CN114729300A - 用于培养甲烷氧化细菌和从细菌生物质分离蛋白质的方法 - Google Patents

用于培养甲烷氧化细菌和从细菌生物质分离蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了通过在低铜条件下培养甲烷氧化细菌来产生生物质的方法。还提供了产生的生物质和从生物质制备的蛋白分离物。

Description

用于培养甲烷氧化细菌和从细菌生物质分离蛋白质的方法
背景
技术领域
本公开涉及细菌培养，通过此种培养产生的生物质和蛋白分离物。更特别地，本公开涉及在低铜条件下培养甲烷氧化细菌(methanotrophic bacteria)以增加细菌生物质的粗蛋白和由生物质制备的蛋白分离物。
背景技术
在全球环境污染和土地和水匮乏方面，通过传统的基于农业的食物供应链生产蛋白质正成为主要问题。同时，全球对高质量蛋白质产品如具有高比例粗蛋白的产品的需求正在增加。由于将饲料转化为肉和乳制品的效率低，因此增加肉和乳制品的产量不能持续满足对蛋白质日益增长的需求。基于植物的蛋白质来源(例如豆类)是具有营养价值的蛋白质来源，但需要耕地和水，而这两者都将变得越来越有限。新的解决方案例如单细胞蛋白质(即，在微生物和藻类细胞中产生的蛋白质)正在研发中。目前，在人类的营养摄入中微生物蛋白只占相对较小的比例。此外，微生物蛋白质产品的生产可能面临与高RNA含量、细菌产生的毒素和免疫原性相关的问题。
发明内容
本公开提供了用于从甲烷氧化细菌产生生物质的方法以及所产生的生物质和由所产生的生物质制备的蛋白分离物。
在一个方面，本公开提供了用于产生生物质的方法，该方法包括：(a)以不超过100mg铜/kg细胞干重(DCW)的铜水平连续培养甲烷氧化细菌以产生生物质。
在另一方面，本公开提供了细菌生物质，其主要包含铜水平不超过100mg铜/kg细胞干重(DCW)的甲烷氧化细菌的生物质，基本上由其构成或由其构成。
在另一方面，本公开提供了由主要包含甲烷氧化细菌的生物质的细菌生物质制备的蛋白分离物，其中所述蛋白分离物包含至少82％粗蛋白，优选地至少85％粗蛋白。
附图说明
图1是显示实施例2中使用的生物质的示例性下游加工的流程图。
图2是显示根据实施例2从在低铜水平(25mg铜/kg生物质)和正常铜水平(154mg铜/kg生物质)下培养的荚膜甲基球菌巴斯的生物质制备的蛋白分离物的粗蛋白百分比的图。B091和B093是来自不同时间点在低铜水平下的连续发酵的生物质。B089是来自正常铜水平下的连续发酵的生物质。
图3是显示在低铜水平(38mg铜/kg生物质)、正常铜水平(154mg铜/kg生物质)和高铜水平(371mg铜/kg生物质)下培养的荚膜甲基球菌巴斯的生物质的粗蛋白(干细胞重量的％)的图。编号#24和#28代表两个单独的发酵运行。
图4是显示来自在不同铜水平(即23、80、96和140mg铜/kg生物质)下生长的荚膜甲基球菌巴斯的生物质的粗蛋白、脂肪和灰分含量的图。
具体实施方式
本公开提供了用于培养甲烷氧化细菌以产生用于制备高质量蛋白质产品的生物质的方法。已发现，与在正常或高铜条件下培养的细菌相比，在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌产生具有更高的粗蛋白、更低的脂质和/或更低的灰分含量的生物质。这样的生物质允许产生具有高粗蛋白、提高的产率和/或最少量的核酸的蛋白分离物。
不希望受任何理论束缚，本发明人假设来自在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌的生物质的粗蛋白的增加可能是由于由低铜条件诱导的内膜结构(包括脂质和膜蛋白)的量的减少。
在本说明书中，除非另外指明，否则术语“约”意指所指示的范围、值或结构的±10％。术语“基本上由……构成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。应当理解，本文所用的术语“一个(a和an)”是指“一个或多个”所列举的组分。替代物的使用(例如，“或”)应理解为意指替代物中的任一个、两个或其任何组合。如本文所用，术语“包括”和“具有”同义使用，这些术语及其变体旨在被解释为非限制性的。术语“包含”是指权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但其不排除一个或多个其他特征、整数，步骤、组分或其群组的存在或添加。本文提供的任何范围包括所述范围内的所有值和较窄范围。
产生生物质
在一个方面，本公开提供了通过在低铜条件下培养甲烷氧化细菌来产生生物质的方法。
1.甲烷氧化细菌
甲烷氧化细菌具有氧化甲烷作为碳源和能量来源的能力。甲烷氧化细菌根据其碳同化途径和内膜结构分为3组：I型(γ变形菌)、II型(α变形菌)和X型(γ变形菌)。I型甲烷氧化菌使用核酮糖单磷酸(RuMP)途径进行碳同化，而II型甲烷氧化菌使用丝氨酸途径。X型甲烷氧化菌使用RuMP途径，但也表达低水平的丝氨酸途径的酶。
甲烷氧化细菌包括专性甲烷氧化菌(只能利用C1底物作为碳源和能量来源)和兼性甲烷氧化菌(天然具有利用一些多碳底物作为碳源和能量来源的能力)。
示例性兼性甲烷营养菌包括甲基细胞菌属(Methylocella)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)和甲基帽菌属(Methylocapsa)(例如，Methylocella silvestris、Methylocella palustris、Methylocella tundrae、Methylocystis daltona菌株SB2、Methylocystis bryophila、和Methylocapsa aurea KYG)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、Methylibium petroleiphilum中的一些物种，或其高速生长变体。
