CN101921786A

CN101921786A - 珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

Info

Publication number: CN101921786A
Application number: CN 201010237912
Authority: CN
Inventors: 文春根; 胡宝庆; 范小勇; 徐欢欢
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2010-12-22

Abstract

一种珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法。是通过提取一种育珠蚌褶纹冠蚌的总RNA，用反转录及PCR技术获得褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶基因的全长cDNA，将cDNA克隆到pET30载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组工程菌。将工程菌在LB培养基中高密度培养，用IPTG诱导，同时在培养基中加一定浓度的Cu²⁺和Zn²⁺后，重组基因得到大量表达。产物经亲和层析柱，得到纯化的重组超氧化物歧化酶。该发明准确获得含有155个氨基酸残基的成熟蛋白序列，该酶具有抗氧化、抗衰老作用。本方法获得的菌体产量高，表达量高，活性高，产物对酸碱、温度、变性剂均很稳定，对乙醇损伤的LO-2肝细胞具有明显的保护作用，且易纯化，具有广阔的工业应用前景。

Description

珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种珍珠蚌褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶基因工程菌的构建及酶产物生产和纯化工艺，属于生物酶制备技术领域。

背景技术

随着现代生物科学的发展，科学家终于揭开了影响人类健康长寿之迷，自由基是导致人类各种疾病的原凶。同时也发现了清除体内自由基的酶一超氧化物歧化酶SOD。SOD是国际医学界公认的能清除体内自由基的活性酶。

超氧化物歧化酶(SOD)具有专一清除生物体内的超氧离子，平衡机体的氧自由基，保护人体细胞免受环境因素破坏，现代医学研究表明SOD酶抗衰老、抗辐射、抗疲劳、消炎，抑制肿瘤和癌细胞，提高机体免疫力，能有效降低血脂、胆固醇和血压，起到增强肝肾的功能，预防前列腺炎，调节女性生理周期，推迟更年期。SOD酶对糖尿病也有明显的恢复作用。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。

但目前商品化的SOD酶由于热稳定性差，非常容易失活，极大的影响其功能的正常发挥，市场需求受到极大制约。目前市场流通的SOD，大多是从动物血液中提取的，用于人类难以消除各种病毒及外源污染，并且欧盟已于1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD用于人类。目前日本、加拿大等国家也开始采用基因重组等新的生物工程技术来合成SOD。因此利用生物工程生产新一代高稳定性，高耐热性的SOD酶是当前SOD酶开发最重要的途径。中国专利(CN1263158“重组超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌、产物制备方法”公开了一种重组超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌产物制备方法。其基因来自丝状兰藻-鱼腥藻的总DNA，克隆到pET32载体上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得工程菌。将工程菌高密度培养，用IPTG诱导后，基因得到大量表达。产物经DEAE-SephadexA-50柱层析，纯化产物为一种重组超氧化物歧化酶。

上述发明获得的是来自于鱼腥藻的含有199个氨基酸残基的成熟蛋白的SOD酶，而且在表达过程中没有加入一定浓度的CuSO₄和ZnCl₂，因此酶的比活不是太高，而且表达产物主要以包涵体形式存在，因此要获得有活性的酶产物需要一个比较繁琐的复性过程。。

发明内容：

本发明的目的，是针对现有技术的不足，利用分子克隆和基因重组技术，开发一种来自于褶纹冠蚌的SOD酶产品：通过分子克隆技术获得褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶(Cp-CuZnSOD)基因，经过与国际基因数据库(GeneBank)比对，发现该基因编码的SOD酶氨基酸序列与全球已知SOD酶基因同源性相比，是一个全新的SOD酶基因，编码155个氨基酸的成熟蛋白。利用该基因构建了一种基因工程菌，该工程菌产生的SOD酶活性高，性质稳定，具有很好的应用前景。

