CN117965664A - 一种cot DNA及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种cot DNA及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域，包括以下步骤：获取物种基因组DNA；针对基因组DNA的重复序列设计sgRNA；利用sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术对基因组DNA的重复序列进行特异性的切割，得到产物；将产物进行纯化，得到Cot DNA。本申请的一种cot DNA的制备方法相比于目前常用的Cot DNA制备方法，减少了打断、变性、退火和消化等实验流程，可更快速地制备出Cot DNA，提高制备效率，且提高了产量。本申请的一种cot DNA的制备方法利用sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术对基因组DNA的重复序列进行特异性的切割，可以特异性切割重复序列的位点，使制备的Cot DNA中重复序列的含量更高。

Description

一种cot DNA及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于分子生物学技术领域，更具体地说，是涉及一种cot DNA及其制备方法和应用。

背景技术

在核酸复性研究中，定义了一个Cot的术语，Cot值等于浓度(Co，单位为摩尔)乘以时间(t，单位为秒)；在分子生物学研究中，Cot值通常用于分析DNA的复杂性、重复序列的丰度以及核酸杂交实验的优化。Cot DNA常用于封闭重复DNA序列，从而达到降低非特异性杂交的目的；在NGS液相捕获、原位杂交、微阵列杂交、滤膜杂交等实验中应用广泛。人Cot DNA还是体细胞杂交文库和流式分选染色体文库的有效文库筛选探针。

目前制备cot DNA的方法主要包括以下步骤：1.先将基因组DNA打断为100-1000bp大小的片段；2.将打断后的DNA片段进行纯化回收；3.将纯化后的片段经过变性、退火；4.去除退火后的单链DNA片段；5.纯化回收剩余的双链DNA片段，得到Cot DNA。

现有制备Cot DNA的流程较长，由于核酸外切酶的消化作用导致最终产物的得率不高。此外，由于打断后的片段平均大小不一，退火时间是一定的，所以导致最终Cot DNA中重复序列的含量只能达到90％-95％左右。

发明内容

本申请的目的在于提供一种cot DNA及其制备方法和应用，通过CRISPR/Cas9技术对基因组DNA进行双链DNA的打断，特异性的获取50-300bp大小的重复序列；免去了打断、变性、退火和消化等流程，缩短了实验时间，增大了Cot DNA的产量，同时提高了Cot DNA中的重复序列的含量。

为实现上述目的，本申请的第一方面，提供了一种cot DNA的制备方法，包括以下步骤：

S1、获取物种基因组DNA；

S2、针对所述基因组DNA的重复序列设计sgRNA；

S3、利用所述sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术对所述基因组DNA的重复序列进行特异性的切割，得到产物；

S4、将所述产物进行纯化，得到Cot DNA。

进一步地，所述sgRNA靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链。

进一步地，所述步骤S3中，切割后得到的所述产物中含有50-300bp大小的重复序列；和/或所述步骤S4中通过磁珠纯化。

进一步地，所述步骤S3中进行特异性切割所配制的反应体系中含有：所述基因组DNA、所述sgRNA、无酶水和Cas9蛋白，所述反应体系在37℃反应60min。

进一步地，所述基因组DNA为人基因组中Alu和Kpn基因；所述sgRNA靶序列为序列表中SEQ ID NO：1～50所示。

本申请的第二方面，提供了一种cot DNA，采用上述任一项所述的制备方法得到。

本申请的第三方面，提供了一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，包括上述所述的cot DNA。

本申请的第四方面，提供了一种cot DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。

本申请的第五方面，提供了一种核酸杂交的方法，包括使用上述所述的cot DNA进行封闭的步骤。

本申请的第六方面，提供了一种序列捕获的方法，包括使用上述所述的cot DNA进行封闭的步骤。

与现有技术相比，本申请具有以下的技术效果：

本申请的一种cot DNA的制备方法相比于目前常用的Cot DNA制备方法，减少了打断、变性、退火和消化等实验流程，可更快速地制备出Cot DNA，提高制备效率，且本申请的一种cot DNA的制备方法避免了常用方法中核酸外切酶的非特异性消化步骤，可以使制备出的cot DNA的产量提高20％左右。

本申请的一种cot DNA的制备方法利用sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术对基因组DNA的重复序列进行特异性的切割，可以特异性切割重复序列的位点，使制备的Cot DNA中重复序列的含量更高。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的一种cot DNA的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等生化领域公知的质量单位。

本申请实施例提供了一种cot DNA及其制备方法，制备流程如图1所示，包括以下步骤：

步骤一：通过核酸提取获取物种基因组DNA；

步骤二：针对该物种基因组DNA的重复序列设计特异性的sgRNA引物组合；

步骤三：将sgRNA混成引物池，与基因组DNA混合，利用CRISPR/Cas9系统，在Cas9蛋白的作用下对基因组DNA进行特异性的切割，从而获得大量片段大小为50-300bp的重复序列；

步骤四：通过DNA cleanbeads双筛纯化(磁珠纯化)回收得到Cot DNA。

其中，上述步骤一中的物种基因组并不特别限定，本领域技术人员可以理解，所述基因组最好与待杂交或待封闭的样本来源于同一物种。并且用于提取基因组的组织部位或者细胞类型并不特别限定，由于不同部位组织的基因组的丰度不同，通过调整组织或者细胞的用量，可以得到适当量的基因组DNA。可以使用人的基因组，提取基因组的样本可以是人的组织或者细胞。基因组DNA的提取可以使用本领域的现有技术，包括使用商品化的基因组提取试剂盒等。