示例性专性甲烷营养菌包括荚膜甲基球菌巴斯(Methylococcus capsulatusBath)(NCIMB 11132)、甲基单胞菌属16a(ATCC PTA 2402)、甲基弯菌OB3b(NRRL B-11,196)、Methylosinus sporium(NRRL B-11,197)、小甲基胞囊菌(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)(NRRL B-11,199)、Methylomonas albus(NRRL B-11,200)、Methylobacter capsulatus Y(NRRL B-11,201)、Methylomonas flagellata sp.AJ-3670(FERM P-2400)、极端嗜酸甲烷氧化菌(Methylacidiphilum infernorum)和嗜碱甲基微菌Methylomicrobium alcaliphilum、或其高速生长变体。
在某些实施方式中，甲烷氧化细菌是表达可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)的甲烷氧化细菌。MMO在甲烷氧化细菌中催化甲烷氧化成甲醇。
优选地，甲烷氧化细菌是甲基球菌属、甲基孢囊菌属、甲基弯曲菌属或甲基细胞菌属，包括表达sMMO的那些。
在某些实施方式中，甲烷氧化细菌是荚膜甲基球菌，包括荚膜甲基球菌巴斯(Bath)、荚膜甲基球菌得克萨斯(Texas)和荚膜甲基球菌阿伯丁(Aberdeen)。优选地，甲烷氧化细菌是荚膜甲基球菌巴斯。它是一种嗜热细菌，最适生长温度为约45℃。荚膜甲基球菌巴斯是I型甲烷营养菌。
2.低、正常和高铜条件
术语“低铜条件”是指连续培养条件，其中连续培养中铜的量(或水平)为至多100mg铜(即元素铜或铜元素)/kg细胞干重(DCW)。
“连续培养条件”是指在连续培养系统中培养甲烷氧化细菌的条件，其中向系统中连续加入确定的培养基(或其一种或多种组分)，同时去除等量的用过的培养基以进行处理。
“连续培养”是指培养基和在连续培养条件下在培养基中培养的细菌的混合物。
“细胞干重(DCW)”是指从细菌培养物收获的生物质的干重。
特定量的铜元素通常由含有相同摩尔数的铜元素的对应或等量的铜盐提供。例如，100mg铜为约1.57mmol，并且可以由约394mg CuSO4·5H2O提供。
术语“正常铜条件”是指连续培养条件，其中连续培养中铜的量为100mg-200mg铜/kg细胞干重(DCW)。
术语“高铜条件”是指连续培养条件，其中连续培养中铜的量大于200mg铜/kg细胞干重(DCW)。
考虑到DCW收获率，通常通过控制Cu进料速率来建立特定的铜条件。例如，对于50μg Cu/g DCW(细胞干重)的低铜(Cu)浓度和5g/L/h DCW的收获率，Cu(例如由CuSO4·5H2O提供)进料应为250μg Cu/L/h。
在某些实施方式中，可以通过使用装置(例如泵)以限定的速率进料连续培养物来控制铜浓度。
在某些实施方式中，在低铜条件下的铜水平为1-100、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、20-90，优选地20-80、20-70、20-60、20-50或20-40mg铜/kg生物质。
在某些实施方式中，正常铜条件下的铜水平为100-180、100-170、100-160、100-150、100-140、100-130mg铜/kg生物质。
在某些实施方式中，高铜条件下的铜水平为200-800、200-700、200-600、200-500或200-400mg铜/kg生物质。
3.培养甲烷氧化细菌
甲烷氧化细菌可以通过连续培养方法在受控的培养单元中生长，例如发酵罐、生物反应器、中空纤维细胞等。连续培养系统是这样的系统，其中将确定的培养基(或其一种或多种组分)连续加入到受控的培养单元中，同时去除等量的用过的(“条件”)培养基以进行处理。连续培养系统通常将细胞维持在恒定的高液相密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续培养系统允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一种或多种因素。例如，一种方法可以以固定的速率维持有限的营养物(例如，碳源、氮)并允许一个或多个其他参数随时间变化。在某些实施方式中，影响生长的几个因素可以连续改变，同时细胞浓度(通过培养基浑浊度测量)保持恒定。连续培养系统的目的是维持稳定状态的生长条件，同时平衡细胞生长速率和由于培养基被排出而引起的细胞损失。调节用于连续培养过程的营养物和生长因子的方法和使产物形成速率最大化的技术是本领域熟知的(参见例如ThomasD.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology[生物技术：工业微生物学教科书],第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA；Deshpande,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]36:227 1992)。
在某些实施方式中，培养基包括碳底物作为甲烷氧化细菌的能量来源。合适的底物包括C1底物，例如甲烷、甲醇、甲醛、甲酸(甲酸盐)、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺(甲胺、二甲胺、三甲胺等)、甲基化硫醇或甲基卤素(溴甲烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷等)。在某些实施方式中，培养基可以包含单一C1底物作为甲烷氧化细菌的唯一碳源，或者可以包含两种或更多种C1底物的混合物(混合的C1底物组合物)作为甲烷氧化细菌的多种碳源。在某些实施方式中，天然气(其主要含有甲烷)可用作碳源。
