CN108350472A

CN108350472A - 芳族化合物及其衍生物的制造方法

Info

Publication number: CN108350472A
Application number: CN201680048974.4A
Authority: CN
Inventors: 野田修平; 白井智量
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2015-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2018-07-31
Also published as: JPWO2017033965A1; US20180237813A1; EP3342874A4; WO2017033965A1; EP3342874A1

Abstract

本发明提供以较高的生产性通过微生物来制造水杨酸等的芳族化合物及其衍生物的方法。本发明提供：改变了糖代谢途径的微生物的制造方法，所述方法包括：抑制编码微生物的磷酸转移酶系酶的基因的表达，抑制编码该微生物的丙酮酸激酶的基因的表达，而且将编码该微生物可由分支酸或异分支酸合成芳族化合物的酶的1或多个基因导入到微生物中；通过该方法所得的改变了的微生物；以及，芳族化合物及其衍生物的制造方法，所述方法包括：培养该微生物，从培养液中回收芳族化合物等。

Description

芳族化合物及其衍生物的制造方法

技术领域

本发明涉及改变了糖代谢途径的微生物的制造方法。本发明还涉及通过该方法所得的改变了的微生物，以及包含培养该微生物、从培养液中回收芳族化合物或其衍生物的芳族化合物等的制造方法。

背景技术

为了可持续的社会形成，谋求从环境负荷大、以及担心将来枯竭的石油依赖型社会向依赖于可再生的生物质(biomass)资源的生物炼制型的社会的改革，近年来，集中关注着利用微生物的芳族化合物的制造。

微生物的代谢途径中，许多芳族化合物可以经由莽草酸途径进行合成。莽草酸途径的最初反应是由赤藓糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)向3-脱氧-D-庚糖醛酸-7-磷酸(DAHP)的、通过DAHP合酶所催化的缩合反应。继续进行该反应，经由共同的前驱物质(前体物)即分支酸而生成包含芳族氨基酸的各种芳族化合物。分支酸可通过仅仅几个步骤转化成多种的芳族化合物，可以成为芳族化合物的生物合成途径中的主要化合物。

作为分支酸衍生物的水杨酸是在医药品、化妆品、食品等中利用的最重要的芳族化合物之一，例如是阿司匹林和拉米夫定(抗-HIV药)制造的前驱物质。近年来，报道了：可以通过微生物的和化学方法将水杨酸转化成尼龙-6,6的原料即己二酸。

在微生物等的生物体内中，水杨酸可以经由通过将分支酸转化成异分支酸的异分支酸合酶(ICS)、和促进异分支酸的脱丙酮酸的异分支酸丙酮酸裂解酶(IPL)所催化的2个反应进行合成。非专利文献1中显示出：可以进行来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的水杨酸合成基因的分析，通过上述2种酶的作用由分支酸生物合成水杨酸。另外，报道了：使大肠杆菌中的ICS即EntC和来自绿脓杆菌的IPL (PchB)在大肠杆菌中表达，合成了水杨酸(非专利文献2)。但是，这些方法中的水杨酸的生产性低，现状是尚未开发出实际应用上有效的生物合成方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Serino L.等人、Mol Gen Genet.、1995年、249卷、2号、217～228页；

非专利文献2：Lin Y.等人、Metab Eng.、2014年、23卷、62～69页。

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，仅使水杨酸合成酶在大肠杆菌中表达，无法获得可以满足程度的生产性。这暗示：由于在大肠杆菌内进行的各种复杂的酶反应的存在，仅将所期望的反应组合无法获得目标化合物的高生产性。

用于解决课题的手段

本发明人为了改善碳向芳族化合物的生物合成途径的流动，研究了几种的策略。在莽草酸途径中，在细胞内的PEP和E4P的利用性是最重要的因子之一，在强化芳族化合物合成途径的基础上，在细胞内的PEP利用量的强化是重要的。

微生物的主要的代谢途径中，存在2个消费PEP的反应。一方面是使用磷酸转移酶系(PTS)的葡萄糖的摄入，为了摄入1mol的葡萄糖，消费1mol的PEP，而形成丙酮酸。另一方面是糖酵解途径中的基于丙酮酸激酶的PEP转化成丙酮酸(图1)。

已知：为了改善PEP和E4P的利用性，而使磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)和转酮醇酶(tktA)过剩表达。因此，这些基因的导入可以成为提高芳族化合物的生产性的方法，但由于通过tktA所催化的反应是可逆反应，因此反应不会仅朝着蓄积E4P的方向进行。另外，即使过剩表达ppsA，使上述的基于PTS和丙酮酸激酶的反应非常容易地进行，也无法获得充分的效果。

本发明人认为：为了合成芳族化合物而改变碳的流动时，在上述的2个反应中改变代谢途径以不消费PEP是必要的，在各种的研究中，导入参与水杨酸合成的基因，同时在细胞内将PEP转化成丙酮酸的上述的2个反应钝化(不活化)，结果，使水杨酸和L-苯丙氨酸的生成量较原始株(元の株)分别提升了3倍和2倍。

其次，还注意到：碳向水杨酸合成的流动与碳向L-苯丙氨酸的流动发生竞争，通过将L-苯丙氨酸的生物合成途径钝化，可以使水杨酸的生产性进一步提升，而增加收率。该情形下，微生物成为主要经由水杨酸合成途径获得丙酮酸。

通过上述的改变，关于PEP和E4P的利用性，不导入至今为止大多研究的基因(tktA、ppsA和csrB)，可以由作为唯一碳源的葡萄糖来改良水杨酸的生产性。

而且，还使用所得的株应用于4-羟基苯甲酸(PHBA)、3-羟基苯甲酸(3HBA)、4-氨基苯甲酸(4ABA)、2-氨基苯甲酸(2ABA)、L-酪氨酸、酚、顺式,顺式-粘康酸(MA)、龙胆酸、马来酰丙酮酸和马来酸等的其他分支酸衍生物的产生，实证了其多用途性。因此，本发明人制作的细胞株可以成为用于微生物中的芳族化合物生产的平台(platform)细胞株。

即，本发明提供以下内容。

1. 改变了糖代谢途径的微生物的制造方法，上述方法包括：

抑制编码微生物的磷酸转移酶系酶的基因的表达，

抑制编码该微生物的丙酮酸激酶的基因的表达，而且

将编码该微生物可由分支酸或异分支酸合成芳族化合物的酶的1或多个基因导入到微生物中。

2. 上述1所述的方法，所述方法进一步包括：抑制编码由分支酸合成L-苯丙氨酸的酶的基因的表达。

3. 上述1或2所述的方法，其中，芳族化合物为水杨酸，导入编码异分支酸合酶的基因和编码异分支酸丙酮酸裂解酶的基因。

4. 上述1或2所述的方法，其中，芳族化合物为4-羟基苯甲酸，导入编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因。

5. 上述1或2所述的方法，其中，芳族化合物为3-羟基苯甲酸，导入编码3-羟基苯甲酸合酶的基因。

6. 上述1或2所述的方法，其中，芳族化合物为4-氨基苯甲酸，导入编码氨基脱氧分支酸合酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因。

7. 上述1或2所述的方法，其中，芳族化合物为2-氨基苯甲酸，导入编码氨茴酸合酶的基因。

8. 上述1或2所述的方法，其中，芳族化合物为L-酪氨酸，导入编码分支酸变位酶的基因和编码预苯酸脱水酶的基因。

9. 上述1或2所述的方法，其中，芳族化合物为酚，导入编码酪氨酸酚裂解酶的基因。

10. 上述3所述的方法，其中，进一步导入编码水杨酸1-单加氧酶的基因和编码儿茶酚1,2-双加氧酶的基因。

11. 上述5所述的方法，其中，进一步导入编码可由微生物的3-羟基苯甲酸合成龙胆酸、马来酰丙酮酸和/或马来酸的酶的1或多个基因。

12. 通过上述1～11的任一项所述的方法所得的、改变了糖代谢途径的微生物。

13. 上述12所述的微生物，其中，微生物选自细菌类、酵母类和真菌类。

14. 芳族化合物或其衍生物的制造方法，所述方法包括：培养上述12或13所述的微生物，从培养液中回收芳族化合物或其衍生物。

15. 上述14所述的方法，其中，芳族化合物为水杨酸、4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酸、L-酪氨酸或酚，衍生物为粘康酸、龙胆酸、马来酰丙酮酸或马来酸。

16. 上述14或15所述的方法，其中，仅添加葡萄糖作为碳源。

本说明书包含成为本申请的优先权基础的日本国专利申请号2015-165023号的公开内容。

发明效果

通过本发明，改变大肠杆菌等微生物的代谢途径，增加细胞内的PEP利用性，同时阻止碳源向L-苯丙氨酸的流动，由此可以由葡萄糖等碳源大量地制造芳族化合物。另外，如果使用本发明所发现的细胞株，还可以制造各种的分支酸衍生物。

本发明所涉及的改变了的微生物，可在5mL试验管培养条件下，以克(gram)规模生产PHBA、3HBA、PABA、2ABA、酪氨酸、酚、粘康酸、龙胆酸、马来酰丙酮酸、或马来酸等芳族化合物。通过本发明成功获取了重要的二羧酸即粘康酸的生产株。这是与将葡萄糖用于单一碳源的粘康酸生产相关的最初报道。

附图说明

[图1] 显示大肠杆菌中的水杨酸生成的代谢途径。

[图2] 模式性地显示质粒pCFTdeltain的结构。

[图3] 显示CFT01株、CFT11株和CFT31株的培养特性。显示(A) OD₆₀₀、(B)葡萄糖浓度、(C)水杨酸浓度、和(D) L-苯丙氨酸浓度的经时性变化。

[图4] 显示CFT51株的培养特性。显示(A) OD₆₀₀、(B)葡萄糖浓度、和(C)水杨酸浓度的经时性变化。

[图5] 显示CFT01株、CFT11株、CFT31株和CFT51株中的水杨酸的收量和每单位菌体的水杨酸生产能。

[图6] 显示2-升的罐发酵器中的CFT01株和CFT51株的培养特性，显示CFT01株的(A)细胞增殖(OD₆₀₀)、(B)葡萄糖浓度变化、(C)水杨酸浓度变化和CFT51株的(D)细胞增殖(OD₆₀₀)、(E)葡萄糖浓度变化、(F)水杨酸浓度变化。

[图7] 显示由分支酸生成各种芳族化合物的途径。

[图8] 显示使用CFT5株的分支酸衍生物的生成量的增加。分别显示(A) 4-羟基苯甲酸(PHBA)、(B) 3-羟基苯甲酸(3HBA)、(C) 4-氨基苯甲酸(PABA)、(D) 2-氨基苯甲酸(2ABA)、(E) L-酪氨酸、和(F)酚的生成量和收率。

[图9] 显示用于由分支酸经由龙胆酸、马来酰丙酮酸合成马来酸的途径。

[图10] 显示CMtS09株和CMtS10株的培养特性。(A)和(B)分别显示CMtS09株和CMtS10株的OD₆₀₀(●)和葡萄糖浓度(□)的经时性变化，(C)和(D)分别显示CMtS09株和CMtS10株中的马来酸(●)、3-羟基苯甲酸(■)、和龙胆酸(▲)的生成量。

[图11] 显示CMtS091株和CMtS101株的培养特性。(A)和(B)分别显示CMtS091株和CMtS101株的OD₆₀₀(●)和葡萄糖浓度(□)的经时性变化，(C)和(D)分别显示CMtS091株和CMtS101株中的马来酸(●)、3-羟基苯甲酸(■)、和龙胆酸(▲)的生成量。

