WO2004038017A1 - イソマルトース生成酵素の遺伝子が欠損した、真菌類に属する微生物 - Google Patents

イソマルトース生成酵素の遺伝子が欠損した、真菌類に属する微生物 Download PDF

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WO2004038017A1
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promoter
microorganism
isomaltose
transformant
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PCT/JP2003/013353
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Kanako Suzuki
Norihiro Tsukagoshi
Original Assignee
Amano Enzyme Inc.
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    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01139—Maltose synthase (2.4.1.139)
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms used for protein production. More particularly, the present invention relates to a microorganism that can be used as a host for producing a protein-producing microorganism, a protein-producing microorganism, and a method for producing a protein using the microorganism.
  • filamentous fungi secrete and produce various enzyme proteins outside the cells. Utilizing these characteristics of filamentous fungi, various filamentous fungi including /! Spe / ⁇ ⁇ / i; s genus filamentous fungi have been used in the brewing field such as miso, soy sauce, and sake production and enzyme preparations since ancient times. It has been widely used. Long-term breeding to increase extracellular enzyme production has resulted in strains that can produce tens of grams of enzyme protein per liter of culture.
  • the promoter of the amylase gene of Aspergillus cerevisiae (see, for example, JP-A-62-272988 and Biotechnolgy, 5, 368 987), the promoter of the darcoamylase gene of Aspergillus niger, such as Biotechnology, 6, 1419 (1 988)) has been isolated and is available for use. Furthermore, the ability of promoters has been enhanced by introducing enhancers and modifying regulatory regions. The production of gene products depending on the promoter ability as described above has improved the production capacity more efficiently than the capacity enhancement by the conventional breeding method. However, in order to increase the production of extracellular enzyme protein as an absolute production, the breeding of the host strain was further improved by applying a conventional breeding method. Disclosure of the invention
  • Aspergillus oryzae Taka-amylase A is a typical inducible enzyme that is induced in starch maltose and suppressed by dulose.
  • the induction mechanism of Aspergillus niger amylase A gene has been analyzed in detail, and it has been revealed that transcription induction is controlled by Aray R, and that the true transcription inducer is isomaltose.
  • the effect of inducing the Taka-amylase A gene was investigated using starch and maltose as isomaltose sources. It was found that the expression of Taka-amylase A was remarkably higher than that of the transformant into which the DNA was introduced. From these results, it was found that the use of a microorganism deficient in the major isomaltose synthase gene as a host is an extremely effective means for producing a protein encoded by a gene that is induced to be expressed by isomaltose.
  • the present invention has been completed based on such knowledge and provides the following configurations.
  • a method for producing a protein comprising: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 shows the sequence of the promoter region of the Taka-amylase A gene (Aspergillus oryzae).
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the promoter region of the Taka-amylase A gene (Aspergillus sera), showing the location of the transcription factor binding sequence (CCAAT sequence s SRE) and the location of the mutation. Restriction enzyme sites introduced by site-specific mutation are underlined.
  • C CAAT is a CCAAT sequence (a binding factor for the broad-range transcription activator (HAP complex))
  • SRE is a transcription activator (AmyR) binding factor of amylolytic enzymes
  • TATA is a TATA-box
  • +1 is Each represents a transcription start point.
  • FIG. 3 is a diagram showing a process of preparing an amylase gene expression vector in Example 3.
  • FIG. 4 is a table summarizing the results of the amylase activity measurement in Example 4. ND in the table indicates Not Determined. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a first aspect of the present invention provides a microorganism belonging to a fungus and deficient in a gene of a main isomaltose producing enzyme.
  • the microorganism can be used as a host when producing a transformant used for producing a specific protein.
  • the “microorganism belonging to fungi” in the present invention is not particularly limited.
  • the filamentous fungus means a filamentous fungus in a broad sense, and includes yeast (ascomycetes, terminal fungi, incomplete fungi).
  • the “main isomaltose-producing enzyme” in the present invention refers to an enzyme that is most involved in the production of isomaltose in the microorganism.
  • the enzyme having the highest activity among these multiple enzymes corresponds to the main isomaltose-forming enzyme here. I do.
  • the microorganism according to the present invention only needs to be deficient in at least a gene encoding such an enzyme.
  • other microorganisms involved in the production of isomaltose (there may be more than one when there are two or more). Genes may also be deleted.
  • Specific examples of the isomaltose-forming enzyme include ⁇ -darcosidase A, -darcosidase B, transrans dulcosidase, dalcamylase, and isopululase.
  • the microorganism according to the present invention is selected by selecting an appropriate microorganism from microorganisms existing in nature or obtained from a preservation institution, and performing mutation treatment so that the gene encoding the main isomaltose synthase is deleted.
  • As a method for mutation treatment for example, a vector containing a sequence corresponding to the gene to be deleted with a mutation added in advance is prepared, and this is integrated into the chromosome of the host microorganism using genetic engineering techniques.
  • a method for disrupting the target gene present on the chromosome of the host microorganism, a site-specific mutation method, or the like can be used.
  • a second aspect of the present invention is to introduce a foreign gene using the above microorganism as a host.
  • a transformant obtained by introducing a foreign gene whose expression is induced by isomaltose into a microorganism belonging to a fungus and deficient in the gene of the main isomaltose synthase.
