CN110747198A

CN110747198A - 毕赤酵母生产重组人源ⅱ型胶原蛋白单链的方法

Info

Publication number: CN110747198A
Application number: CN201911088025.0A
Authority: CN
Inventors: 钱松; 李佳佳
Original assignee: Jiangsu Yuezhi Biology Medicine Co ltd
Current assignee: Jiangsu Chuangjian Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN110029111A; CN110747198B

Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母表达制备重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法。本发明提供了一种编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由此核苷酸序列SEQ ID NO.1所编码的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据本发明所获得的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链包含成熟的人Ⅱ型胶原α1链的全长氨基酸序列，可有效的支撑Ⅱ型胶原蛋白生物学功能的实现，具有良好的生物学活性，且氨基端、羧基端含有不同的亲和纯化标签，可有效的纯化获取全长单链蛋白，也有利于胶原蛋白的鉴定；同时本发明根据毕赤酵母表达特点，对编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的基因序列进行系统性的计算优化，使其更适于在毕赤酵母中表达。

Description

毕赤酵母生产重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列及重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的生产方法。

背景技术

在哺乳动物体内，胶原蛋白含量丰富，分布广泛，种类繁多，是细胞、组织乃至器官行使正常功能和机体损伤修复必不可少的重要成份。在胶原家族的众多成员里，Ⅱ型胶原蛋白主要分布在软骨组织、玻璃体、眼角膜中，占成人软骨基质胶原蛋白总量的90％以上。除了具备胶原蛋白基本的生物学功能，如止血性能、生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等，Ⅱ型胶原蛋白具备一些独特的生物学功能：(1)可形成网状纤维结构，与蛋白聚糖以及其他成分紧密结合，维持软骨组织的基质成分平衡和完整性，以此赋予软骨良好的弹性、拉伸强度和减震特性等生理特征；(2)促进软骨细胞生长增殖，激活人骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化，延缓软骨细胞去分化现象的出现，有利于软骨细胞再分化状态的维持；(3)诱导免疫耐受，可预防或缓解类风湿性关节炎等病症。Ⅱ型胶原蛋白基因是软骨和骨型形成、骨骼生长和成熟软骨维持等所必需的成份。

软骨组织自愈能力极低，一旦发生损伤或病变，很难依靠自身的分泌能力自我修复，必须进行修复甚至替换。由于Ⅱ型胶原蛋白有极好的生物相容性、可降解性、低免疫原性以及可促进软骨细胞的生长和再分化等能力，Ⅱ型胶原蛋白是软骨的修复和再生医学领域最为理想的材料。

目前，Ⅱ型胶原蛋白的生产主要是利用传统提取法获得，即选取不同种类动物软骨组织，分别经氯仿、盐酸胍、酶解、酸、碱等处理，然后经过透析、离心浓缩、冻干等方法纯化得到Ⅱ型胶原蛋白。这样得到的Ⅱ型胶原蛋白多数为胶原蛋白片断或明胶，序列的完整性无法保证；由于是异源胶原蛋白，临床使用上会出现免疫系统的排异反应；由于原材料来源的庞杂性，还有一些疾病、病毒(如口蹄疫、疯牛病)等生物安全性隐患，这些均限制了其作为生物医学材料方面的应用。

利用基因工程表达重组蛋白是另一种获取Ⅱ型胶原蛋白途径，表达宿主主要为动物细胞、动物体、植物和微生物。动物、植物表达周期长(动物、植物的生长周期往往以月或年计算)、成本高、培养条件复杂、产量低，无法大规模集约化、工业化生产。动物细胞表达主要有昆虫细胞(杆状病毒)表达系统和哺乳动物细胞表达系统两种，ALAKOKKO等使用哺乳动物细胞，NONELAINEN等人、孙京臣等人使用杆状病毒和昆虫细胞均表达出全长的Ⅱ型胶原蛋白。但哺乳动物细胞、昆虫细胞培养难度大、成本高、周期长、产量极低，直至目前只限于实验室规模，无法满足大规模工业化生产的要求。

微生物表达系统相比其他技术有着产量高、生产周期短、培养简单、成本低、易获取高密度发酵等优点，目前应用于胶原蛋白表达的宿主主要有毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、大肠杆菌等。范代娣等人使用大肠杆菌，重组表达数段人Ⅱ型胶原蛋白的基因片段的拼接重复序列，重组类人Ⅱ型胶原蛋白肽；朱平等人使用大肠杆菌表达了人Ⅱ型胶原蛋白250-270的短小片断。但大肠杆菌表达蛋白质无任何的翻译后修饰，且均不是完整的全长序列，在支撑完成Ⅱ型胶原蛋白的生物学功能会受到极大限制。毕赤酵母发酵表达产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化，蛋白具有翻译后修饰如糖基化等能力，所以使用毕赤酵母异源表达胶原蛋白具有较大优势。

