CN104611385B - 一种使用同一菌株cgmcc 1593发酵耦合制备乳酸和丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种使用同一菌株CGMCC 1593发酵耦合制备乳酸和丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。出发菌株为CGMCC 1593，有氧发酵系统中在发酵培养基中添加亚硫酸钠0.2~0.5g/L，乙酸铵1~5g/L，通入无菌空气发酵制备乳酸；厌氧发酵系统中在发酵培养基中添加乙酸钠1~5g/L，通入有氧发酵系统的排放尾气发酵制备丁二酸。使用同一种菌株在不同的培养基和不同的氧气含量的环境中实现不同的代谢产物的同时，将有氧发酵系统所产的二氧化碳作为厌氧发酵系统所需的惰性气体，实现发酵成本的节省，降低碳排放。同时，大大降低了两个系统的染菌风险，特别是厌氧发酵的系统。即便有氧发酵系统出现异常，菌体进入厌氧发酵系统，也不会对后续系统产生任何影响。
Description
技术领域
一种使用同一菌株CGMCC 1593发酵耦合制备乳酸和丁二酸的方法，本发明利用微生物发酵实现乳酸和丁二酸的生产，实现使用同一菌株，将有氧发酵和厌氧发酵两种工艺耦合的方法。属于生物工程技术领域。
背景技术
丁二酸（succinic acid）又名琥珀酸，广泛存在于生物体中，是一种重要的二元有机羧酸，也是微生物三羧酸循环糖酵解途径的重要代谢产物。丁二酸在很多领域有着广泛的应用，可用于合成可降解塑料，医药领域的镇定剂，食品工业的食品添加剂，表面活性剂等。因此，丁二酸的高效、低成本的生产方法成为近年来研究的热点。
乳酸是世界公认三大有机酸之一。L-乳酸被认为是安全的食品添加剂，可以在食品工业中广泛应用，也是可完全生物降解塑料聚乳酸的主要原料。
目前，使用琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593厌氧发酵进行丁二酸的制备是一种非常可靠的高效的方法。然而，制备过程中为确保整个发酵过程的厌氧环境，需要不间断的通入二氧化碳，造成了发酵成本的提高。
CN101613722A公开了一种使用纤维素为原料生产乙醇，同时实现丁二酸的发酵生产，过程中是将乙醇发酵过程中产生的二氧化碳通入丁二酸的发酵罐中，实现丁二酸发酵成本的降低。
过程中对于二氧化碳的高效利用是非常有利的，在降低丁二酸发酵成本的同时降低了碳排放。然而，由于乙醇发酵和丁二酸发酵使用的是完全不同的两种菌，极易引起染菌，造成发酵过程的失败，和更大的成本的增加。这种做法在实践生产中实施起来的难度较高，风险加大，不适合工业方法使用。
发明者在实验过程中发现CGMCC 1593在不同的培养基组成和培养条件下，可以产生不同的代谢产物。这本身并不难理解，由于CGMCC 1593取自动物肠道菌群，属于野生菌，其体内存在多种基因和代谢途径，生存环境变化就会产生不同的代谢产物。
特别是在调整培养基组成和发酵时通入一定量空气后，CGMCC 1593即可产生乳酸，同时尾气产生二氧化碳；恢复原有的培养基配方，并通入二氧化碳后，CGMCC 1593即可正常代谢丁二酸。上述发现，为实现使用同一菌株，改变不同的生存环境，即可实现不同的代谢产物以及两个发酵过程的结合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用同一菌株CGMCC 1593实现高产乳酸和丁二酸的方法，
本发明的技术方案：一种使用同一菌株CGMCC 1593发酵耦合实现高产乳酸和丁二酸的方法，所用出发菌株为琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593，在有氧发酵系统中在发酵培养基中添加亚硫酸钠0.2~0.5g/L，乙酸铵1~5g/L，同时通入无菌空气，通入量为发酵总体积的0.1%~0.5%/min，发酵制备乳酸；在厌氧发酵系统中在发酵培养基中添加乙酸钠1~5g/L，通入二氧化碳含量大于50%的有氧发酵系统的排放尾气，尾气通入量为0.5~5L/min，发酵制备丁二酸。
进行有氧发酵制备乳酸时，有氧发酵系统培养基组成如下：
种子培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制。
发酵培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖120g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，亚硫酸钠0.2~0.5g/L，乙酸铵1 ~5g/L，用去离子水配制。
无菌空气通入量为发酵总体积的0.1%~0.5%/min，过程中流加1mol/L氢氧化钠溶液，调控pH值。
进行厌氧发酵制备丁二酸时，厌氧发酵系统培养基组成如下：
种子培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制。
发酵培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1 ~5g/L，用去离子水配制。
有氧发酵系统尾气通入量为0.5~5L/min，过程中流加1mol/L氢氧化钠溶液，调控pH值。
根据实验结果，为使有氧发酵系统产生乳酸，需要添加亚硫酸钠0.2~0.5g/L，乙酸铵1~5g/L，并且通入0.5~5L/min无菌空气。在上述条件下，系统使用的CGMCC 1593在发酵过程中的代谢产物为L-乳酸，发酵尾气中含有大量的二氧化碳。
亚硫酸钠和乙酸铵的使用可以改变CGMCC1593的代谢途径。而丁二酸的制备时，则是添加乙酸钠。
按照有氧发酵系统培养基组成配制培养基，并在121℃下灭菌20min，种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，种子培养达到7h后，将培养液接入有氧发酵系统的发酵罐中，接种量10%。
同时按照厌氧发酵系统的培养及组成配制培养基，并在121℃下灭菌20min，种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，种子培养达到7h后，将培养液接入厌氧发酵系统的发酵罐中，接种量10%。等待有氧发酵系统尾气排放的二氧化碳含量大于50%时，厌氧发酵系统中通入有氧发酵系统尾气。
发酵过程中使用氢氧化钠维持两个发酵系统的pH值为5.5~6.5，最优控制在6.0~6.2，温度为37~39℃，发酵时间为48h，最终乳酸产量为60~70g/L，丁二酸产量为75~80g/L。
检测方法使用液相色谱检测。