具体实施方式

如上所述，本发明人设计了在微生物中用于使芳族化合物过剩表达的新型代谢途径。

即，本发明提供改变了糖代谢途径的微生物的方法，上述方法包括：

抑制编码微生物的磷酸转移酶系酶的基因的表达，

抑制编码该微生物的丙酮酸激酶的基因的表达，而且

本说明书中，“糖代谢途径”是指，为了使葡萄糖等的糖类作为用于能量源和各种化合物的生物合成的原料而用于分解和转化的各种的生物体内反应系，包括糖酵解途径、TCA循环、戊糖磷酸途径、莽草酸途径等。例如，图1所示的水杨酸的生物合成途径是用于说明基于本发明方法的改变糖代谢途径的途径，但本说明书中的“糖代谢途径”没有意旨限于该途径。本领域技术人员可以容易地想到使用葡萄糖以外的糖类、或糖类的分解产物等作为糖类可以适宜本发明方法的“糖代谢途径”。

如图1所示，在本发明的方法中，微生物的生物体内改变成：使分支酸(Cho)首先通过异分支酸合酶(ICS)转化成异分支酸((Iso) Cho)，其次通过异分支酸丙酮酸裂解酶(IPL)由异分支酸释放丙酮酸(Pyr)，而生成水杨酸。在后者的反应中，伴随水杨酸合成，由异分支酸释放丙酮酸。丙酮酸对微生物而言是必需的化合物，水杨酸生成的过程中所得的丙酮酸可以用于糖酵解途径。本发明的方法在于，将微生物本身所具有的糖代谢途径改变成例如仅在生成水杨酸的情形产生丙酮酸，获取适合于水杨酸等芳族化合物的过剩表达的微生物。

本发明的方法中导入的基因虽然可以是任一种的微生物本身所具有的基因，但为通过各种的表达控制机制等、在通常的培养条件下、几乎或完全不表达的基因。通过本发明的方法，可以显著地增加使用微生物的目标芳族化合物的生产量。

本发明中意旨改变的糖代谢途径几乎所有的微生物都具有。因此，本发明的方法中，作为可以改变糖代谢途径的微生物，只要是培养和目标化合物的回收容易的微生物均可，没有特别限定。作为可以适合地使用的微生物，例如可举出：大肠杆菌(Escherichia coli)等的埃希氏菌属细菌、棒状杆菌属细菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)等的杆菌属细菌、链霉菌属、链球菌属等的放线菌等的细菌类；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的酵母属酵母、毕赤酵母(Pichia pastoris)等的毕赤酵母(Pichia)属酵母等的酵母类；米曲霉(Aspergillus oryzae)等的曲霉属菌等的真菌类等。

使用大肠杆菌的情形下，优选：从通过使莽草酸途径(苯丙氨酸合成途径)活化，可以生产性更高地合成分支酸的观点出发，优选苯丙氨酸高生产性大肠杆菌株。作为这样的大肠杆菌株，例如可举出：ATCC31882株、ATCC31883株、ATCC31884株，更优选ATCC31882株。

本发明的实施例中，作为母株使用的ATCC31882株为L-苯丙氨酸过剩产生株，与L-苯丙氨酸产生相关的反馈抑制已经得以解除。本发明人关注到磷酸烯醇丙酮酸(PEP)在细胞内的利用性，对增加可用于水杨酸合成的PEP量进行了研究。首先，为了使PEP的消费降低，本发明人将磷酸转移酶系(PTS)替换为半乳糖透性酶(GalP)和葡糖激酶(Glk)的组合系。所得的本发明的改变株显示0.55的比增殖速度(μ)，为与ATCC31882株几乎同样的增殖和葡萄糖消费速度，显示出已成功制作PTS-钝化株。

因此，本发明的方法包含抑制编码磷酸转移酶系酶的基因的表达。

本说明书中，“基因”是指，蛋白质、特别是具有编码酶的多核苷酸序列的DNA和RNA，可以是天然的基因，也可以是对天然的基因加入变异、或化学合成而得的基因，还可以是实施了本领域中众所周知的各种修饰而得的基因。另外，只要具有目标酶活性，不仅编码酶的全长蛋白质的所得物、而且编码具有酶活性的功能性片段的所得物也包含在“基因”中。

本说明书中，“磷酸转移酶系酶”是指，细菌等的微生物中的糖的输送系的酶，将细胞外的葡萄糖等的糖摄入到细胞内时，使PEP的磷酸基转移到葡萄糖而生成丙酮酸，同时将葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的酶组。所生成的葡萄糖-6-磷酸在其后糖酵解系进行代谢。“磷酸转移酶系”在本领域中也称之为“磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系”。

“磷酸转移酶系酶”由多种的酶构成。为了不引起基于磷酸转移酶系酶的酶反应，没有必要抑制构成磷酸转移酶系的所有酶的表达，通过抑制编码1种以上酶的基因、优选ptsH (例如NCBI Gene ID: 946886)和ptsI (例如NCBI Gene ID: 946879)的表达既可以实现。

本说明书中，“抑制基因的表达”是指，使其基因本身所编码的蛋白质不能表达，包含将微生物的基因组基因序列变异而使基因的一部分或全部人为地缺损、以及抑制基因的转录和/或翻译，使用本领域中所用的任一种方法即可。

作为使基因序列变异的方法，可以适合地使用基因重组技术。作为用于使基因缺失的方法，没有限定，例如，如实施例所记载，可以使用Quick & Easy E. coli GeneDeletion Kit (Funakoshi, Tokyo, Japan)等的市售试剂盒(http://www.funakoshi.co.jp/contents/580)。以试剂盒中所含的基因片段为模板，使用适当的引物进行PCR，由此可以破坏目标基因。

另外，实施例中所用的载体pCFTdeltain可以在以将ptsHI的破坏和GalP-Glk的导入同时进行为目的，用于制作破坏片段和导入基因融合而得的片段中使用。其序列的一部分示于SEQ ID NO: 36。

SEQ ID NO: 36

另外，作为用于抑制基因的转录/翻译的方法，例如可以使用反义RNA或siRNA等的RNA干扰。

本领域技术人员可以适宜设计、合成、或获取用于抑制目标基因的表达而使用的载体和反义RNA等。

微生物中抑制编码磷酸转移酶系酶的基因的表达、使该酶缺损的情形，不产生由葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的反应，因此为了确保葡萄糖-6-磷酸的生成，优选将该系替换成不利用PEP的反应、即将半乳糖透性酶(GalP)和葡糖激酶(Glk)组合的系。或还可以导入其他糖化酶或己糖激酶。导入的酶和酶系可以根据利用的碳源等进行适宜选择。

为了进一步增加水杨酸的生产性，本发明人将另1个的PEP消费反应、即通过丙酮酸激酶(PykF和PykA)所催化的、糖酵解途径中的由PEP转化成丙酮酸钝化。PEP在糖酵解途径中以ADP为辅因子通过PykF和PykA转化成丙酮酸。通过使催化该反应的酶缺损，可以仅在生成水杨酸的情形，使微生物中产生必需的丙酮酸。

因此，本发明的方法包括使编码丙酮酸激酶的基因缺失或抑制其表达。pykF (例如NCBI Gene ID: 946179)和pykA (例如NCBI Gene ID: 946527)同时以ADP为辅酶，编码催化由PEP生成丙酮酸的反应的丙酮酸激酶，但在大肠杆菌等的细胞中两方的基因相辅性地发挥作用，因此如果不使两基因缺损，则无法完全地抑制反应。

本发明的方法进一步包括将编码该微生物可由分支酸或异分支酸合成芳族化合物的酶的1或多个基因导入到微生物中。

“可由分支酸或异分支酸合成芳族化合物的酶”根据目标芳族化合物而不同。例如，在使用本发明的微生物和方法合成水杨酸的情形下，如下进行详细地说明，“可由分支酸或异分支酸合成芳族化合物的酶”是异分支酸合酶(ICS)和异分支酸丙酮酸裂解酶(IPL)。

在使用本发明的化合物的制造中，也有利用微生物本身所具有的酶反应的情形。因此，没有必要使导入的基因与用于目标化合物的合成所必要的所有酶对应，只要导入编码催化所期望促进的一部分反应的酶的基因即可。另外，在根据目标化合物而必要的情形下，可以使2个以上的基因个别地、连续或同时地导入。

另外，使用本发明的微生物和方法，还可以由分支酸化合物经由特定的芳族化合物、进一步地合成其他化合物。进一步形成的化合物也包含非芳族的化合物，因此，为了意旨这些化合物，本说明书中记载为“芳族化合物的衍生物”。或者，另外在可以以分支酸为起始化合物的1个以上的反应中生成的含义上，本说明书中，有时将上述的化合物也包含芳族化合物在内记载为“分支酸衍生物”。

作为微生物中可由分支酸或异分支酸合成的芳族化合物或其衍生物，没有特别限定，例如可举出：水杨酸、水杨酸甲酯、乙酰水杨酸(阿司匹林)、儿茶酚、己二酸、1,6-己二醇、4-羟基苯甲酸(PHBA)、3-羟基苯甲酸(3HBA)、2,5-二羟基苯甲酸(龙胆酸)、马来酰丙酮酸、马来酸、富马酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、2-氨基苯甲酸(2ABA)、L-色氨酸、色胺、苯胺、L-酪氨酸、酚、顺式,顺式-粘康酸、反式,反式-粘康酸等。

需要说明的是，上述的本发明的方法分为以下3个步骤记载：

(1) 抑制编码微生物的磷酸转移酶系酶的基因的表达；

(2) 抑制编码该微生物的丙酮酸激酶的基因的表达；

(3) 将编码该微生物可由分支酸或异分支酸合成芳族化合物的酶的1或多个基因导入到微生物中，

该记载可以理解为不是说明微生物的改变顺序，可以以任何的顺序实施，还可以同时地进行。

通过本发明的方法使PEP的细胞内利用性增加，由此水杨酸和L-苯丙氨酸的生成量均较原始株上升。本发明人进一步发现了：通过将L-苯丙氨酸的生物合成途径钝化，可以使水杨酸的生产性进一步提升而增加收率。

因此，本发明的方法进一步包括使编码由分支酸合成L-苯丙氨酸的酶的基因缺失或抑制其表达。

没有特别限定，以下记载：使用本发明的方法用于制造芳族化合物而导入的设想基因的例子。

目标芳族化合物为水杨酸的情形，本发明的方法包括导入编码异分支酸合酶的基因和编码异分支酸丙酮酸裂解酶的基因。

异分支酸合酶(ICS)是将分支酸转化成异分支酸的酶。作为可在本发明中使用的编码ICS的基因，没有特别限定，例如可举出：来自大肠杆菌的menF (NCBI Gene ID:946712)和entC (NCBI Gene ID: 945511)；来自绿脓杆菌(Psudomonas aeroginosa)的pchA (SEQ ID NO: 37)；来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtICS、以及来自短柄草(Brachypodium distachyon)的BrICS等。

SEQ ID NO: 37

异分支酸丙酮酸裂解酶(IPL)是促进异分支酸的脱丙酮酸，转化成水杨酸的酶。作为可在本发明中使用的编码IPL的基因，没有特别限定，例如优选来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeroginosa)的pchB (SEQ ID NO: 38)、来自结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的MbtI和来自小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)的Irp9，更优选pchB。

SEQ ID NO: 38

目标芳族化合物为4-羟基苯甲酸的情形，本发明的方法包括导入编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因。

分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.1.3.40)是将分支酸转化成4-羟基苯甲酸和丙酮酸的酶。作为可在本发明中使用的基因，没有特别限定，例如可举出：来自大肠杆菌的ubiC (SEQID NO: 39)。