上述步骤二中的sgRNA靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链。

上述步骤三中，切割后得到的产物中含有50-300bp大小的重复序列；进行特异性切割所配制的反应体系中含有：基因组DNA、sgRNA、无酶水和Cas9蛋白，反应体系在37℃反应60min。CRISPR/Cas9系统是通过sgRNA进行介导的，利用Cas9蛋白对基因组DNA进行切割的一种基因编辑工具；sgRNA包括crRNA和tracrRNA组成；主要原理是sgRNA的5'端20bp可以与基因组的靶点进行互补配对，sgRNA从而引导Cas9蛋白对sgRNA识别区域进行随机切割。本申请实施例的Cas9蛋白购买自赛默飞，货号：A36496。

以下通过一个具体实施例来举例说明本申请实施例的一种cot DNA及其制备方法。

实施例

本申请实施例以人类基因组为例，制备用于封闭重复序列的Cot human DNA，包括以下步骤：

1、人gDNA的提取：使用血液DNA提取试剂盒(诺唯赞，货号：DC112)对人全血进行提取，得到人基因组DNA(Human gDNA)。

2、使用CRISPR/Cas9系统对人基因组DNA重复序列进行切割(Cas9蛋白购买自赛默飞，货号：A36496)：针对人基因组中Alu和Kpn等基因家族中的重复序列设计20bp的sgRNA靶向序列，具体序列如下表1所示，共包括50个引物序列，sgRNA靶序列如序列表中SEQ ID NO：1～50所示；并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成完整的sgRNA序列。

表1

3、使用Cas9蛋白对提取的人基因组DNA进行重复序列的切割：配置如下表2体系进行反应，在37℃反应60min：

表2

组分	投入量
		Human gDNA	1μg
5×Cas9	4μl
		sgRNA(10μM)	2μl
无酶水	upto20μl

4、Cot DNA的纯化：取出DNA纯化磁珠(诺唯赞，货号：N411)，室温静置30min平衡磁珠。将上一步的产物补加无酶水至50μl，加入30μl的磁珠，振荡混匀后室温放置10min，将离心管放置在磁力架上吸磁5min，待溶液澄清后将上清转移至新的离心管中，再加入10μl的磁珠，振荡混匀后室温静置10min，再将离心管放置在磁力架上吸磁5min，待溶液澄清后弃去上清；向离心管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s后弃掉上清；重复上一步磁珠纯化的工序，再次将离心管保持在磁力架上放置5min，使磁珠完全干燥；向离心管中加入22μL无酶水，涡旋振荡混匀，短暂离心，室温静置2min；将离心管重新放回磁力架上，静置5min；待溶液澄清后，吸取20μL上清至新的离心管中，弃去磁珠，最终得到Cot human DNA纯化产物。

应用例

本实施例通过使用艾吉泰康的全外显子捕获建库试剂盒，对比艾吉泰康的CotDNA和本申请实施例制备的Cot DNA性能差异。

验证样本：实施例中制备的Cot DNA；

对照样本：艾吉泰康杂交捕获试剂中的Cot DNA；

杂交样本：标准品NA12878，使用艾吉泰康的艾全外文库构建试剂盒进行文库构建。

分别取标准品NA12878各100ng进行全外显子捕获建库，并进行了一次重复，在探针杂交时，区别在于对照组使用艾吉泰康自带的Cot DNA，实验组使用本实施例制备的CotDNA。对文库测序数据进行生信分析后，质控数据如下表3所示；从表3中可以看出本申请实施例制备的Cot DNA与商品化Cot DNA性能相当。

表3

实验组别	比对率	中靶率
			对照组-1	85.81％	71.29％
对照组-2	85.92％	71.31％
			实验组-1	87.47％	72.81％
实验组-2	86.51％	71.88％

以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种cot DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、获取物种基因组DNA；

S2、针对所述基因组DNA的重复序列设计sgRNA；

S3、利用所述sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术对所述基因组DNA的重复序列进行特异性的切割，得到产物；

S4、将所述产物进行纯化，得到Cot DNA。

2.如权利要求1所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述sgRNA靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链。

3.如权利要求1所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，切割后得到的所述产物中含有50-300bp大小的重复序列；和/或所述步骤S4中通过磁珠纯化。

4.如权利要求1所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中进行特异性切割所配制的反应体系中含有：所述基因组DNA、所述sgRNA、无酶水和Cas9蛋白，所述反应体系在37℃反应60min。

5.如权利要求2所述的一种cot DNA的制备方法，其特征在于，所述基因组DNA为人基因组中Alu和Kpn基因；所述sgRNA靶序列为序列表中SEQ ID NO：1～50所示。

6.一种cot DNA，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的制备方法得到。

7.一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的cotDNA。

8.如权利要求6所述的一种cot DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。

9.一种核酸杂交的方法，其特征在于，包括使用权利要求6所述的cot DNA进行封闭的步骤。

10.一种序列捕获的方法，其特征在于，包括使用权利要求6所述的cot DNA进行封闭的步骤。