在细菌培养期间，通常将发酵混合物的pH调节为约6和约8之间，例如约6和约7之间、约7和约8之间、或约6.5和7.5之间。
在细菌培养期间，温度保持在最适合培养细菌的范围内。例如，对于荚膜甲基球菌巴斯，温度可以在40℃和45℃之间。
优选地，甲烷氧化细菌是荚膜甲基球菌巴斯。荚膜甲基球菌巴斯可以用甲烷作为其碳源、用空气或纯氧进行氧合、并用氨作为氮源来培养。在某些实施方式中，用于培养荚膜甲基球菌的包含甲烷的碳原料是天然气或非常规天然气。除了这些底物之外，细菌培养物通常需要水、磷酸盐和几种矿物质，例如镁、钙、钾、铁、铜、锌、锰、镍、钴和钼。示例性培养基包括Higgins最小硝酸盐培养基(NSM)或MM-W1培养基、如实施例1所述的主混合进料(MMF)、培养基MMF1.1、培养基MMS1.0或AMS培养基。可以如上所述调节这些培养基的铜浓度。在实施例1中提供了具有不同铜浓度的示例性培养条件。
培养基MMS 1.0的组成如下：0.8mM MgSO4.7H2O、30mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mMNaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4·2H2O、6μM CuSO4·5H2O、10μMFeIII-Na-EDTA和1mL/L微量金属溶液(每升含有：500mg FeSO4.7H2O、400mg ZnSO4.7H2O、20mg MnCl2·7H2O、50mg CoCl2·6H2O、10mg NiCl2·6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。培养基的最终pH为7.0±0.1。
AMS培养基每升含有以下物质：10mg NH3、75mg H3PO4·2H2O、380mg MgSO4·7H2O、100mg CaCl2·2H2O、200mg K2SO4、75mg FeSO4·7H2O、1.0mg CuSO4·5H2O、0.96mg ZnSO4·7H2O、120μg CoCl2·6H2O、48μg MnCl2·4H2O、36μg H3BO3、24μg NiCl2·6H2O和1.20μgNaMoO4·2H2O。
培养基MMF1.1的组成如下：0.8mM MgSO4·7H2O、40mM NaNO3、0.14mM CaCl2、6mMNaHCO3、4.7mM KH2PO4、6.8Mm K2HPO4、20.7μM Na2MoO4·2H2O、6μM CuSO4·5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA和1mL/L微量金属溶液(每升含有500mg FeSO4·7H2O、400mg ZnSO4·7H2O、20mgMnCl2·7H2O、50mg CoCl2·6H2O、10mg NiCl2·6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。
用于培养甲烷氧化细菌的合适的发酵罐可以是环型或气升式反应器。示例性发酵罐包括U环发酵罐(参见美国专利号7,579,163、WO 2017/218978)、蛇形发酵罐(参见WO2018/132379)和Kylindros发酵罐(参见WO 2019/0366372)。
在某些实施方式中，甲烷氧化细菌在良好生产规范(GMP)条件下培养。如本文所用，术语“良好生产规范”或“GMP”是指由美国食品和药品管理局根据联邦食品(FederalFood)、药品(Drug)和化妆品法案(Cosmetic Act)中21CFR 110(对于人类食品)和111(对于膳食补充剂)颁布的法规或在美国以外的管辖区中提出的类似规范，其描述食品制造、加工、包装或储存所必需的条件和规范以确保其安全和卫生。
在某些实施方式中，甲烷氧化细菌作为分离的培养物培养，不存在其它生物体。在某些其他实施方式中，甲烷氧化细菌可以与一种或多种可以有助于甲烷氧化细菌生长的异源(heterologous)生物体(例如，一种或多种异源细菌)一起生长。例如，甲烷氧化细菌(例如，荚膜甲基球菌巴斯)可以与贪铜菌属(Cupriavidus sp.)、丹麦解硫胺素芽孢杆菌(Anuerinibacillus danicus)或两者一起培养，并任选地与土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)组合。
4.细菌生物质
术语“细菌生物质”是指从细菌培养物收集的有机物。细菌生物质主要(即，大于50％w/w)包含细菌细胞，但可包括其他物质，如裂解的细菌细胞、细菌细胞膜、包涵体和胞外物质(例如，分泌或排泄到培养基中的产物)，或它们的任何组合，其与细菌细胞一起从细菌发酵收集。优选地，生物质包含从细菌发酵收集的超过60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞。
可通过各种技术如沉降、微滤、超滤、喷雾干燥从细菌培养物中收获细菌生物质。优选地，通过离心(例如在10℃以4,000x g离心10分钟)从细菌培养物中收获生物质。例如，可以收集发酵液(细胞和液体)并离心。离心后，可弃去液体，保存沉淀的细胞并任选地冻干。
