CN101323859A - 人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体的构建及转化表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于表达人碱性成纤维细胞生长因子(Human basic fibroblast growth factors，简称hbFGF)的表达载体。本发明采用体外基因重组方法，将hbFGF基因与油体蛋白基因融合，构建成一种植物油体表达载体，用根瘤农杆菌转化了拟南芥、红花并获得了转基因植株，分子生物学检测证明了外源基因的整合和表达，经活性检测，获得的重组蛋白具有生物活性，其生物活性与人bFGF标准品活性相当。本发明还提供一种在植物种子中表达碱性成纤维细胞生长因子的方法，该方法能够经济地生产碱性成纤维细胞生长因子，从而为bFGF的药物开发提供了新途径。

Description

人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体的构建及转化表达方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的说，涉及植物油体表达载体及其在表达人碱性成纤维细胞生长因子中的应用。

背景技术

利用转基因植物生产医用蛋白，近年越来越受到人们的关注，在植物油体中表达药用蛋白，使目的基因插在油体蛋白基因的N端或C末端，构建成融合蛋白基因。由于油体蛋白镶嵌在油体表面，构建的融合蛋白基因便可在受体植物种子的油体中特异表达，这样便可大大提高外源蛋白在植物组织中的表达量，并可利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎后，再经液体抽提离心等步骤，回收油相，便可将融合蛋白或目的蛋白与细胞内的其它组份分开，这样便可明显简化目的蛋白的分离纯化过程，这种植物油体表达体系有利于外源基因的表达及产业化研究，因此本发明采用油体表达技术在植物种子中表达hbFGF，为hbFGF的产业化研究打下了基础。

人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growthfactor，hbFGF)是已知FGF家族中的成员，碱性成纤维细胞生长因子作用广泛，对大量来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有促分裂作用，如促进血管形成、促进创伤愈合与组织修复、调节内分泌功能、神经营养、调节胚胎发育和分化等多种生物学功能。近十多年来，国内外的研究表明，该因子具有促进血管生成、创伤愈合、韧带损伤修复、溃疡愈合、眼晶状体再生、神经组织修复、神经突起生长以及胚胎的发育与分化等功能，预示了巨大的临床应用前景。

一般来说，bFGF的化学特征是可与肝素紧密结合，由于它对酸和热敏感，等电点呈碱性(9.6)，故称之为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。天然bFGF是一种单链蛋白质，分子中含有146个氨基酸残基，分子量约为17kDa，FGF存在两类受体：一类是亲和力受体，属跨膜性酪氨酸蛋白激酶类受体；另一类是低亲和力受体，即肝素样受体，bFGF与高亲和力受体结合时需低亲和力受体的参与，提示低亲和力受体的结合使高亲和力受体结合更容易、更牢固。

迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质的宿主细胞，但使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成所谓“包涵体”，即生物学活性的不溶性聚合体。虽然形成包涵体的优点是可保护被表达的蛋白质免于遭受宿主细胞中蛋白酶的降解，并能够用离心方法很容易地将包涵体分离出来。但为了得到有生物学活性的蛋白质产物，必须对包体进行变性-溶解-复性处理。这个过程一般要在反复试验的基础上完成，而且常常不能得到令人满足的产物回收率。为了解决这一难题，人们试图采用真核植物来表达药用蛋白，使蛋白质正确折叠和糖基化，以此维持蛋白质的生物学活性。

发明内容

本发明的一个目的是提供在植物种子油体中表达hbFGF的重组表达载体，其中所说的表达载体包含与油体蛋白启动子可操作地连接的hbFGF的全长核苷酸序列，且hbFGF全长核苷酸序列是按照植物偏好的密码子设计合成的。

本发明将油体蛋白基因与bFGF基因融合后克隆到表达载体中，所述的油体蛋白基因优选为油菜油体蛋白基因或大豆油体蛋白基因，所述表达载体为植物表达载体，该植物表达载体的启动子优选为油菜油体蛋白启动子或大豆油体蛋白启动子。

将上述含有油体蛋白基因与bFGF基因融合基因的表达载体，转化植物，并整合到植物基因组中，培植出带有上述融合基因的转基因植物，该植物能够产生含所述bFGF的F2代种子；并且，该种子性状能长期稳定遗传到下一代。

