CN105420320B - 胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法 - Google Patents

胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，属于蛋白工程技术领域，菌种的纯化与保藏、活化与扩培；摇瓶、种子罐的种子培养；发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；发酵液后处理后，得到胶原蛋白。本发明采用诱导剂、低温、高动力的的混合加大诱导模式，与用单一阶段添加诱导剂进行诱导相比，菌体对碳源甲醇有更好的适应过程，生物量得到了进一步的积累，循序渐进，逐渐加大诱导强度，目标蛋白的产量大量提高；与单一用温度诱导的方式相比，保证了目标胶原蛋白的正确折叠，同时提高动力条件满足了菌体在诱导表达阶段对溶氧的大量需求，提高了目标胶原蛋白的表达产量，同时又不会造成菌体中毒现象的发生。

Description

胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法
技术领域
本发明属于蛋白工程技术领域，具体涉及一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法。
背景技术
胶原蛋白又称胶原，是胞外基质中的基本蛋白成分，广泛分布于人体各个器官和组织，如皮肤，血管、骨骼和软骨等，尤其在人体的皮肤和结缔组织中，含有大量的胶原蛋白，皮肤细胞外基质中约70％-80％为胶原蛋白，其在人体的总含量约占人体蛋白质总量的25％-33％，这些蛋白质对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有非常重要的作用。胶原蛋白具有非常复杂的特殊超螺旋结构，由Gly-X-Pro为基本重复体构成左手螺旋，X为其他氨基酸残基，缺乏色氨酸，胶原分子呈纤维状，由三条肽链拧成，三条肽链均无链内氢键，仅受链间氢键支撑。胶原蛋白具有无毒、止血、易吸收、非抗原、生物相容性和可生物降解等特性，应用非常广泛，尤其在美容和医学领域，已成功应用于化妆品、矫形、保健、烧伤、创伤、组织修复、创面止血等方面，故胶原蛋白的生产是近年来生物和化学领域研究的热点。
胶原蛋白传统的生产方法是通过酸溶法、碱溶法、中性溶解法或者酶溶法从动物来源(猪、牛、驴、鱼等)的组织和器官，比如皮肤、软骨、骨骼等提取和纯化，但提取出来的胶原蛋白水溶性差、纯度低，并且存在着病毒反应和人体排异反应。为了解决这一难题，利用生物技术手段进行对微生物进行基因重组的改造成为了主流，目前胶原蛋白已成功的在多种宿主中得到了表达，主要有大肠杆菌、酵母菌等。但是由于细菌表达具有诸多弊端，比如内毒素、热源等安全问题，蛋白以包涵体的形式存在于细胞内，提取纯化困难，而在毕赤酵母中具有较高的分泌表达特性，目前在毕赤酵母表达过程中，诱导的模式是添加诱导剂甲醇，而甲醇对菌体具有一定的毒害作用，其量应该要严格准确的控制，量少诱导强度不够，蛋白产量低，量多会对菌体产生毒害作用，使一部分菌体细胞自溶死亡，从而给后期提取纯化带来很大的麻烦，故而蛋白表达量受到了诱导剂甲醇很大的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够克服甲醇对蛋白高效表达的限制，生产成本低，并适用于工业化大规模生产的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法。
本发明所使用的菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)SMD1168保藏编号：CGMCC NO.7189保藏时间为2013.01.29分类命名：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)SMD1168保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源，醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢，为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器—过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其他组分，由于醇氧化酶与氧分子的结合率低，因而毕赤酵母代偿性的产生大量的酶，而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。毕赤酵母经过快速生长阶段之后，菌体已经得到了大量的积累，满足了进行诱导表达的生物量条件，由于甘油是作为生长阶段的碳源，而诱导表达阶段所采用的唯一碳源和能源是甲醇，同时也是使菌体表达蛋白的诱导剂，所以涉及到碳源的代谢转换，故本发明采用分阶段诱导，使毕赤酵母更好的适应诱导剂甲醇。