本发明的技术方案是：挑选健康的褶纹冠蚌，从蚌组织细胞或血细胞中提取总RNA。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit的方法合成cDNA。以第一链cDNA为模板，用一对表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAGGCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAA TTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3′进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对产物进行回收，将回收的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用内切酶Kpn I和EcoR I双酶切后用T4 DNA连接酶将Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并转化感受态大肠杆菌DH5a，用含卡那霉素的LB琼脂平板筛选阳性克隆，将测序验证后的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组表达菌。重组表达菌接种于LB培养基中37℃培养至对数生长期，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导。同时在培养基中同时加入一定浓度的Cu²⁺和Zn²⁺离子，转移至20℃-25℃下继续培养4-8小时，离心收集菌体。将收集的菌体超声波裂解后收集上清。将上清流过已经平衡好的(His)镍离子亲和层析预装柱，先用含50mmol/L-250mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，然后将洗脱液置于透析袋，PBS透析除去盐物质及咪唑，用聚乙二醇8000浓缩。得到纯化的浓缩重组褶纹冠蚌铜锌SOD酶。

专利CN1263158与本发明的差异对比表：

专利CN1263158 本发明

基因来源鱼腥藻褶纹冠蚌

表达质粒 pET32 pET30

重组菌的筛选氨苄青霉素LB培养基卡那霉素LB培养基

诱导剂 IPTG IPTG

诱导温度 37℃ 20-25℃

诱导条件培养基中未添加Cu²⁺离子和Zn²⁺ 培养基中添加一定浓度的Cu²⁺

离子离子和Zn²⁺离子

产物状态包涵体，需复性产物才具有活可溶蛋白，无需复性

性

产物纯化方式 DEAE-SephadexA-50柱层析镍离子亲和柱层析

产物大小编码199个氨基酸的成熟蛋白编码155个氨基酸的成熟蛋白

产物活性一般较高

SOD酶技术指标：重组SOD酶的比活5368U，纯化产物在pH5.0～10.0、温度10～60℃范围内性质稳定，并司耐受2～8mol·L^-1的尿素和1％～6％的十二烷基硫酸钠(SDS)。

本发明的有益效果是：制备工艺流程简便，易于组织生产，SOD产量高、活性高、成本低，产品适用于医疗及水产领域。

附图说明：

附图为珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法工艺流程方框图

具体实施方式：

实施例1

挑选健康的褶纹冠蚌，从蚌闭壳肌血窦中抽取血液10mL；4℃、3600rpm离心5min；弃上清，获得细胞沉淀用于RNA提取。采用Invitrogen公司的Trizol试剂提取血细胞中的总RNA，取上面获得的细胞沉淀，加入1mL的Trizol，反复吹打使Trizol充分裂解血细胞。室温静置10min，于4℃、12000×g离心10min；取上清，加入0.2mL氯仿，剧烈摇动15s，室温静置3min，4℃、12000×g离心15min；取上清，转移到干净的离心管中，加入0.5mL的异丙醇，室温静置10min，于4℃、10000×g离心10min。沉淀用75％乙醇洗涤后，-35℃保存在100％乙醇中，备用。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit的方法合成cDNA。取总RNA 5μg，加入CDS引物和Smart II引物各1μL，70℃保温3min后，冰上速冷2min；然后在终体积为20μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/LTris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)4μL、DTT(20mmol/L)2μL、dNTP(10mmol/L)1μL和逆转录酶Primerscript II transcriptase 1μL，42℃保温1h合成第一链cDNA，合成反应在PCR扩增仪中完成。以第一链cDNA为模板，用表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAA TTC TCA ATC CAATTT TGA AAT TCC-3′进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对产物进行回收，将回收的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切后用T4 DNA连接酶将Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并转化感受态大肠杆菌DH5a，涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜；PCR鉴定阳性克隆后接种阳性克隆抽提重组质粒，用Kpn I和EcoR I双酶切并琼脂糖电泳作初步鉴定，然后交测序公司测定序列以验证重组质粒pET30-CpSOD。将pET30-CpSOD转化大肠杆菌BL21(DE3)，PCR方法鉴定阳性菌落，获得重组表达菌。用含重组质粒pET30-CpSOD菌体接种至少量LB(含卡那霉素50μg/mL，LBK)培养基中37℃、220r/min培养过夜，培养产物作为菌种，次日按1∶1000比例转接至大量LBK，于37℃振荡培养至对数生长期，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L。并且在培养基中同时加入0.5mmol/L的Cu²⁺离子和0.1mmol/L的Zn²⁺离子，在20℃下继续培养8小时，12,000g离心5min，收集菌体。将收集的菌体用PBS(20mmol/L磷酸盐，0.5mol/L氯化钠，pH 7.4)缓冲液重悬，超声裂菌(功率300W，破5s停15s，超声2min，冰浴)后收集上清。将上清流过已经平衡好的(His)镍离子亲和层析预装柱，先用含50mmol/L咪唑的洗脱Buffer(50mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱杂蛋白，后用含250mmol/L咪唑的洗脱Buffer(250mM咪唑，50mmol/LT ris-HCl，100mmol/LNaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱目的蛋白。将洗脱液置于透析袋，PBS透析除去盐物质及咪唑，用聚乙二醇8000浓缩。得到纯化的浓缩重组褶纹冠蚌铜锌SOD酶。