目前，并没有相关研究或专利使用毕赤酵母分泌表达人Ⅱ型胶原蛋白全长α1成熟肽链，且目前用于生产的重组表达人源胶原，通常不添加或只在一端添加亲和标签，而表达出的肽链较易降解，经传统非特异性纯化方法或单一亲和标签纯化获得的蛋白纯度不够，难以去除部分降解产物，无法满足对纯度要求高的应用。之前的研究或专利中，所使用的表达胶原的DNA序列均为人基因组中的天然编码序列(一般通过反转录方法获得)，但酵母与人在基因的转录、翻译过程中有着一定的差别，尤其是密码子的偏好性上有所不同，使用人胶原的天然编码DNA序列在毕赤酵母中表达，会因密码子偏好性、mRNA的整体结构等造成翻译表达效率的低下。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种毕赤酵母表达的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的制备方法：对编码胶原蛋白的DNA序列进行系统性的优化设计，更适应于在毕赤酵母中的表达；采用毕赤酵母分泌表达，在成熟的人Ⅱ型胶原蛋白全长α1肽链N、C两端添加带有两种不同的特异性亲和纯化标签，可高效率直接从诱导发酵上清中纯化得到全长的、无降解蛋白的Ⅱ型胶原全长α1链；有人Ⅱ型胶原成熟α1链全部的氨基酸序列，有相应的翻译后修饰，可完整执行人Ⅱ型胶原生物学功能，有良好的生物学活性和生物安全性。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种经过人为优化设计的表达重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的基因序列。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

在本发明的第二方面，本发明提供了上述基因序列编码表达的一种重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链，所述重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

其中1～12为Strep-tagⅡ标签的氨基酸序列，13～1072为成熟人Ⅱ型胶原蛋白α1链全长氨基酸序列(13～31为N端端肽序列，32～1045为三螺旋区域序列，1046～1073为C端端肽序列)，1073～1078为6×His亲和纯化标签序列。

本发明的第三方面提供了一种重组毕赤酵母菌，所述重组毕赤酵母基因组中整合有SEQ ID NO.1所述核苷酸序列。

进一步地，所述酵母的分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

进一步地，所述酵母为毕赤酵母Pichia pastoris。

上述重组毕赤酵母菌种可以通过由下述步骤获得：

(1)合成如SEQ ID NO.1所示的编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列；

(2)设计PCR引物，扩增获取编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的DNA片断，引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

SEQ ID NO.3：cggaattctggagtcatcctcaattcgaaaaacaaatggctggtggattcgatga，

SEQ ID NO.4：acggcggccgcttagtgatgatggtgatggtgtgctctcatatattgaagagggtcagg；

(3)构建重组表达载体；

(4)将制备得到重组表达载体线性化后导入至毕赤酵母中，经筛选获得阳性克隆，得到重组的毕赤酵母菌种。

在本发明的具体实施方式中，申请人已经将获得重组酵母菌样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号是：CGMCC NO.17149。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2019年1月10日。

本发明的第四方面提供了一种生产上述的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)培养上述重组毕赤酵母菌种，表达重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链；

(2)分离纯化步骤(1)中所表达的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链：分别使用Strep-tagⅡ标签亲和层析介质、6×His标签的亲和层析介质进行双亲各纯化。上述步骤(2)中的Strep-tagⅡ标签亲和层析介质、6×His标签的亲和层析介质两个纯化步骤可以顺序可进行调换。

优选的，所述步骤(2)中分离纯化为先采用Strep-tagⅡ标签的亲和层析介质吸附重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链，再用6×His标签的亲和层析介质吸附重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链。

本发明的第五方面提供了构建所述表达载体所需的PCR引物，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明的第六方面提供了上述表达载体在制备基因工程酵母中的应用。

本发明的第七方面提供了上述重组毕赤酵母菌种在制备重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的应用。

如上所述，本发明的具有以下优势：

(1)本发明根据毕赤酵母表达特点，对编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的基因序列进行系统性的计算优化，消除毕赤酵母罕见密码子的使用，优化mRNA的二级结构，使其更适于在毕赤酵母中表达；

(2)本发明分别在人Ⅱ型胶原蛋白α1链氨基酸序列N、C两端添加了不同的两种亲和纯化标签，只需两步亲和纯化即可高效率的获取高纯度、无降解的全长人源Ⅱ型胶原蛋白α1链；这两种标签序列很小，不影响胶原的生物学功能；同时两种标签可作为重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链检测、鉴定的特异性标记序列；

(3)本发明表达的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链包含人Ⅱ型胶原蛋白成熟肽链所有的序列，完整的蛋白质序列才能有力支撑人Ⅱ型胶原蛋白完成其生物学功能；同时使用毕赤酵母来表达生产胶原蛋白，无内毒素，可对胶原蛋白进行多种的翻译后修饰，可充分支持以此胶原生产的胶原产品的生物学功能；

(4)本发明所使用的表达载体为分泌表达载体，可在工程菌自身生命活动过程中持续分泌表达胶原蛋白，生产工艺简单，杂质蛋白少，可进行连续高密度发酵，为后续的大规模工业化生产提供了优秀工程菌种。

附图说明

图1为载体pPIC9K-Strep-2A1-His构建技术路线图；

图2为实施例2中重组毕赤酵母菌株基因组PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为重组毕赤酵母工程菌表达重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的SDS-PAGE分析图；

图4为重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的Western Blot检测图，4a图为抗Srtep-tagⅡ抗体的WB图，4b图为抗6×His抗体的WB图；

图5a，5b为重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链SDS-PAGE图上120kDa处(>116kDa)条带的质谱分析结果图；