SEQ ID NO: 39

目标芳族化合物为3-羟基苯甲酸的情形，本发明的方法包括导入编码3-羟基苯甲酸合酶的基因。

3-羟基苯甲酸合酶(EC 4.1.3.45)是将分支酸转化成3-羟基苯甲酸和丙酮酸的酶。作为可在本发明中使用的基因，没有特别限定，例如可举出：来自吸水链霉菌(S. hygroscopicus)的hyg5 (SEQ ID NO: 40)和来自链霉菌属(Streptomyces sp.) LZ35的cuv10 (SEQ ID NO: 41)。

SEQ ID NO: 40

SEQ ID NO: 41

目标芳族化合物为4-氨基苯甲酸的情形，本发明的方法包括导入编码氨基脱氧分支酸合酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因。

氨基脱氧分支酸合酶(EC 2.6.1.85)是将分支酸和L-谷氨酰胺转化成4-氨基-4-脱氧分支酸和L-谷氨酸的酶。4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶(EC 4.1.3.38)是将4-氨基-4-脱氧分支酸转化成4-氨基苯甲酸和丙酮酸的酶。作为编码这些酶的基因，没有限定，例如可举出：来自大肠杆菌的pabA、pabB和pabC (SEQ ID NO: 42)。

SEQ ID NO: 42

目标芳族化合物为2-氨基苯甲酸的情形，本发明的方法包括导入编码氨茴酸合酶的基因。

氨茴酸合酶(EC 4.1.3.27)是将分支酸和L-谷氨酰胺转化成氨茴酸、丙酮酸、L-谷氨酸的酶。作为可在本发明中使用的基因，例如可举出：来自大肠杆菌的trpE (NCBI GeneID: 945846)和trpG (NCBI Gene ID: 945109、Microbial Cell Factories 2009, 8:19,Doi: 10.1186/1475-2859-8-19)。

芳族化合物为L-酪氨酸的情形，本发明的方法包括导入编码分支酸变位酶的基因和编码预苯酸脱水酶的基因。

分支酸变位酶(EC 5.4.99.5)是将分支酸转化成预苯酸的异构酶。预苯酸脱水酶(EC 4.2.1.51)是将预苯酸转化成苯基丙酮酸与水和二氧化碳的酶。作为编码这些酶的基因，可举出：来自大肠杆菌的tyrA^fbr(SEQ ID NO: 43)。

SEQ ID NO: 43

目标芳族化合物为酚的情形，本发明的方法包括导入编码酪氨酸酚裂解酶的基因。

酪氨酸酚裂解酶(TPL、EC 4.1.99.2)是催化将L-酪氨酸和水阶段性地转化成酚、丙酮酸和氨的反应的酶。作为可在本发明中使用的编码TPL的基因，没有特别限定，例如可举出：来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的tpl (SEQ ID NO: 44)。

SEQ ID NO: 44

另外，通过向使可以合成水杨酸而改变的微生物中进一步导入编码水杨酸1-单加氧酶的基因和编码儿茶酚1,2-双加氧酶的基因，可以合成顺式,顺式-粘康酸。

水杨酸1-单加氧酶(SMO、EC 1.14.13.1)是以NADH作为辅酶将水杨酸转化成儿茶酚的酶。儿茶酚1,2-双加氧酶(CDO、EC 1.13.11.1)是将儿茶酚转化成顺式,顺式-粘康酸的酶。作为编码这些酶的基因，没有特别限定，例如可举出：来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) TK2440的nahG^opt(SEQ ID NO: 45)和来自恶臭假单胞菌DOT-T1E的catA (SEQ IDNO: 46)。

SEQ ID NO: 45

SEQ ID NO: 46

另外，可以向使可以合成3-羟基苯甲酸而改变的微生物中导入编码可由3-羟基苯甲酸合成龙胆酸、马来酰丙酮酸、和/或马来酸的酶的1或多个基因。作为可用于该目的的基因，可举出：编码3-羟基苯甲酸6-羟基化酶的基因、编码龙胆酸-1,2-双加氧酶的基因、和编码马来酰丙酮酸水解酶的基因(图9)。关于本发明的方法，由于利用微生物本身所具有的生物合成途径，因此根据微生物的种类，可以变动必须导入的基因。或者，上述的基因可以与编码3-羟基苯甲酸合酶的基因一起导入到微生物中。

3-羟基苯甲酸6-羟基化酶(3H6H、EC 1.14.13.24)是将3-羟基苯甲酸转化成龙胆酸的酶。作为编码该酶的基因，没有特别限定，例如可举出：来自红球菌(Rhodococcus jostii) RHA1的3hb6h (SEQ ID NO: 47)。

SEQ ID NO: 47

龙胆酸-1,2-双加氧酶(GDO、EC 1.13.11.4)是将龙胆酸转化成马来酰丙酮酸的酶。作为编码该酶的基因(g12d)，没有特别限定，例如可举出：来自红球菌属(Rhodococcus sp.)NCIMB 12038的mps2 (SEQ ID NO: 48)。

SEQ ID NO: 48

马来酰丙酮酸水解酶(MPH、EC 3.7.1.23)是将马来酰丙酮酸转化成马来酸的酶。作为编码该酶的基因，没有特别限定，例如可举出：来自产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) NCIMB 9867的hbzF (SEQ ID NO: 49)。

SEQ ID NO: 49

意旨导入到微生物中的基因可以适合地使用由Invitrogen等供应商市售的基因。另外，这些基因的碱基序列等信息可以通过互联网进入美国的国立生物工学信息中心(National Center for Biotechnology Information、NCBI)等所公开的数据库而获取，根据情形，也可以化学合成。

关于各基因，根据情形，还可以改变其核苷酸序列，维持或进一步提高其酶活性。因此，例如作为编码异分支酸合酶的基因，还可以使用与由SEQ ID NO: 37记载的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸、由与SEQ ID NO: 37记载的核苷酸序列具有90％以上、95％以上、99％以上的序列同源性的序列构成的多核苷酸。

为了导入基因，优选使用适合于各基因的引物，通过聚合酶链反应(PCR)来扩增基因。其情形，通过选择模板和引物，还可以以2个以上基因连接而成的形态同时地扩增。

将基因导入微生物时，可以将上述的编码各酶的基因插入到适当的表达载体中。其情形，优选按照成为宿主的微生物进行密码子的优化。

本领域技术人员在本发明的方法中使用和改变细菌类、酵母类、真菌类时，可以选择适合于各自中的基因导入的表达载体。用于基因导入或改变的表达载体可以例如从Invitrogen、Life technologies、Expressys等的供应商购入市售品，还可以基于它们根据目的进一步进行改变。

需要说明的是，本说明书中，“表达载体”是指，自我复制载体、即以染色体外的独立体形式存在，其复制不依赖于染色体的复制，例如可以以质粒为基础进行构建。另外，所述表达载体的构建的程序和方法可以使用在基因工学的领域常用者。

关于表达载体，为了向微生物导入基因而使目标酶表达，期望包含：编码该酶的多核苷酸、以及控制其表达的DNA序列或用于选择已转化的大肠杆菌的基因标记物等。

作为控制表达的DNA序列，启动子、增强子、终止子、核蛋白体结合序列(RBS)等包含在其中。另外，在前述控制表达的DNA序列以外还可以包含诱导表达的DNA序列。作为所述诱导表达的DNA序列，可举出：通过异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的添加，可以诱导在下游所配置的基因的表达的乳糖操纵子。本发明中的基因标记物可以根据已转化的大肠杆菌的选择性方法进行适宜选择，例如可以利用编码药物抗性的基因、辅助营养需求性的基因。

在意旨导入2以上基因的情形下，可以同时或分别地导入包含各自的基因的2以上的表达载体，或可以将这些基因串联地插入1个表达载体。蛋白质还可以通过或不通过适当的接头以融合蛋白质的形态表达。

另外，本发明的方法中，还可以使已导入的基因所编码的酶与其它功能性蛋白质或肽融合而表达。其它功能性蛋白质或肽可以与酶的氨基末端、羧基末端的任一侧或两侧直接性或间接性地融合。作为其它功能性蛋白质，没有特别限制，根据必要的功能进行适宜选择。例如，为了蛋白质的精制或检测等，可以使用绿色荧光蛋白质(GFP)、荧光素酶蛋白质、Myc-标签(tag)蛋白质、His-标签蛋白质、血凝素(HA)-标签蛋白质、FLAG-标签蛋白质(注册商标、Sigma-Aldrich社)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白质等。

本发明还提供通过本发明的方法获得的、糖代谢途径获得改变的微生物。微生物从细菌类、酵母类、和真菌类中选择。

本发明还提供芳族化合物或其衍生物的制造方法，所述方法包括：培养上述的本发明的获得改变的微生物，从培养液回收芳族化合物或其衍生物。

微生物的培养条件依赖于所选择的微生物。本领域技术人员可以根据各种的细菌类、酵母类、真菌类等的微生物选择适当的培养基和培养条件，没有特别限定。例如大肠杆菌的培养条件如以下和实施例中所记载。

培养基可以是液体培养基也可以是固体培养基，从容易回收分泌到菌体外的产物的观点出发，优选为液体培养基。培养基除了包含培养微生物所必要的成分之外，还可包含可以成为意旨高生产的芳族化合物等的生物合成原料的碳源。

作为碳源，没有特别限定，优选为葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、二羟基丙酮磷酸、甘油醛-3-磷酸、1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、乙酰CoA等，为了进一步提供将作为可再生资源的生物质用于原料的清洁的制造方法，更优选作为生物质的主成分的葡萄糖。本发明的一个实施方式中，可以将葡萄糖作为唯一的碳源添加。另外，添加到培养基中的碳源的量可以根据碳源的种类、微生物的种类等适宜调整，通常为20～200g/L、优选为20～50g/L。

作为微生物的培养所必需的成分，没有特别限制，可举出：酵母提取物、多肽、三肽、酪蛋白及其代谢物、玉米浆、大豆蛋白质、肉膏、鱼肉膏等的氮源。另外，优选添加镁盐、钠盐、铁盐、锰盐等的金属盐。作为金属盐，可举出：氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铁(II)、硫酸铁(III)、氯化铁(II)、氯化铁(III)、枸橼酸铁、硫酸铵铁、氯化钙二水合物、硫酸钙、硫酸镁、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化铜、硫酸锰、氯化锰。进一步根据需要，可在培养基中添加生物素、烟酸、硫胺素、核黄素、肌醇、吡哆醇等维生素类、核酸关联物质等。

另外，培养基中可以添加用于诱导蛋白质表达的物质、例如IPTG等或用于选择细胞所使用的抗生物质、例如青霉素系、β-内酰胺系、大环内酯系、氯霉素系、四环素系、氨基糖苷系、酮内酯系、多烯大环内酯系、糖肽系、核酸系、多聚羧酸系等抗生物质。

作为培养条件，可以在培养基中增殖微生物，且只要在可以生物合成目标化合物的条件下即可，本领域技术人员可以按照微生物的种类、所用的培养基等，适宜调整、设定培养温度、是否添加空气、氧的浓度、二氧化碳的浓度、培养基的pH值、培养时的振荡速度、培养时间、湿度等，关于培养温度，通常为25℃～40℃，大肠杆菌等的情形，从容易使增殖速度最大的观点出发，优选为37℃。另外，用于培养大肠杆菌所适合的培养基的pH值为7.0，作为培养时的振荡速度，通常为180～300rpm、优选为180～200rpm。

