CN104561201A

CN104561201A - 膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法

Info

Publication number: CN104561201A
Application number: CN201410837503.4A
Authority: CN
Inventors: 刘珂; 朱维忠; 王静; 刘官军; 张兴灿; 宋超
Original assignee: Shandong Lukang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amicogen China Biopharm Co Ltd
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了一种膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法,属于蛋白工程技术领域，采用巴斯德毕赤酵母Pichia？pastori？SMD1168作为菌种，进行种子培养、种子罐培养和发酵罐培养，得到毕赤酵母菌发酵液；在通过除杂、脱色、超滤和冻干的操作，从毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白。本发明膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，工艺简单、蛋白收率高，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法。

Description

膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法

技术领域

本发明属于蛋白工程技术领域，具体涉及一种膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法。

背景技术

胶原蛋白是人体内含量最多的一种蛋白质，在皮肤、骨骼、软骨、血管等组织器官广泛分布，尤其大量存在于皮肤和结缔组织中。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中。目前我国生产胶原蛋白主要利用酸碱法从猪、牛等的皮、腱等为原料，此种方法虽然产量较大，但是生产的胶原蛋白水溶性差、纯度低且存在病毒隐患，生产过程产生废水对环境污染严重。

随着现代生物技术的发展，利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效的真核表达系统，它具有表达量高、稳定性好、成本相对较低、能分泌至胞外、便于工业化生产等优点，因而可用于胶原蛋白的产业化发酵生产。

中国专利申请专利号为201010602214.8公开了一种毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，该方法公开了以下内容：

“对发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、凝胶柱层析、沉淀脱色、离子交换层析和超滤脱盐，得到重组类人胶原蛋白。”

上述方法中，操作提取工艺流程繁琐，工艺参数不易控制。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、蛋白产率高、收率高及纯度高，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法。

本发明膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，包括以下步骤：

1)采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastori SMD1168作为菌种，进行种子培养、种子罐培养和发酵罐培养，得到毕赤酵母菌发酵液；

2)毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白：

a除杂：将毕赤酵母菌发酵液通过陶瓷膜进行水洗过滤，保留滤液；

b脱色：向步骤a)所得滤液中加入0.5-10mol/L的盐酸调节pH到3.5～4.5，静置8～12h,沉淀脱色，收集上清液；

c超滤：采用截留分子量为300-350kD的超滤膜对步骤b)所得上清液进行超滤，收集滤液；再用用截留分子量25-30kD的超滤膜超滤上述滤液，收集滤液；最后用截留分子量5-10kD的纳滤膜将上述滤液超滤，获得高浓度胶原蛋白浓缩液；

d冻干：将上述高浓度胶原蛋白浓缩液放入冻干机进行真空冷冻干燥，获得重组类人胶原蛋白Ⅰ型固体纤维状粉末。

所述步骤2)中脱色过程中，pH为4.0。

所述步骤2)中，超滤过程依次使用截留分子量为300kD、30kD、10kD的超滤膜。

本发明中发酵过程所用毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoriSMD1168，于2013年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.7981。

本发明的有益效果为：本发明膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，工艺简单、蛋白收率高，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法。

具体实施方式

实施例1

1.菌种：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoriSMD1168，保藏编号为CGMCC No.7981，保藏日期2013年8月5日；

2.培养基:

1)种子培养基为BMGY培养基，组成为(体积分数)：

酵母浸出粉 5％蛋白胨 10％

pH6.0的磷酸钾缓冲溶液 5％ YNB 1.34％

Biotin 0.33％甘油 10％；

2)种子罐培养基(30L)：

3)发酵罐培养基(300L)：

发酵方法：

1)摇瓶种子培养：

将甘油保存的菌种接种到含有300ml种子培养基的摇瓶中，30℃，300r/min培养24h；

2)种子罐培养：

将摇瓶中的种子液全部转入含30L种子罐培养基的50L发酵罐中，30℃培养，氨水调控pH5.0，溶氧控制在25％，罐压0.1MPa，搅拌100rpm,培养48h；

3)发酵罐培养：

将种子罐培养液30L转入含300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，30℃培养，氨水调控pH5.0，溶氧控制在40％，搅拌150rpm,溶氧值到达最高点100％时，说明罐内甘油消耗已尽，开始补料流加甘油，维持溶氧在40％以下；菌体湿重约150g/L后，停止甘油补料，待溶氧回升至40％后维持2h，开始甲醇诱导，诱导阶段罐温维持28℃，pH5.0，甲醇补料流速为6.5L/h,补料过程溶氧下降，等待溶氧回升至100％，以同样流速补加甲醇，如此循环72h，得到发酵液；

毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白：

a除杂：将发酵液通过100nm孔径陶瓷膜进行水洗过滤，收集滤液500L；

b脱色：向步骤a所得滤液中加入0.5mol/L的盐酸调节pH到4.0，静置沉淀脱色8h，收集上清液500L；

c超滤：采用截留分子量为300kD的超滤膜对步骤b所得上清液进行超滤，收集滤液50L；再用用截留分子量25kD的超滤膜超滤上述滤液，收集滤液20L；每次加水后测透出液电导，初始电导为5370μm/cm，电导降至85μm/cm，说明了小分子杂质和盐类已基本除去；最后用截留分子量5kD的纳滤膜将上述滤液超滤，获得高浓度胶原蛋白浓缩液2L；

d冻干：将上述高浓度胶原蛋白浓缩液放入冻干机进行真空冷冻干燥，获得重组类人胶原蛋白Ⅰ型固体纤维状粉末，胶原蛋白收率为72.65％，纯度83.60％。

实施例2

2.培养基:

1)种子培养基为BMGY培养基，组成为(体积分数)：

酵母浸出粉 5％蛋白胨 10％

pH6.0 磷酸钾缓冲溶液 5％ YNB 1.34％

Biotin 0.33％甘油 10％；

2)种子罐培养基(30L)：

3)发酵罐培养基(300L)：

发酵方法：

1)摇瓶种子培养：

2)种子罐培养：

将摇瓶中的种子液全部转入含30L种子罐培养基的50L发酵罐中，30℃培养，氨水调控pH5.0，溶氧控制在40％，罐压0.1MPa，搅拌200rpm,培养48h；

3)发酵罐培养：

将种子罐培养液30L转入含300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，30℃培养，氨水调控pH5.0，溶氧控制在30％，搅拌300rpm,溶氧值到达最高点100％时，说明罐内甘油消耗已尽，开始补料流加甘油，维持溶氧在40％以下；菌体湿重约150g/L后，停止甘油补料，待溶氧回升至40％后维持2h，开始甲醇诱导，诱导阶段罐温维持28℃，pH5.0，甲醇补料流速为6.5L/h,补料过程溶氧下降，等待溶氧回升至100％，以同样流速补加甲醇，如此循环72h；

毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白：

a除杂：将350L发酵液通过100nm陶瓷膜进行水洗过滤，收集滤液500L；

b脱色：向步骤a所得滤液中加入1.0mol/L的盐酸调节pH到4.0，静置沉淀脱色8～12h，收集上清液500L；

c超滤：采用截留分子量为350kD的超滤膜对步骤b所得上清液进行超滤，收集滤液50L；再用用截留分子量30kD的超滤膜超滤上述滤液，收集滤液20L；每次加水后测透出液电导，初始电导为6785μm/cm，电导降至80μm/cm，说明了小分子杂质和盐类已基本除去；最后用截留分子量10kD的纳滤膜将上述滤液超滤，获得高浓度胶原蛋白浓缩液2L；

d冻干：将上述高浓度胶原蛋白浓缩液放入冻干机进行真空冷冻干燥，获得重组类人胶原蛋白Ⅰ型固体纤维状粉末，收率为69.87％，纯度80.40％。

Claims

1.一种膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白：

2.根据权利要求1所述的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2)中脱色过程中，pH为4.0。

3.根据权利要求1所述的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2)中，超滤过程依次使用截留分子量为300kD、30kD、10kD的超滤膜。