图6为不同培养板上培养人软骨细胞的生长曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明所选用的毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168菌株、表达载体pPIC9K均购自Invitrogen公司。所用培养基配方如下：

1)YPD完全培养基：

酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)；

2)MD培养基(选择培养基)：

配100mL，向80mL水中加入琼脂2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4g/L)，10×葡萄糖10mL(20g/L)，500×生物素0.2mL(4×10^-4g/L)；

3)BMGY培养基(酵母生长培养基)：

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g K₂HPO₄，11.8g KH₂PO₄，定容到890mL。121℃蒸汽高压灭菌20min，冷却至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL；

4)BMMY培养基(酵母诱导培养基)：

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g K₂HPO₄，11.8g KH₂PO₄，定容到895mL。121℃蒸汽高压灭菌20min，冷却至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10^-4g/L)，甲醇5mL。

本发明中实施实例中所使用的DMEM基础培养液、胎牛血清(FBS)、双抗(100×)、L-谷氨酰胺(100×)均购自Invitrogen公司，MTT、甲苯胺蓝、胰酶均购自AMRESCO公司，所用配方如下：

5)PBS溶液(PH＝7.2-7.4)：称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.56g，KH₂PO₄0.2g，倒入盛有去离子水的烧杯中用玻璃棒搅动使其充分溶解，然后将溶液倒入容量瓶中准确定容至1000mL摇匀即成新的PBS溶液，高压蒸汽灭菌20分钟后4℃备用。

6)MTT溶液：MTT比色法中溶液浓度为5mg/mL，称取MTT 0.5g，溶于100mL的PBS液，在超净台用0.22μm滤器过滤以除去细菌，4℃避光保存，2周内有效。

7)1％甲苯胺蓝原液(10×)：甲苯胺蓝粉1g加入70％酒精10mL充分溶解制成，常温或者4℃保存。使用时以1％NaCl稀释，用时新鲜配制。

8)0.25％胰酶:称取0.25胰酶(1:250)，以100mL PBS溶液溶解，在超净台用0.22μm滤器过滤除菌，分装后，-20℃保存。

9)完全培养液：10％FBS、1×双抗、1×L-谷氨酰胺的DMEM培养液。

实施例1重组表达载体的构建

需表达的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的全长为1078个氨基酸，其N端为Srtep-tagⅡ标签，C端为6×His标签，该基因重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

1.1基因序列的优化与合成

以Genebank基因序列NM_001844.4和重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链氨基酸序列SEQID NO.2为基础，针对毕赤酵母密码子偏好性、DNA序列的GC含量、mRNA二级结构、CpG岛、重复序列、PolyA位点、RNA不稳定区域等多种参数进行系统计算优化，同时利用同义转化法消除序列中EcoRI(GAATTC)、NotI(GCGGCCGC)等酶切位点。相比于天然Ⅱ型胶原α1链的编码序列，人为设计优化后密码子适应指数(Codon Adaptation Index)从0.65提高至0.79，最佳密码子频率(Frequency of Optimal Codons)中最高使用频率(比值为91～100)从36％提高至48％，GC含量从63.45％降低至55.80％，去除了1个GGTAAG剪接位点和3个GGTGAT剪接位点。优化后的基因序列见SEQ ID NO.1，优化后的胶原基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。

1.2扩增Strep-2A1-His基因片断

根据优化的Ⅱ型胶原基因序列，按照引物设计原则，利用Primer Primer 5.0软件设计PCR扩增引物，上游引物添加表达Strep-tagⅡ标签序列，同时添加EcoRI酶切位点；下游引物添加表达6×His标签序列，同时添加终止密码子和NotI酶切位点。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物：cggaattctggagtcatcctcaattcgaaaaacaaatggctggtggattcgatga(SEQID NO.3)；

下游引物：acggcggccgcttagtgatgatggtgatggtgtgctctcatatattgaagagggtcagg(SEQ ID NO.4)。

以上述引物扩增目的基因，PCR高保真酶为NEB的Q5 2×Master Mix。PCR条件：98℃预变性，2min，一个热循环；98℃热变性10s，55℃退火30s，72℃延伸90s，40个热循环；72℃复性2min。

1.3PCR产物双酶切

用EcolRI、NotI双酶切消化1.2中的PCR产物，回收目的片段Strep-2A1-His，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TaKaRa公司)

1.4质粒pPIC9K双酶切

用EcolRI、NotI双酶切消化质粒pPIC9K，回收线性化载体，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TaKaRa公司)

1.5由1.3和1.4步所得的目的片段和载体片段，PCR产物纯化试剂盒纯化，该试剂盒购自大连TaKaRa公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.6步骤1.5回收得到的经双酶处理后的目的片段Strep-2A1-His和载体pPIC9K用SolutionI连接试剂(购自大连TaKaRa公司)进行连接反应，目的片段准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

质粒pPIC9K线性化片段 2μL

Strep-2A1-His 3μL

SolutionI连接试剂 5μL

将连接产物转化进入感受态大肠杆菌DH5α，在含有Amp的LB抗性平板筛选阳性克隆，利用通用引物5’AOX1、3’AOX1进行菌落PCR验证，有大小为3172bp的片段的为阳性克隆。提取质粒酶切鉴定正确后，将重组质粒进行测序鉴定。