  • transformants Such a transformant of the present invention can be used for protein production.
  • the transformation method used for producing the transformant of the present invention is not particularly limited, and an appropriate one can be selected from known transformation methods. For example, the method of Turner et al. (Gene, 36, 321-331 (1985)) using protoplasted cells can be used. In addition, the method of Gomi et al. (Agric. Biol. Chem., 51, 323-328 (1987)) may be employed.
  • the type of vector used is not particularly limited.
  • a commercially available vector suitable for transformation in relation to a host may be prepared, and a product into which a desired gene is inserted may be used.
  • the vector preferably incorporates a selection marker suitable for selecting a transformant when the host microorganism is transformed. An appropriate selection marker is adopted in relation to the host used.
  • Orditin rubamoyltransferase gene argB
  • nitrate reductase gene niaD
  • amdS acetate amidase gene
  • tributofan synthase gene trpC
  • dihydrofolate reductase gene DHFR
  • drug resistance genes against oligomycin, destomycin, hygromycin and the like can be mentioned as specific examples of the selection marker.
  • the foreign gene used in the present invention basically includes a promoter and a structural gene (coding region).
  • the promoter of the host microorganism to be transformed In the case where-can be used (including the case where a suitable promoter has been introduced into the host microorganism in advance), those having no promoter region as the exogenous gene of the present invention, that is, those having only the coding region. It is also possible to use one that includes only the code region and the evening / mineral evening region.
  • the gene may encode a homologous protein or a gene encoding a heterologous protein.
  • the homologous protein means a protein originally produced by the host microorganism.
  • a heterologous protein means a protein that the host microorganism does not naturally produce, that is, a protein that is produced only when a gene encoding it is introduced exogenously. It is not necessary that the promoter and the structural gene (coding region) be provided from the same vector during the transformation. That is, by preparing a first vector having an introduction promoter and a second vector having a structural gene for introduction, and performing transformation using both of them, an exogenous target can be obtained. A transformant into which the gene has been introduced may be obtained.
  • a modified promoter obtained by modifying a promoter existing in nature can also be used. Specific examples of the modified promoter are shown below. In the following description, a function that can enhance promoter activity is referred to as an “enhancer function”.
  • a promoter that functions in a filamentous fungus comprises: a first DNA fragment containing CCAATNNNNNN (first nucleotide sequence: SEQ ID NO: 1); and a second DNA fragment containing CGGNNNNNNNNNGG (second nucleotide sequence: SEQ ID NO: 2).
  • a modified promoter inserted is inserted.
  • the promoter is so constructed that one first DNA fragment and one second DNA fragment form a pair, and in each pair, the first DNA fragment is located at the 5 ′ end of the promoter.
  • N represents one of A, T, C, and G.
  • the first DNA fragment and the second DNA fragment in the above modified promoter can be synthesized using, for example, a commercially available DMA synthesizer.
  • the promoter can be prepared by PCR using Aspergillus-Lyzae evening light amylase A gene as a promoter region and using an appropriate primer.
  • a portion important for the enhancer function is a sequence portion corresponding to the first DNA fragment and the second DNA fragment
  • the degree of modification of the sequence portion is preferably small.
  • other parts are not expected to be directly involved in the enhancer function, so relatively large modifications are considered to be permitted.
  • substitution, deletion, addition and the like of about 1 to 20 bases, preferably 1 to 10 bases, more preferably 1 to 5 bases can be performed.
  • Such modifications include the introduction of a restriction enzyme cleavage sequence at the 5 'end, 3' end, or other site, and addition of a sequence encoding a signal peptide.
  • a modified promoter can also be prepared by inserting a plurality of first DA fragments and a plurality of second DNA fragments into a promoter that functions in filamentous fungi. In this case, it is preferable to use the same number of the first DNA fragment and the second DNA fragment. In addition, it is preferable that one first DNA fragment and one second DNA fragment form a pair, and that the first DNA fragment is inserted into the promoter such that the first DNA fragment is located on the 5 'end side in each pair.
  • the promoter may be modified by inserting a plurality of them. Also in this case, when a promoter having a CCAAT sequence and an SRE is used as the promoter to be modified, it is preferable to insert the DNA fragment into a site other than between these two sequences. By further modifying the promoter by incorporating a plurality of DNA fragments having an enhancer function, further improvement in promoter activity can be expected.
  • the type of the promoter functioning in filamentous fungi used for the production of the modified promoter is not particularly limited as long as it has the property of functioning in filamentous fungi.
  • promoters of genes encoding proteins in microorganisms such as Aspergillus, Penicillium and Trichoderma can be mentioned.
  • promoters of genes encoding ⁇ -amylase, darcoamylase, ⁇ -darcosidase and the like of Aspergillus can be used.
  • These promoters are more sensitive to microorganisms carrying them, such as restriction enzyme treatment and PCR. It can be obtained using a biological technique.
  • the vector can be obtained from the vector by restriction enzyme treatment or PCR.
  • the target protein can be produced by culturing the transformant of the present invention under conditions capable of expressing the introduced foreign gene.
