CN108285884A - 一种甲烷单细胞蛋白的生产方法 - Google Patents

一种甲烷单细胞蛋白的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108285884A
CN108285884A CN201810161056.3A CN201810161056A CN108285884A CN 108285884 A CN108285884 A CN 108285884A CN 201810161056 A CN201810161056 A CN 201810161056A CN 108285884 A CN108285884 A CN 108285884A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
tank
seed
medium
fermentation tank
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810161056.3A
Other languages
English (en)
Inventor
储卫华
周淑鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Rishengchang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
China Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Pharmaceutical University filed Critical China Pharmaceutical University
Priority to CN201810161056.3A priority Critical patent/CN108285884A/zh
Publication of CN108285884A publication Critical patent/CN108285884A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用甲烷生产单细胞蛋白的工业化生产方法，为有效解决我国畜禽、水产动物饲料蛋白短缺，解决养殖业生产成本上涨等问题提供一条新方法。本发明利用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中的一种或者多种菌株利用甲烷生产单细胞蛋白，所生产单细胞蛋白粗蛋白含量达70%以上，发酵用菌种对发酵条件适应性强，生产的饲料安全无毒。

Description

一种甲烷单细胞蛋白的生产方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种转化甲烷生产单细胞蛋白的菌株及其在单细胞蛋白生产方法。具体指在利用甲烷资源，形成新的甲烷下游产品生产链，将甲烷转化生成单细胞蛋白产品，解决近年来动物性蛋白饲料价格上涨，养殖行业成本增加、传统单细胞蛋白生产受原料来源限制，不能大规模生产等问题，有绿色环保、生产能耗低、不受环境和气候影响、可连续生产、易于控制等优点，是传统蛋白饲料新的替代源。
背景技术
随着畜牧业的快速发展，动物饲料资源短缺问题越来越受到人们的关注，尤其是动物蛋白质饲料缺乏，严重影响到畜牧业的发展。动物饲料占据整个养殖期间养殖生产成本的大部分资金，然而在所有的动物饲料中，尤其是动物蛋白质饲料缺乏严重。但是，全球性的粮食危机已开始显现，全球粮食储备水平不足年消费量的15%，以大豆与玉米为主要原料的饲料行业受到严重冲击。近年来，动物饲料蛋白的价格逐年上涨，养殖成本不断上升。以动物蛋白饲料鱼粉为例，我国的鱼粉需求量非常大，但我国渔业资源匮乏，鱼粉产量低，工业化水平低，根据世界粮农组织（2013年）统计称，我国鱼粉年产量约120万吨，仅占国内鱼粉消费总量的一半，并且国产鱼粉的粗蛋白质含量低，脂肪含量相对较高，所含氨基酸比例不平衡等不足，远不能满足国内动物蛋白饲料需求。我国每年都需要从秘鲁（约80％）、智利等国进口大量的鱼粉来弥补国产鱼粉产量的不足。但是，近年来由于鱼粉的主要出口国不断缩减捕鱼配额以及气候变化与环境恶化等原因造成的渔业资源的衰退，秘鲁等国禁捕令的实施，鱼粉价格也持续走高。进口鱼粉的价格比较高昂，并且进口量受到国外的限制，因此开发新型廉价的蛋白源，降低养殖行业的生产成本势在必行。
单细胞蛋白（Single cell protein，SCP）又称微生物蛋白，指的是从纯培养的微生物细胞中提取得到的总蛋白，可作为人及动物蛋白的补充。研究已经表明，使用微生物产生的单细胞蛋白安全无毒，含有丰富的蛋白质、氨基酸和多种维生素，可以用作饲料促进畜禽生产，提高饲料利用率，代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉等蛋白补充饲料，具有较高的附加值。在日粮中添加单细胞蛋白质饲料，能提高饲料利用率，增强机体免疫力，生猪瘦肉率、蛋鸡产蛋量和奶牛产奶量也会得以提高。由细菌以甲烷为原料生产的新型单细胞蛋白的蛋白含量69%-80%，远远高于工业生产饲料15%-20% 的蛋白含量，具有较高的经济效益和广阔的市场空间。单细胞蛋白作为动物的蛋白质饲料，不但可以在一定程度上缓解我国蛋白质资源的短缺危机，满足动物的生长和生产，更有利于降低养殖行业的生产成本，促进整个畜牧业的可持续健康发展。
发明内容
针对上述情况，本发明之目的就是提供一种甲烷单细胞蛋白的工业化生产方法，可有效解决动物饲料蛋白紧缺，降低养殖业成本。
本发明解决的技术方案是，包括如下步骤：
1）、使用的菌株为荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中的一种或几种：
将甘油管保藏的菌种0.5mL 接种至无机盐试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，30℃培养4 d，即得斜面种子，所述的无机盐试管斜面培养基为在1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl、1.0g（NH4）2SO4和2.0g 琼脂，pH 自然。用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以无机盐液体培养基体积1%-5% 的接种量接入到含有石蜡油的无机盐液体培养基中，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养4-6 d，菌体OD600 达到9-10，获得摇瓶种子，所述的无机盐液体培养基为在1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然。所述含甲烷的体系中石蜡油添加量为2.0%-3.0% (v/v)。所述含甲烷的体系中甲烷和空气体积比为1:1-1:5，每24h-48h 换气一次；
2）、一级种子培养：
