CN112735525B - 一种基于分治法的mRNA序列优化的方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种基于分治法的mRNA序列优化的方法和装置，采用分治法对mRNA序列优化，通过在每次合并后均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，能够保证优化的mRNA序列不具有上述影响表达的因素，生成序列结构稳定，优化序列表达效率高。同时采用的分治法具有优化速度快，可进行批量序列优化的特点。
Description
技术领域
本申请属于基因优化技术领域，尤其是涉及一种基于分治法的mRNA序列优化的方法与装置。
背景技术
遗传密码子有64种，但是大部分生物倾向于利用这些密码子中的一部分，被频繁用到的密码子称为最佳密码子，不被经常用到的被称为稀有密码子。密码子优化是一种基因工程方法，通常用于增强重组蛋白表达。当功能蛋白在外源宿主中表达，由于功能蛋白基因使用了低频密码子等因素，会使其在外源宿主中很难表达。由于密码子简并性，每个氨基酸平均有三个对应密码子，这使得不同的核苷酸序列可以编码出相同的氨基酸序列。可以通过同义密码子替换使基因与宿主的密码子使用频率相匹配来提高蛋白表达水平。近年来，具有合适密码子用法的合成基因序列已成为试图改善重组表达的重要工具之一。到目前为止，通常主要通过选择表达宿主中频繁出现的密码子来优化编码区，这主要是通过商业供应商的专有算法来进行的。必须注意的是，不同的优化算法采用不同的方法来确定表达宿主中的密码子频率，例如，基于所有蛋白质编码基因中或仅针对有限的一组高度表达基因中的密码子使用；另一种选择是，根据表达宿主中同源tRNA基因的拷贝数确定首选密码子。此外，大多数密码子优化算法都是多参数算法，同时还要考虑其他几个因素。这些措施包括针对所需的GC含量，避免5'UTR中强大的mRNA二级结构以及避免某些不想要的基序，例如重复序列和RNase位点等。
mRNA降解是基因表达中的关键调控因素，研究表明密码子最优性具有促进mRNA稳定性的功能。生物信息学分析表明最佳密码子的百分比与mRNA半衰期之间具有很强的相关性。例如，具有少于40％最佳密码子的mRNA的中位半衰期为5.3分钟，而具有超过70％最佳密码子的mRNA的平均半衰期为20.1分钟。全基因组的RNA衰减分析表明，稳定的mRNA富含指定为最佳的密码子，而不稳定的mRNA则主要包含非最佳密码子。用同义的非最佳密码子替代最佳密码子会导致mRNA大幅失稳，而相反的替换会显著增加稳定性。此外，密码子最优性影响核糖体易位，通过密码子最优性连接翻译延伸和衰变的过程，所以密码子优化可作为微调mRNA和最终蛋白质表达水平的一种机制而存在。目前常用密码子优化方法具有优化时间长，序列表达效率较低的现象。
发明内容
本发明主要是解决目前常用密码子优化方法具有优化时间长，序列表达效率较低的现象，不同与现有密码子优化方法，本发明在提高表达效率的同时也尽可能地降低序列自由能以达到提高mRNA稳定性的目的。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于分治法的mRNA序列优化的方法，包括以下步骤：
S1:获取一段待优化的mRNA序列，截取蛋白质编码区，并且获取mRNA序列来源物种的相同蛋白质对应的密码子的使用频率；
S2:将mRNA序列连续均分若干次，最终均分得到仅含有1个密码子的序列片段；
S3:将表达为相同蛋白质的密码子统一替换成S1步骤中使用频率最高的密码子；
S4:逆向操作均分过程，从2个密码子开始进行合并直至合并形成与待优化的mRNA序列相同的长度，每次合并均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，若没有发夹结构和影响蛋白表达的因素则进入下一次合并，否则则将发夹结构处或者影响蛋白表达的因素处的密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子；
S5:以S4步骤确定的mRNA序列作为优化后的mRNA序列。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的方法，S4步骤中每次合并检查时还检查GC含量，若GC含量不处于百分之三十和七十之间时，则将其中的至少一个密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子，直至GC含量处于百分之三十和七十之间。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的方法，所述影响蛋白表达的因素包括：特定限制酶识别位点、Chi-site延伸重组热点、SD核糖体结合位点序列、CpG含量、TATAbox、串联稀有密码子、起始密码子与终止密码子环境、核糖核酸酶E、真核表达中的PolyA结构和隐蔽剪切位点。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的方法，还包括S6步骤，计算优化后的mRNA序列的密码子适应指数。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的方法，S4步骤中当密码子合并达到设定的阈值长度才开始检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素。