本发明的另一个目的是提供一种在真核宿主中表达成碱性成纤维细胞生长因子的方法，包括将表达载体转化受体植物，经筛选鉴定获得转基因受体植物并获得植物种子，进一步从植物种子中提取获得碱性成纤维细胞生长因子。具体地说包括以下步骤：

(1)构建植物油体表达载体；

(2)按植物偏好的密码子合成hbFGF的核苷酸序列；

(3)将hbFGF的核苷酸序列连接到油体蛋白核苷酸序列的3`端，克隆进表达载体中；

(4)用步骤(3)的重组表达载体用农杆菌侵染转化适当的真核宿主愈伤组织；

(5)筛选转基因抗性愈伤组织；

(6)筛选抗性植物转化苗；

(7)将得到的植物种子经粉碎、用提取液萃取，离心可除去90％以上的杂质，经洗涤纯化回收所需的碱性成纤维细胞生长因子活性多肽。

本发明涉及以重组DNA技术生产bFGF的方法，特别是涉及以真核植物作为宿主生产bFGF的方法。更具体的说，本发明涉及用于在真核植物种子油体蛋白中融合表达bFGF蛋白。本发明进一步涉及按本发明的方法制备的bFGF在治疗由于血管病变、心肌梗塞或脑出血引起的局部缺血性疾病、促进组织修复、伤口愈合中及其在个人护理品中的应用。

可按照本领域已知的技术进行基因的分离和合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞转化和培养，以及表达产物的分离和纯化等操作(参见Sambrook ct al.，Molecular Cloning：ALaboratory Mannual，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cola SpringHarbor，NY，1989)。

可以将按本发明方法制备的bFGF与选自人血清白蛋白、多聚甘氨酸、金属阳离子(如Zn²⁺、Mn⁺和Mg²⁺)及低分子量肽的活性蛋白质保护剂，选自聚乙二醇、谷胱甘肽的稳定剂混合，并加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂，制成适于经胃肠道途径，特别是经胃肠道外途径给药的药物组合物。可以按照制药领域的常规方法，将这样的药物组合物制成适于经血管内、肌肉内、或腹腔内给药的溶液剂、经口服给药的片剂或粉末剂，或制成适合于外用的栓剂、软膏、霜剂、乳化剂等剂型。

上述的药物组合物可用于促进因烧伤或其他机械床上造成的软组织、肌腱、人带、软骨或骨组织伤口的修复或愈合。所说的软骨组织包括皮肤、肌肉、血管、内脏器官及角膜组织等处古和软骨组织外的所有组织。上述的药物组合物亦可用于治疗血管组织损伤，如促进血管生长(血管生成)和血管修复(促进受损部位的血管内皮细胞增殖)。本发明的药物组合物还可用于促进中枢和外周神经组织修复，包括刺激阿尔海默氏病(早老性痴呆)病理过程中受损的海马神经元的生长。作为该药物组合物的活性成分，bFGF可刺激因各种原因受到损伤的神经组织，使之通过成神经细胞的有丝分裂再生新的神经元，恢复受损部位的神经细胞群体，并促进轴突的延伸。

本发明通过本发明按照植物密码子的偏爱性和成了hFGF基因，并与植物油体蛋白基因融合，进一步构建表达载体，不仅克服了原核生物不能使蛋白质正确折叠和糖基化的问题，而且利用油体蛋白还能使hFGF便于纯化，提高了其纯化产率，通过该表达载体获得的hFGF活性与野生型相比略高。此外，通过本发明的方法hFGF的表达量可占种子总蛋白的1％，比目前其它植物表达载体的表达量(一般为植物总可溶蛋白的0.001～0.01％)提高1000至10000倍，满足了生产需求。

附图说明

图1表达载体pCAMBIA1390的图谱；

图2hbFGF目的蛋白的Western检测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：bFGF基因的制备及序列测定