A、一级种子培养在50L 的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L 罐中配制30L 的无机盐液体培养基，加入2.5％（v/v）的石蜡油，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min 即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对无机盐液体培养基进行降温，当无机盐液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；
B、摇瓶种子1000mL 从50L 发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在20-30℃，转速150rpm，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，培养5-7d 后，得一级种子；
3）、二级种子培养：
二级种子培养在5m3 发酵罐中进行，二级种子培养基采用无机盐液体培养基，步骤如下：
5m3 发酵罐中装含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐液体培养基体积为3m3 ；所述的无机盐液体培养基为：1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然；
用2）A 步骤中的灭菌方法对含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，将培养好的一级种子30L 接种到3m3 的无机盐液体培养基中，接种量为1%，接种前应检查一级种子质量，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，接种时二级种子罐（二级种子罐即5m3 发酵罐）罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过气压将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度20-30℃，1 ：1-1.5vvm（vvm 表示通风量为发酵液体积的1-1.5 倍/ 分钟）通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，罐压0.05MPa，pH自然，培养6-8d，得二级种子；
4）、发酵罐甲醇蛋白生产
发酵培养基为与3）步骤中的二级种子培养基相同，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3-4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min 后，进入50m3 发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3 发酵罐温度维持在121℃ 30min，此时，用蒸汽对与50m3 发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3 发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3 发酵罐内的发酵培养基降温到30℃-35℃；然后将二级种子以发酵培养基体积10% 的接种量接种到50m3 发酵罐内开始发酵，发酵温度20-30℃，1 ：1.5-2 vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷，罐压0.04MPa，pH自然，培养7-9d得发酵液；
5）、出料
发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4-8 小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5 的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉。
有益效果
本发明采用菌种涉及的荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261除了能在有机碳源的培养基上生长，还首次发现其能够在以甲烷为唯一碳源以及价格低廉且容易获得的硫酸铵为培养基上生长工业化生产饲用单细胞蛋白。用甲烷作为碳源的优势在于，降低成本，除了可以利用天然气，还能利用农产品废弃物发酵获得的沼气联合应用，该方法适合于循环再生，利于环保和节能，符合可持续发展。
本发明采用菌种为荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中的一种或几种，本发明首次利用这些菌株中的一种或者几种以甲烷和硫酸铵作为培养基主要碳源及氮源进行单细胞蛋白生产，其产量达到0.4g/L，该产物含粗蛋白> 70%，灰分4% 以及7%的脂类。发酵菌种对发酵条件适应性强，该发酵工艺蛋白产量高，稳定性强，适宜工业化生产，是一种有效获得蛋白质的新途径。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
无机盐液体发酵培养基：溶剂为水，溶质为1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4•7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然。
固体培养基：每升上述无机盐液体培养基添加20g 琼脂制备得到的培养基。
实施例1
应用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009 进行的单细胞蛋白生产
其中，所使用的培养基配方：
无机盐液体培养基：溶剂为水，溶质为1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然。
（1）一级种子培养：在超净工作台（仪器型号SW-CJ-1FD）上将甘油管保藏的荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009菌种接种至种子斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，通入过滤除菌的甲烷气体，30℃培养96小时后，取1支培养好的斜面种子，用10mL 无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到含2.5％石蜡油、250mL无机盐液体培养基的2L三角瓶中，通入过滤除菌的甲烷气体，置于30℃，220rpm 的摇床中振荡培养直至OD600=9-10，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，得一级种子；