实施例2

挑选健康的褶纹冠蚌，从蚌闭壳肌血窦中抽取血液10mL；4℃、3600rpm离心5min；弃上清，获得细胞沉淀用于RNA提取。采用Invitrogen公司的Trizol试剂提取血细胞中的总RNA，取上面获得的细胞沉淀，加入1mL的Trizol，反复吹打使Trizol充分裂解血细胞。室温静置10min，于4℃、12000×g离心10min；取上清，加入0.2mL氯仿，剧烈摇动15s，室温静置3min，4℃、12000×g离心15min；取上清，转移到干净的离心管中，加入0.5mL的异丙醇，室温静置10min，于4℃、10000×g离心10min。沉淀用75％乙醇洗涤后，-35℃保存在100％乙醇中，备用。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit的方法合成cDNA。取总RNA 5μg，加入CDS引物和Smart II引物各1μL，70℃保温3min后，冰上速冷2min；然后在终体积为20μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/LKCl；30mmol/L MgCl2)4μL、DTT(20mmol/L)2μL、dNTP(10mmol/L)1μL和逆转录酶Primerscript II transcriptase 1μL，42℃保温1h合成第一链cDNA，合成反应在PCR扩增仪中完成。以第一链cDNA为模板，用表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAA TTC TCA ATC CAATTT TGA AAT TCC-3′进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对产物进行回收，将回收的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切后用T4DNA连接酶将Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并转化感受态大肠杆菌DH5a，涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜；PCR鉴定阳性克隆后接种阳性克隆抽提重组质粒，用Kpn I和EcoR I双酶切并琼脂糖电泳作初步鉴定，然后交测序公司测定序列以验证重组质粒pET30-CpSOD。将pET30-CpSOD转化大肠杆菌BL21(DE3)，PCR方法鉴定阳性菌落，获得重组表达菌。用含重组质粒pET30-CpSOD菌体接种至少量LB(含卡那霉素50μg/mL，LBK)培养基中37℃、220r/min培养过夜，培养产物作为菌种，次日按1∶1000比例转接至大量LBK，于37℃振荡培养至对数生长期，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L。并且在培养基中同时加入0.6mmol/L的Cu²⁺离子和0.15mmol/L的Zn²⁺离子，在25℃下继续培养8小时，12,000g离心5min，收集菌体。将收集的菌体用PBS(20mmol/L磷酸盐，0.5mol/L氯化钠，pH 7.4)缓冲液重悬，超声裂菌(功率300W，破5s停15s，超声2min，冰浴)后收集上清。将上清流过已经平衡好的(His)镍离子亲和层析预装柱，先用含50mmol/L咪唑的洗脱Buffer(50mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱杂蛋白，后用含200mmol/L咪唑的洗脱Buffer(250mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/LNaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱目的蛋白。将洗脱液置于透析袋，PBS透析除去盐物质及咪唑，用聚乙二醇8000浓缩。得到纯化的浓缩重组褶纹冠蚌铜锌SOD酶。