在某些实施方式中，细菌生物质基本上由或由从在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌中收获的生物质构成，其铜水平不超过100mg铜/kg DCW(mg/kg)。在某些实施方式中，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质的铜水平为1-100、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50或20-40mg铜/kg DCW。
在某些实施方式中，在低铜条件下培养的细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至少71％粗蛋白，例如至少72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％或81％粗蛋白。“粗蛋白”、“粗蛋白含量”、“粗蛋白浓度”或“粗蛋白百分比”是蛋白样品中氮的测量值。氮的量指示样品中蛋白质的量。本文公开的生物质或蛋白分离物的粗蛋白含量通过杜马法测定。在某些实施方式中，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质由约71％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、82％至约99％、约71％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约82％至约95％、约71％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约82％至约90％、约71％至约85％、约75％至约85％粗蛋白构成。
在某些实施方式中，在低铜条件下培养的细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％真蛋白。“真蛋白”、“真蛋白含量”、“真蛋白浓度”或“真蛋白百分比”是蛋白质样品中粗蛋白量减去非蛋白氮含量的测量值。在某些实施方式中，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质由约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约60％至约95％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约60％至约75％、或约60％至约70％真蛋白构成。在某些实施方式中，在低铜条件下培养的细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至多14％，例如至多13％、12％或11％灰分。“灰分”是在燃烧后(例如，在炉中12-18小时或在550℃下过夜)的样品中剩余的物质。
在某些实施方式中，在低铜条件下培养的细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至多10％，例如至多9％、8％、7％、6％或5％核酸。使用Lucigen MasterpureComplete DNA&RNA纯化试剂盒MC85200测量本文公开的生物质或蛋白分离物的核酸含量。
在某些实施方式中，在低铜条件下培养的细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至多10％、9％、8％、7.5％、7％、6％或5％粗脂肪。粗脂肪可以通过酸水解然后有机溶剂萃取来测量。简言之，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质中的脂肪或脂质首先通过酸水解分解，然后通过溶剂(例如乙醚或己烷)提取。然后蒸发溶剂，剩余的物质称为“粗脂肪”。
在某些实施方式中，其中甲烷氧化细菌与一种或多种异源生物体一起培养，例如荚膜甲基球菌巴斯与贪铜菌属、丹麦解硫胺素芽孢杆菌或两者一起培养，并任选地与土壤短芽孢杆菌组合，除了来自甲烷氧化细菌的生物质之外，细菌生物质还可以包含来自一种或多种异源生物体的生物质。
优选地，细菌生物质主要包含(即按重量计大于50％，例如大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％或大于90％)来自甲烷氧化细菌的生物质。
在某些实施方式中，其中甲烷氧化细菌与一种或多种异源生物体一起培养，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有不超过100mg铜/kg DCW(mg/kg)的铜水平。在某些实施方式中，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质的铜水平为1-100、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50或20-40mg铜/kg DCW。
在某些实施方式中，其中甲烷氧化细菌与一种或多种异源生物体一起培养，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％或81％粗蛋白，例如约71％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、82％至约99％、约71％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约82％至约95％、约71％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约82％至约90％、约71％至约85％、约75％至约85％粗蛋白。