（2）二级种子培养：在50L发酵罐中加入30L 的无机盐液体培养基，750mL石蜡油作为甲烷传递体，20mL二甲基硅油作S消泡剂，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至35℃后，将2瓶共500mL 的一级种子接种至发酵罐中的无机盐液体培养基中，培养条件为：培养温度30℃，通气量2vv/m，转速300rpm，发酵9d后，收集发酵液，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，得二级种子；
（3）5m3 发酵罐中高密度发酵：
5m3 发酵罐中采用无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m3，用160℃以上的高温蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至35℃时，将二级种子30L 全部接种到5m3 发酵罐中进行发酵，发酵温度为30℃，除菌甲烷通气量1.5vv/m，搅拌转速200rpm，发酵7d，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，收集发酵液；
（4）30m3 发酵罐中高密度发酵
30m3 发酵罐中用的发酵培养基与5m3 发酵罐中的发酵培养基相同，均为含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐培养基，配制方法同上。30m3 发酵罐中装无机盐培养基20m3，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌。将5m3 发酵罐中的发酵液在发酵结束前12小时移种1m3 到30m3 发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度20-30℃，通气量1.5-2vv/m，搅拌转速100-150rpm，发酵7d后终止。
（5）单细胞蛋白收获：
将上述（4）步骤在30m3 发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5 吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m3发酵液储罐中，向储罐中加入1m3 的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140-160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集收集干粉即为单细胞蛋白，其产量达到0.4g/L，该产物含粗蛋白> 70%，灰分4% 以及7%的脂类。检测方法参照：GB/T 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法；GB/T 6433-2006 饲料中粗脂肪的测定，GB/T 6438-2007 饲料中粗灰分的测定。
实施例2
应用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261混合发酵进行的单细胞蛋白生产
其中，所使用的培养基配方：
无机盐液体培养基：溶剂为水，溶质为1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然。
（1）一级种子培养：在超净工作台（仪器型号SW-CJ-1FD）上将甘油管保藏的荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agriACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilusACCC10261菌种接种至种子斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，通入过滤除菌的甲烷气体，30℃培养96小时后，取培养好的斜面种子，用10mL 无菌水将斜面种子全部冲洗下来，分别接种到3个含2.5％石蜡油、250mL 无机盐液体培养基的2L 三角瓶中，通入过滤除菌的甲烷气体，置于30℃，220rpm 的摇床中振荡培养直至OD600=9-10，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，得一级种子；
（2）二级种子培养：在50L 发酵罐中加入30L 的无机盐液体培养基，750mL石蜡油作为甲烷传递体，20mL 二甲基硅油作S消泡剂，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至35℃后，将2瓶共500mL 的一级种子接种至发酵罐中的无机盐液体培养基中，培养条件为：培养温度30℃，通气量2vv/m，转速300rpm，发酵9d后，收集发酵液，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，得二级种子；
（3）5m3 发酵罐中高密度发酵：
5m3 发酵罐中采用无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m3，用160℃以上的高温蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至35℃时，将二级种子30L 全部接种到5m3 发酵罐中进行发酵，发酵温度为30℃，除菌甲烷通气量1.5vv/m，搅拌转速200rpm，发酵7d，镜检种子菌体健壮、形态一致、均匀整齐，无杂菌污染，收集发酵液；
（4）30m3 发酵罐中高密度发酵
30m3 发酵罐中用的发酵培养基与5m3 发酵罐中的发酵培养基相同，均为含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐培养基，配制方法同上。30m3 发酵罐中装无机盐培养基20m3，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌。将5m3 发酵罐中的发酵液在发酵结束前12 小时移种1m3 到30m3 发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度20-30℃，通气量1.5-2vv/m，搅拌转速100-150rpm，发酵7d后终止。
（5）单细胞蛋白提取：
将上述（4）步骤在30m3 发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5 吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m3发酵液储罐中，向储罐中加入1m3 的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140-160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集收集干粉即为单细胞蛋白。其产量达到0.5g/L，该产物含粗蛋白> 72%，灰分5% 以及7.2%的脂类。检测方法参照：GB/T 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法；GB/T 6433-2006 饲料中粗脂肪的测定，GB/T 6438-2007 饲料中粗灰分的测定。