得到重组表达载体pPIC9K-Strep-2A1-His，整个表达载体构建流程示意图如附图1所示，pPIC9K-Strep-2A1-His序列如SEQ ID NO.5所示：

AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGT

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ATTTTGAACCATCATCTTGGCAGCAGTAACGAACTGGTTTCCTGGACCAAATATTTTGTCACACTTAGGAACAGTTTCTG

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AACAGTTATTATTCG

实施例2重组毕赤酵母工程菌的构建

2.1表达载体pPIC9K-Strep-2A1-His的线性化

用限制性内切酶SalI于37℃进行酶切消化过夜，反应体系如下:

然后以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测是否完全切开，待完全切开后，用质粒提取试剂盒对酶切液进行处理，回收线性化质粒，使体积控制在10μL左右。

2.2毕赤酵母SMD1168感受态细胞的制备

1)挑取酵母SMD1168单菌落，接种至含有5mL的YPD液体培养基的试管中，30℃、220rpm振荡培养过夜；

2)取50μL的过夜培养物接种至含有50mL新鲜YPD液体培养基的500mL三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养过夜，至OD600值达到1.1～1.3；

3)将培养物于4℃，1500×g离心5min，用50mL冰预冷的无菌双蒸水重悬菌体；

4)按步骤3)离心，用25mL冰预冷的无菌双蒸水重悬菌体；

5)按步骤3)离心，用20mL冰预冷的1M的山梨醇溶液重悬菌体；

6)按步骤3)离心，用0.3mL冰预冷的1M的山梨醇溶液重悬菌体，其终体积约为0.5mL；

7)分装成每80μL一份，于-70℃保存备用。

2.3毕赤酵母的电转化

1)将一个0.2cm的电转杯置于冰中预冷10min；

2)将新鲜制备的毕赤酵母感受态细胞中加入约10μL的线性化的pPIC9K-Strep-2A1-His质粒，轻轻混匀，转至0.2cm冰预冷的电转杯中，继续于冰上预冷5min；

3)电击，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间为5～10mSec；

4)电击结束，迅速加入1mL冰预冷的1M的山梨醇溶液，轻轻吹打混匀，并转至1.5mL离心管中；

5)将菌悬液涂布于MD平板上，每100μL～200μL涂布一块平板，室温静置10min，于30℃倒置培养2-5天，直至有单菌落出现。

2.4多拷贝插入重组子的筛选

1)在生长有转化子的MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中；

2)加入20mL无菌双蒸水稀释，混匀后测定其OD600值(1OD600＝5×10⁷cells/mL)；

3)取105个细胞涂布于含有0.5mg/mLG418的YPD平板上，倒置，30℃培养3～4d；

4)在无菌96孔板中每孔加入200μL YPD液体培养基；

5)用无菌牙签往步骤4)的96孔板中分别接入在含有0.5mg/mL G418的YPD平板上获得的转化子，混匀，于30℃培养48h；

6)48h后，取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第一块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h；

7)24h后，再取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第二块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h；

8)24h后，从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上，于30℃继续培养96h～120h。毕赤酵母转化子若能在含高浓度G418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个pPIC9K-Strep-2A1-His片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选得到的高拷贝的重组酵母将更有可能实现目的蛋白的高效表达。

2.5重组子的PCR鉴定

挑选重组子单菌落接种YPD液体培养基，30℃、220rpm过夜培养，取一毫升菌液提取基因组，酵母基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，具体操作步骤参考试剂盒说明书。

以基因组DNA为模板，5’AOX1、3’AOX1通用引物为扩增引物进行PCR，所用的酶为ExTaq，购自大连TaKaRa公司。其中，PCR条件为98℃预变性，2min，一个热循环；98℃热变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，25个热循环；72℃复性2min。扩增产物有两个条带，一条2.2kb的为SMD1168基因组自身的AOX1基因，另一条3712bp的为目的基因，如图2所示。

2.6重组酵母的诱导表达

1)分别挑选单菌落，置于装有10mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，于28-30℃、220rpm培养至OD600为2～6(16-18h).

2)室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为1左右。

3)将步骤2)所得的菌液置于250mL的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃、220rpm的摇床上继续生长3天。

4)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％。

5)按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mL EP管中，最大转速离心2～3min，收集上清。分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

6)待检测样品于-80℃保存备用。

2.7重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的鉴定

1)2.6中收取的上清进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示。

2)目的蛋白N端有Srtep-tagⅡ标签，C端有6×His标签，分别以购自南京金斯瑞生物科技有限公司的抗Srtep-tagⅡ抗体(A01736)、圣克鲁斯生物技术有限公司的抗His抗体(sc-8036)进行检测，结果如图4所示(a图抗抗Srtep-tagⅡ抗体的WB图，b图为抗His抗体的WB图)120kDa左右的条带可被两种抗体识别，可证明其为带有Srtep-tagⅡ、6×His双标签的完整重组蛋白。

3)将步骤1)SDS-PAGE上120kDa处(>116kDa)条带的条带割下，经Nano-LC-ESI-MS/MS蛋白鉴定，该条带为人Ⅱ型胶原α1链，结果如图5所示。质谱检测由苏州普泰生物医药有限公司完成。