本发明的目的是提供一种能够克服甲醇对蛋白高效表达的限制，生产成本低，并适用于工业化大规模生产的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法。
本发明胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，包括以下步骤：
(1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培；
(2)摇瓶、种子罐的种子培养；
(3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；
甲醇驯化过程为：
第一阶段加入甲醇，使发酵罐溶氧下降至16％-20％，维持时间3-4h，之后溶氧回升；第二阶段加入甲醇，使发酵罐内溶氧下降至15％-20％，维持时间2-3h；
初始诱导阶段过程为：
调节发酵罐内的温度为28℃，采用间歇式恒速流加甲醇，控制溶氧在18％-22％，设置搅拌转速为650rpm，流量为1L/(L·min)，罐压为0.05MPa并保持不变，待生物量达到240-260g/L时此阶段结束；
混合加大诱导阶段为：
调整发酵罐内温度为25℃，将通气流量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐压升高至0.07MPa-0.09MPa，加大甲醇的流加速率以维持18％-22％的溶氧，一直维持到发酵结束，菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L，此阶段结束；
(4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白。
所述甲醇驯化过程中第一阶段发酵罐内控制甲醇的浓度为0.3％，第二阶段发酵罐内控制甲醇的浓度为0.5％。
所述种子罐的种子培养基和发酵罐内菌体培养基为改良后的FBS培养基，其配方为：
所述初始诱导阶段采用间歇式恒速流加甲醇，流加速率是3.55-3.95ml/h/L。
所述混合加大诱导阶段甲醇的流加速率为9.0-9.30ml/h/L。
所述后处理包括离心去菌体、缓冲液抽提、盐析、离子交换、柱层析精制和冷冻干燥，细胞经离心后获得上清液，然后加入甲酸缓冲液进行抽提，盐析粗提，用离子交换树脂吸附以0.5mol/LNaCl、20mM Tris pH8.0洗脱后，再用金属螯合柱吸附、洗脱，收集蛋白冷冻干燥，即可获得胶原蛋白样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
(1)本发明采用巴斯德毕赤酵母基因工程菌表达人胶原蛋白，生长繁殖快，醇氧化酶基因的启动子具有强诱导性和启动性，与动物来源的产品相比无病毒隐患，与原核生物表达体系相比，其表达载体不是以游离质粒形式存在，而是整合到染色体上，菌株十分稳定，同时毕赤酵母为分泌表达，易于后期纯化，培养基大部分为无机盐，价格低廉，适合大规模发酵生产；
(2)本发明与用单一阶段添加诱导剂进行诱导相比，菌体对碳源甲醇有更好的适应过程，在此基础上，进入初始诱导阶段，兼顾生长与表达，生物量得到了进一步的积累，最终进入蛋白的大量表达阶段，即混合加大诱导阶段，循序渐进，逐渐加大诱导强度，在菌体很好的适应诱导剂的同时，目标蛋白的产量也得到了大量的提高；菌体未出现自溶，发酵液未大量出现泡沫；与单一用温度诱导的方式相比，保证了目标胶原蛋白的正确折叠，同时提高动力条件满足了菌体在诱导表达阶段对溶氧的大量需求，加大了诱导的强度，提高了目标胶原蛋白的表达产量，同时又不会造成菌体中毒现象的发生，最终使发酵单位提高了18％-20％，诱导剂利用率提高了7％-15％。
附图说明
图1为本发明不同诱导方式的结果比较图，坐标轴X上1，2，3分别代表单纯用诱导剂诱导、诱导剂加低温诱导，混合加大诱导；
图2为不同诱导方式甲醇利用率的比较图，坐标轴X上1，2，3分别代表单纯用诱导剂诱导、诱导剂加低温诱导，混合加大诱导。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
本发明胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，包括以下步骤：
(1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培；
(2)摇瓶、种子罐的种子培养；
(3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；
发酵罐内菌体培养：
