und ist daher energieeffizient und im Wesentlichen verschmutzungsfrei.
- – Kautschukbäume erfordern
keine spezielle Aufmerksamkeit außer der Routinebetreuung durch
Gärtner. Ihre
Verwendung ist daher höchst
kosteneffizient.
- – Die
Technik ist anwendbar zur Verwendung für eine große Vielzahl von Zielprodukten.
- – Der
Latex, der aus dem Kautschukbaum fließt, ist vollständig frei
von Bakterien und tierischen Viren. Dies steht im Gegensatz zu den
rigorosen aseptischen Praktiken, die angewendet werden müssen, wenn
genetisch transformierte Mikroorganismen oder Tiere angewendet werden.
- – Kautschukbäume sind
einer klonalen oder vegetativen Vermehrung zugänglich, am häufigsten
durch Okulieren. Andere Ansätze
schließen
ein, dass ein Ableger genommen wird, Senkervermehrung oder Gewebekultur.
Somit kann eine unbegrenzte Anzahl von genetisch identischen Pflanzen
(Klonen) aus einer einzigen transgenen Pflanze erzeugt werden
- – die
alle das gewünschte
Produkt in ihrem Latex exprimieren werden.
- – Kautschukbäume haben
eine ökonomische
Lebensdauer von etwa 30 Jahren. Während dieser Zeit wird zusätzlich zur
Erzeugung des Zielproduktes der genetisch transformierte Baum natürlich darin
fortfahren, natürlichen
Kautschuk in seinem Latex zu erzeugen, der selbst ein wertvoller
Bestandteil ist. Wenn schließlich
der Baum gefällt
wird, liefert er auch ein wertvolles Tropenholz (Kautschukholz),
das begehrt ist für
Export und Möbelherstellung.
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Einige dieser Vorteile werden von
anderen Fluid produzierenden Pflanzen geteilt, die zur Verwendung für diese
Erfindung geeignet sind.
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Die Erfindung wird nun weiter durch
die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 betrifft die genetische Transformation von Hevea brasiliensis
unter Verwendung der Particle-gun-Methode, während die Beispiele 2 und 3
die Verwendung des Agrobacterium-Vektorsystems bzw. die Einsaugtechnik
zeigen. Das Enzym Glucuronidase wird als Beispiel für das Zielprotein
verwendet, aber die gleichen Verfahren werden allgemein für andere
Produkte angewendet, wobei das Gen, das die Produktion von Glucuronidase
kontrolliert, durch das geeignete Gen für das Zielprotein ersetzt wird.
Die folgenden Abkürzungen
werden in den Beispielen verwendet:
| MB | Hevea-Antherkulturstartmedium |
| GUS/gus | β-Glucuronidase |
| NPTII/nptII | Neomycinphosphotransferase |
| CAT/cat | Chloramphenicolacetyltransferase |
| PCR | Polymerasekettenreaktion |
| ELISA | Enzyme
linked immunosorbent assay |
| CaMV | Blumenkohlmosaikvirus |
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Beispiel 1
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Pflanzenmaterial und Gewebekultur
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Embryogener Hevea-Antherencallus
wurde aus einzelnen Antheren der Staubbeutel erzeugt. Der Callus
wurde initiiert und bei 25°C
auf MB-Medium (Chen et al., 1984) gehalten und wurde zur Transformation nach
4 Wochen auf diesem Medium verwendet. Alle Gewebekulturprozeduren
folgten im Wesentlichen dem von Chen et al. (1984) beschriebenen
Protokoll.
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Pflanzenexpressionsvektoren
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Die folgenden Plasmide wurden zur
Transformation verwendet:
pBI221.1 (Jefferson, 1987), das das β-Glucuronidase-(gus)-Gen
enthält,
pMON9793 (Gasser, Monsanto Company, unveröffentlicht), das die gus- und
nptII-Gene enthält,
pDE10 (Rhodes, Norwich, GB), das die cat- und nptII-Gene enthält und pHP23
(Paszkowski und Saul, 1988), das nptII enthält. Diese Gene waren unter
Kontrolle des starken CaMV 35S-Promotors. Rekombinante Plasmide
wurden E. coli gezüchtet,
durch Alkalilyse isoliert und mit Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid
Dichtegradientenzentrifugation (Sambrook, Fritsch und Maniatis,
1989) gereinigt. Plasmid-DNA wurde quantitativ durch ihre Absorption
bei 260 nm und durch Gelelektrophorese ausgewertet.