实施例3

挑选健康的褶纹冠蚌，从蚌闭壳肌血窦中抽取血液10mL；4℃、3600rpm离心5min；弃上清，获得细胞沉淀用于RNA提取。采用Invitrogen公司的Trizol试剂提取血细胞中的总RNA，取上面获得的细胞沉淀，加入1mL的Trizol，反复吹打使Trizol充分裂解血细胞。室温静置10min，于4℃、12000×g离心10min；取上清，加入0.2mL氯仿，剧烈摇动15s，室温静置3min，4℃、12000×g离心15min；取上清，转移到干净的离心管中，加入0.5mL的异丙醇，室温静置10min，于4℃、10000×g离心10min。沉淀用75％乙醇洗涤后，-35℃保存在100％乙醇中，备用。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit的方法合成cDNA。取总RNA 5μg，加入CDS引物和Smart II引物各1μL，70℃保温3min后，冰上速冷2min；然后在终体积为20μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/LTris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)4μL、DTT(20mmol/L)2μL、dNTP(10mmol/L)1μL和逆转录酶Primerscript II transcriptase 1μL，42℃保温1h合成第一链cDNA，合成反应在PCR扩增仪中完成。以第一链cDNA为模板，用表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAA TTC TCA ATC CAATTT TGA AAT TCC-3′进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对产物进行回收，将回收的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切后用T4 DNA连接酶将Cp-icCuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并转化感受态大肠杆菌DH5a，涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜；PCR鉴定阳性克隆后接种阳性克隆抽提重组质粒，用Kpn I和EcoR I双酶切并琼脂糖电泳作初步鉴定，然后交测序公司测定序列以验证重组质粒pET30-CpSOD。将pET30-CpSOD转化大肠杆菌BL21(DE3)，PCR方法鉴定阳性菌落，获得重组表达菌。用含重组质粒pET30-CpSOD菌体接种至少量LB(含卡那霉素50μg/mL，LBK)培养基中37℃、220r/min培养过夜，培养产物作为菌种，次日按1∶1000比例转接至大量LBK，于37℃振荡培养至对数生长期，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L。并且在培养基中同时加入0.8mmol/L的Cu²⁺离子和0.2mmol/L的Zn²⁺离子，在20℃下继续培养4小时，12,000g离心5min，收集菌体。将收集的菌体用PBS(20mmol/L磷酸盐，0.5mol/L氯化钠，pH 7.4)缓冲液重悬，超声裂菌(功率300W，破5s停15s，超声2min，冰浴)后收集上清。将上清流过已经平衡好的(His)镍离子亲和层析预装柱，先用含50mmol/L咪唑的洗脱Buffer(50mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱杂蛋白，后用含250mmol/L咪唑的洗脱Buffer(250mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/LNaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱目的蛋白。将洗脱液置于透析袋，PBS透析除去盐物质及咪唑，用聚乙二醇8000浓缩。得到纯化的浓缩重组褶纹冠蚌铜锌SOD酶。

实施例4

取健康褶纹冠蚌蚌肝胰腺0.1g，加液氮碾磨，将碾磨碎的组织转移至1.5ml EP管中，加入Trizol试剂使细胞充分裂解，静置5min，4℃、12000×g离心10min；取上清，加入0.25mL氯仿，剧烈摇动15s，室温静置2min，4℃、12000×g离心10min；取上清，转移到干净的EP管中，加入0.5mL的异丙醇，室温静置10min，4℃、10000×g离心10min。沉淀用75％乙醇洗涤，-20℃保存在100％乙醇中备用。取上述总RNA 5μg，加入CDS引物和Smart II引物各1μL，70℃保温3min后，冰上速冷2min；然后在终体积为20μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)4μL、DTT(20mmol/L)2μL、dNTP(10mmol/L)1μL和逆转录酶Primerscript II transcriptase 1μL，42℃保温1h合成第一链cDNA，合成反应在PCR扩增仪中完成。以第一链cDNA为模板，用表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAGGCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAA TTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3′进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对产物进行回收，将回收的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切后用T4 DNA连接酶将Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并转化感受态大肠杆菌DH5a，涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜；PCR鉴定阳性克隆后接种阳性克隆抽提重组质粒，用Kpn I和EcoR I双酶切并琼脂糖电泳作初步鉴定，然后交测序公司测定序列以验证重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，PCR方法鉴定阳性菌落，获得重组表达菌。用含重组质粒pET30-CpSOD菌体接种至少量LB(含卡那霉素50μg/mL，LBK)培养基中37℃、220r/min培养过夜，培养产物作为菌种，次日按1∶1000比例转接至大量LBK，于37℃振荡培养至对数生长期，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L。并且在培养基中同时加入0.6mmol/L的Cu²⁺离子和0.2mmol/L的Zn²⁺离子，在25℃下继续培养4小时，12,000g离心5min，收集菌体。将收集的菌体用PBS(20mmol/L磷酸盐，0.5mol/L氯化钠，pH 7.4)缓冲液重悬，超声裂菌(功率300W，破5s停15s，超声2min，冰浴)后收集上清。将上清流过已经平衡好的(His)镍离子亲和层析预装柱，先用含50mmol/L咪唑的洗脱Buffer(50mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱杂蛋白，后用含250mmol/L咪唑的洗脱Buffer(250mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱目的蛋白。将洗脱液置于透析袋，PBS透析除去盐物质及咪唑，用聚乙二醇8000浓缩。得到纯化的浓缩重组褶纹冠蚌铜锌SOD酶。