实施例3酵母重组胶原蛋白表达、纯化制备

Strep-Tactin亲和层析树脂购自IBA生命科学公司，Ni-NTA His·Bands亲和层析树脂购自Merck公司。

3.1酵母工程菌的发酵诱导表达

1)用YPD培养基于30℃220rpm过夜活化培养毕赤酵母工程菌；

2)取上述菌液转接于BMGY培养基，于30℃、220rpm培养该工程菌16-18h，至OD600＝2.0～6.0；

3)室温下1500g离心5min，收集菌体，用10mL的BMMY培养基重悬菌体，使OD600＝1.0左右，将所得的菌液置于100mL无菌三角瓶中，于28℃220rpm下继续振荡培养；

4)每24小时向培养基中添加甲醇至终浓度为1％进行诱导培养；

5)发酵培养结束后，4℃下3000×g离心20min，收集上清；

3.2Strep-Tactin亲和纯化

6)上清中加入5～7倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的20％；

7)上述浓缩液使用Strep结合缓冲液4℃透析过夜；

8)以1mL上述透析液加100μl Strep-Tactin树脂(IBA)悬液轻柔混匀，结合30min；

9)将上述混合液缓慢加入纯化柱中，再将穿流液加入以蠕动泵慢速泵入纯化柱中结合一次；

10)用20倍体积的1×Strep-Tactin漂洗缓冲液漂洗树脂，重复一次；

11)用20倍体积1×Strep-Tactin洗脱缓冲液将树脂重悬，洗脱目的蛋白，15000×g离心10秒，小心将上清转移至干净小管中，再重复2次；

3.3Ni-NTA His·Bands亲和纯化

12)取上述洗脱液，加入1～3倍体积的PBS，再经超滤浓缩至初始体积的20％；

13)取上述浓缩液每1ml中加入100μl 1×Ni-NTA结合缓冲液，4℃充分混合；

14)取上述混合液每1ml中加入20μl 50％Ni-NTA His·Bands树脂(Merck)悬液轻柔混匀，结合30min；

15)15000×g离心10秒沉淀树脂，弃上清；

16)以10倍体积1×Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗树脂，15000×g离心10秒，小心吸去上清，再重复一次；

17)用20倍体1×Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，15000×g离心10秒，小心将上清转移至干净小管中，再重复2次；

18)将得到的洗脱液经脱盐、浓缩，所制得的浓缩液经真空冷冻干燥制得酵母重组胶原蛋白；

19)取浓缩液倒入玻璃培养皿中，放入-20℃冰箱中冷冻过夜，然后转入预冷至-45℃的冷冻干燥机中，开启真空泵，维持48h；

20)冻干结束后，小心打开放气阀，直至内外气压平衡。取出培养皿，得到白色酵母重组人源Ⅱ型胶原蛋白固体海绵。

实施例4MTT法测重组人源Ⅱ型胶原蛋白促进人软骨细胞增殖

4.1人软骨细胞的解冻、培养、传代

1)取液氮中冻存P3代之前的人软骨细胞(购买自西安悦蔻霖智生物科技有限公司)，37℃中迅速解冻后，加入至10mL 37℃预热的完全培养液中，室温1000rpm离心7min，弃上清，完全培养液重悬后，取微量重悬液，台盼蓝染色后，血球计数板计数。

2)以8×10⁵个/瓶的密度接种于25cm²塑料培养培养瓶中，将培养瓶放入培养箱，37℃、5％CO₂、95％湿度中进行培养。每3天用PBS清洗后更换培养液。

3)待软骨细胞长满培养瓶85％以上，弃去原培养液，PBS清洗3次，加2-3ml 0.25％胰酶(以刚好覆盖培养瓶底为宜)消化2min，镜下观察贴壁细胞变圆脱落(过程中可以轻轻晃动培养瓶)，待细胞大部分脱落后加入含胎牛血清的培养液终止消化。将消化下的细胞悬液用培养液混匀后移入15ml离心管，室温1000rpm离心7min，弃上清，加入完全培养液制成细胞悬液，计数细胞，约按1:2接种于两个25cm²培养瓶中，继续培养箱培养，软骨细胞长满85％以上时再次胰酶消化传代。

4.2胶原蛋白培养板的制备

1)将去离子水加入冰乙酸中调节至pH 3.0，取纯化冻干后的重组人源Ⅱ型胶原蛋白，以5mg/mL溶解重组人源Ⅱ型胶原蛋白，稀释100倍后使用供包被使用。

2)以每8μg/cm²的包被量向96孔细胞培养板内加入Ⅱ型胶原蛋白包被液，将加入胶原蛋白的培养板37℃或者室温放置数小时、2～8℃过夜使胶原蛋白结合。

3)移去培养板多余胶原蛋白过夜干燥。

4)紫外光下过夜照射使胶原蛋白交联。

4.3细胞增殖与MTT检测

1)取P3代的人软骨细胞，消化、离心、重悬后，以2×10³/孔的密度接种于4.2包被的96孔细胞培养板中；同时接种于未进行胶原蛋白包被的96孔细胞培养板中。37℃、5％CO₂、95％湿度中进行培养。