从培养物中回收芳族化合物和/或衍生物通过本领域中通常使用的方法进行即可，没有特别限定，例如，根据必要，可以单独或组合使用过滤、离心分离、各种色谱等的精制等方法。

通过本发明的方法可以制造包含例如水杨酸、水杨酸甲酯、乙酰水杨酸(阿司匹林)、儿茶酚、己二酸、1,6-己二醇、4-羟基苯甲酸(PHBA)、3-羟基苯甲酸(3HBA)、2,5-二羟基苯甲酸(龙胆酸)、马来酰丙酮酸、马来酸、富马酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、2-氨基苯甲酸(2ABA)、L-色氨酸、色胺、苯胺、L-酪氨酸、酚、顺式,顺式-粘康酸、反式,反式-粘康酸等的各种的芳族化合物或其衍生物。

实施例

＜细胞株和质粒＞

本实施例中使用的细胞株和质粒记载于表1和表2中。为了克隆基因，使用了大肠杆菌NovaBlue感受态细胞(Novagen, Cambridge, MA)。需要说明的是，表中未记载供给元的细胞是本发明人制作的细胞。

[表1]

[表2]

＜PCR用引物＞

聚合酶链反应(PCR)使用KOD FX Neo (TOYOBO, Osaka, Japan)和表3所示的引物对进行了实施。将各自的基因使用Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA)装配成各质粒。pCFTdeltain (图2)购入了市售品(Invitrogen, San Diego, CA)。

[表3]

＜培养条件＞

为了在5mL的试验管中制造水杨酸，使用了M9最小培养基。M9最小培养基是每1升含有20g葡萄糖、0.5g NaCl、17.1g Na₂HPO₄・12H₂O、3g KH₂PO₄、2g NH₄Cl、246mg MgSO₄・7H₂O、14.7mg CaCl₂・2H₂O、2.78mg FeSO₄・7H₂O、10mg 盐酸硫胺素、40mg L-酪氨酸和40mg L-色氨酸(ATCC31882表示L-酪氨酸和L-色氨酸需求性)。根据需要以分别达到100、50、和15μg/mL的最终浓度添加了氨苄青霉素、卡那霉素、和/或氯霉素。CFT5株的培养中以达到100mg/L的最终浓度添加了L-苯丙氨酸。另外，CFT3株和CFT5株的预培养中为了促进增殖而向培养基中添加了0.2％丙酮酸钠。将预培养培养基在5mL试验管中的M9培养基中以0.05的初期光学密度(OD₆₀₀)进行了植菌。试验管培养边在180rpm下振动边在37℃下进行了实施。0.1mMIPTG在最初添加到培养基中。

PHBA、PABA、2ABA、L-酪氨酸、3HBA、酚、MA、和马来酸生成在5mL的试验管培养中进行了实施。PHBA和L-酪氨酸的生成在添加有0.1％丙酮酸钠的M9培养基中进行，2ABA和马来酸的生成在添加有0.5％酵母提取物的M9Y培养基中进行，PABA、3HBA、酚和粘康酸的生成在添加有0.1％丙酮酸钠和0.5％酵母提取物的M9Y培养基中进行。将各自的预培养培养基在5mL试验管的培养基中以0.05的初期光学密度(OD₆₀₀)进行了植菌。试验管培养边在180rpm下振动边在37℃下进行了实施。

关于批量培养，考虑上述的培养条件，通过本领域中通常进行的方法进行了实施。关于水杨酸的批量培养，在实施例5中更具体地进行记载。

＜各种产物的分析＞

培养上清中的葡萄糖浓度使用Glucose CII test Wako (Wako, Kyoto, Japan)进行了测定。添加丙酮酸钠的情形，为了评价收率，除了葡萄糖消费量之外还考虑了丙酮酸钠的消费量([化合物生成量]-mol/[葡萄糖和丙酮酸消费量]-mol%)。

GC-MS通过具备CP-Sil 8 CB-MS 毛细管柱(30mx0.25mmx0.25μm; Agilent)的GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu, Kyoto, Japan)进行了实施。使用氦作为载气，维持了流速2.1ml/分钟。注射量设为1μl(分流比1:10)。

水杨酸和粘康酸的生成量如下进行了定量。以烘箱的初期温度为150℃保持1分钟后，以12℃/分钟升温至240℃，进一步以120℃/分钟升温至300℃，于300℃维持了3分钟。全部测定时间为10分钟。其它设定条件如下：界面温度250℃、离子源温度200℃、电冲击离子化压力(EI) 70eV。

使已干燥的水杨酸和粘康酸如下进行了分析：在50μL的N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)和20μL的吡啶中于80℃进行60分钟衍生物化。作为内部标准使用了庚二酸。

PHBA、L-苯丙氨酸、和L-酪氨酸的生成量如下进行了定量。以烘箱的初期温度为150℃保持5分钟后，以10℃/分钟升温至300℃，于300℃维持了5分钟。全部测定时间为25分钟。其它设定条件如下：界面温度250℃、离子源温度200℃、电冲击离子化压力(EI) 70eV。

4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、L-苯丙氨酸、和L-酪氨酸如下进行了分析：在30μL的N-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-N-甲基-三氟乙酰胺(MTBSTFA)和30μL的N,N-二甲基甲酰胺中于80℃进行60分钟衍生物化。作为内部标准使用了环亮氨酸。

2ABA、PABA、3HBA和酚的浓度通过使用5C₁₈-AR-II柱(Nacalai Tesque, Kyoto,Japan)的高速液相色谱(HPLC; Shimadzu, Kyoto, Japan)进行了测定。关于测定条件，于30℃、流速为1.2ml/分钟。关于溶剂系，使用磷酸水溶液(50mM, pH 2.5)作为溶剂A、使用乙腈作为溶剂B。关于浓度梯度，以70％溶剂A和30％溶剂B开始，从3分钟到7分钟使用溶剂A和B的50-50混合液，其次从7分钟到10分钟使用溶剂A和B的70-30混合液。

2ABA、PABA、和3HBA的浓度通过254nm紫外线的吸光度检测器(SPD-20AV,Shimadzu, Kyoto, Japan)进行了测定。酚的情形检测了270nm的吸光。培养上清通过将培养液以21,880×g离心分离20分钟而获取，将其用于HPLC。作为2ABA、PABA、和3HBA的测定情形的内部标准，使用苯甲酸，酚的情形使用2ABA。

马来酸的浓度与上述同样地通过将培养液以21,880×g离心分离20分钟而分离的培养上清进行了测定。将培养上清通过使用5C₁₈-PAQ柱(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)的高速液相色谱(HPLC; Shimadzu, Kyoto, Japan)进行了分析。关于柱，于30℃进行操作、流速为1.2ml/分钟。关于溶剂系，使用磷酸水溶液(50mM, pH2.5)作为溶剂A、使用乙腈作为溶剂B。关于浓度梯度，以100％溶剂A开始(0-3分钟)，缓慢地变更(3-6分钟)成溶剂A和B的50-50混合液，维持(6-7分钟)溶剂A和B的50-50混合液，接着缓慢地变更成(7-13分钟)100％溶剂A。产物的浓度检测了210nm的紫外线的吸光度(SPD-20AV, Shimadzu, Kyoto,Japan)。使用富马酸作为内部标准。

[实施例1] 基因缺损细胞株的制作

为了产生分支酸衍生物尝试了大肠杆菌的转化。作为母株，使用了大肠杆菌的L-苯丙氨酸过剩产生株(ATCC31882)。

编码GalP和Glk的基因片段使用大肠杆菌MG1655 (ATCC700926)的基因组DNA作为模板，通过使用glk_NI_f (SEQ ID NO: 23)和glk_NI_r (SEQ ID NO: 24)、以及galP_NI_f(SEQ ID NO: 25)和galP_NI_r (SEQ ID NO: 26)作为引物的PCR分别进行了扩增。将已扩增的片段串联地插入到pCFTdeltain (图2)的HindIII和BamHI部位。将所得的质粒命名为pCFTdeltain-GG。

基因的缺失操作使用Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit (Funakoshi,Tokyo, Japan)，按照其使用说明书的方案，进行了实施。

关于用于破坏ptsHI、而导入P_A1lacO-1-Glk-GalP的片段，以pCFTdeltain-GG为模板，通过使用delta-ptsHI_NI_f (SEQ ID NO: 27)和delta-ptsHI_NI_r (SEQ ID NO: 28)作为引物的PCR进行扩增而获取。关于用于使pykF、pykA、pheA基因钝化的片段，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，通过分别使用表3所示引物(SEQ ID NO: 29～34)的PCR进行扩增而同样地获取。

关于用于缺失的基因片段和重组酶，使用Gene Pulser II (Bio-RadLaboratories社制)通过电穿孔导入到细胞中。将基于ATCC31882株所得的基因钝化细胞株在本说明书中记载为CFT1～CFT5株。

如表1所示，CFT1株具有编码Glk和GalP的基因，缺损ptsHI。因此，在CFT1株中，原本的PTS被置换成将半乳糖透性酶(GalP)和葡糖激酶(Glk)组合而得的系。

CFT2株是除了CFT1株的变异之外还缺损pykF。CFT3株是除了CFT2株的变异之外还缺损pykA。pykF和pykA编码同时以ADP为辅酶、催化由PEP生成丙酮酸的反应的丙酮酸激酶，但在大肠杆菌等的细胞中，两者的基因协同性地发挥作用，因此如果使两基因缺损则无法完全地抑制反应。在CFT3株中，使产生丙酮酸的2个反应途径阻断。

CFT4株是除了CFT3株的变异之外还缺损pheA。因此，CFT4株是在使产生丙酮酸的反应缺损的基础上，改变成不能进行苯丙氨酸合成反应。CFT5株是除了CFT4株的变异之外还缺损tyrA，改变成不能进行酪氨酸合成反应。通过破坏这两基因首次可以完全地抑制苯丙氨酸的合成。

[实施例2] 水杨酸合成细胞株的制作

使用ATCC31882株，为了提高其水杨酸合成能，导入了编码ICS和IPL的基因。在本实施例中，作为编码ICS的基因，使用menF、entC和pchA，作为编码IPL的基因，使用pchB。

关于来自绿脓杆菌(P. aeruginosa)的pchA和pchB的基因片段，获取市售品(SEQID NO: 37和38、Invitrogen)，将pchA和pchB的密码子使用为了大肠杆菌而进行了优化。

关于编码pchB的基因片段，以密码子优化后的合成基因片段为模板，通过使用pchB_f (SEQ ID NO: 1)和pchB_r (SEQ ID NO: 2)作为引物的PCR进行了扩增。将已扩增的片段插入到pZE12MCS (Expressys社制)的HindIII部位。将所得的质粒命名为pZE12I。

关于编码menF和entC的基因片段，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，通过使用menF_f (SEQ ID NO: 3)和menF_r (SEQ ID NO: 4)以及entC_f (SEQ ID NO: 5)和entC_r (SEQ ID NO: 6)作为引物的PCR分别进行了扩增。将已扩增的各自片段插入到包含编码pchB的基因的pZE12I的KpnI部位。将所得的质粒命名为pZE12mI和pZE12eI。

关于编码pchA的基因片段，以密码子优化后的合成基因片段为模板，通过使用pchA_f (SEQ ID NO: 7)和pchA_r (SEQ ID NO: 8)作为引物的PCR进行了扩增。将已扩增的片段插入到包含编码pchB的基因的pZE12I的KpnI部位。将所得的质粒命名为pZE12pI。

关于编码menF-pchB (menF和pchB的融合蛋白质)的基因片段，以pZE12mI为模板，通过使用menF_f (SEQ ID NO: 3)和pchB_r (SEQ ID NO: 2)作为引物的PCR进行了扩增。将已扩增的片段插入到pZA23MCS (Expressys社制)的KpnI部位。将所得的质粒命名为pZA23mI。

关于使用各质粒的菌株的转化，使用Gene Pulser II (Bio-Rad, Hercules, CA)进行了实施。根据需要，将100μg/L氨苄青霉素和50μg/L卡那霉素添加到培养基中。