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Mikroprojektilbeschuss
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Plasmid-DNA wurde auf Wolframteilchen
ausgefällt,
wie früher
beschrieben (Gordon-Kamm et al., 1990). Die Ausfällungsmi schung enthielt 1,30
mg Wolframteilchen, 25 μg
Plasmid-DNA, 1,1 M CaCl2·2H2O
und 8,7 mM Spermidin in einem Gesamtvolumen von 575 μl. Nach Zugabe
der Komponenten in der obigen Reihenfolge wurde die Mischung bei
4°C 10 Minuten
lang gevortext, mit 500 × g
5 Minuten lang zentrifugiert und dann wurden 550 μl Überstand
verworfen. Das Pellet wurde wieder in dem verbleibenden 25-μl-Überstand
suspendiert und daraus 1 μl
der Wolframsuspension auf ein Mikroprojektil geladen und zu dem
Ziel mit einer biolistischen Particle gun beschleunigt (Spearline
Precision Engineering Ltd., GB). Die Antherencalli wurden in die Mitte
einer Whatman Nr. 1-Filterpapierscheibe (7 cm) gegeben, die dann
vor dem Beschuss in die Mitte einer Kunststoffpetrischale (9 cm
Durchmesser) gelegt, die MB-Medium
enthielt. Die Calluskulturen wurden 5 cm unter der Mikroprojektilstoppplatte
angeordnet und ein 100-μm-Sieb
aus rostfreiem Stahl wurde auf halbem Weg zwischen Stoppplatte und
Gewebe angebracht, um die Dispersion der Wolframteilchen zu fördern. Jede
Platte wurde einmal bombardiert und die Calli wurden dann eine kurze
Zeit inkubiert, während
sie in einer Wachstumskammer bei 25°C im Dunkeln waren.
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Selektion
der Transformanten
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Nach der Bombardierung bzw. dem Beschuss
und der Inkubation bei 25°C
im Dunkeln wurden die Calli vorsichtig von dem Filterpapier entfernt
und auf eine frische Platte gelegt, die MB-Medium enthielt, und
weiter 10 Tage lang bei 25°C
im Dunkeln inkubiert. Bombardierte Calli und Kontrollen wurden dann
auf MB-Selektionsmedium, das 100 μg
Kanamycinsulfat ml–1 enthielt, überführt. Gegen
Antibiotika resistente Kolonien wurden 4 Wochen nach dem Beschuss
isoliert und auf Differenzierungsmedium überführt, das 100 μg Kanamycinsulfat
ml–1 enthielt
und bei 25°C
im Licht (250 μE
m–2s–1)
inkubiert . Dies stimulierte die Entwicklung von Sprösslingen
und Wurzeln; sogar ohne Antibiotikaselektion differenzierte jedoch
nur ein geringer Prozentsatz (3%) der somatischen Embryos in Pflänzchen (Chen
et al., 1981 b).
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Enzymassays
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NPTII:
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Die NPTII-Aktivität in transformiertem Gewebe
wurde bestimmt unter Verwendung eines ELISA-Kits (5 Prime–3 Prime
Inc., erhalten von CP Laboratories, GB). Ungefähr 400 μg extrahiertes Protein wurden
pro Test verwendet.
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GUS:
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Die histochemische Analyse von β-Glucuronidaseaktivität in transformiertem
Antherencallus, Embryoiden und Wurzeln von Hevea wurde unter Verwendung
des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid (X-gluc)
gemäß dem Verfahren
von Jefferson (1987) durchgeführt.
Das Gewebe wurde untersucht auf blau gefärbte Zellen 18 bis 36 Stunden
nach der Zugabe von X-gluc. Mikrofotografien wurden aufgenommen
unter Verwendung eines Nikon SZM-U 1 : 10 Zoomdoppelokularmikroskops
mit Kodacolor Tungsten 160T-Film. Ein fluorimetrischer Assay der
GUS-Aktivität wurde
durchgeführt
unter Verwendung des Substrats 4-Methyl-umbelliferyl-beta-D-glucuronid
(Jefferson et al., 1987).
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CAT:
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Die CAT-Aktivität wurde bestimmt, wie von Gorman
et al., 1982, beschrieben. Positive Kontrollen wurden parallel mit
bombardierten Gewebeproben laufen gelassen unter Verwendung einer
Einheit bakteriellem CAT-Enzym (Sigma). Negative Kontrollen schlossen
Proben des CAT-Puffers und Extrakte aus nicht bombardierten Embryoiden
ein.