在某些实施方式中，其中甲烷氧化细菌与一种或多种异源生物体一起培养，在低铜条件下培养的细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％真蛋白，例如约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约60％至约95％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约95％、约80％至约95％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约60％至约85％、约65％至约85％、约70％至约85％、约75％至约85％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约60％至约75％、或约60％至约70％真蛋白。
在某些实施方式中，其中甲烷氧化细菌与一种或多种异源生物体一起培养，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至多14％，例如至多13％、12％或11％灰分。
在某些实施方式中，其中甲烷氧化细菌与一种或多种异源生物体一起培养，细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至多10％，例如至多9％、8％、7％、7.5％、6％或5％核酸。
在某些实施方式中，其中甲烷氧化细菌与一种或多种异源生物体一起培养，在低铜条件下培养的细菌生物质和/或甲烷氧化细菌的生物质具有至多10％、9％、8％、7％、6％或5％粗脂肪。
在某些实施方式中，生物质从在GMP条件下培养的甲烷氧化细菌中收获。
制备蛋白分离物
在相关方面，本公开提供了通过从本文公开获得的生物质纯化蛋白质来产生蛋白分离物的方法。
术语“蛋白分离物”是指主要包含从细菌生物质分离、提取或纯化的蛋白质的组合物，该细菌生物质主要包含甲烷氧化细菌的生物质，基本上由其构成或由其构成。主要包含分离自细菌生物质的蛋白质的组合物是指其中超过50％的重量(例如，超过55％、60％、70％、75％或80％)是来自细菌生物质的蛋白质的组合物。通过使用蛋白质分离、提取、纯化技术中的一种或多种，蛋白分离物具有比制备蛋白分离物的细菌生物质更高的蛋白含量(例如，通过粗蛋白百分比测量)。然而，蛋白分离、提取或纯化不需要达到单个蛋白质彼此分离的程度。相反，蛋白分离物通常包含从细菌生物质分离、提取或纯化的蛋白质的混合物，其中去除了细菌生物质中的至少一些其它组分(例如核酸或脂质)。
通常，从甲烷氧化细菌的培养物收获的细菌生物质经历细胞破碎步骤(例如，均质化、珠磨、冷冻/解冻循环、酶消化、超声处理、弗氏压碎器和化学溶解)以初步产生裂解物，随后进行裂解物的蛋白质分离和/或一种或多种浓缩步骤(例如，絮凝、微滤、超滤、纳滤、沉淀、等电沉淀(经由pH或盐)、溶剂沉淀、基于吸附的色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法或亲和、以及热变性)以产生蛋白分离物。所得蛋白分离物可为液体蛋白分离物或进一步干燥(例如，经由喷雾干燥、冻干、蒸发、真空干燥)以获得干燥的蛋白分离物。
制备蛋白分离物的示例性工作流程是均质化细菌生物质(例如，经由微流化器)、离心均质物以获得澄清的上清液，使上清液经受微滤，使所得渗透物经受超滤，并且冻干所得渗余物以获得干粉形式的蛋白分离物。图1示出了在实施例1中使用的工作流程的特定实例的示意图。
制备蛋白分离物的另一示例性工作流程是使细菌生物质均质化(例如，经由微流化器)，将絮凝剂添加到均质物中，离心以去除细胞碎片并获得澄清上清液，使澄清上清液经受超滤，并且冻干所得渗余物以获得呈干粉形式的蛋白分离物。
制备蛋白分离物的另一示例性工作流程是使细菌生物质均质化(例如，经由微流化器)，将絮凝剂添加到均质物中，离心以去除核酸和/或细胞碎片并获得澄清上清液，使澄清上清液经受酸沉淀(例如，用H2SO4将pH调节到约4.5)，任选地洗涤沉淀的蛋白质，中和并再悬浮沉淀的蛋白质(例如，用氢氧化钠将pH调节到7)，并且冻干再悬浮的蛋白质以获得呈干粉形式的蛋白分离物。
制备蛋白分离物的另一个示例性工作流程是使细菌生物质均质化(例如，经由微流化器)，离心均质物以除去细胞碎片并获得澄清的上清液，使澄清的上清液经受酸沉淀(例如，用H2SO4调节pH至约4.5)，任选地洗涤沉淀的蛋白质，中和并再悬浮沉淀的蛋白质(例如，用氢氧化钠调节pH至7)，并冻干再悬浮的蛋白质以获得呈干粉形式的蛋白分离物。
可用于制备蛋白分离物以减少核酸和/或细胞碎片的絮凝剂，尤其是阳离子絮凝剂包括壳聚糖(例如，来自贝类或真菌来源的壳聚糖)、多聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺(PEI)、DEAE(二乙氨基乙基离子交换树脂)、DEAE-葡聚糖盐酸盐、酰胺化果胶(例如，酰胺化低甲氧基果胶)、Tramfloc 860系列(烷基胺表氯醇)、pDADMAC(二烯丙基二甲基氯化铵)、鱼鳔胶、明胶、蛋清。优选地，絮凝剂是壳聚糖、聚-L-赖氨酸、DEAE、烷基胺表氯醇和pDADMAC。
关于由细菌生物质制备蛋白分离物的其他描述可以在2019年10月7日提交的题为“Food Compositions Comprising Methylococcus Capsulatus Protein Isolate[包含荚膜甲基球菌蛋白分离物的食品组合物]”的美国临时申请中找到。
在某些实施方式中，与在正常或高铜条件下培养甲烷氧化细菌相比，在低铜条件下培养甲烷氧化细菌可提高蛋白分离物的产率。在一些实施方式中，由在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌的生物质制备的蛋白分离物的产率与由在正常或高铜条件下(例如，在150mg铜/kg DCW的铜水平下)培养的甲烷氧化细菌的生物质制备的蛋白分离物的产率的比率是至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9，或优选地至少2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5。