将上述的质粒pZE12mI、pZE12eI、pZE12pI和pZA23mI导入到ATCC31882株所得的转化体在本说明书中分别记载为CFT01株、CFT02株、CFT03株、和CFT09株。将这些转化体在包含葡萄糖作为碳源的M9最小培养基中进行了培养。需要说明的是，IPTG添加到最初的培养基(OD₆₀₀=0.05)中。

CFT01株的培养特性示于图3。通过具有menF和pchB的CFT01株而生成的水杨酸和L-苯丙氨酸的量分别达到210和350mg/L，实现了将葡萄糖作为唯一碳源来制造水杨酸。该值为高于CFT02株、CFT03株和CFT09株的值。因此，在以下的实验中，使用menF作为编码ICS的基因。

[实施例3] 水杨酸生物合成途径的导入

代替ATCC31882株，向实施例1中制作的变异株中导入实施例2中制作的质粒，研究了水杨酸的生成能。

将pZE12mI导入到具有编码Glk和GalP的基因、缺损ptsHI的CFT1株，制作了可以表达menF和pchB的株。本说明书中，将其记载为CFT11株。

将CFT11株与CFT01株同样地在包含葡萄糖作为唯一碳源的M9最小培养基中进行了培养并评价。CFT11株的培养特性示于图3。水杨酸和L-苯丙氨酸的生成量分别达到311和358mg/L。水杨酸的生产性与CFT01株比较增加了1.5-倍，但L-苯丙氨酸的生产性几乎相同。

其次，将pZE12mI导入到除了CFT1株的变异之外、还使 pykF和pykA均缺损的CFT3株，制作了可以表达menF和pchB的株。本说明书中，将其记载为CFT31株。

在包含葡萄糖作为唯一碳源的M9最小培养基中将CFT31株进行培养的结果，如图3所示，水杨酸和L-苯丙氨酸的生成量分别达到603和694mg/L。如图3(A)和(B)所示，存在CFT31株的细胞增殖和葡萄糖消费速度较CFT01株和CFT11株略微降低的倾向，但CFT31株的水杨酸生成量较其他株高。

[实施例4] L-苯丙氨酸生产能的钝化

将pZE12mI导入到除了CFT3株的变异之外、还使缺损pheA和tyrA的CFT5株，制作了可以表达menF和pchB的株。本说明书中，将其记载为CFT51株。

将CFT51株在包含葡萄糖作为唯一碳源的M9最小培养基中进行了培养。图4显示CFT51株的培养特性。其结果，水杨酸的生成量在培养48小时后达到1,480mg/L (约1.5g/L)。该值可以表达menF和pchB，但与未进行阻断其他途径的操作的CFT01株比较，上升约7.5倍。另一方面，未观察到L-苯丙氨酸的生成(数据未显示)。

为了查看已制作的细胞株中的水杨酸和L-苯丙氨酸以外的副产物的生成量，测定了大肠杆菌培养中的主要副产物即培养上清中的有机酸的量(表4)。

[表4]

如表4所示，在CFT01株和CFT11株中，主要生成乙酸和丙酮酸，已生成的乙酸量分别达到19.5和30.6mM (1.17和1.84g/L)。另一方面，CFT31株和CFT51株产生了少量乙酸，但培养上清中完全未见到丙酮酸的蓄积，丙酮酸的生成伴随PEP转化成丙酮酸的反应的破坏而减少。CFT31株和CFT51株中生成的有机酸总量不足8.5mM，与CFT01株和CFT11株比较，显著地减少。

根据上述的结果，认为：在CFT31株和CFT51株中，抑制了副产物即有机酸的生产，葡萄糖有效地转化成水杨酸。认为这是由于：通过pykF和pykA的钝化，丙酮酸的供给变得缓慢，由丙酮酸衍生的乳酸或乙酸等有机酸的生产降低。

图5显示CFT01株、CFT11株、CFT31株和CFT51株中的、由葡萄糖生成水杨酸的收量和每OD₆₀₀的水杨酸生产能。 CFT51株中的水杨酸的收量和每OD₆₀₀的生产能较CFT01株分别增加了6.2和7.6倍，证实到水杨酸的生产性显著地增加。

[实施例5] 基于批量培养的水杨酸的制造

使用所得的细胞株，进行了基于大量培养的水杨酸的制造。

批量培养在2.0升的罐发酵器(操作容积400mL)中进行了实施。为了在罐发酵器中制造水杨酸，使用了由包含0.4%酵母提取物的M9培养基构成的M9Y培养基。将4mL的预培养培养基加入到加入了400mL培养基的罐发酵器中。为了使培养中的pH值维持7.0，自动地添加了NH₄OH。通过自动控制搅拌速度、于37℃供给氧，使溶存氧(DO)浓度维持在3.0ppm以上。使葡萄糖的初期浓度为40g/L。在培养5小时后将0.1mM IPTG添加到培养基中。

图6显示CFT01株和CFT51株的培养特性。与CFT01株比较，CFT51株的细胞增殖和葡萄糖消费速度得以改善(图6 (A)、(B)、(D)、和(E))。培养48小时后，CFT01株中生成的水杨酸量仅为0.9g/L，相对于此，CFT51株中生成的水杨酸量达到约11g/L (图6(C)和(F))。

关于CFT51株中的超过10g/L的生产性，在基于使用大肠杆菌的回文式培养的芳族化合物生产试验中，为世界最高水平(与原始株比较为14倍)。过去没有将葡萄糖作为单一碳源的水杨酸生产的实例，生产量超过了将葡萄糖和甘油用于碳源的过去的报道。

[实施例6] 促进4-羟基苯甲酸的生成

推测CFT51株的母株即CFT5株在细胞内蓄积分支酸。因此，本发明人接下来根据CFT5株尝试制造其他分支酸衍生物，实证该株的多用途性，构建了用于芳族化合物制造的平台。

首先，对水杨酸的结构异构体即4-羟基苯甲酸(PHBA)的生成进行了研究。为了可由分支酸生成PHBA，导入了编码来自大肠杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶(EC 4.1.3.40)的基因(SEQ ID NO: 39、ubiC)。

使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板，通过使用ubiC_f (SEQ ID NO: 9)and ubiC_r (SEQ ID NO: 10)作为引物的PCR，扩增了编码ubiC的基因片段。将已扩增的片段插入到pTrcHis B (Life technologies社制)的BamHI部位。将所得的质粒命名为pTrcBubiC。将该质粒pTrcBubiC导入到实施例1中制作的CFT5株，制作了CFT54株。

图8(A)显示CFT54株的培养液中的PHBA的生成量和收率。CFT54株中的PHBA的生成量在培养96小时后达到1,820mg/L。另外，PHBA的收率与向ATCC31882株中导入pTrcBubiC的对照株即CFT04株比较，增加了15.8倍。

[实施例7] 促进3-羟基苯甲酸的生成

与实施例6同样地对水杨酸的结构异构体即3-羟基苯甲酸(3HBA)的生成进行了研究。为了可由分支酸生成3HBA，导入了编码来自S. hygroscopicus 的3-羟基苯甲酸合酶 (EC4.1.3.45)的基因(SEQ ID NO: 40、Hyg5)。

使用合成基因片段作为模板，通过使用hyg5_f (SEQ ID NO: 19)和hyg5_r (SEQID NO: 20)作为引物的PCR，扩增了编码hyg5的基因片段。使用Gibson Assembly (NewEngland BioLabs社制)将该基因片段与pTrcHis B (Life technologies社制)的片段一同组装。将所得的质粒命名为pTrcBhyg5。将该质粒pTrcBhyg5导入到实施例1中制作的CFT5株，制作了CFT58株。

图8(B)显示CFT58株的培养液中的3HBA的生成量和收率。CFT58株中的3HBA的生成量在培养72小时后达到2,180mg/L。另外，3HBA的收率与向ATCC31882株中导入pTrcBhyg5的对照株即CFT08株比较，分别增加了310倍。

[实施例8] 促进4-氨基苯甲酸的生成

对本发明的基于细胞株的4-氨基苯甲酸(PABA)的生成进行了研究。为了由分支酸制造PABA，使用了来自大肠杆菌的氨基脱氧分支酸合酶(EC 2.6.1.85)和4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶 (EC 4.1.3.38) (PabA、PabB、和PabC)。

使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板，通过分别使用pabA_f (SEQ ID NO:11)和pabA_r (SEQ ID NO: 12)、以及pabB_f (SEQ ID NO: 13)和pabB_r (SEQ ID NO:14)作为引物的PCR，扩增了编码pabA和pabB的基因片段。将已扩增的片段串联地插入到pZE12MCS (Expressys社制)的KpnI部位。将所得的质粒命名为pZE12pabAB。来自大肠杆菌的pabC的基因片段获取了市售品(SEQ ID NO: 42、Invitrogen)。将该基因片段直接插入到pZE12pabAB的PstI部位。将所得的质粒命名为pZE12pabABC。将该质粒pZE12pabABC导入到实施例1中制作的CFT5株，制作了CFT55株。

图8(C)显示CFT55株的培养液中的PABA的生成量和收率。培养48小时后的PABA的生成量为2,880mg/L。另外，PABA的收率较向ATCC31882株中导入pZE12pabABC的对照株即CFT05株增加了32.1倍。

[实施例9] 促进2-氨基苯甲酸的生成

对本发明的基于细胞株的2-氨基苯甲酸(2ABA)的生成进行了研究。为了由分支酸制造2ABA，可以利用大肠杆菌的L-色氨酸生物合成途径的一部，因此导入了编码来自大肠杆菌的氨茴酸合酶(EC 4.1.3.27)的基因(trpE和trpG)。

使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板，通过使用trpEG_f (SEQ ID NO: 15)和trpEG_r (SEQ ID NO: 16)作为引物的PCR，扩增了编码trpEG的基因片段。将已扩增的片段插入到pZE12MCS (Expressys社制)的KpnI部位。将所得的质粒命名为pZE12trpEG。将该质粒pZE12trpEG导入到实施例1中制作的CFT5株，制作了CFT57株。

图8(D)显示CFT57株的培养液中的2ABA的生成量和收率。培养48小时后的2ABA的生成量为1,830mg/L。另外，2ABA的收率较向ATCC31882株中导入pZE12trpEG的对照株即CFT07株增加了46.5倍。

[实施例10] 促进L-酪氨酸的生成

使用CFT5株，制作了可以产生L-酪氨酸的大肠杆菌株。为了由分支酸制造L-酪氨酸，导入了编码来自大肠杆菌的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(EC 5.4.99.5 和EC 4.2.1.51)的基因(SEQ ID NO: 43、tyrA^fbr)。

来自大肠杆菌的tyrA^fbr的基因片段获取了市售品(Invitrogen)。将该基因片段直接插入到pZA23MCS (Expressys社制)的KpnI部位。将所得的质粒命名为pZA23tyrA^fbr。将该质粒pZA23tyrA^fbr导入到实施例1中制作的CFT5株，制作了CFT56株。

图8(E)显示CFT56株的培养液中的L-酪氨酸的生成量和收率。L-酪氨酸的生成量在培养96小时后达到1,620mg/L，与向ATCC31882株中导入pZA23tyrA^fbr的对照株即CFT06株比较，收率高达10.8倍。