  • An appropriate culture medium is used depending on the transformant used. For example, various commercially available media or media to which components necessary for the growth, selection, promotion of protein expression and the like of transformants such as arginine and peridine are added can be used.
  • the target protein is recovered from the culture solution or the cells after culturing for a desired time. If it is a secreted protein, it can be recovered from the culture solution, otherwise it can be recovered from the cells.
  • the culture supernatant When recovering from a culture solution, for example, the culture supernatant should be filtered and centrifuged to remove insolubles, and then separated and purified by a combination of salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, and various types of chromatography. Thus, the desired protein can be obtained.
  • the target protein in the case of recovering from the cells, can be obtained by, for example, crushing the cells by pressure treatment, ultrasonic treatment, and the like, and then performing separation and purification in the same manner as described above. The above series of steps (crushing, separation, and purification of the cells) may be performed after the cells have been collected from the culture solution in advance by filtration, centrifugation, or the like.
  • Example 1 Purification of ⁇ -dalcosidase B (agdB) and cloning of agdB gene (111) 0! —Purification and enzymatic properties of dalcosidase B
  • the cell extract is dialyzed against 20 mM MES-K0H buffer (pH 5.5) containing ImM EDTA and 0.5 mM PMSF, and then equilibrated with 20 mM MES-K0H buffer (pH 5.5) beforehand.
  • the protein adsorbed on this column was eluted with a linear gradient of 0-0.5 M NaCI in 200 ml.
  • ⁇ _darcosidase activity eluted in 0.1 M NaCI
  • the fractions were collected and dialyzed against a 20 mM MES-K0H buffer (pH 5.5) containing 1.5 mM ammonium sulfate, and the active fraction was equilibrated with a Phenyl Sepha rose CL-4B column (1 x 12 cm) and eluted with a linear gradient of 40 ml of 1.5-0 ammonium sulfate.
  • the active fraction eluted with 0 mm ammonium sulfate was collected and 20 mM HEPES- After dialysis against K0H buffer-(pH 7.4), the solution was concentrated to 1 ml with Centriprep YM-10. The pull was applied to a Resource Q column previously equilibrated with the same bath sofa.
  • This enzyme has a glycosyltransferase activity that regioselectively forms ⁇ -1,6 darcoside bonds in addition to its degradation activity. It shows high hydrolysis activity for maltooligosaccharides and the highest reactivity for maliletotriose, and the reactivity decreases in the order of maltotetraose and maltobenose. It was suggested that maltooligosaccharides with low reactivity had low reactivity. The enzyme also showed hydrolytic activity against isomaltose, nigerose, kojibiose, ⁇ , ⁇ -trehalose. However, it showed little activity against ⁇ -ditrophenyldarcoside and sucrose and starch.
  • glucose and multiple glycosyltransfer products were synthesized from maltose by the glycosyltransferase activity of this enzyme. Its major glycosyltransfer products were isomaltose and panose. Six hours after the start of the reaction, a transglycosylation product was produced in an amount equivalent to about 50! Of the maltose added as a substrate, of which 60% was isomaltose. In addition, isomaltose was produced when Kojibi-Seiichi or Nigerose was used as a substrate, and isomaltriose was produced when isomaltose was used as a substrate.
  • the purified enzyme was subjected to SDS-PAGE to separate both subunits, and each was electroeluted from acrylamide.
  • Each subunit was digested with lysyl endopeptidase, and the resulting peptides were fractionated by ⁇ 5! ⁇ SDS-PAGE and electrophoretically transferred to a PVDF membrane.
  • the N-terminal amino acid sequence of each major band was determined by a protein sequencer.
  • PCR was performed using A. nidulans chromosome DMA with type I Bramera N1,11. A PCR reaction was performed again using a part of the PCR reaction product and the primers N2 and N12 to amplify a partial (440 bp) DMA fragment of the agc / ⁇ gene.
  • the n / 'cfu / a /) s chromosomal DNA was digested with ⁇ /' fld III, and the W / '? Dl II digested DNA fragment was fractionated by size on agarose gel electrophoresis.
  • ⁇ -dalcosidase ⁇ is synthesized as a single polypeptide precursor and processed to form a heterodimeric structure.
  • the amino acid sequence from the ⁇ -end to the 20th has the typical characteristics of a signal peptide, suggesting that this enzyme is a secretory enzyme.
  • Takaamylase ⁇ gene (iaaGZ) 3164 bp [Gene, 84, 319-327 (1989) pTG-taa containing D [Mo Gene. Genet., 254, 119-126 (1997)]
  • a Taka-amylase A gene promoter region and a Taka-amylase A gene coding region were prepared.
  • a 750 bp fcoR Sa / I fragment containing the Taka-amylase A (iaai ⁇ ) promoter region was obtained from pTG-taa, and this fragment was used as the fcoR of the multicloning site of plasmid pKF18K (Toyobo Co., Ltd.).
  • Plasmid pKF-taaP containing Taka-amylase promoter overnight was obtained by inserting into the mouse Sa / I site. This plasmid was used for the operation of introducing a mutation into the promoter overnight region and the construction of the modified promoter overnight region.