“蛋白分离物的产率”是指来自保留在蛋白分离物中的生物质均质物的蛋白质的百分比。换句话说，当将制备蛋白分离物的生物质均质物设定为100％时，蛋白分离物的产率是蛋白分离物中蛋白质的百分比。生物质均质物是由均质化生物质产生的混合物(参见例如图1)。蛋白质含量可通过BCA方法测量(Smith等人,Anal Biochem.[分析生物化学]150(1):76-85,1985)，例如使用ThermoFisher Scientific Pierce BCA蛋白质分析试剂盒)。
在某些实施方式中，蛋白分离物的产率为至少10％，例如至少11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％，优选至少20％、21％、22％、23％、24％或25％。
由在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌制备的蛋白分离物通常比以相同方式由在正常或高铜条件下培养的甲烷氧化细菌制备的蛋白分离物具有更高的粗蛋白含量。在某些实施方式中，由在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌制备的蛋白分离物具有至少82％，例如至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、或至少96％粗蛋白。在某些实施方式中，蛋白分离物由约82％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约82％至约95％、约85％至约95％或约90％至约95％粗蛋白构成。
在某些实施方式中，蛋白分离物由至少65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％真蛋白构成。在某些实施方式中，荚膜甲基球菌蛋白分离物由按重量计约65％至约99％、约65％至约95％、约65％至约90％、约65％至约85％、约65％至约80％、约65％至约75％、约70％至约99％、约70％至约95％、约70％至约90％、约70％至约85％、约70％至约80％、约75％至约99％、约75％至约95％、约75％至约90％、约75％至约85％、约80％至约99％、约80％至约95％、或约80％至约90％重量的真蛋白构成。由在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌制备的蛋白分离物优选地含有最少量的核酸，以最小化高核酸水平对食用蛋白分离物的动物或人的潜在不良影响(例如，引起痛风和肾结石)。在某些实施方式中，由在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌制备的蛋白分离物具有至多10％、9％、8％、7％、6％，优选至多5％、4％、3％、2％或1％核酸。
由在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌制备的蛋白分离物优选含有最少量的灰分。在某些实施方式中，荚膜甲基球菌蛋白分离物具有少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％重量的灰分。
由在低铜条件下培养的甲烷氧化细菌制备的蛋白分离物优选含有最少量的脂肪。在某些实施方式中，荚膜甲基球菌蛋白分离物具有小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％重量的粗脂肪。
在某些实施方式中，蛋白分离物具有至多100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5mg铜/kg蛋白分离物的铜水平。在一些实施方式中，蛋白分离物具有1至100、1至5、5至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至20、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、20至90、20至80、20至70、20至60、20至50、20至40mg铜/kg蛋白分离物的铜水平。
根据本公开制备的蛋白分离物可用于制备各种动物饲料或人类食品，例如，在例如汉堡包和香肠中用作肉类似物、无乳冰淇淋或酸奶、冷冻甜点、蛋白粉、蛋白质强化食品或膳食(例如，蛋白质强化零食，例如薯片和饼干)、营养饮料、烘焙食品(例如，蛋糕、饼干、布朗尼、面包)、蛋白质条、蛋白质布丁或蛋白质凝胶、调味品、酱汁、蛋黄酱、咖啡奶精、奶油沙司或汤、和蛋白酥皮。蛋白分离物的潜在用途的其他描述可以在2019年10月7日提交的题为“Food Compositions Comprising Methylococcus Capsulatus Protein Isolate[包含荚膜甲基球菌蛋白分离物的食品组合物]”的美国临时申请中找到。
在某些实施方式中，在GMP条件下从细菌生物质加工蛋白分离物。
实施例
实施例1
荚膜甲基球菌巴斯在具有不同铜浓度的连续培养系统中的生长
野生型荚膜甲基球菌巴斯在2L容器中连续发酵生长。除了不同量的铜之外，生长所需的营养物与营养主混合进料(MMF)一起过量提供。MMF的组成示于表1中。
表1.主混合进料的组成
材料 来源 浓度 单位 材料 单位
H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub> 原液 85 ％(w/w) 0.948 g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 盐 100 ％ 0.456 g