实施例5

取健康褶纹冠蚌蚌肝胰腺0.1g，加液氮碾磨，将碾磨碎的组织转移至1.5ml EP管中，加入Trizol试剂使细胞充分裂解，静置5min，4℃、12000×g离心10min；取上清，加入0.25mL氯仿，剧烈摇动15s，室温静置2min，4℃、12000×g离心10min；取上清，转移到干净的EP管中，加入0.5mL的异丙醇，室温静置10min，4℃、10000×g离心10min。沉淀用75％乙醇洗涤，-20℃保存在100％乙醇中备用。取上述总RNA 5μg，加入CDS引物和Smart II引物各1μL，70℃保温3min后，冰上速冷2min；然后在终体积为20μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)4μL、DTT(20mmol/L)2μL、dNTP(10mmol/L)1μL和逆转录酶Primerscript II transcriptase 1μL，42℃保温1h合成第一链cDNA，合成反应在PCR扩增仪中完成。以第一链cDNA为模板，用表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAGGCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAA TTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3′进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对产物进行回收，将回收的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切后用T4 DNA连接酶将Cp-icCuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并转化感受态大肠杆菌DH5a，涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜；PCR鉴定阳性克隆后接种阳性克隆抽提重组质粒，用Kpn I和EcoR I双酶切并琼脂糖电泳作初步鉴定，然后交测序公司测定序列以验证重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，PCR方法鉴定阳性菌落，获得重组表达菌。用含重组质粒pET30-CpSOD菌体接种至少量LB(含卡那霉素50μg/mL，LBK)培养基中37℃、220r/min培养过夜，培养产物作为菌种，次日按1∶1000比例转接至大量LBK，于37℃振荡培养至对数生长期，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L。并且在培养基中同时加入0.4mmol/L的Cu²⁺离子和0.1mmol/L的Zn²⁺离子，在25℃下继续培养6小时，12,000g离心5min，收集菌体。将收集的菌体用PBS(20mmol/L磷酸盐，0.5mol/L氯化钠，pH 7.4)缓冲液重悬，超声裂菌(功率300W，破5s停15s，超声2min，冰浴)后收集上清。将上清流过已经平衡好的(His)镍离子亲和层析预装柱，先用含50mmol/L咪唑的洗脱Buffer(50mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱杂蛋白，后用含200mmol/L咪唑的洗脱Buffer(250mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0)洗脱目的蛋白。将洗脱液置于透析袋，PBS透析除去盐物质及咪唑，用聚乙二醇8000浓缩。得到纯化的浓缩重组褶纹冠蚌铜锌SOD酶。

Claims

1.一种珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，包括从生物组织或血细胞中提取总RNA，克隆铜锌超氧化物歧化酶基因，将酶基因与原核表达质粒连接，转化大肠杆菌，通过筛选得到工程菌，将工程菌高密度培养，通过诱导，纯化得到铜锌超氧化物歧化酶，其特征在于：

(1)从健康的褶纹冠蚌组织或血细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后用表达引物SODFb：5′-AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G-3′，SODRb：5′-GGA GAATTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3′对铜锌超氧化物歧化酶基因进行PCR扩增；

(2)选用PET30原核表达质粒与目的基因连接；

(3)用卡那霉素LB培养基对重组菌进行筛选；

(4)在诱导过程中，培养基内添加Cu²⁺离子和Zn²⁺离子，诱导温度为20℃-25℃；

(5)通过镍离子亲和柱层析对产物进行纯化；

(6)用聚乙二醇8000对蛋白进行浓缩。