CN106119322A - 一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺，首先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中加入丙酮酸钠，其中丙酮酸钠的加入量为0.01～10g/L。本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段加入丙酮酸钠，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺。
背景技术
胶原蛋白是动物体内一类重要的蛋白质，广泛分布于皮肤、软骨、血管等组织，参与细胞的迁移、分化和繁殖，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能起着重要的作用，在食品、饲料、美容、化妆品、医药等领域应用普遍。目前，胶原蛋白原料主要通过酸、碱、加热等物理化学方法处理如猪、牛等动物皮肤、骨骼等组织后分离纯化获得。但是，上述方法得到的胶原蛋白成分复杂，水溶性差，并且由于来自动物组织，存在病毒隐患，限制了胶原蛋白在医药方面的应用。
随着DNA重组技术的迅速发展，各种宿主细胞被选为基因工程菌用于表达胶原蛋白。与传统工艺相比，胶原蛋白的基因工程菌发酵工艺具有生产原料易得、环保、产品质量稳定等优点，但是也存在着发酵周期较长，生产效率较低等问题。中国专利201010602214.8公开了一种毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，采用巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris C13为菌种，重组胶原蛋白表达量为5g/L，发酵周期99小时，发酵水平为0.051g/L·h，发酵周期虽短，但蛋白表达量和发酵水平过低。中国专利201110327865.5构建了一种重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，基因工程菌经发酵培养得到重组人源胶原蛋白，发酵周期为136小时，蛋白表达量为16g/L，发酵水平为0.118g/L·h，蛋白表达量虽有提高，但是发酵周期过长，发酵水平较低。因此，进一步地缩短发酵时间，提高蛋白表达量，进而提高发酵水平，有利于胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺，通过在发酵过程中加入0.01g/L-10g/L的丙酮酸钠，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，缩短了发酵周期，提高了重组人源胶原蛋白的表达量，进一步提升了重组人源胶原蛋白的生产水平。
本发明的技术方案如下：
一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种 液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中加入丙酮酸钠，其中丙酮酸钠的加入量为0.01～10g/L。
本发明所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。
优选地，所述的丙酮酸钠的加入量为0.1g/L～1g/L。
优选的，所述的丙酮酸钠的加入方式为流加。
本发明所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。
本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.0～5.2，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
与现有技术相比，本发明的显著效果如下：本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段加入丙酮酸钠，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。
具体实施方式
在本发明的具体实施例中，采用的菌株为表达重组人源胶原蛋白的毕赤酵母，为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC NO.5021，保藏日期为2011年6月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明所述的PTM1溶液参照Invitrogen公司的操作手册，具体配方为：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4·7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
发酵培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入丙酮酸钠，加入量为0.01g/L发酵培养基。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.0g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.143g/L·h，与对照组相比提高23.3％。
实施例2
发酵培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入丙酮酸钠，加入量为10g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.8g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.150g/L·h，与对照组相比提高29.3％。
实施例3
发酵培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为216g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入丙酮酸钠，加入量为0.1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.8g/L，发酵周期113小时，发酵生产 水平为0.158g/L·h。与对照组相比提高36.2％。
实施例4
发酵培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为213g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加丙酮酸钠溶液至发酵结束，总加入量为0.1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.2g/L，发酵周期108小时，发酵生产水平为0.169g/L·h，与对照组相比提高45.3％。
实施例5
发酵培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加丙酮酸钠溶液至发酵结束，总加入量为1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.0g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.161g/L·h，与对照组相比提高38.8％。
实施例6
发酵培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加 甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入丙酮酸钠，加入量为1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.5g/L，发酵周期113小时，发酵生产水平为0.155g/L·h，与对照组相比提高33.6％。
实施例7
发酵培养基：85％H3PO4 6.6mL/L；CaSO4·2H2O 0.3g/L；K2SO4 4.5g/L；MgSO4·7H2O3.7g/L；KOH 1g/L；甘油10.0g/L；PTM1 0.435mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入丙酮酸钠，加入量为1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.1g/L，发酵周期113小时，发酵生产水平为0.151g/L·h，与对照组相比提高30.2％。
对比例
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为218g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵120h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为15.8g/L，发酵周期136小时，发酵生产水平为0.116g/L·h。
Claims (6)
1.一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中加入丙酮酸钠，其中丙酮酸钠的加入量为0.01～10g/L。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的丙酮酸钠的加入量为0.1g/L～1g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC No.5021。
4.根据权利要求1或2所述的发酵工艺，其特征在于，所述的丙酮酸钠的加入方式为流加。
5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的毕赤酵母发酵培养基的配方为85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。
6.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.0～5.2，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 214500 Jiangsu city of Taizhou province Jingjiang City Jingcheng Textile Road No. 18 Applicant after: JIANGSU JLAND BIOTECH Co.,Ltd. Address before: 214500 Jiangsu city of Taizhou province in the eastern suburbs of Jingjiang textile Village Road on the south side of Building 2 Applicant before: JIANGSU JLAND BIOTECH Co.,Ltd. |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yang Shulin Inventor after: Du Erfeng Inventor after: Huang Jianmin Inventor after: Gao Lihu Inventor after: Zhao Jianfeng Inventor after: Tao Hai Inventor after: Feng Liping Inventor after: Zhou Aimei Inventor before: Du Erfeng Inventor before: Huang Jianmin Inventor before: Gao Lihu Inventor before: Zhao Jianfeng Inventor before: Tao Hai Inventor before: Feng Liping Inventor before: Zhou Aimei Inventor before: Ji Le |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A fermentation process for improving the production level of recombinant human collagen Effective date of registration: 20200922 Granted publication date: 20191015 Pledgee: Jiangsu Jingjiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: JIANGSU JLAND BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006328 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20221107 Granted publication date: 20191015 Pledgee: Jiangsu Jingjiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: JIANGSU JLAND BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006328 |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230626 Address after: 311899 No. 69, Youyi North Road, Taozhu Street, Zhuji City, Shaoxing, Zhejiang Province Patentee after: Zhejiang Zhuji Juyuan Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 214500 No.18, Jingcheng Textile Road, Jingjiang City, Taizhou City, Jiangsu Province Patentee before: JIANGSU JLAND BIOTECH Co.,Ltd. |