配FBS培养基，校正pH电极，校正溶氧电极，灭菌，降温到30℃，注意水分蒸发损失。插入补料瓶：氨水瓶、消泡剂瓶。补料50％的甘油、甲醇；校正蠕动泵，精确计量进样体积；设置转速300rpm，空气通气量1.0L/(L·min)，温度为30℃，pH为5.0，温度自动控制；与氨水泵级联控制，并开始校正培养基pH；接种前，每升培养基加入4.35ml无菌PTM1(微量元素盐)；按照8％的接种量，将菌种从种子罐移入发酵罐，接入前需做镜检。随着菌体对甘油的消耗，待溶氧下降至18％-22％，提高搅拌转速为300rpm，使溶氧控制在20％-40％，待甘油耗尽，溶氧回升到100％以后，流加甘油速度11.8ml/h/L，维持溶氧在18％-22％，此时生物量逐渐积累，待生物量积累到细胞湿重应达到200g/L时，停止流加甘油，保持40min，然后进入甲醇驯化过程。
甲醇驯化阶段：
第一阶段在发酵罐中加入甲醇，使发酵罐内甲醇浓度为0.3％，随后溶氧会急剧下降，当下降至16％-20％，溶氧又会产生回升，回升至40％-45％，然后维持9min恒定，之后溶氧又继续下降，下降幅度为8％-12％，然后溶氧急剧的上升，此时说明第一次加入的甲醇已完全消耗殆尽，此阶段时长为3-4h；
第二阶段加入甲醇使发酵罐内甲醇浓度达到0.5％，溶氧立即下降至15％-20％，维持2h，然后溶氧立马回升，说明此阶段加入的甲醇已完全消耗殆尽，可进入初始诱导阶段。
初始诱导阶段：
此阶段首先调节发酵罐温度为28℃，流加甲醇，采用蠕动泵，蠕动速率为1/7，即每七秒周期内运转一秒，流加速率为3.55ml/h/L，以控制溶氧在18％-22％，设置转速为650rpm，通气流量为1L/(L·min)，罐压为0.05MPa并保持不变，此时，菌体生物量会不断增加，待生物量达到250g/L时，作为此阶段的结束，本阶段总诱导时长为20-25h，随后可进入混合加大诱导阶段。
混合加大诱导阶段：
此阶段调节发酵罐温度由28℃降为25℃，创造低温环境，调整通气量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐压升高至0.07MPa，为发酵提供高动力，此时溶氧升高，加大甲醇的流加速率至9.0ml/h/L以维持18％-22％的溶氧，一直维持到发酵结束，菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L作为发酵结束的标准，此阶段维持时间在40-50h，菌体湿重最终可达280g/L，蛋白产量可达3.3g/L。
(4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白；
后处理包括离心去菌体、缓冲液抽提、盐析、离子交换、柱层析精制和冷冻干燥，细胞经离心后获得上清液，然后加入甲酸缓冲液进行抽提，盐析粗提，用离子交换树脂吸附以0.5mol/LNaCl、20mM Tris pH 8.0洗脱后，再用金属螯合柱吸附、洗脱，收集蛋白冷冻干燥，即可获得胶原蛋白样品。
如附图1所示，混合加大诱导的蛋白产量达到了3.3g/L，而单一诱导剂诱导的蛋白产量为2.77g/L，提高了19.1％，而诱导剂加低温诱导蛋白产量最低，不足2.5g/L。
如附图2所示单纯诱导剂诱导、诱导剂加低温诱导和本发明的混和诱导的甲醇利用率分别为7.5×10-3L/(h.L)、6.1×10-3L/(h.L)和8.33×10-3L/(h.L)，混合诱导较传统的单纯诱导剂诱导甲醇的利用率提高了9.96％。
实施例2
本发明胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，包括以下步骤：
(1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培；
(2)摇瓶、种子罐的种子培养；
挑取单菌落接入摇瓶，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下培养24h，然后接入种子罐，接种量为3％，接种前，每升培养基加入4.35ml无菌PTM1(微量元素盐)；接入摇瓶发酵液，接入前需每瓶做镜检，温度为30℃，pH为5.0，设起始转速300rpm，空气通气量1.0L/(L·min)，罐压为0.05MPa，通气量为1.0L/(L·min)，每4h，无菌取样测OD600、湿重、镜检纯度，经过5-8h的迟缓期之后，菌体开始生长，溶氧开始下降，待溶氧下降至18％开始提高搅拌转速，每次提高50rpm，一直提高到650rpm，维持溶氧在20％，培养24h，生物量达到50g/L，移入发酵罐。
(3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；
发酵罐内菌体培养：