以hbFGF基因为蓝图，首先按照植物偏好的密码子将hbFGF碱基序列重新改造，并按照密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，利用在线软件Primerfinder及DNASTAR设计引物，为了合成含植物偏好的bFGF全长基因，共设计合成了十二条引物，每条引物长度约为57～59bp：P1F-P6F为正向引物，P7R-P12R为反向引物，其中P6F和P7R为互补的嵌合引物(有19个互补碱基)；在引物P1F和P12R中分别引入了BamHI和凝血酶切位点及SpeI、EcoRI酶切位点和保护碱基，以便克隆进中间克隆载体及植物表达载体中，引物序列如下：

p1F：CGGGATCCATTGAGGGAAGACCAGCTTTGCCAGAGGATGGAGGATC

p2F：GCCAGAGGATGGAGGATCTGGAGCTTTCCCACCAGGACATTTCAAGGACCCAAAGAG

p3F：TTTCAAGGACCCAAAGAGATTGTACTGCAAGAACGGAGGATTCTTCTTGAGAATCCATC

p4F：TTCTTCTTGAGAATCCATCCAGATGGAAGAGTTGATGGAGTTAGAGAGAAGTCTGATCC

p5F：AGAGAGAAGTCTGATCCACATATTAAGTTGCAATTGCAAGCTGAGGAGAGAGGAGTTGT

p6F：AGGAGAGAGGAGTTGTTTCTATTAAGGGAGTTTGCGCTAACAGATACTTGGCTATGAAG

p7R：CATCAGTAACGCACTTAGAAGCCAACAATCTTCCATCCTCCTTCATAGCCAAGTATCTG

p8R：GTTGTAGTTGTTAGACTCCAATCTCTCGAAGAAGAAGCACTCATCAGTAACGCACTTAG

p9R：AAAGCAACGTACCAAGAAGTGTACTTTCTTGATCTGTAAGTGTTGTAGTTGTTAGACTC

p10R：TCCAGTCTTAGATCCCAACTTGTATTGTCCAGTTCTCTTCAAAGCAACGTACCAAGAAG

p11R：TAGCAGACATTGGCAAGAACAAAATAGCCTTTTGTCCTGGTCCAGTCTTAGATCCCAAC

p12R：CGGAATTCACTAGTTTAAGACTTAGCAGACATTGGCAAG

bFGF全长基因合成

第一轮PCR扩增，如下建立100μl的反应体系：

10×pfu buffer                       10μl

dNTP(2.5mM)                          8μl

引物P6F(10μmol/L)                   2μl

引物P7R(10μmol/L)                   2μl

pfu DNA聚合酶                0.5μl

ddH₂O                        77.5μl

                                            

Total                        100μl

反应参数：

94℃             5min

55℃             5min

72℃             5min

4℃              ∞

经2％琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物命名为B6/7。

第二轮PCR扩增，如上采用100μl反应体系：

10×pfu buffer                        10μl

dNTP(2.5mM)                           8μl

引物P5F(10μmol/L)                    2μl

引物P8R(10μmol/L)                    2μl

B6/7模板                              1μl

pfu DNA聚合酶                         0.5μl

ddH₂O                                 76.5μl

                                                    

Total                                 100μl

反应参数如下：

94℃                4min

94℃                35s

55℃                35s

72℃                35s

72℃            2min

4℃             保存

如上用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物命名为B5/8。其后，以B5/8为模板，以P4F及P9R作引物，经PCR扩增得PCR产物B4/9；再以B4/9为模板，以P3F及P10R作引物，扩增得PCR产物B3/10；如此进行，直至合成改造后的bFGF全长基因。

将PCR产物bFGF经BamHI及EcoRI双酶切后连接到pUC19上，得到pUCbFGF。重组质粒pUCbFGF的DNA序列测序结果表明，本发明设计合成的bFGF核苷酸序列正确。获得了441bp的hbFGF基因，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

实施例2：重组油体表达载体的构建

以白菜型油菜的总DNA为模板，以oleosin基因的启动子的序列设计引物，引物1含有HindIII酶切位点，引物2引入PstI酶切位点，经PCR扩增获得了约900bp的oleosin基因的启动子(PCR反应条件为：94℃，5分钟；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟；25个循环结束后72℃延伸5分钟)，PCR产物用HindIII和PstI双酶切后，将其连接到pUC19上，得到pUCON，其测序结果表明克隆产物为油菜油体蛋白基因的启动子。