  • SREf (5'-GACTAGTTAACCTAGGGGCGGAAATTTAACGGGATGTTAACTAGTC-3 ': SEQ ID NO: 15) as a synthetic DNA having Spel site and ///' / 7cl I site added to the 5 'end and 3' end of SRE
  • SREr (5′-GACTAGTTAACATCCCGTTAAATTTCCGCCCCTAGGTTAACTAGTC-3 ′: SEQ ID NO: 16) was synthesized as a complementary strand of this sequence, and a DMA fragment containing SRE alone was obtained in the same manner as described above.
  • CCAAAT fragment the DNA fragment containing only the CCAAT sequence prepared here
  • SRE fragment the DMA fragment containing only SRE
  • SEQ ID NO: 9 a DNA fragment containing the region from the CCAAT sequence to the SRE
  • PCR was carried out for 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds.
  • rcCAAT-SRE Psi fragment
  • JTfto Woil site Piece SEQ ID NO: 1 1.
  • rCCAAT- SRE referred Tft 0 Bok / Voil
  • Mutagenesis was introduced into the Taka-amylase A gene promoter region as follows. First, in order to introduce a restriction enzyme site for promoter region modification into pKF-taaP prepared in (2-1), the following primers and Mutan-Super Express Km Kit (TA KARA) were used. Site-directed mutagenesis was performed on pKF-taaP.
  • the sequence of the wild-type promoter (SEQ ID NO: 12) is shown in FIG. 1, and the position of the introduced restriction enzyme site is shown in FIG.
  • a primer for introducing a W oil site into a downstream region location 465 of the evening force amylase promoter shown in SEQ ID NO: 12
  • a primer for introducing a Wol site into a region sandwiched between the CCAAT sequence and the SRE (location 252 of the evening force amylase promoter shown in SEQ ID NO: 12);
  • a primer for introducing a Spel site into a downstream region (position 490 of the Taka-amylase promoter shown in SEQ ID NO: 12),
  • Plasmid pKF-SREb containing the modified promoter-PSREb inserted into the site, the DNA fragment obtained by cleaving the CCAAT-SRE (Psil) fragment prepared in (2-2) with Pst, is the Psti in the downstream region of the promoter.
  • Plasmid pKF-PCSb containing a modified open-ended motor PCSb in which the fragment was inserted into the Xfw / Voti site downstream of the promoter was prepared.
  • the CCAAT-SRE ( ⁇ ⁇ Woil) fragment was digested with W ⁇ and cut with a Woil, recovered. The purified fragment was inserted into the ⁇ ⁇ ⁇ Woil site downstream of the promoter, and then the CCAAT-SRE ⁇ sil) fragment was removed. Plasmid pKF-PCSPb containing the modified promoter PCSPb in which the CCAAT-SRE fragment was inserted in two places was prepared by insertion into the Psil site.
  • FIG. 3 shows the process for preparing the amylase gene expression vector.
  • plasmid pU C18 Toyobo Co., Ltd.
  • Klenow treatment plasmid P UC18 lacking the Sa / I site by cell Ruch ligated (S-) I got it.
  • the fcoRI fragment of the litter force amylase A gene was isolated from the plasmid pTG-taa, and this fragment was inserted into the fcom site of the multicloning site of pUC18 (S-) to obtain pUC-taa (S-). .
  • This plasmid pUC-taa (S-) was partially digested with fcoRI to obtain a plasmid pUC-taa in which the fcoRI site at the 3 'end of the taaG gene had been deleted.
  • plasmid pBlue (XSE-) in which pBiuescriptl I KS (+) had been deleted and Sa / SaroHI was deleted was obtained.
  • an EcoR Hind ⁇ II fragment containing taaG2 was isolated from pUC-taa, and this fragment was inserted into the £ coR I-W / nrfl II site of the multicloning site of the plasmid pBlue (XSE-).
  • a plasmid pBIue-taa containing taaG2 was obtained.
  • the modified promoter region from the plasmid pKF-taaPM series (pKF-CCAATb, pF-SREb, pKF-PCSP, pKF-PCSb, or pKF-PCSPb) containing the modified promoter obtained in (2-3) was isolated and inserted into the plasmid pBlue-taa multicloning site fcoR Sa / I to obtain the plasmid pBlue-taaM in which the modified promoter region and the taa gene were linked. did.
  • the XbaI Bam fragment of the iaaG gene containing the modified promoter was isolated from pBIue-taaM, and the plasmid pBAR7 (pBluescriptl I KS (+) was inserted with the argfl gene lacking the C-terminal from Aspergillus' PBAR-taaM series (pBAR-CC AATb, pBAR-SREb. PBAR-PCSP, pBAR-PCSb, and pBAR-), which are incorporated into the Sa / nHI of the multicloning site of the purified plasmid. PCSPb).
  • a plasmid having a wild-type promoter was prepared by the same procedure, and this was designated as pBAR-taa.
  • a part (4.9 kb) cl fragment (-3, 132 to +1, 689) of the agrfS gene contained in the plasmid PGBH6 obtained in (1-2) was added to pB I uesc rip 11 I KS (+). It was subcloned to construct pGBS5.
  • the 4.9 kb fragment of C / a from W / nd III of pGBH6 (+222 to +4,726) and the / Ipa C / al3.1 kb fragment (-2, 834 to +221) prepared from PGBS5 Then, the plasmid was ligated to C / al-erased pBluescript II KS + to construct pGBA8.