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DNA-Isolierung
und PCR
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DNA-Isolierung:
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Genomische DNA wurde isoliert unter
Verwendung der Proteasemethode, wie von Draper et al. (1988) beschrieben.
50 mg lyophilisiertes Hevea-Gewebe wurden zu einem feinen Pulver
vermahlen unter Verwendung von Mörser
und Pistill. Das gepulverte Gewebe wurde dann vorsichtig mit 400 μl Proteasepuffer
(100 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl, 50 mM EDTA pH 8,0, 2,0% SDS,
0,1 ml Proteinase K ml–1) gemischt und bei 37°C 1 bis 2
Stunden lang bei gelegentlichem vorsichtigen Umdrehen inkubiert.
Das Gewebe/Pufferhomogenisat wurde mit 80 μl Phenol und 80 μl 24 : 1
(V/V) Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die wässrige Phase wurde
durch Zentrifugation getrennt und das Extraktionsverfahren wiederholt.
Die gesammelte wässrige
Phase wurde nach der zweiten Extraktion über Nacht bei –20°C ausgefällt unter
Verwendung von 0,54 Volumina Isopropanol. Am folgenden Tag wurde
der Niederschlag mit 70% Ethanol gewaschen und wieder in 50 μl TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0) suspendiert. Für die Restriktion
wurde genomische DNA von Hevea, 2 μl 10 × BSA/Spermidin (2,5 mg BSA
ml–1,
40 mM Spermidin) routinemäßig in den
Restriktionspuffer gegeben, um Probleme aufgrund der Gegenwart von
Verunreinigungen zu überwinden.
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PCR:
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Jede PCR-Reaktion wurde durchgeführt in 50 μl, die 10
mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2,
50 μl Mineralöl, 200 μM dATP, 200 μM dTTP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, Taq-Polymerase (0,5 bis
1,0 U), DNA (2 bis 10 ng) und Oligonucleotidprimer:
5'GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG
3' und 5' GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA
3' (Positionen 400
bis 420 bzw. 1599 bis 1579 im GUS-Gen, Jefferson et al., 1986) enthielten.
100 ng jedes Primers wurden in der PCR-Reaktion verwendet. Die Taq-Polymerase
wurde von Amersham International plc. erhalten. Die Denaturierungstem peratur
war 92°C
(Dauer 1 Minute), die Hybridisierungstemperatur war 55°C (Dauer
1,5 Minuten) und die Extensionstemperatur war 72°C (Dauer 2,0 Minuten). Die Reaktionen
wurden für
30 Zyklen programmiert unter Verwendung eines programmierbaren Thermocontrollers
(The Hybaid Thermal Reactor). Die DNA wurde nachgewiesen, nachdem
Proben auf 1,0% Agarose/Ethidiumbromidgelen laufen gelassen wurden
unter Verwendung von TBE (0,9 M Tris-HCl, 25 mM EDTA, 0,9 mM HB3O3) als Laufpuffer.
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Ergebnisse
Transformation und Regeneration
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Das biolistische Protokoll folgte
dem Verfahren, das für
die Einführung
von Genen in Gerstenembryos etabliert ist, um eine vorübergehende
Genexpression zu untersuchen (M. G. K. Jones, Rothamsted, GB). Für den Teilchenbeschuss
stammte der verwendete Antherencallus aus einem hoch embryogenen
Hevea-Klon (Klon-Hinterlegungsnummer 11). Beim Überführen des bombardierten Callus
auf Selektionsmedium schienen Kanamycinresistente Mikrocalli sehr
langsam zu wachsen, diese transformierten Calli erschienen jedoch
gesund und weiß unter
den dunklen und sterbenden nicht bombardierten Calli (1). Der Prozentanteil an durch
Antibiotikum ausgewählten
Calli und Embryoiden, die eine blaue Verfärbung bei Zugabe von X-gluc zeigten, erreichte
in Callus 90% und 80% bei Embryoiden nach Beschuss unter Verwendung
des Plasmids pMON9793. Unter Verwendung von pBI221.2, aber ohne
Kanamycinselektion, erreichte der Prozentanteil an blauer Verfärbung 60%
bei Callus und 70% bei Embryoiden (Tabelle 2). Die höhere Transfereffizienz,
die Callus und Embryoiden aufwiesen, die unter Verwendung des Plasmids
pMON9793 bombardiert wurden, beruht wahrscheinlich auf der Kanamycinselektion.