本申请还提供一种基于分治法的mRNA序列优化的装置，包括：
数据获取模块:用于获取一段待优化的mRNA序列，截取蛋白质编码区；
密码子频率确定模块：用于获取mRNA序列来源物种的相同蛋白质对应的密码子的使用频率；
序列均分模块:用于将mRNA序列连续均分若干次，最终均分得到仅含有1个密码子的序列片段；
密码子替换模块:将表达为相同蛋白质的密码子统一替换成密码子频率确定模块中使用频率最高的密码子；
密码子合并模块:用于逆向操作均分过程，从2个密码子开始进行合并直至合并形成与待优化的mRNA序列相同的长度，每次合并均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，若没有发夹结构和影响蛋白表达的因素则进入下一次合并，否则则将发夹结构处或者影响蛋白表达的因素处的密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子；
结果输出模块:用于以密码子合并模块确定的mRNA序列作为优化后的mRNA序列。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的装置，密码子合并模块中每次合并检查时还检查GC含量，若GC含量不处于百分之三十和七十之间时，则将其中的至少一个密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子，直至GC含量处于百分之三十和七十之间。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的装置，所述影响蛋白表达的因素包括：特定限制酶识别位点、Chi-site延伸重组热点、SD核糖体结合位点序列、CpG含量、TATAbox、串联稀有密码子、起始密码子与终止密码子环境、核糖核酸酶E、真核表达中的PolyA结构和隐蔽剪切位点。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的装置，还包括密码子适应指数计算模块，所述密码子适应指数计算模块用于计算优化后的mRNA序列的密码子适应指数。
优选地，本发明的基于分治法的mRNA序列优化的装置，密码子合并模块中当密码子合并达到设定的阈值长度才开始检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素。
本发明的有益效果是：
本申请的基于分治法的mRNA序列优化的方法和装置，采用分治法对mRNA序列优化，通过在每次合并后均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，能够保证优化的mRNA序列不具有上述影响表达的因素，生成序列结构稳定，优化序列表达效率高。同时采用的分治法具有优化速度快，可进行批量序列优化的特点。
附图说明
下面结合附图和实施例对本申请的技术方案进一步说明。
图1是本申请实施例的基于分治法的mRNA序列优化的方法的流程图；
图2是本申请效果实施例中的定OD测定值以及跑1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切纯化产物图；
图3是本申请效果实施例中RNA电泳图；
图4是本申请效果实施例中eGFP-DC与eGFP-control体外转录mRNA转染显微镜荧光图；
图5是本申请效果实施例中流式检测结果分析。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请的技术方案。
实施例1
本实施例提供一种基于分治法的mRNA序列优化的方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1:获取一段待优化的mRNA序列，截取蛋白质编码区，并且获取mRNA序列来源物种的相同蛋白质对应的密码子的使用频率；可以从ncbi下载表达目的基因物种的全基因组测序文件与注释文件，截取蛋白质编码区，统计该物种各种蛋白质的密码子的使用频率，将同一种蛋白质的密码子按照出现的频率进行排序形成使用频率，使用频率高的密码子将优先在优化时使用；
S2:将mRNA序列连续均分若干次，最终均分得到仅含有1个密码子的序列片段；比如mRNA序列长度为M bp，则进行连续均分以满二叉树的形式表示，最后一层有节点M/3个，共有log2(M/3)+1层，也即最后一层为1个密码子(3个碱基)，倒数第二层为2个密码子，倒数第三层为4个密码子……；
S3:将表达为相同蛋白质的密码子统一替换成S1步骤中使用频率最高的密码子；