  • the agciS gene disruption plasmid PGBAP2 was constructed by replacing the Sa / I1 fragment of pGBA8 (corresponding to -181 to +3,435 of the agciS gene) with the Sspl 2.0 kb fragment containing the crassapy gene.
  • the Bsp ⁇ 2.0 kb fragment contains pTG1 containing the pyr4 gene (Mol.Gen. Genet. (1997) 254: 119-126, M. Kato, A. Aoyama, F. Naruse, T. Kobayash i, and N Prepared from Tsukagosh i).
  • A. nidulans ABPU1 was transformed to obtain ⁇ aggrfg strain DBP9.
  • the insertion of the oyM gene at the site was confirmed by Southern plot analysis. This strain has been deposited as follows.
  • Filamentous fungi were transformed as follows. First, the plasmids pBAR-taa, pBAR-PCSb, and pBAR-PCSPb obtained in Example 3 were digested with fcoRV, followed by extraction with phenol / chloroform and ethanol precipitation to obtain purified plasmid. Was used for transformation. Transformation was performed as follows.
  • ⁇ -Darcosidase deficient strain DBP9 ((pyrG89) biAl wA3 argB2 pyroA4A agdB :: pyr4) of Aspergillus penidlans obtained in (4-1) and an Aspergillus' two-drance ABPU1 strain (biAI pyrG89) as a control strain wA3 argB2 pyroA4) was added to a complete medium (2% malt extract, 2% glucose, 0.1% peptone) and supplemented with nutrients (arginine, peridine, pyridoxine, and biscuitin) at 37 ° C. C.
  • a complete medium 2% malt extract, 2% glucose, 0.1% peptone
  • Chromosomal DMA was prepared from each transformant as follows. First, the transformant was cultured overnight at 37 ° C in a medium supplemented with the necessary nutrients (peridine, pyridoxine, and biotin) in a complete medium, and the resulting cells were placed in a Buchner funnel. It was collected with No. 2 filter paper (Advantech) and washed with sterilized water. After removing excess water, the mixture was frozen at -80 ° C and dried using FREEZONE (LABCONCO). After drying, add 1 glass ball and crush it with a multi-beads shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) at 2,000 rpm for 5 minutes to form a fine powder.
  • a multi-beads shocker Yasui Kikai Co., Ltd.
  • a TE solution containing 0.2 mg / ml proteinase K was further added, and 37 ° (:, This solution was reacted for 30 minutes, extracted with phenol / chloroform, and precipitated with 2.5 volumes of cold ethanol The precipitate was rinsed with 70% ethanol, dried, and dissolved in TE solution.
  • Chromosomal DNA solution Southern blot analysis was performed by digesting chromosomal DNA with / lI or fcoRV, separating it by agarose gel electrophoresis, and plotting it on nylon membrane (Roche). Sg / It Sfflal digest was detected as a probe, and probe labeling and signal detection were performed using a DIG nucleic acid detection kit (Roche).
  • Amylase productivity using the BPU1 strain as a host was compared by the following procedure.
  • each transformant minimal medium (0.9% Na 0 3, 0.05 % KCU 0.15% KH 2 P0 4, 0.
  • the amylase activity was determined by adding an enzyme solution to 20 mM sodium acetate buf fer, lOmM CaCI 2 , and 2% Soluble Starch (Nacalai Tesque) to prepare a reaction system for I.
  • the amount of reducing sugars produced by reacting at 7 ° C for 20 minutes was quantified by the NeIson-Somogyi method.
  • the amount of enzyme that releases ⁇ of glucose per minute was defined as lun.
  • the amylase production was determined from the measured amylase activity value, and the amylase productivity was compared between the case where the ⁇ -darcosidase B-deficient strain was used as the host and the case where the ABPU 1 strain was used as the host.
  • the amylase activity when cultured in MP medium using maltose as a C source was measured.
  • the amount of amylase production is about 7 times that when the ABPU 1 strain is used as a host, and the modified promoter (PCS b Alternatively, the amylase production of the strain incorporating PCS P b) was about twice that of the ABPU1 strain as a host. From these results, it was found that when a C source such as maltose, which easily synthesizes isomaltose, was used in the medium, the amylase producing ability could be further enhanced by using a host lacking the agdB gene.
  • a host microorganism capable of efficiently increasing the expression of a gene when the gene is introduced exogenously.
  • the target protein can be produced with high productivity.