2)根据软骨细胞生长速度，取2、4、6、8、10d的孔各3～4个，每孔加入配置好的MTT20μL，继续放入培养箱箱培养4小时。

3)小心吸弃培养液，每孔加入DMSO150ul，摇床震荡10min使结晶充分溶解，酶标仪检测570nm吸光度值。

4)分析结果，绘制细胞生长曲线，见图6。

结果显示：Ⅱ型胶原蛋白包被培养板中的软骨细胞增殖快于未包被的培养板；在培养第8天时，Ⅱ型胶原蛋白包被培养板中的软骨细胞增殖缓慢，进入平台期；至培养第10天时Ⅱ型胶原蛋白包被培养板中软骨细胞仍多于未包被的培养板，说明包被使用的Ⅱ型胶原蛋白有良好的生物学活性。

实施例5人软骨细胞分泌糖胺多糖的测定

5.1胶原蛋白培养皿的制备

与4.2方法类似，使用30mm细胞培养皿包被

5.2细胞接种

1)取P3代的人软骨细胞，消化、离心、重悬后，以1×10⁴/皿的密度接种于5.1包被的30mm细胞培养皿中；同时也接种于30mm细胞培养皿中作为对照。37℃、5％CO₂、95％湿度中进行培养。

2)培养10d后，去上清，使用GAG总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司生产)对实验孔及对照孔中的软骨细胞分泌的GAG做定量分析。

3)处理分析实验结果，见表1。

表1不同培养皿中人软骨细胞培养上清液中细胞分泌糖胺多糖的水平

组别	糖胺多糖(mg/L)
		普通培养组	1.27±1.22
重组人源Ⅱ型胶原蛋白包被培养皿	4.46±0.87<sup>a</sup>

注：与普通培养皿板比较，^aP<0.01，结果显示普通培养皿与Ⅱ型胶原蛋白包被培养皿相比，皿中软骨细胞分泌糖胺多糖最多差异极显著。

结果显示：重组人源Ⅱ型胶原蛋白包被培养板中软骨细胞分泌糖胺多糖显著高于未包被对照组(P<0.01，差异极显著)，说明包被培养板使用的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链有良好的生物学活性，能有效的延缓软骨细胞的去分化，维持细胞再分化的状态。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 江苏悦智生物医药有限公司

<120> 毕赤酵母生产重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3237

<212> DNA

<213> 自动生成人工序列(Artifical sequence)

<400> 1

tacgtagaat tctggagtca tcctcaattc gaaaaacaaa tggctggtgg attcgatgaa 60

aaggctggtg gagcccaatt aggtgttatg caaggtccta tgggtccaat gggtcctaga 120

ggtcctccag gtcccgccgg tgctcctgga ccacagggtt tccaaggaaa ccccggtgaa 180

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ggtccccagg gtaaagtggg tcccagtggt gccccaggtg aagatggaag acctggtcct 1260