S4:逆向操作均分过程，从2个密码子开始进行合并直至合并形成与待优化的mRNA序列相同的长度，每次合并均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，若没有发夹结构和影响蛋白表达的因素则进入下一次合并，否则则将发夹结构处或者影响蛋白表达的因素处的密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子(也即从使用频率的排序中，顺序选择使用频率更小的密码子)；
S5:以S4步骤确定的mRNA序列作为优化后的mRNA序列。
本实施例的基于分治法的mRNA序列优化的方法，采用分治法对mRNA序列优化，通过在每次合并后均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，能够保证优化的mRNA序列不具有上述影响表达的因素，生成序列结构稳定，优化序列表达效率高。同时采用的分治法具有优化速度快，可进行批量序列优化的特点。
分治法的算法设计模式如下，以下为举例：
Divide-and-Conquer(P)
1.if|P|≤n0
2.then return(ADHOC(P))
3.将P分解为较小的子问题P1,P2,...,Pk
4.for i←1 to k
5.do yi←Divide-and-Conquer(Pi)//递归解决子问题Pi
6.T←MERGE(y1,y2,...,yk)//合并子问题的解
7.return(T)
|P|表示原问题P的规模；n0表示一阈值，当问题P的规模小于等于n0时，问题可直接解出，无需继续分解。ADHOC(P)是表示基本子算法，用于解小规模的问题P，当P的规模小于等于n0时直接用算法ADHOC(P)求解。算法MERGE(y1,y2,...,yk)表示该算法中的合并子算法，用于将P的子问题P1,P2,...,Pk的相对应的解y1,y2,...,yk合并为P的解T。
作为一种改进，S4步骤中每次合并检查时还检查GC含量(碱基中G和C的占比)，若GC含量不处于百分之三十和七十之间时，则将其中的至少一个密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子，直至GC含量处于百分之三十和七十之间。GC含量处于百分之三十和七十之间时，表达效率更高。每次合并后均检查GC含量，还能保证GC尽可能均匀分布在整个基因序列上。
作为一种改进，所述影响蛋白表达的因素包括：特定限制酶识别位点、Chi-site延伸重组热点、SD核糖体结合位点序列、CpG含量、TATA box、串联稀有密码子、起始密码子与终止密码子环境、核糖核酸酶E、真核表达中的PolyA结构和隐蔽剪切位点。通过避免影响蛋白表达的因素可以保障蛋白质的表达。也即通过微调避开某些特定限制酶识别位点，检查Chi-site延伸重组热点(原核)、SD核糖体结合位点序列(原核)、CpG含量(真核中影响转录启动)、TATA box(真核中影响转录启动)、串联稀有密码子、起始密码子与终止密码子环境、核糖核酸酶E(影响mRNA结构稳定性)、真核表达中的PolyA结构(可能干扰提前终止)、隐蔽剪切位点以及其他未知的可能影响转录和翻译的影响因素。
作为一种改进，还包括S6步骤，计算优化后的mRNA序列的密码子适应指数。密码子适应指数(CAI)：是指编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的相符程度，取值在0-1之间。CAI可以用来评估外源基因在宿主内的表达水平，CAI越高，则外源基因在宿主内的表达水平越高。
作为一种改进，S4步骤中当密码子合并达到设定的阈值长度才开始检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素。由于序列较短时，通常不会发生发夹结构和影响蛋白表达的因素，因此，在长度到达设定阈值后再进行检查(比如设置为大于12个碱基时进行检查)，可以提高处理效率。
实施例2
本发明还提供一种基于分治法的mRNA序列优化的装置，包括：
数据获取模块:用于获取一段待优化的mRNA序列，截取蛋白质编码区；
密码子频率确定模块：用于获取mRNA序列来源物种的相同蛋白质对应的密码子的使用频率；
序列均分模块:用于将mRNA序列连续均分若干次，最终均分得到仅含有1个密码子的序列片段；
密码子替换模块:将表达为相同蛋白质的密码子统一替换成密码子频率确定模块中使用频率最高的密码子；
密码子合并模块:用于逆向操作均分过程，从2个密码子开始进行合并直至合并形成与待优化的mRNA序列相同的长度，每次合并均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，若没有发夹结构和影响蛋白表达的因素则进入下一次合并，否则则将发夹结构处或者影响蛋白表达的因素处的密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子；
结果输出模块:用于以密码子合并模块确定的mRNA序列作为优化后的mRNA序列。
作为一种改进，密码子合并模块中每次合并检查时还检查GC含量，若GC含量不处于百分之三十和七十之间时，则将其中的至少一个密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子，直至GC含量处于百分之三十和七十之间。