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Tabelle
2: Prozentanteil an Callus und Embryoiden, die GUS-Aktivität exprimieren
| Plasmide | 10 |
| Transformanten | 10 |
| Anzahl
der Calli | 9 |
| Anzahl
der Calli, die GUS exprimieren | 8 |
| Prozentanteil | 90 |
| pMON9793 | 10 |
| Antherencallus | 10 |
| Embryoiden | 6 |
| pBI221.2 | 7 |
| Antherencallus | 60 |
| Embryoiden | 70 |
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Der histochemische Test für GUS zeigte
oft ein heterogenes Muster an Enzymaktivität in Callus, der ohne Kanamycinselektion
gehalten wurde, zeigte aber ein homogenes Muster bei Zellen nach
Kanamycinselektion. Weder Kontroll-(nicht bombardierter)-Antherencallus
noch Embryoiden oder Wurzeln wurden blau gefärbt bei Verwendung von X-gluc.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den Mikrofotografien, die
in 1 gezeigt sind, zusammengefasst.
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Die bei der histochemischen Färbung auf
GUS-Aktivität
erhaltenen Ergebnisse wurden bestätigt unter Verwendung eines
fluorimetrischen Assays (2).
Die fluorimetrische GUS-Aktivität war evident
bei 90% der transformierten analysierten Embryoiden und insgesamt
gab es einen vierfachen Anstieg der GUS-Aktivität bei transformierten Embryoiden
verglichen mit nicht bombardierten Kontrollwerten.
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Die NPT-II-Anteile wurden quantitativ
ausgewertet in transformierten Calli unter Verwendung der ELISA-Technik
(3). Insgesamt waren
die NPT-II-Proteinlevel ungefähr
vierfach über
den Hintergrundkontrollwerten und lagen in einem Bereich von 28
bis 32 ng NPT II pro mg Gesamtprotein.
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Zusätzlich zur Verwendung von gus
als Reportergen wurde auch ein cat-Gen verwendet, um die Genabgabe
in Hevea zu kontrollieren. Die Ergebnisse für diese Versuche sind in der
in 4 gezeigten Autoradiografie
zusammengefasst. Es ist klar, dass Plasmide, die das cat-Gen enthalten,
durch Beschuss abgegeben werden können und wirksam in Hevea-Callus
und Embryoidengewebe exprimiert werden. Nur ein sehr geringer Anteil
an CAT-Aktivität
wurde in nicht beschossenem Kontrollgewebe beobachtet (4, Bahn 3).
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Eine direkte Kontrolle auf Gegenwart
von transferierten Reportergenen in Hevea-Callus wurde durchgeführt unter
Verwendung der PCR-Technik. Die Methode von Hamill et al. (1991)
wurde verwendet, um die innere Sequenz von gus zu amplifizieren.
Nach 30 Zyklen Amplifikation war eine einzige Bande auf Agarose/Ethidiumbromidgelen
sichtbar unter Verwendung von nur 0,8 ng Matrizen-DNA (5). Diese amplifizierte Bande
war in der Größe identisch
mit dem gus-Gen.
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Schließlich war es möglich, zwei
Hevea-Pflänzchen
(axenisches Wachstum) nach Teilchenbeschuss (6) zu regenerieren. Die Pflänzchen schienen
ganz normal zu sein und die Wurzeln färbten sich blau nach Behandlung
mit X-gluc. Die Gegenwart des gus-Gens in einem dieser Pflänzchen wurde
bestätigt
unter Verwendung des gleichen PCR-Protokolls, das an von Callus
abgeleiteter DNA durchgeführt
wurde. Wie in 7 gezeigt,
wurde eine erfolgreiche Amplifikation des gus-Gens erreicht mit
nur 4,0 ng Hevea-Blatt-DNA. Weder bei dem Kontroll-(nicht bombardierten)-Callus,
noch den Embryoiden oder Pflänzchen
konnte das gus-Gen unter den gleichen PCR-Bedingungen, wie oben
beschrieben, amplifiziert werden.
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Diese Ergebnisse zeigen, dass Mikroprojektile/Mikroteilchen
Fremd-DNA in die Zellen von Hevea brasiliensis abgeben können, wie
durch die Reportergenassays, die Gewinnung der Kanamycin-resistenten Transformanten
und die Verwendung der PCR-Technik
bestimmt. Die DNA, die in die Zelle getragen wird, desorbiert offensichtlich
von der Oberfläche
des Mikroprojektils und wird durch einen passiven oder aktiven Mechanismus
in den Kern transportiert, wo die Gene exprimiert werden können.