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Abstract

　目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した際に当該遺伝子の発現を効率的に高めることが可能な宿主微生物を提供する。また、目的のタンパク質を高い効率で産生可能な形質転換体を提供する。更には、目的のタンパク質を高い生産性で生産可能な生産方法を提供する。真菌類に属し且つ主たるイソマルトース生成酵素の遺伝子を欠損した微生物である。当該微生物に目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る。導入された遺伝子が発現可能な条件下で当該形質転換体を培養してタンパク質を産生させる。

Description

明 細 書 イソマルトース生成酵素の遺伝子が欠損した、 真菌類に属する微生物 技術分野
本発明はタンパク質の生産に利用される微生物に関する。 詳しくは、 タンパク 質生産用微生物を作製するための宿主として用いることができる微生物、 夕ンパ ク質生産用微生物、 及び該微生物を用いたタンパク質の生産方法に関する。 背景技術
糸状菌は菌体外に各種の酵素蛋白質を分泌生産することが知られている。 糸状 菌の持つこうした特性を利用して古来より味噌、 醤油、 清酒製造などの醸造分野 や酵素製剤の製造に /!spe/^〃/i;s属糸状菌を始めとする各種の糸状菌が広く用い られてきた。 菌体外酵素の生産能力を高めるために長期間にわたる育種が行われ た結果、 培養液 1 リッ トルあたり数十グラムの酵素蛋白質を生産できる菌株も得 られている。
一方、 近年の遺伝子組換え技術の応用により多様な蛋白質の生産が可能となつ た。 遺伝子組換え菌による酵素蛋白質の生産においては目的の醉素を大量に生産 させる こめの手段として、 遺伝子の転写能力を高める事が高生産に繋がるとの考 えから、 より強い転写能力を持つプロモー夕一を検索し、 これを利用することが 行われている。 このような観点から、 これまでに種々の糸状菌由来のプロモータ 一が単離され、 それらを用いたタンパク質の生産系が報告されている。 例えば、 ァスペルギルス■才リゼのアミラーゼ遺伝子のプロモータ一 （例えば特開昭 62— 272988号公報及び Biotechnol ogy, 5， 368 987)を参照）、 ァスペルギルス .ニガ 一のダルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター （例えば Biotechno logy, 6， 1419(1 988)を参照） 等が単離され、 利用に供されている。 さらに、 ェンハンサ一の導入 や調節領域の改変などによりプロモーターの能力を高める事も行われてきた。 以 上のようなプロモーターの能力に依存した遺伝子産物の生産によって、 旧来の育 種法による能力増強に比べると効率的に生産能力を上げる事が出来ている。 しか しながら、 絶対生産量として菌体外酵素蛋白質の生産量を上げるためには更に旧 来の育種法を適用しての宿主菌株の育種改良が行われていた。 発明の開示
本発明は以上の背景に鑑み、 目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した 際に当該遺伝子の発現を効率的に高めることが可能な宿主微生物を提供すること を目的とする。 また、 目的のタンパク質を高い効率で産生可能な形質転換体を提 供することを目的とする。 更には、 目的のタンパク質を高い生産性で生産するこ とが可能な生産方法を提供することをも目的とする。
本発明者らは以上の課題を解決すべく麹菌タカアミラーゼ Aに注目して種々の 検討を行った。 麹菌タカアミラーゼ Aはデンプンゃマル卜一スで誘導され、 ダル コースで抑制される典型的な誘導酵素である。 麹菌夕力アミラーゼ A遺伝子の誘 導機構は詳細に解析されており、 Aray Rにより転写誘導が制御され、 真の転写誘導 物質はィソマル卜一スである事が明らかにされている。 デンプンゃマル卜ースに より麹菌夕力アミラーゼ A遺伝子が転写誘導されるのは、 デンプンゃマル卜ース に 0；—ダルコシダーゼが作用することによリィソマル卜一スが生成することに起 因することが明らかにされている。 本発明者らはまず、麹菌夕力アミラーゼ A遺伝子の誘導機構を解明する過程で、 ァスペルギルス ■ 二ドランスにおける主たるイソマルトース生成酵素である α— ダルコシダ一ゼ Βに着目し、 これを欠損する変異株（A agdB株）を作製した。 続い て当該欠失変異株に夕力アミラーゼ A遺伝子を導入した。 このようにして得られ た形質転換体において、 イソマルト一ス源となるデンプン及びマルト一スを用い てタカアミラーゼ A遺伝子の誘導効果を調べたところ、 コントロール （野生株を 宿主として夕力アミラーゼ A遺伝子を導入した形質転換体） に比較して飛躍的に タカアミラーゼ Aが発現していることが判明した。 この結果から、 イソマルトー スによる発現誘導を受ける遺伝子のコードするタンパク質を生産する目的におい て、 主たるイソマルトース生成酵素遺伝子を欠損した微生物を宿主として用いる ことが極めて有効な手段となるとの知見が得られた。 本発明はかかる知見に基づ き完成されたものであって次の各構成を提供する。