cccggacccc aaggtgcaag aggtcagcct ggagtgatgg gatttcctgg acccaagggt 1320

gctaacggag aacctggaaa agctggtgag aaaggactgc ccggtgcccc aggtcttaga 1380

ggtttgccag gtaaagatgg agaaacagga gccgcaggac cacccggtcc agccggacca 1440

gcaggagaga gaggtgaaca aggagcacct ggtccaagtg gttttcaggg tcttccaggt 1500

ccccctggtc caccaggaga gggaggtaaa ccaggtgacc aaggtgtccc tggagaagca 1560

ggtgcacccg gtcttgtggg tccaagaggt gaaagaggat tccctggtga gagaggatct 1620

cccggagccc agggacttca aggtcctaga ggtctgccag gtacccctgg tacagacgga 1680

ccaaagggag catcaggacc cgctggacct cccggagccc aaggtcctcc aggtttacaa 1740

ggtatgcctg gtgaaagagg tgctgcaggt atagctggac caaaaggaga cagaggtgac 1800

gttggtgaga agggtcccga aggagcccct ggaaaagatg gtggaagagg attaacaggt 1860

cctataggac cacccggtcc agccggtgct aatggagaaa aaggagaagt aggtcctcca 1920

ggtccagcag gatctgcagg tgctagaggt gcccctggag agagaggtga aacaggacca 1980

cctggtccag ctggtttcgc tggtccccca ggagctgatg gacagcccgg tgcaaaaggt 2040

gaacaaggag aagccggaca gaagggagat gctggagccc ccggtccaca aggtccctca 2100

ggagcaccag gtcctcaagg tccaactggt gtgaccgggc caaagggtgc aagaggagca 2160

cagggacctc caggagcaac aggtttccca ggagctgctg gtagagtcgg tccacccgga 2220

tctaatggta accccggacc accaggacca cctggaccat ctggaaagga tggacccaaa 2280

ggagcaagag gagattcagg accacccgga agagcaggag aacctggatt acagggtccc 2340

gccggtccac caggagagaa aggagagccc ggagatgatg gtccctcagg tgcagaggga 2400

cccccaggac cccaaggtct ggcaggtcaa agaggtatag tgggtcttcc aggtcaaaga 2460

ggtgaaagag gatttccagg acttccaggt ccttcaggtg aacccggtaa acagggagcc 2520

cccggagcct caggtgacag aggtcctcca ggaccagtag gacccccagg tttaaccgga 2580

ccagcaggtg agccaggaag agaaggttct cctggagccg atggacctcc aggaagagac 2640

ggtgcagctg gtgttaaggg tgacagaggt gaaactggag ccgtaggagc cccaggtgcc 2700

cccggaccac ccggatcacc cggacctgca ggtcctactg gtaaacaagg agatagagga 2760

gaagccggtg cccagggtcc tatgggtcct tctggtcctg caggagcaag aggtatacaa 2820

ggtccacagg gtcccagagg tgacaagggt gaagcaggag aacccggtga gagaggtctg 2880

aagggtcata gaggattcac cgggttacag ggtttgccag gaccccctgg accaagtggt 2940

gaccagggtg catccggtcc agcaggtcct tctggaccaa gaggtcctcc cggtccagtt 3000

ggtccatcag gtaaagacgg agccaacggt atcccaggtc ccatcggtcc tccaggtcct 3060

agaggaagaa gtggagagac tggtcctgct ggacctcctg gaaaccctgg tcctccagga 3120

cctccaggtc ctccaggtcc cggaatagat atgtccgctt tcgctggatt gggaccaaga 3180

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<210> 2

<211> 1078

<212> PRT

<213> 自动生成人工序列(Artifical sequence)

<400> 2

Tyr Val Glu Phe Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Met Ala Gly

1 5 10 15

Gly Phe Asp Glu Lys Ala Gly Gly Ala Gln Leu Gly Val Met Gln Gly

20 25 30

Pro Met Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala

35 40 45

Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Asn Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro

50 55 60

Gly Val Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

65 70 75 80

Lys Pro Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Lys Ala Gly Glu

85 90 95

Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro

100 105 110

Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly His Arg Gly Tyr Pro Gly Leu Asp Gly

115 120 125

Ala Lys Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Ser

130 135 140

Pro Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro

145 150 155 160

Gly Glu Arg Gly Arg Thr Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Ala Arg Gly

165 170 175

Asn Asp Gly Gln Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro

180 185 190

Ala Gly Gly Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Glu Ala

195 200 205

Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Pro Glu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Gly

210 215 220

Glu Pro Gly Thr Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ser Gly Asn

225 230 235 240

Pro Gly Thr Asp Gly Ile Pro Gly Ala Lys Gly Ser Ala Gly Ala Pro

245 250 255

Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly

260 265 270

Pro Gln Gly Ala Thr Gly Pro Leu Gly Pro Lys Gly Gln Thr Gly Glu

275 280 285

Pro Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro

290 295 300

Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly

305 310 315 320

Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Gly Val Gly Pro Ile Gly Pro

325 330 335

Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Asn Arg Gly Phe Pro Gly Gln Asp

340 345 350

Gly Leu Ala Gly Pro Lys Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ser Gly

355 360 365

Leu Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asn Gly Asp Pro Gly Arg Pro Gly Glu

370 375 380

Pro Gly Leu Pro Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Asp Ala

385 390 395 400

Gly Pro Gln Gly Lys Val Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly Glu Asp Gly

405 410 415

Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Gln Pro Gly Val

420 425 430

Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Asn Gly Glu Pro Gly Lys Ala

435 440 445

Gly Glu Lys Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Leu Pro Gly

450 455 460

Lys Asp Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro

465 470 475 480

Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Phe Gln

485 490 495

Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Glu Gly Gly Lys Pro Gly

500 505 510

Asp Gln Gly Val Pro Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Leu Val Gly Pro

515 520 525

Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Ala Gln

530 535 540

Gly Leu Gln Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly Thr Asp Gly

545 550 555 560

Pro Lys Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Gln Gly Pro

565 570 575

Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Ala

580 585 590

Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Val Gly Glu Lys Gly Pro Glu Gly

595 600 605

Ala Pro Gly Lys Asp Gly Gly Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro

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Pro Gly Pro Ala Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Glu Val Gly Pro Pro

625 630 635 640

Gly Pro Ala Gly Ser Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly

645 650 655

Glu Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala

660 665 670

Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Gln Gly Glu Ala Gly Gln Lys

675 680 685

Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly

690 695 700

Pro Gln Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly Ala

705 710 715 720

Gln Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val

725 730 735

Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

740 745 750

Pro Ser Gly Lys Asp Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly Asp Ser Gly Pro

755 760 765

Pro Gly Arg Ala Gly Glu Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro

770 775 780

Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Asp Gly Pro Ser Gly Ala Glu Gly

785 790 795 800

Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Gly Leu

805 810 815

Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser

820 825 830

Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Ala Pro Gly Ala Ser Gly Asp Arg Gly

835 840 845

Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Leu Thr Gly Pro Ala Gly Glu

850 855 860

Pro Gly Arg Glu Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp

865 870 875 880

Gly Ala Ala Gly Val Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Ala Val Gly

885 890 895

Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro

900 905 910

Thr Gly Lys Gln Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Met

915 920 925

Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly

930 935 940

Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Gly Leu

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Lys Gly His Arg Gly Phe Thr Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Pro Pro

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Gly Pro Ser Gly Asp Gln Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly

980 985 990

Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Lys Asp Gly Ala

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Asn Gly Ile Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Ser

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Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly

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Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gly Ile Asp Met Ser Ala Phe Ala Gly

1045 1050 1055

Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly Pro Asp Pro Leu Gln Tyr Met Arg Ala

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His His His His His His

1075

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<211> 55

<212> DNA

<213> 自动生成人工序列(Artifical sequence)

<400> 3

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<212> DNA

<213> 自动生成人工序列(Artifical sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 12495

<212> DNA

<213> 自动生成人工序列(Artifical sequence)