Claims (2)

1.一种甲烷单细胞蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、使用荚膜甲基球菌Methylococcus capsulatus ATCC33009、土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri ACCC10247以及嗜热嗜气硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus thermoaerophilus ACCC10261中任意一种或任意两种以上混合物；
将甘油管保藏的菌种0.5mL 接种至无机盐试管斜面培养基上，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，30℃培养4 d，即得斜面种子，所述的无机盐试管斜面培养基为在1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl、1.0g（NH4）2SO4和20g 琼脂，pH 自然；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以无机盐液体培养基体积1%-5% 的接种量接入到含有石蜡油的无机盐液体培养基中，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养4-6 d，菌体OD600 达到9 ～10，获得摇瓶种子，所述的无机盐液体培养基为在1L 水中加入1.5gK2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然；所述含甲烷的体系中石蜡油添加量为2.0%-3.0% v/v；所述含甲烷的体系中甲烷和空气体积比为1:1-1:5，每24h-48h 换气一次；
2）、一级种子培养：
A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L 罐中配制30L 的无机盐液体培养基，加入2.5％v/v的石蜡油，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min 即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对无机盐液体培养基进行降温，当无机盐液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；
B、摇瓶种子1000mL 从50L 发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在20-30℃，转速150rpm，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，培养5-7d 后，得一级种子；
3）、二级种子培养：
二级种子培养在5m3 发酵罐中进行，二级种子培养基采用无机盐液体培养基，步骤如下：
5m3 发酵罐中装含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基体积为3m3 ；所述的无机盐液体培养基为：1L 水中加入1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4 •7H2O、1.0g NaCl和1.0g（NH4）2SO4，pH 自然；
用2）A 步骤中的灭菌方法对含2.5％v/v石蜡油的无机盐液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，将培养好的一级种子30L 接种到3m3的无机盐液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过气压将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度20-30℃，1 ：1-1.5vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，罐压0.05MPa，pH自然，培养6-8d，得二级种子；
4）、发酵罐甲醇蛋白生产
发酵培养基为与3）步骤中的二级种子培养基相同，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3-4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min 后，进入50m3 发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3 发酵罐温度维持在121℃ 30min，此时，用蒸汽对与50m3 发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3 发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3 发酵罐内的发酵培养基降温到30℃-35℃；然后将二级种子以发酵培养基体积10% 的接种量接种到50m3 发酵罐内开始发酵，发酵温度20-30℃，1 ：1.5-2 vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷，罐压0.04MPa，pH自然，培养7-9d得发酵液；
5）、出料
发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4-8 小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5 的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉，包装。
2. 根据权利要求1 所述的甲烷单细胞蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、摇瓶种子培养：
将甘油管保藏的菌种0.5mL 用划线法接种至无机盐试管斜面培养基上，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，30℃培养4d，即得斜面种子；取1支培养好的斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有250mL 无机盐液体培养基的三角瓶中，瓶口用8 层纱布包好，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养4-6d 后，菌体OD600 达到9-10，获得摇瓶种子；
2）、一级种子培养：
A、在50L 发酵罐中先加水10L，再投入45g K2HPO4、15g KH2PO4、6g MgSO4 •7H2O、30gNaCl和30g（NH4）2SO4，750mL石蜡油，pH 自然，搅拌溶解，然后再加水至30L 得YPD 液体培养基，打开罐体蒸汽阀进口，通蒸汽进发酵罐夹套层，将无机盐液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，时间30min，同时，对发酵罐的空气过滤器和取样口灭菌10min，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，同时使冷却水进入罐体夹套对培养基降温，当培养基温度降至30℃时，开始接种；
B、摇瓶种子1000mL 从50L 发酵罐接种口倒入，接种前检查种子质量，要求无杂菌污染，菌体健壮、形态一致、均匀整齐，接种后，控制发酵罐温度30℃，转速150rpm，通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，培养5-7d 后，得一级种子；
3）、二级种子培养：
将3m3 含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐液体培养基装入5m3 发酵罐中，用2）A 步骤中的灭菌方法对培养基进行灭菌，灭菌完成后，将30L一级种子通过压力管道接种到5m3 发酵罐内液体培养基中，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过气压将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度20- 30℃，1 ：1-1.5vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷气体，罐压0.05MPa，pH自然，培养6-8d，得二级种子；
4）、50m3 发酵罐中甲烷单细胞蛋白的发酵生产
发酵培养基为与3）步骤中的二级种子所用含2.5％（v/v）石蜡油的无机盐液体培养基相同配方，首先将30m3 发酵培养基投入到配料罐内，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到125℃，进入层流罐中维持20min 后，进入50m3 发酵罐中，当进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3 发酵罐温度维持在121℃ 30min，此时，用蒸汽对与50m3 发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3 发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，打开50m3 发酵罐内盘管冷却管进水阀门，对发酵培养基降温；待发酵培养基温度降到30℃时，将3m3 二级种子接种到50m3 发酵罐内发酵，发酵温度20-30℃， 1 ：1.5-2 vvm通入经过0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤除菌的甲烷，罐压0.04MPa，pH自然，培养7-9d得发酵液；
5）、出料
发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到两个25m3 的发酵液储罐中，静置沉降4-8 小时，沉降液经卧螺离心机离心，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，离心获得菌泥，收集到发酵液储存罐中，向发酵液储存罐中加入2m3清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，调节进口温度至130-150℃、出口温度至65-80℃，进料流量为1 吨/小时，进行喷雾干燥，收集蛋白干粉，包装。
CN201810161056.3A 2018-02-27 2018-02-27 一种甲烷单细胞蛋白的生产方法 Pending CN108285884A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810161056.3A CN108285884A (zh) 2018-02-27 2018-02-27 一种甲烷单细胞蛋白的生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810161056.3A CN108285884A (zh) 2018-02-27 2018-02-27 一种甲烷单细胞蛋白的生产方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108285884A true CN108285884A (zh) 2018-07-17