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 盐 100 ％ 0.201 g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 盐 100 ％ 0.025 g
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O Sol-n 6 g/L 0.0264 mL
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O Sol-n 2 g/L 0.0051 mL
CoSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O Sol-n 2 g/L 0.0114 mL
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O Sol-n 2 g/L 0.0201 mL
NiCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O Sol-n 2 g/L 0.0055 mL
DI水QS 1000 mL
荚膜甲基球菌巴斯具有将铜摄取到细胞中，然后使用或储存所有提供的铜(浓度在以下实施例2中测试的范围内)的能力。为了确定铜浓度对粗蛋白的影响，通过注射泵以计算的进料速率进料铜。计算基于如下假设：所有供给的铜被细菌消耗。例如：对于50μgCu/gDCW(细胞干重)的低铜(Cu)浓度和5g/L/h DCW的收获率，Cu-CuSO4·5H2O进料应为250μg/L/h。
甲烷连续发酵的条件提供在表2中。
表2.甲烷连续培养参数
参数 条件/备注
工作体积 1.5L
温度 42℃
搅拌 1200RPM
微喷射器，(20μM) 甲烷
甲烷流量 100mL/min
环形喷射器 空气
控制pO<sub>2</sub>的气流 360-720mL/min
pO<sub>2</sub>设定点 10％按气流
pH设定点 6.5
pH控制 1N NaOH，0.5M H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
主混合进料(MMF) 未添加铜
MMF功率 支持生长高达15g/L的DCW
氮进料 0.5M HNO<sub>3</sub>
N-NO<sub>3</sub>范围 5-60mg/L
稀释率 0.1 1/h
生物质收集
在整个实验中，改变条件后应用清除期以清除在先前铜浓度下获得的生物质并建立新的稳态发酵。清除期长度为20-24小时或两个发酵体积。对于每组条件，收集2-3升连续泵出的发酵液，其是获得15-20克细胞干重生物质的体积。在收集期间，将发酵液储存在冰箱中。将收集的发酵液离心，并将湿细胞沉淀储存在-80℃。接着，将沉淀冻干，并对干细胞生物质进行粗蛋白和元素分析。在生物质收集期间进行甲烷、氧气和二氧化碳的气体分析。
实施例2
使用微滤和超滤的蛋白质分离
方法与材料
从连续发酵中收集发酵液并离心。弃去液体。将收集的生物质重悬于冷的去离子水中至总固体量为6％-8％。使用5N氢氧化钠将混合物的pH调节至pH8。使用设定在22,000psi或1300bar的Microfluidics LM-10处理器均质化溶液。使溶液通过处理器1次将溶液均质化并在冰上保持冷却。均质化后用5N氢氧化钠将pH从pH7重新调节至pH8。
然后用冷水将均质化的溶液调节至2％的总固体，并在10℃以3000x g离心5分钟。将上清液小心地倒入干净的烧杯中，弃去沉淀。使用Millepore Pellicon 2系统和Durapore 0.65um过滤盒对上清液进行微滤。将渗余物压力保持在5psi。通过加入水保持渗余物体积恒定。收集2-3体积的渗透液。使用Pellicon 2 10kDa过滤盒通过超滤将渗透液浓缩10倍。使用哥伦比亚国际真空冷冻干燥器型号FD50-B2A冷冻干燥渗余物。
使用LECO 828氮分析仪，使用杜马法，通过粗蛋白百分比表征干燥的蛋白分离物。简言之，将干蛋白分离物粉末的测量样品在纯氧环境下在热炉中快速燃烧。通过使用氦气作为载气的热导检测器测量燃烧气体中释放的氮气。燃烧气体中的水分通过热电冷却器除去。通过将释放的氮量与具有已知氮含量的校准标准比较来测定蛋白分离物样品的氮含量。通过将样品的氮含量乘以氮到蛋白质的转换因子来计算蛋白分离物中的粗蛋白含量。
使用Lucigen Masterpure Complete DNA&RNA纯化试剂盒MC85200测定核酸含量。
图1显示了使用微滤接着超滤的蛋白质分离方法的流程图。
结果
与从在正常铜水平(154mg/kg生物质)下生长的生物质产生的蛋白分离物相比，从在低铜条件(25mg铜/kg生物质)下生长的生物质产生的蛋白分离物显示具有87％-88％的较高百分比粗蛋白(参见图2)。在低铜和正常铜两种条件下，核酸含量都保持在蛋白分离物总重量的2％-3％的低水平。
图3显示了从在减少量的铜水平下进行的发酵所收集的生物质中粗蛋白的增加。在低铜(0.038g/kg)下的发酵产生82％-83％的粗蛋白，而在正常(0.154g/kg)和高铜(0.371g/kg)水平下的发酵分别产生约75％和75％-77％的粗蛋白。
图4显示了在那些不同铜水平条件(23、80、96和140mg/kg)下生长的生物质的粗蛋白、脂肪和灰分含量的分析结果。降低的铜水平增加了蛋白分离物的粗蛋白百分比，同时降低了脂肪和灰分百分比。
总之，结果显示与正常铜水平下生长的生物质相比，来自低铜水平下生长的生物质的粗蛋白百分比更高(图3和4)。此外，在相同的下游加工(DSP)条件下，蛋白分离物产物中生物质的粗蛋白维持在更高水平(图2)。