[实施例11] 促进酚的生成

使用实施例10中所得的L-酪氨酸过剩产生株，制作了制造可由L-酪氨酸通过酪氨酸酚裂解酶(TPL) [EC 4.1.99.2]合成而得的酚的株。

使用根据编码来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的TPL的基因的序列(SEQ ID NO: 44、tpl)所合成的基因片段作为模板，通过使用tpl_f (SEQ ID NO: 17)和tpl_r (SEQ ID NO: 18)作为引物的PCR，扩增了编码tpl的基因片段。也使用pTrcHis B(Life technologies社制)作为模板，通过使用pTrc_inv_f (SEQ ID NO: 21)和pTrc_inv_r (SEQ ID NO: 22)作为引物的PCR扩增了pTrcHis B的基因片段。将各片段使用GibsonAssembly (New England BioLabs社制)进行了组装。将所得的质粒命名为pTrcBtpl。将该质粒pTrcBtpl导入到实施例10中制作的CFT56株，制作了CFT561株。

图8(F)显示CFT561株的培养中的酚生成量和收率。酚的生成量在培养96小时后达到1,100mg/L，显示了显著地高于向CFT06株中导入pTrcBtpl的对照株即CFT061株的酚生成能。

[实施例12] 促进粘康酸的生成

通过由水杨酸1-单加氧酶(SMO)和儿茶酚1,2-双加氧酶(CDO)所催化的反应，可由水杨酸生成粘康酸(图7)。

来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440的SMO (SEQ ID NO: 45、nahG^opt)和来自恶臭假单胞菌DOT-T1E的CDO (SEQ ID NO: 46、catA)的基因片段使用了市售品(Invitrogen)。向pZE12MCS (Expressys社制)的KpnI部位直接插入nahG^opt的基因片段，将其命名为pZE12nahG。其次，将catA的基因片段插入到pZE12nahG的HindIII部位。将所得的质粒命名为pZE12nGcA。将该质粒pZE12nGcA与pZA23mI一同导入到CFT5株，制作了CFT591株。

培养96小时后，由作为唯一碳源的葡萄糖的粘康酸的生成量在CFT591株的培养液中达到830mg/L，显示了：显著地高于实施例2中制作的向CFT09株中导入pZE12nGcA的对照株即CFT091株的粘康酸生成能。

[实施例13] 促进马来酸的生成

利用本发明的细胞株，制作了由分支酸经由3-羟基苯甲酸、龙胆酸、马来酰丙酮酸生成马来酸的株(图9)。

向实施例1中制作的CFT5株中导入了编码3-羟基苯甲酸合酶的基因、编码3-羟基苯甲酸6-羟基化酶的基因、编码龙胆酸-1,2-双加氧酶和马来酰丙酮酸水解酶的基因。

本实施例中所用的来自S. hygroscopicus的hyg5 (SEQ ID NO: 40)、来自红球菌(Rhodococcus jostii) RHA1的3hb6h (SEQ ID NO: 47)、来自红球菌属种(Rhodococcussp.) NCIMB 12038的mps2 (SEQ ID NO: 48)、和来自产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) NCIMB 9867的hbzF (SEQ ID NO: 49)的基因片段使用了市售品(Invitrogen)。

将上述的3hb6h基因片段用作模板，通过使用3hb6h_f (SEQ ID NO: 50)和3hb6h_r (SEQ ID NO: 51)作为引物的PCR，扩增了编码3H6H的基因片段。同样地进行操作，使用mps2基因片段和hbzF基因片段，扩增了编码GDO的基因片段、编码MPH的基因片段。

将已扩增的mps2、hbzF、hyg5和3hb6h基因片段串联地插入到pTrcHisB (Lifetechnologies社制)，将所得的质粒命名为pT2t01。将该质粒pT2t01导入到实施例1中制作的CFT5株，制作了CFMt1株。其结果，在基因导入前的CFT5株中，未确认到马来酸的生成，相对于此，CFMt1株中的马来酸的生成量在培养144小时后达到1,210mg/L，确认到马来酸的生成量显著地增加。

其次，为了获得使马来酸生成能更高的细胞株，研究了进一步的基因导入。分别制作了使hyg5基因片段与Ptrc启动子同时包含的2种质粒pS09和pA09，而且使hyg5和3hb6h基因片段与Ptrc启动子同时包含的质粒pS10 (参照表2)。将质粒pS09和pS10分别导入到上述的CFMt1株，制作了CMtS09株和CMtS10株。而且，将质粒pA09导入到CMtS09株和CMtS10株，制作了CMtS091株和CMtS101株(参照表1)。

图10表示CMtS09株和CMtS10株的培养液中的马来酸的生成量，图11表示CMtS091株和CMtS101株的培养液中的马来酸的生成量。如所示的那样，这些细胞株具有较CFMt1株更高的马来酸生成能，在CFMtS101株中，培养72小时后，马来酸的生成量达到2,000mg/L(图11(D))。在这些细胞株中，也确认到3-羟基苯甲酸和龙胆酸的生成，但几乎未确认到马来酰丙酮酸的生成，暗示到所用的细胞株中的向马来酸的快速的转化。

产业上的可利用性

通过本发明提供改变了糖代谢途径的各种的微生物。通过增加微生物细胞内的PEP利用性，阻止碳源向L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的流动，可以由葡萄糖等的碳源大大增加水杨酸的生成量和收率。另外，如果使用本发明的微生物，也可以制造由分支酸衍生的各种芳族化合物。本发明还可以提供用于芳族化合物合成的平台细胞株。根据本发明，以生物质的主成分即葡萄糖为碳源，可以通过微生物以较高的生产性获得各种芳族化合物。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接通过引用而纳入本说明书中。

<110> 国立研究开发法人理化学研究所

<120> 芳族化合物及其衍生物的制造方法

<130> PH-6674-PCT

<150> JP 2015-165023

<151> 2015-08-24

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工的

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<223> 引物

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<212> DNA

<213> 人工的

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<213> 人工的

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tctcgagctc ggatcttacg ctttcggttc aaaacgcgcc 40

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<213> 人工的

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tctcgagctc ggatcttaca tcacaacacc ttcaa 35

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<213> 人工的

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tctttatcga taccgtcgac ttaatgatga tgatgatgat gcagaatgtg acctaaggtc 60

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ttagcagatt gttttttctt caatgaactt gttaaccagc gtcattaact taatacgact 60

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<213> 人工的

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ttacaggacg tgaacagatg cggtgttagt agtgccgctc ggtaccagtg taatacgact 60

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<213> 人工的

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agccgctttg gactgcctat ttatgttccg gagcgcgagg catctatgtt taatacgact 60

cactataggg ctc 73

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<212> DNA

<213> 人工的

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<223> term-PAlacO-1-FRT-gb2-neo-FRT in pCFTdeltain

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gctagcccta ggtctagggc ggcggatttg tcctactcag gagagcgttc accgacaaac 60

aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt tgatgcctct 120

agcacgcggg atcctttatc atcgtcgtct ttatagtcga tatcaagctt ggtcagtgcg 180

tcctgctgat gtgctcagta tcttgttatc cgctcacaat gtcaattgtt atccgctcac 240

aattaattaa ccctcactaa agggcggccg cgaagttcct attctctaga aagtatagga 300

acttcattct accgggtagg ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc atgcgcttta 360

gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac acattccaca 420

tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc accttccact 480

cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag gacgtgacaa 540

atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag 600

cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt ctgggctcag 660

aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc 720

gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg 780

ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgacctgca gcagcacgtg ttgacaatta 840

atcatcggca tagtatatcg gcatagtata atacgacaag gtgaggaact aaaccatggg 900

atcggccatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 960

attcggctat gactgggcac aacagacgat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 1020

gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 1080

actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 1140

tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 1200

gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 1260

aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 1320

tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 1380

cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc 1440

cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 1500

aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 1560

ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 1620

cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 1680

tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaat aaagaccgac caagcgacgt 1740

ctgagagctc cctggcgaat tcggtaccaa taaaagagct ttattttcat gatctgtgtg 1800

ttggtttttg tgtgcggcgc ggaagttcct attctctaga aagtatagga acttcctcga 1860

gccctatagt gagtcgtatt agtcgac 1887

<210> 37

<211> 1431

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 37

atgagccgtc tggcaccgct gagccagtgt ctgcatgcac tgcgtggcac ctttgaacgt 60

gcaattggtc aggcacaggc actggatcgt ccggttctgg ttgcagcaag ctttgaaatt 120

gatccgctgg atcctctgca ggtttttggt gcatgggatg atcgtcagac cccgtgtctg 180

tattgggaac agccggaact ggcatttttt gcatggggtt gtgcactgga actgcagggt 240

catggtgaac agcgttttgc acgtattgaa gaaaattggc agctgctgtg tgcagatgca 300

gttgttgaag gtccgctggc tccgcgtctg tgtggtggtt ttcgttttga tccgcgtggt 360

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gttctgcgtg aaggtgaacg ttatcgtgtt ctgtgtcagc atctggcaaa accgggtgaa 480

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cgtcgtcgtc cgagtggtcc gacagccggt gcacagggtg atgcaagcgc acaagaacgt 600

cgtcagtggg aagcaaaagt tagtgatgca gttagcagcg ttcgtcaggg tcgttttggt 660

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gcatgttttc tgggtgcaag tccggaacgt ctggttcgta ttcgtgccgg tgaagcactg 840

acccatgcac tggcaggcac cattgcacgt ggtggtgatg cacaagaaga tgcacgtctg 900

ggtcaggcac tgctggatag cgcaaaagat cgtcatgaac atcagctggt tgttgaagca 960

attcgtaccg cactggaacc gtttagcgaa gttctggaaa ttccggatgc accgggtctg 1020

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gcaccgctgg gttggctgga tggtgaaggt aatggtgatt ttctggttgc actgcgtagt 1260

gcactgctga caccgggtcg tggttacctg tttgcaggtt gtggtctggt tggtgatagc 1320

gaaccggcac atgaatatcg tgaaacctgt ctgaaactga gcgcaatgcg tgaagccctg 1380

agcgccattg gtggtctgga tgaagttcct ctgcagcgtg gtgttgccta a 1431

<210> 38

<211> 306

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 38

atgaaaaccc ctgaagattg taccggtctg gcagatattc gtgaagcaat tgatcgtatt 60

gatctggata ttgttcaggc actgggtcgt cgtatggatt atgttaaagc agcaagccgt 120

tttaaagcaa gcgaagcagc aattccggca ccggaacgtg ttgcagcaat gctgccggaa 180

cgcgcacgtt gggctgaaga aaatggtctg gatgcaccgt ttgttgaagg tctgtttgca 240

cagattatcc attggtatat tgccgagcag atcaaatatt ggcgtcagac ccgtggtgca 300

gcctaa 306

<210> 39

<211> 498

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 39

atgtcacacc ccgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attgtaaaga gatccctgcc 60

ctggatccgc aactgctcga ctggctgttg ctggaggatt ccatgacaaa acgttttgaa 120

cagcagggaa aaacggtaag cgtgacgatg atccgcgaag ggtttgtcga gcagaatgaa 180

atccccgaag aactgccgct gctgccgaaa gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg 240

ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta 300

agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc 360

acatcatcga cattaacccg ggactttatt gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg 420

cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg 480

gcgtcaccgt tgtactaa 498

<210> 40

<211> 1023

<212> DNA

<213> Streptomyces hygroscopicus

<400> 40

atgctgaatc cgagcagcct ggttctgaat ggtctgacca gctattttga aaatggtcgt 60

gcacgtgttg ttccgcctgt tggtcgtaat attctgggtg ttgttaatta tgccagcgtt 120

tgtgaatatc cgaccctgga tcatggttat ccggaactgg aaattaacat ggttgcaccg 180

accgcagaac cgtttgccga agtttgggtt accgatgcag aaagcgaaca tggtgaacgt 240

gatggtatta cctatgcaca tgatggcgaa tatttctttt gtgcaggtcg tgttccgcca 300

accggtcgtt ataccgaagc aacccgtgca gcatatgtta ccatgtttga actgctggaa 360

gaatttggtt atagcagcgt ttttcgcatg tggaacttta ttggtgatat caatcgtgat 420

aatgccgaag gcatggaagt gtatcgtgat ttttgtcgtg gtcgtgccga agcatttgaa 480

cagtgtcgtc tggaatttga tcagtttccg gcagcaaccg gtattggtag ccgtggtggt 540

ggtattgcat tttatctgct ggcatgtcgt agcggtggtc atgttcatat tgaaaatccg 600

cgtcaggttc cggcatatca ttatccgaaa cgttatggtc cgcgtgcacc gcgttttgca 660

cgtgccacct atctgccgag ccgtgcagcc gatggtgttg gtggtcaggt ttttgttagc 720

ggcaccgcaa gcgttctggg tcatgaaacc gcacatgaag gtgatctggt taaacaatgc 780

cgtctggcac tggaaaatat tgaactggtt attagtggtg gtaatctggc agcacatggt 840

attagcgcag gtcatggcct gaccgcactg cgtaacatta aagtttatgt tcgtcgtagc 900

gaagatgttc cggcagttcg tgaaatttgt cgtgaagcat ttagtccgga tgccgatatt 960

gtttatctga ccgttgatgt ttgccgtagc gatctgctgg ttgaaattga aggtgttgtg 1020

atg 1023

<210> 41

<211> 1023

<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

<400> 41

atgaatccga gcagcctggt tctgaatggt ctgaccagct attttgaaaa tggtcgtgcc 60

ggtggtgttc cgcctgcagg tcgtaatatt ctgggtgttg ttaattatgc cagcgtttgt 120

gaatatccga ccctggatca tggttatccg gaactggcca ttaatatggt tgcaccgacc 180

gcagaaccgt ttgccgaagt ttgggttacc gatgccgaag cagaacatgg tgaacgtgat 240

ggtattacct atgcacatga tggcgaatat ttcttttgtg cgggtcgtgt tcctccgacg 300

ggtcgttata ccgaagcaac ccgtgcagca tatgttacca tgtttgaact gctggaagaa 360

tttggttata gcagcgtttt tcgcatgtgg aactttattg gtgatatcaa tcgtgataat 420

gccgaaggca tggaagtgta tcgtgatttt tgtcgtggtc gtgcggaagc atttgaacag 480

tgtcgtctgg aatttgatca gtttccggca gcaaccggta ttggtagccg tggtggtggt 540

attgcatttt atctgctggc atgtcgtagc ggtggtcatg ttcatattga aaatccgcgt 600

caggttccgg catatcatta tccgaaacgt tatggtccgc gtgcaccgcg ttttgcacgt 660

gccacctatc tgccgagccg tgcagccgat ggcggtggtg gtcaggtttt tgttagcggc 720

accgcaagcg ttctgggtca tgaaaccgca catgaaggtg atctggttaa acaatgccgt 780

ctggcactgg aaaatattga actggttatt agtggtggta atctggcagc acatggtatt 840

agcgcaggtc atggcctgac cgcactgcgt aacattaaag tttatgttcg tcgtgcagaa 900

gatgttccgg cagttcgtga aatttgtcgt gaagcattta gtccggatgc cgatattgtt 960

tatctgaccg ttgatgtttg ccgtagcgat ctgctggttg aaattgaagg tgttgtgatg 1020

taa 1023

<210> 42

<211> 888

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 42

cttgatatcg aattcaaaga ggagaaactg cagatgtttc tgatcaacgg tcataaacaa 60

gaaagcctgg cagttagcga tcgtgcaacc cagtttggtg atggttgttt taccaccgca 120

cgtgttattg atggtaaagt tagcctgctg agcgcacata ttcagcgtct gcaggatgca 180

tgccagcgtc tgatgattag ctgtgatttt tggcctcagc tggaacaaga aatgaaaacc 240

ctggcagcag aacagcagaa tggtgttctg aaagttgtta ttagccgtgg tagcggtggt 300

cgtggttata gcaccctgaa tagcggtccg gcaacccgta ttctgagcgt taccgcatat 360

ccggcacatt acgatcgtct gcgtaatgaa ggtattaccc tggcactgag tccggttcgt 420

ctgggtcgta atccgcatct ggcaggtatt aaacatctga atcgtctgga acaggttctg 480

attcgtagcc acctggaaca gaccaatgca gatgaagcac tggttctgga tagcgaaggt 540

tgggttaccg aatgttgtgc agcaaacctg ttttggcgta aaggtaatgt tgtttataca 600

ccgcgtctgg atcaggcagg cgttaatggt attatgcgtc agttttgtat tcgtctgctg 660

gcacagagca gctatcagct ggttgaagtt caggcaagcc tggaagaaag tctgcaggca 720

gatgaaatgg ttatttgtaa tgcactgatg ccggttatgc cggtgtgtgc atgtggtgat 780

gttagcttta gcagcgcaac cctgtatgaa tatctggcac cgctgtgtga acgtccgaat 840

gaacagaaac tgattagcga agaagatctg taactgcagc ccggggga 888

<210> 43

<211> 1158

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 43

attaaagagg agaaaggtac catggttgct gaattgaccg cattacgcga tcaaattgat 60

gaagtcgata aagcgctgct gaatttatta gcgaagcgtc tggaactggt tgctgaagtg 120

ggcgaggtga aaagccgctt tggactgcct atttatgttc cggagcgcga ggcatctata 180

ttggcctcgc gtcgtgcaga ggcggaagct ctgggtgtac cgccagatct gattgaggat 240

gttttgcgtc gggtgatgcg tgaatcttac tccagtgaaa acgacaaagg atttaaaaca 300

ctttgtccgt cactgcgtcc ggtggttatc gtcggcggtg gcggtcagat gggacgcctg 360

ttcgagaaga tgctgaccct ctcgggttat caggtgcgga ttctggagca acatgactgg 420

gatcgagcgg ctgatattgt tgccgatgcc ggaatggtga ttgttagtgt gccaatccac 480

gttactgagc aagttattgg caaattaccg cctttaccga aagattgtat tctggtcgat 540

ctggcatcag tgaaaaatgg gccattacag gccatgctgg tggcgcatga tggtccggtg 600

ctggggctac acccgatgtt cggtccggac agcggtagcc tggcaaagca agttgtggtc 660

tggtgtgatg gacgtaaacc ggaagcatac caatggtttc tggagcaaat tcaggtctgg 720

ggcgctcggc tgcatcgtat tagcgccgtc gagcacgatc agaatatggc gtttattcag 780

gcactgcgcc actttgctac ttttgcttac gggctgcacc tggcagaaga aaatgttcag 840

cttgagcaac ttctggcgct ctcttcgccg atttaccgcc ttgagctggc gatggtcggg 900

cgactgtttg ctcaggatcc gcagctttat gccgacatca ttatgtcgtc agagcgtaat 960

ctggcgttaa tcaaacgtta ctataagcgt ttcggcgagg cgattgagtt gctggagcag 1020

ggcgataagc aggcgtttat tgacagtttc cgcaaggtgg agcactggtt cggcgattac 1080

gttcagcgtt ttcagagtga aagccgcgtg ttattgcgtc aggcgaatga caatcgccag 1140

taagggcccc ccctcgag 1158

<210> 44

<211> 1413

<212> DNA

<213> Pasteurella multocida

<400> 44

attaaagagg agaaaggtac catgagaaac tatcctgcag aaccttataa agtcaaagct 60

gttgaaccga ttgcaatgac gactcgtgag caacgtgaag cctacatgaa aaaagcaggc 120

tacaatacgt ttttactcaa ttcagaagaa gtgtatattg atttattaac cgatagtggt 180

acctcagcca tgagtgataa gcaatgggcg ggtcttatga tcggtgatga agcttatgca 240

ggtagccgta acttcatgca tttacaagac gtggtcagag aatattatgg tttcaaatat 300

gtcgtaccaa ctcaccaagg tcgtggtgca gaaaacttac tttcaaccat tatgatcaaa 360

ccgggcgatt atgtaccggg taatatgtat tttactacaa cacgcgcgca ccaagagcgt 420

aatggggcga ctttcgttga tattattatt gatgaagccc atgattcaca aattgattta 480

cctttcaaag gcaatgtcga tgtgaagaaa ttacaaaaac tgattgatga agtgggtgcg 540

gataaaattc cttacatctg tttagcggtt accgtaaact tagcgggtgg acaacctgtg 600

agtatggcaa acatgcgtga agtaaaagca ttatgtagca aacatggtat taaagtgatg 660

tttgatgcca cacgttgtgt agaaaatgcg tacttcatta aagagcgtga agcagagtat 720

aaagatgcaa ccatcaaaga tattctaaaa gaaatgatga gttatgcaga tggttgtacc 780

atgagtggta aaaaagactg tcttgtgaat attggtggtt tcttatgtat taatgatgat 840

gatctttatc aacaagcttg tgaactcgtg gtgctctttg aagggatgcc atcttatggt 900

ggactagctg gtcgtgatat ggaagcaatg gcaattggta ttacggaatc tgtcgatttc 960

cactatatcc agcaccgtgt tgcacaatgt tactacctcg cggataaatt agaagcggcg 1020

ggtgtgccga ttgtgaaacc agtgggaggt catgcggtat tcttagatgc gaagaaattc 1080

cttccacata ttccacaaga acaattccca gcacagatgc ttgctgcgca aatttatatt 1140

gagggtggcg tacgttcaat ggaacgtggt attgtatcgg cgggtcgtga taagaaaacc 1200

ggtgcaaacc atacgcctaa attagaatta gtgcgtttaa ctatcccacg tcgtgtttat 1260

acttatgcgc atttagatca tgttgctgac accattatta aactctttaa acacagagat 1320

gacattaaag gtcttgatat ggtgtatgag cctaaattat tacgtttctt tacggcgcgt 1380

tttgaaccga aagcgtaagg gccccccctc gag 1413

<210> 45

<211> 1326

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida TK2440

<400> 45

attaaagagg agaaaggtac catgcagaac agtaccagcg ccctgaacgt tagcatcatt 60

ggcggcggta tcgcaggcgt tgcactggcc ctggacttat gtcgccacgc ccacctgaac 120

gtgcagctgt tcgaggcagc cccggccttt ggcgaagttg gtgccggtgt tagcttcggc 180

gccaatgcag tgcgtgcaat cgccggtctg ggtatcgcag agccgtacgg caaaattgcc 240

gacagtaatc cggccccgtg gcaggacatc tggttcgaat ggcgcaatgg ccgtgatgcc 300

aaatacctgg gttgcagcgt tgccgaaggc gttggtcaaa gcagtgtgca ccgtgccgat 360