本发明的有益效果：使用同一种菌株CGMCC 1593在不同的培养基和不同的氧气含量的环境中实现不同的代谢产物的同时，将有氧发酵系统所产生的二氧化碳作为厌氧发酵系统所需要的惰性气体，从而实现发酵成本的节省，降低碳排放。同时，大大降低了两个系统的染菌风险，特别是厌氧发酵的系统。即便有氧发酵系统出现异常，菌体进入厌氧发酵系统，也不会对后续系统产生任何影响，因为前后系统使用的是同一菌株。
附图说明
图1 本发明方法流程示意图。1、有氧发酵系统，2、厌氧发酵系统，3、有氧发酵系统的尾气管线直接通入厌氧发酵系统中，4、无菌空气通入。
具体实施方式
实施例1
本发明所用菌株琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593，已在中国专利ZL 200610038113.6中公开，公开号CN1814747A，公开日2006年8月9日。
配制种子培养液100mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制。
配制有氧发酵系统发酵培养基1000mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖120g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，亚硫酸钠0.5g/L，乙酸铵5g/L，用去离子水配制。
种子培养基及发酵培养基均在灭菌锅中，温度121℃，灭菌20min。
发酵罐中通入无菌空气5mL/min，维持发酵罐温度37~39℃。
种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，培养时间达到7h后，将培养液接入有氧发酵系统的发酵罐中。6h后，尾气中二氧化碳体积含量达到55%。
发酵过程中使用氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值为5.8~6.0，温度为37~39℃，发酵时间为48h，最终乳酸产量为65g/L。
实施例2
配制种子培养100mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制。
配制厌氧系统发酵培养基1000mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1 ~5g/L，用去离子水配制。
种子培养基及发酵培养基均在灭菌锅中，温度121℃，灭菌20min。
发酵罐中通入二氧化碳3mL/min，维持发酵罐温度37~39℃。
种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，培养时间达到7h后，将培养液接入厌氧发酵系统的发酵罐中，接种量10%。
发酵过程中使用氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值为6.0~6.1，温度为37~39℃，发酵时间为48h，最终丁二酸产量为77g/L。
实施例3 耦合发酵
按上述实施例1准备好有氧发酵系统；
按上述实施例2准备好厌氧发酵系统；
发酵6h后，将有氧系统的尾气通入厌氧系统中。
发酵过程中使用氢氧化钠溶液维持两个发酵系统的pH值为6.0~6.2，温度为37~39℃，发酵时间为48h，最终乳酸产量为65g/L，丁二酸产量为79g/L。
Claims (4)
1.一种使用同一种菌株CGMCC 1593发酵耦合制备乳酸和丁二酸的方法，其特征在于所用出发菌株为琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593，在有氧发酵系统中在发酵培养基中添加亚硫酸钠0.2~0.5g/L，乙酸铵1~5g/L，同时通入无菌空气，通入量为发酵总体积的0.1%~0.5%/min，发酵制备乳酸；在厌氧发酵系统中在发酵培养基中添加乙酸钠1~5g/L，通入二氧化碳含量大于50%的有氧发酵系统的排放尾气，尾气通入量为0.5~5L/min，发酵制备丁二酸。
2.根据权利要求1所述的使用同一种菌株CGMCC 1593发酵耦合制备乳酸和丁二酸的方法，其特征在于进行有氧发酵制备乳酸时：
有氧发酵系统培养基组成如下：
种子培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制；
发酵培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖120g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，亚硫酸钠0.2~0.5g/L，乙酸铵1~5g/L，用去离子水配制；
无菌空气通入量为发酵总体积的0.1%~0.5%/min，过程中流加1mol/L氢氧化钠溶液，调控pH值；
培养基在121℃下灭菌20min，种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，种子培养达到7h后，将培养液接入有氧发酵系统的发酵罐中，接种量10%，流加氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值为5.8~6.0，温度为37~39℃，发酵时间为48h。
3.根据权利要求1所述的使用同一种菌株CGMCC 1593发酵耦合制备乳酸和丁二酸的方法，其特征在于进行厌氧发酵制备丁二酸时：
厌氧发酵系统培养基组成如下：
种子培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制；
发酵培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1~5g/L，用去离子水配制；
有氧发酵系统尾气通入量为0.5~5L/min，过程中流加1mol/L氢氧化钠溶液，调控pH值；
培养基在121℃下灭菌20min，种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，种子培养达到7h后，将培养液接入厌氧发酵系统的发酵罐中，接种量10%；等待有氧发酵系统尾气排放的二氧化碳含量大于50%时，厌氧发酵系统中通入有氧发酵系统尾气，通入量为0.5~5L/min，流加氢氧化钠溶液维持pH值为5.5~6.5，温度为37~39℃，发酵时间为48h。
4.根据权利要求3所述的使用同一种菌株CGMCC 1593发酵耦合制备乳酸和丁二酸的方法，其特征在于进行厌氧发酵制备丁二酸时：发酵过程维持pH值为6.0~6.2。
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