上述各种实施方式可以被组合以提供另外的实施方式。在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开(包括2019年10月7日提交的美国专利申请号62/911,747)通过引用以其整体并入本文。如果有必要，则可以对实施方式的各方面进行修改以采用各个专利、申请和出版物的概念来提供再另外的实施方式。
鉴于以上详细描述，可以对实施方式作出这些和其他改变。通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求中公开的具体实施方式，而是应当被解释为包括所有可行的实施方式以及这种权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求不受本公开限制。

Claims (26)

1.一种用于产生生物质的方法，该方法包括：
(a)以不超过100mg铜/kg细胞干重(DCW)的铜水平连续培养甲烷氧化细菌以产生生物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述甲烷氧化细菌是荚膜甲基球菌巴斯。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述铜水平为20-70mg铜/kg DCW。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物质包含至少71％粗蛋白，优选地至少80％粗蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物质包含至多7.5％脂肪。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物质包含至多11％灰分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述生物质包含至多10％核酸，优选地至多5％核酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，该方法进一步包括：
(b)从所述生物质纯化蛋白质以产生蛋白分离物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(b)包括(i)破碎所述生物质的细胞以产生裂解物，和(ii)从所述裂解物中分离和/或浓缩蛋白质。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述蛋白分离物具有至少82％粗蛋白，优选地至少85％粗蛋白。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述蛋白分离物的产率高于以相同方式但所述甲烷氧化细菌在150mg铜/kg DCW的铜水平下培养而制备的蛋白分离物的产率。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述蛋白分离物的产率为至少约15％，优选地至少约20％。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白分离物的产率与以相同方式但所述甲烷氧化细菌在150mg铜/kg DCW的铜水平下培养而制备的蛋白分离物的产率的比率为至少1.2或至少1.5，优选地至少2.0或至少2.5。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述蛋白分离物包含至多3％核酸。
15.一种细菌生物质，其主要包含铜水平不超过100mg铜/kg细胞干重(DCW)的甲烷氧化细菌的生物质，基本上由其构成或由其构成。
16.根据权利要求15所述的细菌生物质，其中所述细菌生物质和/或所述甲烷氧化细菌的生物质具有20-70mg铜/kg DCW范围内的铜水平。
17.根据权利要求15或16所述的细菌生物质，其中所述细菌生物质和/或所述甲烷氧化细菌的生物质具有至少71％粗蛋白，优选地至少80％粗蛋白。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的细菌生物质，其中所述细菌生物质和/或所述甲烷氧化细菌的生物质具有至多7.5％脂肪。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的生物质，其中所述细菌生物质和/或所述甲烷氧化细菌的生物质包含至多11％灰分。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的细菌生物质，其中所述细菌生物质和/或所述甲烷氧化细菌的生物质包含至多10％核酸，优选地至多5％核酸。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的细菌生物质，其中所述甲烷氧化细菌是荚膜甲基球菌巴斯。
22.一种由主要包含甲烷氧化细菌的生物质的细菌生物质制备的蛋白分离物，其中所述蛋白分离物包含至少82％粗蛋白，优选地至少85％粗蛋白。
23.根据权利要求22所述的蛋白分离物，其中所述蛋白分离物包含至多3％核酸。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的蛋白分离物，其中所述甲烷氧化细菌是荚膜甲基球菌巴斯。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的蛋白分离物，其中所述细菌生物质和/或所述甲烷氧化细菌的生物质具有不超过100mg铜/kg细胞干重(DCW)的铜水平。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的蛋白分离物，其中所述蛋白分离物具有不超过100mg铜/kg蛋白分离物的铜水平。
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