配FBS培养基，校正pH电极，校正溶氧电极，灭菌，降温到30℃，注意水分蒸发损失。插入补料瓶：氨水瓶、消泡剂瓶。补料50％的甘油、甲醇；校正蠕动泵，精确计量进样体积；设置转速300rpm，空气通气量1.0L/(L·min)，温度为30℃，pH为5.0，温度自动控制；与氨水泵级联控制，并开始校正培养基pH；接种前，每升培养基加入4.35ml无菌PTM1(微量元素盐)；按照8％的接种量，将菌种从种子罐移入发酵罐，接入前需做镜检。随着菌体对甘油的消耗，待溶氧下降至18％-22％，提高搅拌转速为600rpm，，使溶氧控制在20％-40％，待甘油耗尽，溶氧回升到100％以后，流加甘油速度12.9ml/h/L，维持溶氧在18％-22％，此时生物量逐渐积累，待生物量积累到细胞湿重应达到200g/L时，停止流加甘油，保持40min，然后进入甲醇驯化过程。
甲醇驯化阶段：
第一阶段在发酵罐中加入甲醇，使发酵罐内甲醇浓度为0.3％，随后溶氧会急剧下降，当下降至16％-20％，溶氧又会产生回升，回升至40％-45％，然后维持11min恒定，之后溶氧又继续下降，下降幅度为8％-12％，然后溶氧急剧的上升，此时说明第一次加入的甲醇已完全消耗殆尽，此阶段时长为3-4h；
第二阶段加入甲醇使发酵罐内甲醇浓度达到0.5％，溶氧立即下降至15％-20％，维持3h，然后溶氧立马回升，说明此阶段加入的甲醇已完全消耗殆尽，可进入初始诱导阶段。
初始诱导阶段：
此阶段首先调节发酵罐温度为28℃，流加甲醇，采用蠕动泵，蠕动速率为1/7，即每七秒周期内运转一秒，流加速率为3.95ml/h/L，以控制溶氧在18％-22％，设置转速为650rpm，通气流量为1L/(L·min)，罐压为0.05MPa并保持不变，此时，菌体生物量会不断增加，待生物量达到250g/L时，作为此阶段的结束，本阶段总诱导时长为20-25h，随后可进入混合加大诱导阶段。
混合加大诱导阶段：
此阶段调节发酵罐温度由28℃降为25℃，创造低温环境，调整通气量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐压升高至0.070.09MPa，为发酵提供高动力，此时溶氧升高，加大甲醇的流加速率至9.30ml/h/L以维持18％-22％的溶氧，一直维持到发酵结束，菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L作为发酵结束的标准，此阶段维持时间在40-50h，菌体湿重最终可达270g/L，蛋白产量可达3.1g/L。
(4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白；
后处理包括离心去菌体、缓冲液抽提、盐析、离子交换、柱层析精制和冷冻干燥，细胞经离心后获得上清液，然后加入甲酸缓冲液进行抽提，盐析粗提，用离子交换树脂吸附以0.5mol/L的NaCl、20mM Tris pH 8.0洗脱后，再用金属螯合柱吸附、洗脱，收集蛋白冷冻干燥，即可获得胶原蛋白样品。

Claims (5)

1.一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培；
(2)摇瓶、种子罐的种子培养；
(3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；
甲醇驯化过程为：
第一阶段加入甲醇，使发酵罐溶氧下降至16％-20％，维持时间3-4h，之后溶氧回升；第二阶段加入甲醇，使发酵罐内溶氧下降至15％-20％，维持时间2-3h；
初始诱导阶段过程为：
调节发酵罐内的温度为28℃，采用间歇式恒速流加甲醇，控制溶氧在18％-22％，设置搅拌转速为650rpm，流量为1L/(L·min)罐压为0.05MPa并保持不变，待生物量达到240-260g/L时此阶段结束；
混合加大诱导阶段为：
调整发酵罐内温度为25℃，将通气流量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐压升高至0.07MPa-0.09MPa，加大甲醇的流加速率以维持18％-22％的溶氧，一直维持到发酵结束，菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L，此阶段结束；
(4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述甲醇驯化过程中第一阶段发酵罐内控制甲醇的浓度为0.3％，第二阶段发酵罐内控制甲醇的浓度为0.5％。
3.根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述种子罐的种子培养基和发酵罐内菌体培养基为改良后的FBS培养基，其配方为：
4.根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述初始诱导阶段采用间歇式恒速流加甲醇，流加速率是3.55-3.95ml/h/L。
5.根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述混合加大诱导阶段甲醇的流加速率为9.0-9.30ml/h/L。
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