<400> 5

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

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acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 1080

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cctggtgtta agggtgaatc aggaagtccc ggtgaaaatg gaagtcccgg tccaatgggt 1680

ccaagaggac tgccaggtga gagaggaaga accggaccag ctggtgctgc aggtgctaga 1740

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gcaagaggta tacaaggtcc acagggtccc agaggtgaca agggtgaagc aggagaaccc 4080

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cctggtcctc caggacctcc aggtcctcca ggtcccggaa tagatatgtc cgctttcgct 4380

ggattgggac caagagagaa aggtcctgac cctcttcaat atatgagagc acaccatcac 4440

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tggaaggttg cagtgttaac tccgctgtat tgacgggcat atccgtacgt tggcaaagtg 5400

tggttggtac cggaggagta atctccacaa ctctctggag agtaggcacc aacaaacaca 5460

gatccagcgt gttgtacttg atcaacataa gaagaagcat tctcgatttg caggatcaag 5520

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atgacttctg gggtaagggt accatccttc ttaggtggag atgcaaaaac aatttctttg 6060

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atcaggttgt gcagctggtc agcagcatag ggaaacacgg cttttcctac caaactcaag 7680

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cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg aatcgcccca 7920

tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag 7980

ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg 8040

atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg tcccgtcaag 8100

tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat 8160

cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa 8220

aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat 8280

cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct 8340

cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga 8400

atggcaaaag cttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt 8460

catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac 8520

gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca 8580

ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct 8640

ggaatgctgt tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga 8700

taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct 8760

catctgtaac atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat 8820

cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc 8880

atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg 8940

tttcccgttg aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt 9000

ttattgttca tgatgatata tttttatctt gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca 9060

caacgtggct ttcccccccc cccctgcagg tcggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 9120

ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 9180

tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg 9240

ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac 9300

tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagtatct atgattggaa 9360

gtatgggaat ggtgataccc gcattcttca gtgtcttgag gtctcctatc agattatgcc 9420

caactaaagc aaccggagga ggagatttca tggtaaattt ctctgacttt tggtcatcag 9480

tagactcgaa ctgtgagact atctcggtta tgacagcaga aatgtccttc ttggagacag 9540

taaatgaagt cccaccaata aagaaatcct tgttatcagg aacaaacttc ttgtttcgaa 9600

ctttttcggt gccttgaact ataaaatgta gagtggatat gtcgggtagg aatggagcgg 9660

gcaaatgctt accttctgga ccttcaagag gtatgtaggg tttgtagata ctgatgccaa 9720

cttcagtgac aacgttgcta tttcgttcaa accattccga atccagagaa atcaaagttg 9780

tttgtctact attgatccaa gccagtgcgg tcttgaaact gacaatagtg tgctcgtgtt 9840

ttgaggtcat ctttgtatga ataaatctag tctttgatct aaataatctt gacgagccaa 9900

ggcgataaat acccaaatct aaaactcttt taaaacgtta aaaggacaag tatgtctgcc 9960

tgtattaaac cccaaatcag ctcgtagtct gatcctcatc aacttgaggg gcactatctt 10020

gttttagaga aatttgcgga gatgcgatat cgagaaaaag gtacgctgat tttaaacgtg 10080

aaatttatct caagatctct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 10140

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 10200

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 10260

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 10320

gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 10380

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 10440

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 10500

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 10560

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 10620

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 10680

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 10740

ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 10800

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 10860

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 10920

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 10980

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 11040

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 11100

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 11160

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 11220

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 11280

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 11340

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 11400

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 11460

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 11520

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 11580

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 11640

gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 11700

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 11760

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 11820

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 11880

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 11940

acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 12000

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 12060

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 12120

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 12180

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 12240

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 12300

cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 12360

aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattaattc tcatgtttga cagcttatca 12420

tcgataagct gactcatgtt ggtattgtga aatagacgca gatcgggaac actgaaaaat 12480

aacagttatt attcg 12495

Claims

1.一种编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链，其特征在于，所述重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链是由权利要求1所述的核苷酸序列编码表达获得。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1所述的核苷酸序列。

4.一种重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种的基因组中整合有如权利要求1所述的核苷酸序列，所述重组毕赤酵母菌种基于巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris经过基因工程技术手段构建获得。

5.如权利要求4所述的重组毕赤酵母菌种，其特征在于所述重组毕赤酵母菌种由下述步骤获得：

(2)设计PCR引物，扩增获取编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的DNA片断；

(3)构建重组表达载体；

(4)将制备得到重组表达载体线性化后导入至毕赤酵母中，经筛选获得阳性克隆，得到重组毕赤酵母菌种。

6.一种生产如权利要求2所述的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)培养如权利要求4所述重组毕赤酵母菌种，表达重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链；

(2)分离纯化步骤(1)中所表达的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链：分别使用Strep-tagⅡ标签亲和层析介质、6×His标签的亲和层析介质进行双亲各纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中分离纯化为先采用Strep-tagⅡ标签的亲和层析介质吸附重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链，再用6×His标签的亲和层析介质吸附重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述表达载体构建时的PCR引物如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

9.如权利要求3所述的表达载体在制备基因工程酵母中的应用。

10.如权利要求4所述重组毕赤酵母菌种在制备重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的应用。