以大豆24kD油体蛋白基因序列设计引物：

引物1序列为：5′-aactgcagtcaaccatgaccacagtgccaccac

引物2序列为：5′-cgggatcctgcggttgcggttgttgctgtcactg

引物1含有PstI酶切位点，引物2引入BamHI酶切位点，以大豆种子基因组DNA为模板，经PCR扩增获得完整的大豆24kDa油体蛋白基因编码区序列678bp(PCR反应条件为：94℃，5分钟；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟；25个循环结束后72℃延伸2分钟)，PCR产物用PstI和BamHI双酶切后，将其连接到pUC19上，得到pUCOE，其测序结果表明克隆产物为大豆油体蛋白基因。

将pUCON质粒用HindIII和PstI双酶切后，将酶切片段油菜油体蛋白启动子连接到商业载体pCAMBIA1390(国际农业分子生物学应用中心Centre for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture，Australia)中，重组质粒命名为p1390ON，经酶切鉴定正确后进行后续工作。将pUCOE质粒经PstI和BamHI双酶切后，将酶切片段大豆油体蛋白基因与p1390ON连接，重组质粒命名为p1390ONE，此即油体表达载体。

实施例3：含hbFGF基因的重组油体表达载体的构建

将pUCbFGF质粒用BamHI和SpeI双酶切后，将得到的hbFGF酶切片段与重组油体表达载体p1390ONE连接，得到重组植物油体表达载体p1390ONE-bFGF。

实施例4：农杆菌介导的拟南芥、红花等遗传转化

p1390ONE-bFGF质粒DNA转入农杆菌

取1μg p1390ONE-bFGF质粒DNA加入到100微升LBA4404感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置5分钟；然后置液氮中冷冻5分钟后迅速转至37℃水浴中温育5分钟。加入1毫升LB液体培养基，在28℃摇床上180rpm振荡培养4小时。取适量菌液涂布到含链霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上，置28℃培养24～48小时，经抗性筛选、PCR及酶切鉴定获得带有p1390ONE-bFGF质粒DNA的农杆菌单菌落。

含p1390ONE-bFGF质粒的农杆菌的活化

从平板上挑取含p1390ONE-bFGF质粒的农杆菌单菌落，接种到5毫升LB液体培养基中(含卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L)，振荡培养过夜，取100微升菌液接种到50毫升LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L)中，28℃，180rpm振荡培养至OD600为1,1500rpm离心10分钟，菌体用浸染培养基重悬，使OD600为0.5。

拟南芥或红花等植物的遗传转化

将拟南芥或红花等子叶或下胚轴在重悬的农杆菌菌液中浸泡15分钟，放到含适当激素配比的MS固体培养基上共培养3天，之后转到含有潮霉素15mg/L+头孢霉素250mg/L的MS固体培养基上进行抗性愈伤组织的筛选及进行芽分化选择培养，约8周左右有抗性芽出现，待抗性芽伸长至2～5厘米时转至生根培养基上，一般15～30天左右即可生根。

实施例4：转基因拟南芥、红化等植物的PCR检测

提取转基因拟南芥或红花等植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以bFGF基因的一对引物扩增目的基因bFGF、以大豆油体蛋白基因的一对引物扩增大豆油体蛋白基因、以大豆油体蛋白基因5`端引物和bFGF基因的3`端引物扩增融合蛋白基因。扩增bFGF基因的PCR反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 35秒，58℃35秒，72℃35秒，25个循环；72℃延伸2分钟。扩增大豆油体蛋白基因的PCR反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃ 1分钟，25个循环；72延伸 5分钟。扩增融合蛋白基因的PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃ 1分钟，25个循环；72延伸5分钟。分别扩增出预期的475bp的bFGF基因(含酶切位点和凝血酶切位点)、678bp的大豆油体蛋白基因及约1150bp的融合蛋白基因。