[ 1 ]真菌類に属し且つ主たるイソマル卜一ス生成酵素の遺伝子を欠損した微生 物。
[2 ]糸状菌に分類される微生物である、 [ 1 ]に記載の微生物。
[3 ] α—ダルコシダーゼ B遺伝子が欠損したァスペルギルス · ニドランス。
[4 ]真菌類に属し且つ主たるイソマルトース生成酵素の遺伝子を欠損した微生 物に、 イソマルトースでその発現が誘導される外来遺伝子を導入してなる形質転 換体。
[5 ]前記微生物が糸状菌に分類される微生物である、 [4 ]に記載の形質転換体。
[6 ] α —ダルコシダ一ゼ Β遺伝子を欠損したァスペルギルス ■ 二ドランスに、 イソマルト一スでその発現が誘導される外来遺伝子を導入してなる形質転換体。
[7 ]前記外来遺伝子が次の改変プロモ一夕一を含有する、 [4：]〜 [6 ]のいずれ かに記載の形質転換体、
糸状菌で機能するプロモーターに、 CCAATNNMNNN (第 1 塩基配列 ： 配列番号 1 ) を含む第 1 DNA断片と、 CGGN MNNNNNN GG (第 2塩基配列 ： 配列番号 2 ) を含む第 2 DNA断片と、 を挿入してなる改変プロモー夕一。
[8 ]前記外来遺伝子が発現可能な条件下で [4：]〜 [ 7 ]のいずれかの形質転換体 を培養するステップ、 及び
産生されたタンパク質を回収するステップ、
を含む、 タンパク質の生産方法。 図面の簡単な説明
図 1 はタカアミラーゼ A遺伝子 （ァスペルギルス ■ォリゼ） のプロモーター領 域の配列を示す図である。
図 2はタカアミラーゼ A遺伝子 （ァスペルギルス ■ 才リゼ） のプロモーター領 域の模式図であり、 転写制御因子結合配列 （CCAAT配列 ■ SRE) の位置と、 変異導 入箇所を示す。 部位特異的変異によって導入した制限酵素サイ 卜を下線で示す。 C CAATは CCAAT配列 （広域転写活性化因子 （HAP複合体） の結合因子）、 SREはデン プン分解酵素遺伝子群の転写活性化因子 （AmyR) の結合因子、 TATAは TATA- box、 +1 は転写開始点をそれぞれ表す。
図 3は実施例 3におけるアミラーゼ遺伝子発現ベクターの作製過程を示す図で ある。
図 4は実施例 4におけるアミラーゼ活性測定の結果をまとめた表である。 表中 の N. D.は Not Determined (未決定） を表す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の構成を詳細に説明する。 本発明の第 1 の局面は、 真菌類に属し 且つ主たるイソマルトース生成酵素の遺伝子が欠損した微生物を提供する。 当該 微生物は特定の夕ンパク質を生産する際に利用される形質転換体を作製する場合 の宿主として用いられ得る。 本発明における「真菌類に属する微生物」は特に限定 されない。 例えば、 ァスペルギルス ■ 才リゼゃァスペルギルス · ニドランス、 ァ スペルギルス ' 二ガー、 ァスペルギルス ' ァヮモリ、 ぺニシリウ厶 ' クリソゲノ 厶、 ニューロスボラ · クラッサ、 卜リコデルマ ' レツセィなどの糸状菌 （ッポ力 ビ門、 接合菌門、 子嚢菌門、 サビキン類、 不完全菌類を含む） が含まれる。 尚、 本発明における糸状菌とは広義の糸状菌を意味し、 酵母 （子嚢菌類、 端子菌類、 不完全菌類） を包含する。 本発明における「主たるイソマルトース生成酵素」とは当該微生物においてイソ マルトースの生成に最も関与している酵素のことをいう。 即ち、 対象の微生物が イソマル卜ース生成活性を有する異なる種類の酵素を有する場合には、 これら複 数の酵素の中で最も活性の高いものがここでの主たるイソマル卜ース生成酵素に 該当する。 本発明における微生物は少なくともこのような酵素をコードする遺伝 子が欠損しておればよく、 例えばイソマルトースの生成に関与するその他の酵素 (二つ以上ある場合には複数であってもよい） の遺伝子があわせて欠損していて もよい。 イソマルトース生成酵素の具体例としては α —ダルコシダーゼ A、 - ダルコシダーゼ B、 卜ランスダルコシダーゼ、 ダルクアミラーゼ、 イソプルラナ ーゼを挙げることができる。 自然界に存在する微生物又は保存機関などから入手される微生物から適切なも のを選択し、 これに主たるイソマルトース生成酵素をコードする遺伝子が欠損す るように変異処理を施すことによって本発明における微生物を作製することがで きる。 変異処理の方法としては例えば、 欠損させようとする遺伝子に相当する配 列に予め変異を加えたものを含むベクターを用意し、 これを宿主微生物の染色体 に遺伝子工学的手法を用いて組込み、 これによつて宿主微生物染色体上に存在す る目的の遺伝子を破壊する方法や、部位特異的変異法などを用いることができる。 本発明の第二の局面は上記微生物を宿主として外来遺伝子を導入することによ り得られる形質転換体に関し、 具体的には、 真菌類に属し且つ主たるイソマル卜 ース生成酵素の遺伝子が欠損した微生物に、 イソマルトースでその発現が誘導さ れる外来遺伝子を導入してなる形質転換体を提供する。 かかる本発明の形質転換 体はタンパク質の生産に利用することができる。 本発明の形質転換体を作製する際に用いられる形質転換方法は特に限定されず, 公知の形質転換方法から適当なものを選択できる。 例えばプロ 卜プラスト化した 菌体を用いた Turner らの方法 （Gene, 36, 321-331 (1985)) を利用することがで きる。 その他、 五味らの方法 （Agric. Bio l . Chem. , 51， 323-328 (1987) ) などを 採用してもよい。