Family

ID=62832925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810161056.3A Pending CN108285884A (zh) 2018-02-27 2018-02-27 一种甲烷单细胞蛋白的生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108285884A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438034A (zh) * 2019-07-03 2019-11-12 中国药科大学 一种甲烷氧化菌及其应用
WO2021071895A1 (en) * 2019-10-07 2021-04-15 Calysta, Inc. Food compositions comprising methylococcus capsulatus protein isolate
CN114045235A (zh) * 2021-11-04 2022-02-15 西安交通大学 一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法
CN114729300A (zh) * 2019-10-07 2022-07-08 凯利斯塔公司 用于培养甲烷氧化细菌和从细菌生物质分离蛋白质的方法
CN115024442A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 中国农业科学院饲料研究所 利用荚膜甲基球菌蛋白生产高蛋白浮性膨化鱼饲料的方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438034A (zh) * 2019-07-03 2019-11-12 中国药科大学 一种甲烷氧化菌及其应用
CN110438034B (zh) * 2019-07-03 2023-01-31 中国药科大学 一种甲烷氧化菌及其应用
WO2021071895A1 (en) * 2019-10-07 2021-04-15 Calysta, Inc. Food compositions comprising methylococcus capsulatus protein isolate
CN114729300A (zh) * 2019-10-07 2022-07-08 凯利斯塔公司 用于培养甲烷氧化细菌和从细菌生物质分离蛋白质的方法
CN114945286A (zh) * 2019-10-07 2022-08-26 凯利斯塔公司 包含荚膜甲基球菌蛋白分离物的食品组合物
CN114045235A (zh) * 2021-11-04 2022-02-15 西安交通大学 一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法
CN114045235B (zh) * 2021-11-04 2022-11-08 西安交通大学 一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法
CN115024442A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 中国农业科学院饲料研究所 利用荚膜甲基球菌蛋白生产高蛋白浮性膨化鱼饲料的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108285884A (zh) 一种甲烷单细胞蛋白的生产方法
CN103981118B (zh) 一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用
CN101914460B (zh) 一种海洋红酵母培养物的发酵方法
CN103060212B (zh) 一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法
CN105132301B (zh) 一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母及其应用
CN103275907A (zh) 一种解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用
CN101376605B (zh) 一种利用活菌发酵活化肥料的制备方法
CN104016805B (zh) 一种含三十烷醇的水产复合氨基酸菌肥及其制备方法
CN102925502A (zh) 利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法
CN102212493A (zh) 一种鸡舍发酵床复合微生物菌剂及其制备方法
CN101148643A (zh) 一种海参用海洋胶红酵母的生产方法
CN105754903A (zh) 规模化培育红假单胞菌属光合细菌的方法
CN105132311B (zh) 利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法
WO2015085631A1 (zh) 一种高产率的葡萄藻培养方法
CN105176853B (zh) 一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母及其应用
CN103211088A (zh) 海参饵料的制备方法
CN100467584C (zh) 水产养殖及景观水体用复合微生态制剂及其制备方法
CN101748075A (zh) 高活性海洋红酵母粉的制备方法
CN201878571U (zh) 子母式食用菌液体菌种培养罐
CN109055264A (zh) 一种用于海参养殖的微生物菌剂及其制备方法
CN109123076A (zh) 一种畜禽用维生素b2营养型微生态制剂的生产方法
CN102676408B (zh) 一种高密度液体深层发酵生产海洋红酵母的方法
CN107937286A (zh) 一种异常毕赤酵母及其发酵培养物和应用
CN101653189A (zh) 天然植物小分子群物质浓缩物及其生产方法
CN106165790A (zh) 一种用于养殖卤虫的饵料及卤虫养殖方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20240924

Address after: No. 39 Meihua Avenue, Xuyi Economic Development Zone, Huai'an City, Jiangsu Province, China 211700

Applicant after: Jiangsu Rishengchang Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: No. 639 Jiangning longmian Road District of Nanjing City, Jiangsu province 211198

Applicant before: CHINA PHARMACEUTICAL University

Country or region before: China