作为一种改进，所述影响蛋白表达的因素包括：特定限制酶识别位点、Chi-site延伸重组热点、SD核糖体结合位点序列、CpG含量、TATA box、串联稀有密码子、起始密码子与终止密码子环境、核糖核酸酶E、真核表达中的PolyA结构和隐蔽剪切位点。
作为一种改进，还包括密码子适应指数计算模块，所述密码子适应指数计算模块用于计算优化后的mRNA序列的密码子适应指数。
作为一种改进，密码子合并模块中当密码子合并达到设定的阈值长度才开始检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素。
本实施例的基于分治法的mRNA序列优化的装置与实施例的方法相对应，优点与实施例1中的相同。
效果实施例
1.实验方法：
1.1使用分治法优化eGFP序列命名为eGFP-DC，未优化的对照组命名为eGFP-control，构建质粒(pUC57为载体)。
1.2线性质粒模板制备：
①质粒抽提：采用商业化试剂盒提取质粒；
②采用XbaI单酶切质粒方法获得线性化质粒模板；
③鉴定：测定OD值和1％琼脂糖凝胶电泳。
1.3 eGFP-DC与eGFP-control线性加帽加尾mRNA制备:
①采用T7 Polymerase体外合成线性加帽加尾mRNA；
②制备的mRNA采用商业化硅膜离心柱纯化；
③鉴定：Nanodrop测纯化后RNA的浓度并跑1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.4不同密码子优化eGFP cell水平验证：
转染293Tcell-24h，
在荧光显微镜观察不同密码子方法优化eGFP表达差异；
使用Flow Cytometry定量检测不同密码子优化序列eGFP表达。
2.具体实验步骤：
2.1 eGFP-DC与eGFP-control质粒构建
将不同密码子优化的eGFP目的序列插入pUC57载体。
2.2 eGFP-DC与eGFP-control体外转录线性质粒模板制备
1)质粒抽提
①将外部合成的穿刺菌活化，条件37℃/220rpm/3～4h；
②取活化菌液扩大培养，培养条件：37℃/220rpm/过夜；
③质粒抽提(天根无内毒素小量中提试剂盒)，测定OD值。
2)质粒酶切
采取XbaI单酶切的方法酶切上述1)制备质粒
酶切体系如下：
37℃，酶切过夜；采用直接过柱的回收酶切产物的方法(天根通用型DNA胶回收试剂盒)，测定OD值并跑1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切纯化产物(见图2)；纯化的线性质粒模板用于体外转录。
2.3 eGFP-DC与eGFP-control体外转录mRNA制备
1)IVT线性加帽加尾mRNA合成
采用体外转录(HyperScribeTM All in One mRNA Synthesis Kit II(EZ CapReagent AG(3'OMe)T7,poly(A)))的方法合成mRNA
过程如下：
Capped RNA Synthesis
经过37℃孵育2h,然后用DNaseI消化未转录的线性DNA模板，消化条件：37℃消化15min
b.Poly(A)Tailing
2)IVT线性加帽加尾mRNA纯化
将上述转录反应液，用硅胶膜离心柱法纯化(Thermo,GeneJET RNA PurificationKit),最后得到的RNA用Water-nuclease,H2O洗脱
3)线性加帽加尾mRNA鉴定
Nanodrop测定RNA浓度，跑1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA大小，过程如下：
1％变性琼脂糖凝胶配方：
称取1g琼脂糖，至72ml nuclease-free,H2O中，微波炉加热溶解
上述冷却至55～60℃时，在通风橱加0.1％的gel red,10ml 10xMOPS,18ml甲醛，灌胶
变性琼脂糖凝胶电泳：
取等体积样本RNA与2x Loading buffer,65～70℃变性5～10min
②上样(RNA上样量500ng)，100V/30min,照胶(见图3)
2.4.eGFP-DC与eGFP-control体外转录mRNA转染293T cell-24h显微镜荧光观察(图4)及流式检测结果分析(图5)；
2.5实验结果：
使用分治法优化的eGFP序列表达水平比较高，优化效率明显。
以上述依据本申请的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
本领域内的技术人员应明白，本申请的实施例可提供为方法、系统、或计算机程序产品。因此，本申请可采用完全硬件实施例、完全软件实施例、或结合软件和硬件方面的实施例的形式。而且，本申请可采用在一个或多个其中包含有计算机可用程序代码的计算机可用存储介质(包括但不限于磁盘存储器、CD-ROM、光学存储器等)上实施的计算机程序产品的形式。