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Beispiel 2
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I. Callusgewebetransformation
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Männliche
Blüten
von ausgewählten
Hevea-Sorten wurden mit Chlorox (5,25% a.i. Natriumhypochlorit)
5 Minuten lang desinfiziert und anschließend mehrmals mit sterilem
destillierten Wasser gewaschen. Die Anthere wurden aus den Staubgefäßen herausgeschnitten
und auf MB-Medium geimpft (20 Anthere/Petriplatte). Die Kulturen
wurden bei 25°C
im Dunkeln inkubiert.
-
Genetische Transformation über Agrobacterium
-
Vier Wochen alte Hevea-Antherencalli
wurden mit Agrobacterium tumefaciens infiziert, das die Gene für die Enzyme
Glucuronidase (GUS) und Neomycinphosphotransferase trug. Letzteres
trägt die
Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin bei. Der Callus wurde
eine Minute lang in eine Über-Nacht-Kultur
von Agrobacterium tumefaciens-Suspension, pH 5,8, eingetaucht, mit
flüssigem
MB-Medium, das 7% Saccharose enthielt, aber ohne Hormonergänzung, verdünnt, was
eine fertige geschätzte
Bakterienpopulation von 3,7 × 108 Zellen/ml ergab. Die Abschätzung der
Populationsdichte wurde durchgeführt,
indem die Absorption bei 600 nm der Über-Nacht-Kultur gemessen wurde.
Die überschüssige Bakteriensuspension
wurde von dem Callus unter Verwendung von sterilem Whatman Nr. 1
Filterpapier geblottet und letzteres wurde auf die Petriplatte überführt für einen
Co-Kultivierungszeitraum von zwei Tagen.
-
Der Callus wurde in MB-Medium überführt, das
die Antibiotika Cefotaxim (250 μg/ml)
und Ticar (500 μg/ml)
enthielt, um Agrobacterium abzutöten.
-
Nach einer Woche wurde der Callus
auf selektive Platten (MB, Km 100 μg/ml) gelegt, wobei immer noch
Cefotaxim und Ticar aufrechterhalten wurden. Die Konzentrationen
von Cefotaxim und Ticar wurden nach und nach in nachfolgenden Subkulturen
in wöchentlichen
Intervallen reduziert.
-
II. Regeneration der transformierten
Pflanze
-
Die Calluskultur wurde auf MB-Medium
plattiert und über
einen Zeitraum von einer Woche inkubiert und dann alle sieben Tage
auf frisches Medium (MB) überführt. Nach
drei Wochen wurde die Kultur auf selektives Differenzierungsmedium überführt. Diese
Phase dauert ungefähr
zwei Monate, wobei die Überführungen auf
frisches Medium nach 30 Tagen durchgeführt wurden. Die Kulturen wurden
wiederum im Dunkeln bei 25°C inkubiert.
Sowohl das Startmedium (MB) als auch das Differenzierungsmedium
enthielten Kanamycinsulfat (100 μg/ml),
um die transformierten Zellen zu selektieren.
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Nach einem Zeitraum von etwa 60 Tagen
im Differenzierungsmedium wurden die entwickelten Embryoiden auf
das Entwicklungsmedium überführt zur
Bildung von Schößlingen
und Wurzeln. Das Pflänzchen
wurde in den Erdboden gepflanzt und kann dann bis zur Reife genährt werden.
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Hevea brasiliensis-Pflänzchen wurden
erfolgreich regeneriert nach Insertion des GUS-Gens durch Agrobacterium-Vermittlung.
Die Pflänzchen
sahen normal aus und Proben der Blätter färbten sich blau nach Behandlung
mit X-gluc, was auf die Expres sion des GUS-Gens deutet. Proben der
Blätter
aus in vitro kultivierten Hevea-Pflanzen, die nicht transformiert
waren, waren ungefärbt,
wenn sie in gleicher Weise mit X-gluc behandelt wurden. Die Ergebnisse
sind in 8 gezeigt.