实施例5：拟南芥和红花籽中bFGF目的蛋白的Western检测

提取拟南芥籽中和红花籽中的油体蛋白，经凝血酶切割后过肝素亲和层析柱，分离纯化得到bFGF纯品，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经转膜后用山羊抗兔bFGF的多克隆抗体进行Western分析，结果表明，在转基因拟南芥和红花的种子中有bFGF蛋白的表达，表达产物大小约为17kD，与预期的大小一致，其表达量占种子总蛋白的1％，比目前其它植物表达载体的表达量(一般为植物总可溶蛋白的0.001～0.01％)提高1000至10000倍，满足了生产需求，Western结果见附图2。

实施例6：油体蛋白与bFGF融合蛋白的分离纯化及生物活性测定

1.拟南芥和红花籽中油体蛋白bFGF融合蛋白的提取

(1)分别取适量拟南芥种子和红花种子，加2.5倍体积的缓冲液A(0.15M Tricine-KOH pH7.5，10mM  KCI，1mM  MgCl₂，1mMEDTA，0.6M蔗糖)研磨，5000g、4℃离心15分钟。

(2)上清用含0.65M蔗糖的缓冲液A重悬。

(3)液面上覆以等体积的含O.12M蔗糖的缓冲液A。

(4)15000g、4℃离心25分钟，重复两次，取上清。

至此将油体与种子中的其它成份分开。

(5)上清中加2倍体积的乙醚，15000g离心8分钟，上部的乙醚层中多为中性脂类，磷脂留在下面的水相中，取中间的蛋白层。

(6)以适量含0.1M蔗糖的缓冲液A重悬蛋白，加三倍体积的氯仿/甲醇(2∶1)混合物，抽提3次。

(7)取中间蛋白层，用乙醚抽提一次，-70℃超低温冰箱中冻干保存。

2.油体蛋白与bFGF蛋白的分离

(1)将油体蛋白bFGF融合蛋白溶于无菌水中，加入0.2U凝血酶，37℃酶切过夜。

(4)将酶切反应液上Harpin-Sepharose CL-6B亲和层析柱，用平衡缓冲液(10mmol/L PBS，PH7.0，0.2mol/L NaCl)洗至基线，用含0.6mol/L NaCl洗除杂蛋白，再用含1.2mol/L NaCl的PBS缓冲液进行洗脱，收集活性峰，经SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析得到bFGF纯品，纯度达98％。

用MTT法测定纯化后bFGF蛋白和野生型bFGF对Balb/c 3T3细胞的促分裂活性。结果表明，油体表达bFGF纯品的ED50为4.05ng/ml，野生型bFGF的ED50为4.15ng/ml；油体表达得到的bFGF蛋白纯品与野生型活性相当，比野生型活性稍有提高。

序列表

<110>吉林农业大学森母柏澳斯特遗传有限公司

<120>人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccagctttgc cagaggatgg aggatctgga gctttcccac caggacattt caaggaccca    60

aagagattgt actgcaagaa cggaggattc ttcttgagaa tccatccaga tggaagagtt    120

gatggagtta gagagaagtc tgatccacat attaagttgc aattgcaagc tgaggagaga    180

ggagttgttt ctattaaggg agtttgcgct aacagatact tggctatgaa ggaggatgga    240

agattgttgg cttctaagtg cgttactgat gagtgcttct tcttcgagag attggagtct    300

aacaactaca acacttacag atcaagaaag tacacttctt ggtacgttgc tttgaagaga    360

actggacaat acaagttggg atctaagact ggaccaggac aaaaggctat tttgttcttg    420

ccaatgtctg ctaagtctta a                                              441

Claims (8)

1、含有油体蛋白和人碱性成纤维细胞生长因子融合基因的植物表达载体。

2、如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述油体蛋白基因为大豆油体蛋白基因。

3、如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体的启动子为油菜油体蛋白启动子。

4、如权利要求1所述的表达载体，其为p1390ONE-bFGF。

5、含有权利要求1～4任一项所述表达载体的宿主细胞。

6、权利要求1～4任一项所述的表达载体在制备bFGF中的应用。

7、一种在植物种子油体中表达人碱性成纤维细胞生长因子的方法，包括步骤：将权利要求1～4任一所述的植物表达载体转化受体植物，经筛选鉴定获得转基因受体植物并获得植物种子，从得到的植物种子中提取获得碱性成纤维细胞生长因子。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥或红花。

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