本申请是参照根据本申请实施例的方法、设备(系统)、和计算机程序产品的流程图和/或方框图来描述的。应理解可由计算机程序指令实现流程图和/或方框图中的每一流程和/或方框、以及流程图和/或方框图中的流程和/或方框的结合。可提供这些计算机程序指令到通用计算机、专用计算机、嵌入式处理机或其他可编程数据处理设备的处理器以产生一个机器，使得通过计算机或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令产生用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的装置。
Claims (10)
1.一种基于分治法的mRNA序列优化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:获取一段待优化的mRNA序列，截取蛋白质编码区，并且获取mRNA序列来源物种的相同蛋白质对应的密码子的使用频率；
S2:将mRNA序列连续均分若干次，最终均分得到仅含有1个密码子的序列片段；
S3:将表达为相同蛋白质的密码子统一替换成S1步骤中使用频率最高的密码子；
S4:逆向操作均分过程，从2个密码子开始进行合并直至合并形成与待优化的mRNA序列相同的长度，每次合并均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，若没有发夹结构和影响蛋白表达的因素则进入下一次合并，否则则将发夹结构处或者影响蛋白表达的因素处的密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子；
S5:以S4步骤确定的mRNA序列作为优化后的mRNA序列。
2.根据权利要求1所述的基于分治法的mRNA序列优化的方法，其特征在于，S4步骤中每次合并检查时还检查GC含量，若GC含量不处于百分之三十和七十之间时，则将其中的至少一个密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子，直至GC含量处于百分之三十和七十之间。
3.根据权利要求1或2所述的基于分治法的mRNA序列优化的方法，其特征在于，所述影响蛋白表达的因素包括：特定限制酶识别位点、Chi-site延伸重组热点、SD核糖体结合位点序列、CpG含量、TATA box、串联稀有密码子、起始密码子与终止密码子环境、核糖核酸酶E、真核表达中的PolyA结构和隐蔽剪切位点。
4.根据权利要求1或2所述的基于分治法的mRNA序列优化的方法，其特征在于，还包括S6步骤，计算优化后的mRNA序列的密码子适应指数。
5.根据权利要求1或2所述的基于分治法的mRNA序列优化的方法，其特征在于，S4步骤中当密码子合并达到设定的阈值长度才开始检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素。
6.一种基于分治法的mRNA序列优化的装置，其特征在于，包括：
数据获取模块: 用于获取一段待优化的mRNA序列，截取蛋白质编码区；
密码子频率确定模块：用于获取mRNA序列来源物种的相同蛋白质对应的密码子的使用频率；
序列均分模块:用于将mRNA序列连续均分若干次，最终均分得到仅含有1个密码子的序列片段；
密码子替换模块:将表达为相同蛋白质的密码子统一替换成密码子频率确定模块中使用频率最高的密码子；
密码子合并模块:用于逆向操作均分过程，从2个密码子开始进行合并直至合并形成与待优化的mRNA序列相同的长度，每次合并均检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素，若没有发夹结构和影响蛋白表达的因素则进入下一次合并，否则则将发夹结构处或者影响蛋白表达的因素处的密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子；
结果输出模块:用于以密码子合并模块确定的mRNA序列作为优化后的mRNA序列。
7.根据权利要求6所述的基于分治法的mRNA序列优化的装置，其特征在于，密码子合并模块中每次合并检查时还检查GC含量，若GC含量不处于百分之三十和七十之间时，则将其中的至少一个密码子替换成与替换前的密码子相比使用频率更小的密码子，直至GC含量处于百分之三十和七十之间。
8.根据权利要求6或7所述的基于分治法的mRNA序列优化的装置，其特征在于，所述影响蛋白表达的因素包括：特定限制酶识别位点、Chi-site延伸重组热点、SD核糖体结合位点序列、CpG含量、TATA box、串联稀有密码子、起始密码子与终止密码子环境、核糖核酸酶E、真核表达中的PolyA结构和隐蔽剪切位点。
9.根据权利要求6或7所述的基于分治法的mRNA序列优化的装置，其特征在于，还包括密码子适应指数计算模块，所述密码子适应指数计算模块用于计算优化后的mRNA序列的密码子适应指数。
10.根据权利要求6或7所述的基于分治法的mRNA序列优化的装置，其特征在于，密码子合并模块中当密码子合并达到设定的阈值长度才开始检查是否有发夹结构生成以及是否具有影响蛋白表达的因素。
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