-
Beispiel 3
-
Das Verfahren von Beispiel 2 wurde
im Wesentlichen durchgeführt,
außer
dass anstelle des Agrobacterium-Vektorsystems die genetische Transformation
durch Einsaugen wie folgt durchgeführt wurde:
-
Vier Wochen alte Hevea-Antherencalli
wurden dehydratisiert, in dem das Gewebe 30 Minuten lang in einen
Inkubator mit 37°C
gelegt wurde. Der Callus wurde 30 Minuten mit einer DNA-Lösung getränkt, die das Gen für Glucuronidase
enthielt (100 μg
pBI221.1 DNA in sterilem Wasser). Die Kultur wurde auf MB-Medium überführt und
anschließend
auf ein Differenzierungsmedium. Anders als in Beispiel 2 enthielten
die Medien jedoch kein Kanamycinsulfat.
-
Legende zu
den Figuren
-
1.
GUS-Aktivität
in Hevea-Gewebe nach Behandlung mit dem chromogenen Substrat X-gluc.
(A) Kontrollcallus. (B) Zellen von einem 3 Wochen alten bombardierten
Antherencallus. (C) Kontrollembryoid. (D) Embryoiden nach Teilchenbeschuss.
Alle Fotografien sind 25-fach vergrößert.
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2.
Ein Säulendiagramm,
das die GUS-Aktivität
bei bombardierten Hevea-Embryoiden zeigt (T. E.) verglichen mit
Kontrollwerten (U. T. E.). Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert ±s.d.;
n = 20 Embryoiden.
-
3.
NPT-II-Proteingehalte in bombardierten Hevea-Calli verglichen mit
Kontrollwerten. Die Ergebnisse sind für drei verschiedene Plasmide
dargestellt (siehe Methodik), die das npt-II-Gen beherbergen. Die Werte
sind angegeben als Mittelwert ±s.d.;
n = x Replikate. 4.
Autoradiografie, die die CAT-Aktivität in Hevea-Gewebe zeigt, das
vorher mit Plasmid pDE10 beschossen wurde.
-
Die Positionen von [14C]-Chloramphenicol
(CAP), [14C]-1-Acetylchloramphenicol (1-CAP)
und [14C]-3-Acetylchloramphenicol (3-CAP)
sind angezeigt. Bahn 1: Kommerzielles CAT (Sigma) verwendet als
positive Kontrolle. Bahn 2: Negative Kontrolle (enthält nur Puffer).
Bahn 3: Kontrolle (nicht bombardierter) Antherencallus. Bahnen 4
bis 6: Verschiedene transformierte Antherencalli 3 Wochen nach Selektion
auf Kanamycinsulfat. Bahn 7: Embryoidgewebe regeneriert aus bombardiertem
Callus in Gegenwart von Kanamycinsulfat.
-
5.
Amplifikation des gus-Gens aus DNA, die aus x Wochen altem mit Antibiotika
selektierten Callus von Hevea isoliert wurde. Bahn 1: 1 kb Leiter.
Bahn 2: 500 ng DNA. Bahn 3: 100 ng DNA. Bahn 4: 20 ng DNA. Bahn
5: 4 ng DNA. Bahn 6: 0,8 ng DNA.
-
6.
(E) Hevea-Pflänzchen
gezogen aus dem mit Teilchen beschossenen Gewebe, wie in 1 gezeigt. GUS-Aktivität nach Behandlung
mit dem chromogenen Substrat X-gluc. (F) Kontrollwurzel. (G) Wurzeln regeneriert
aus transformierten Embryoiden. Alle Fotografien sind 25-fach vergrößert.
-
7.
Detektion des gus-Gens durch PCR von genomischer DNA, die aus einer
regenerierten Hevea brasiliensis-Pflanze isoliert wurde. Bahn 1:
1 kb Leiter. Bahn 2: 4,0 ng DNA aus einer Kontroll-(nicht bombardierten)-Pflanze.
Bahn 3: 4,0 ng DNA aus einem transformierten Callus. Bahn 4: 4,0
ng DNA aus einem transformierten Embryoiden. Bahn 5: 4,0 ng DNA
isoliert aus einem einzelnen Blatt einer transformierten Hevea-Pflanze.
-
8.
(H) Oberflächen
von Blattproben, die in X-gluc inkubiert wurden. Die untransformierte
Probe (oben) ist ungefärbt;
während
die transformierte Probe (unten) blau gefärbt ist. Die Fotografie ist
zehnfach vergrößert. (I)
Abschnitte von Blattproben, die in X-gluc inkubiert wurden. Die
untransformierte Probe (oben) ist ungefärbt; während die transformierte Probe
(unten) blau gefärbt
ist. Die Fotografie ist 31-fach
vergrößert.
-
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