ttcctggacg ctctggcttc tcagctgccg gacggtatcg ctcagttcgg taaacgtgct 420

cagcgtgttg aacaggacgg tgagcaagtg cgtgtgacat tcacagacgg cagcgagcac 480

cgctgcgatc tgctgattgg tgccgacggt atcaagagta gcatccgtga ccacgtgtta 540

cagggcctga atcaaccgct ggcaagcccg cgttttagcg gcacctgcgc ctatcgcggt 600

ctgatcgata gccagcagct gcgtgaggcc tatcgtgccc gtggcgtgga cgagcatctg 660

attgacgtgc cgcagatgta cctgggcctg gacggccaca tcctgacctt cccggttaaa 720

caaggccgcc tgatcaacgt ggtggccttc atcagtgacc gcagccaacc gaacccggtt 780

tggccgagcg atacaccgtg ggttcgtaat gccacccaag ccgagatgct ggccgcattc 840

gagggctggg atgatgcagc ccaagtgctg ctggagtgca tcccgacccc tagtctgtgg 900

gccctgcacg acctggcaga attaccgggc tacgttcacg gccgtgttgg cttaatcggc 960

gacgccgccc acgcaatgtt accgcatcag ggtgccggtg caggtcaggg tctggaggat 1020

gcctggttac tggcccgcct gctggaagac ccgaaggtgc tggacaaacg cccgcaggca 1080

gtgctggatg cctatgacgc cgttcgtcgt cctcgtgcct gccgtgtgca gcgtaccagc 1140

ttcgaggccg gcgaactgta tgagttccgt gacccggccg tgttagccga cgaggagcgt 1200

ctgggcaaag ttctggccga acgctttgac tggctgtgga accacgacat gcaggaagac 1260

ttattacagg cccgtgagct gctgggttta cgtgcccaag ccgcctaata ggggcccccc 1320

ctcgag 1326

<210> 46

<211> 987

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida DOT-T1E

<400> 46

gtcgacggta tcgatcatta aagaggagaa aggatgaccg tgaaaattag ccataccgca 60

gatattcagg ccttttttaa ccgtgttgca ggtctggatc atgcagaagg taatccgcgt 120

tttaaacaaa ttattctgcg tgttctgcag gataccgcac gtctgattga agatctggaa 180

attaccgaag atgaattttg gcatgccgtg gattatctga atcgtctggg tggtcgtaat 240

gaagcaggtc tgctggcagc cggtctgggt attgaacatt ttctggatct gctgcaggat 300

gcaaaagatg ccgaagcagg cctgggtggt ggtacaccgc gtaccattga aggtccgctg 360

tatgttgcgg gtgcaccgct ggcacagggt gaagcacgta tggatgatgg caccgatccg 420

ggtgttgtta tgtttctgca gggtcaggtt tttgatgcag atggcaaacc tctggcaggc 480

gcaaccgttg atctgtggca tgcaaatacc cagggcacct atagctattt tgatagcacc 540

cagagcgaat ttaatctgcg tcgtcgtatt attaccgatg cggaaggtcg ttatcgtgca 600

cgtagcattg ttccgagcgg ttatggttgt gatccgcagg gtccgaccca agaatgtctg 660

gacctgctgg gtcgtcatgg tcagcgtccg gcacatgttc attttttcat tagcgcaccg 720

ggtcatcgtc atctgaccac acagattaac tttgccggtg ataaatatct gtgggatgat 780

tttgcatatg ccacccgtga tggtctgatt ggtgaactgc gttttgttga agatgcagca 840

gcagcacgtg atcgtggtgt tcagggtgaa cgttttgcag aactgagctt tgattttcgc 900

ctgcagggtg ccaaaagtcc ggatgcagaa gcccgtagcc atcgtccgcg tgcactgcaa 960

gaaggttaat aggatatcga attcctg 987

<210> 47

<211> 1200

<212> DNA

<213> Rhodococcus jostii RHA1

<400> 47

atgagcaatc tgcaggatgc ccgtattatc attgccggtg gtggtattgg tggtgcagca 60

aatgcactgg cactggccca gaaaggtgca aatgttaccc tgtttgaacg tgcaagcgaa 120

tttggtgaag ttggtgcagg tctgcaggtt ggtccgcatg gtgcacgtat tctggatagc 180

tggggtgttc tggatgatgt tctgagccgt gcatttctgc cgaaaaatat cgtttttcgt 240

gatgccatta ccgcagaagt tctgaccaaa attgatctgg gtagcgaatt tcgtggtcgt 300

tatggtggtc cgtattttgt tacccatcgt agcgatctgc atgcaaccct ggttgatgca 360

gcacgtgcag ccggtgcaga actgcatacc ggtgttaccg ttaccgatgt tattaccgaa 420

ggtgataaag caattgtgag caccgatgat ggtcgtaccc atgaagcaga tattgcactg 480

ggtatggatg gtctgaaaag ccgtctgcgt gaaaaaatca gcggtgatga accggttagc 540

agcggttatg cagcatatcg tggcaccacc ccgtatcgtg atgttgaact ggatgaagat 600

attgaagatg tggtgggtta tattggtccg cgttgtcatt ttattcagta tccgctgcgt 660

ggtggtgaaa tgctgaatca ggttgcagtt tttgaaagtc cgggattcaa aaacggcatt 720

gaaaattggg gtggtccgga agaactggaa caggcatatg cacattgcca tgaaaatgtt 780

cgtcgcggta ttgattatct gtggaaagat cgttggtggc cgatgtatga tcgtgaaccg 840

attgaaaact gggttgatgg tcgcatgatt ctgctgggtg atgccgcaca tccgcctctg 900

cagtatctgg caagcggtgc agttatggca atcgaagatg caaaatgtct ggcagattat 960

gcagccgaag attttagcac cggtggtaat agcgcatggc ctcagattct gaaagaagtt 1020

aataccgaac gcgcaccgcg ttgtaatcgt attctgacca ccggtcgtat gtggggtgaa 1080

ctgtggcatc tggatggcac cgcacgtatt gcacgtaatg aactgtttcg tacccgtgat 1140

accagcagct ataaatacac cgattggctg tggggttata gcagcgatcg tgcaagctaa 1200

<210> 48

<211> 1134

<212> DNA

<213> Rhodococcus sp. NCIMB 12038

<400> 48

attaaagagg agaaaggtac catgaccgca accgaaccgc atgttgatga tgatccggca 60

ctgaaacagc tgtataccga ttttgaagca gaacatctga atccgctgtg gacacagctg 120

ggtgatctga tgccgatgac cccgaccagc cgtgcagttc cgtttgtttg gaaatggtca 180

accctgtatc cgctggcaca gcgtgccggt gatctggttc cggttggtcg tggtggtgaa 240

cgtcgtgcaa ttgccctggc aaatccgggt ctgggtggtg ttccgtatgt taccccgacc 300

ctgtgggcag caattcagta tctgggtccg aaagaagttg caccggaaca tcgtcatgca 360

cagaatgcat ttcgttttgt tgttgaaggt gaaggtgttt ggaccgttgt taatggtgat 420

ccggttgcaa tgcgtcgtgg tgattttctg ctgacaccgg gttggcattt tcatggtcat 480

cataatgaaa ccgatcagcc gatggcatgg attgatggtc tggatatccc gtttgttcat 540

tataccgata ccggcttttt tgaatttggc agcgaaaatg ttaccgatga tagcacaccg 600

gatgttagcc gtagcgaacg tctgtgggca catcctggtc tgcgtccgct ggttggcctg 660

gatgcaaaaa ccagcagccc gattgcagca tatcgttggg aacacaccga tgcagcactg 720

cgtgaacagc tggcactgga agatgaaggt tatgcagcaa ccaccgaacc gggtcatgca 780

gcagttcgtt ataccaatcc gaccacaggt ggtgatgtta tgccgaccat tcgtgcagaa 840

tttcatcgtc tgcgtgcggg tgcacatacc cgtccgcgtc gtgatgttgg tagcaccgtt 900

tatcaggttt ttgaaggtag cggtcgtttt gtgctgggtg gtcagacccg taccgtgggt 960

aaaggtgata tgattgttgt tccgagctgg accgaatggt caattgaagc cgataccgaa 1020

tttgacctgt ttgcatttag tgatgcaccg attgttgaac gtctgcattt tcaccgtacc 1080

tatattagcg aaggtgcaca tcatcatcat catcattaag ggccccccct cgag 1134

<210> 49

<211> 939

<212> DNA

<213> Pseudomonas alcaligenes NCIMB 9867

<400> 49

gtcgacggta tcgatttcat taaagaggag aaaggtatga aaatctgccg ctttaatgaa 60

aatcgtctgg gtgttgttga tggtgatgaa gttctggatg ttaccgaagc actgagcgtt 120

ctgccgagct atgaatatcc gctgcctggt tatgatccgc tgattaaaca tctggatgca 180

ctgctggcac gtattgaaac cctgattaaa gatgcaccgc gtattctgct ggcagatgtt 240

cgtctgctga gtccggttgc aaatccgggt aaaatcattg cagcaccgat taactatacc 300

cgtcatctgc aagaagtgct ggccgatagc gcaattaaca atggtgttgc aagctttacc 360

cagcatatca aaaaaagcgg tctgtttctg aaagcaaata gcagcctggc tggtgccggt 420

gaaggtgttg cactgagcca tcaggatcgt cgtaatgatc atgaagttga actggccatt 480

gtgattggta aaaccgcacg taatgttccg cgtgaaaaaa gcctggaata tgttgcaggt 540

tattgcattg gtattgatat gaccgttcgt ggtccggaag aacgtagctt tcgtaaaagt 600

ccggatagct ataccattct gggtccgtgg ctggttaccc gtgatgaaat tgatagtccg 660

ggtgaactgc agatgagcct gaaagttaat ggtgaagttc gtcagaatgc aaataccagc 720

gatctgattc tgggtgtgga agaactggtt gaatttgcaa gcagctttta taccctgcat 780

ccgggtgatg tgattattag cggtacaccg gaaggtgtgg gtccggttaa tcctggtgat 840

gccatgctgg cggaaattga acgtattggc accatgacca ttgcaattcg tagcgttgac 900

tacaaggatg acgatgacaa gtaagatatc gaattcctg 939

<210> 50

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 50

atctgcagct ggtacttaaa gaggtatata atgagcaatc tgcaggatgc 50

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 51

attcccatat ggtacttagc ttgcacgatc gctgc 35

Claims

1.改变了糖代谢途径的微生物的制造方法，上述方法包括：

抑制编码微生物的磷酸转移酶系酶的基因的表达，

抑制编码该微生物的丙酮酸激酶的基因的表达，而且

2.权利要求1所述的方法，其进一步包括：抑制编码由分支酸合成L-苯丙氨酸的酶的基因的表达。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，芳族化合物为水杨酸，导入编码异分支酸合酶的基因和编码异分支酸丙酮酸裂解酶的基因。

4.权利要求1或2所述的方法，其中，芳族化合物为4-羟基苯甲酸，导入编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因。

5.权利要求1或2所述的方法，其中，芳族化合物为3-羟基苯甲酸，导入编码3-羟基苯甲酸合酶的基因。

6.权利要求1或2所述的方法，其中，芳族化合物为4-氨基苯甲酸，导入编码氨基脱氧分支酸合酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因。

7.权利要求1或2所述的方法，其中，芳族化合物为2-氨基苯甲酸，导入编码氨茴酸合酶的基因。

8.权利要求1或2所述的方法，其中，芳族化合物为L-酪氨酸，导入编码分支酸变位酶的基因和编码预苯酸脱水酶的基因。

9.权利要求1或2所述的方法，其中，芳族化合物为酚，导入编码酪氨酸酚裂解酶的基因。

10.权利要求3所述的方法，其中，进一步导入编码水杨酸1-单加氧酶的基因和编码儿茶酚1,2-双加氧酶的基因。

11.权利要求5所述的方法，其中，进一步导入可由3-羟基苯甲酸合成龙胆酸、马来酰丙酮酸、和/或马来酸的1种以上的基因。

12.通过权利要求1～11的任一项所述的方法所得的、改变了糖代谢途径的微生物。

13.权利要求12所述的微生物，其中，微生物选自细菌类、酵母类和真菌类。

14.芳族化合物或其衍生物的制造方法，所述方法包括：培养权利要求12或13所述的微生物，从培养液中回收芳族化合物或其衍生物。

15.权利要求14所述的方法，其中，芳族化合物为水杨酸、4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酸、L-酪氨酸或酚，衍生物为粘康酸、龙胆酸、马来酰丙酮酸或马来酸。

16.权利要求14或15所述的方法，其中，仅添加葡萄糖作为碳源。