形質転換をベクターを用いて行う場合において、 使用されるベクターの種類は 特に限定されない。 例えば、 宿主との関係において形質転換に適した市販のべク 夕一を用意し、 これに目的の遺伝子を挿入したものを用いることができる。 ベクターには、 宿主微生物を形質転換した際に形質転換体を選択するのに好適 な選択マーカーが組込まれていることが好ましい。 選択マーカーは使用する宿主 との関係で適当なものが採用される。 オル二チン力ルバモイル卜ランスフェラー ゼ遺伝子（argB)、硝酸還元酵素遺伝子（niaD)、 ァセ卜アミダーゼ遺伝子（amdS)、 トリブトファンシンターゼ遺伝子 （trpC)、 ジヒドロ葉酸レダク夕ーゼ遺伝子 （D HFR) 等の栄養要求性相捕遺伝子、 オリゴマイシン、 デス卜マイシン、 ハイグロマ イシン等に対する薬剤耐性遺伝子などを選択マーカーの具体例として挙げること ができる。 本発明において使用される外来遺伝子は、 原則的にはプロモーターと構造遺伝 子 （コード領域） とを含む。 但し、 形質転換に供される宿主微生物のプロモー夕 —を利用できる場合 （予め外来的に適当なプロモーターが宿主微生物に導入され ている場合も含む） には、 本発明の外来遺伝子としてプロモーター領域を含まな いもの、 即ちコード領域のみを含むものゃコ一ド領域及び夕一ミネ一夕領域のみ を含むものなどを用いてもよい。
プロモーターとしてはイソマルト一スで誘導されるという性質を有するものが 用いられ、 一方、 構造遺伝子としては形質転換体に組込まれた後に当該プロモー 夕一の支配下となるものが用いられる。 このような条件を満たす限りプロモータ —及び構造遺伝子は特に限定されず、 プロモーターとしては例えばァスペルギル ス属、 ぺニシリウ厶属、 卜リコデルマ属等の微生物におけるタンパク質をコード する遺伝子の中でイソマルトースによる誘導が行われるプロモーターを用いるこ とができる。 より具体的には、 ァスペルギルス属の α —アミラーゼ、 ダルコアミ ラーゼ、 α—ダルコシダーゼ等をコ一ドする遺伝子のプロモーターを用いること ができる。 中でも、 ァスペルギルス ■ 才リゼのタカアミラーゼのプロモーターを 用いることが好ましい。 これらのプロモーターはそれを有する微生物より制限酵 素処理、 PC R 法などの遺伝子工学的手法を用いて取得することができる。 また、 目的とするプロモーターが組込まれたベクターを利用できる場合には当該べクタ 一から制限酵素処理や PCR法などによって取得することができる。 一方、 構造遺 伝子としては例えば、 α —アミラーゼ、ダルコアミラーゼ、 α —ダルコシダーゼ、 セルラーゼ、 ぺクチナーゼ等の糖質関連酵素をコードする遺伝子や、 キモシン等 のプロテアーゼをコードする遺伝子、 或はリパーゼをコードする遺伝子などを用 いることができる。 尚、 同種タンパク質をコードする遺伝子であっても異種タン パク質をコードする遺伝子であってもよい。 ここでの同種タンパク質とは、 宿主 微生物が本来的に産生するタンパク質を意味する。 一方、 異種タンパク質とは、 宿主微生物が本来は産生しない夕ンパク質、 即ち外来的にそれをコードする遺伝 子が導入されることにより初めて産生されるタンパク質を意味する。 形質転換の際にプロモーターと構造遺伝子 （コード領域） とが同一のベクタ一 から供与される必要はない。 即ち、 導入用プロモーターを保有する第 1 のべクタ 一と、 導入用構造遺伝子を保有する第 2のべクタ一とを用意し、 これら両者を用 いて形質転換を行うことによリ目的の外来遺伝子が導入された形質転換体を得る こととしてもよい。 自然界に存在するプロモーターを改変して得られる改変プロモーターを用いる こともできる。 以下に改変プロモーターの具体例を示す。 尚、 以下の説明におい てプロモーター活性を高めることができる機能を「ェンハンサー機能」という。
(1)糸状菌で機能するプロモーターに、 CCAATNNNNNN (第 1塩基配列 ： 配列番号 1 ) を含む第 1 DNA断片と、 CGGNNNNNNNNNGG (第 2塩基配列 ： 配列番号 2 ) を含 む第 2DNA断片と、 を挿入してなる改変プロモーター。
(2)前記第 1塩基配列が CCAATTAGAAG (配列番号 3 ) である、 （1)に記載の改変 プロモータ一。
(3)前記第 2塩基配列が CGGHN WWNWHGG (配列番号 4) である、 （1)又は（2)に 記載の改変プロモーター。
(4)前記第 2塩基配列が CGG 龍 WW HGG (配列番号 5 ) である、 （1)又は（2)に 記載の改変プロモータ一。
(5)前記第 2塩基配列が CGGAAATTTAAAGG (配列番号 6 )、 CGGAATTTAAACGG (配列 番号 7 ) 又は CGGAAATTTAACGG (配列番号 8) である、 （1)又は（2)に記載の改変プ 口モーター。
(6)前記プロモーターの 5'末端側から 3'末端側に向かって順に第 1 DMA断片、 第 2DNA 断片が並ぶよう挿入される、 （1)~(5)のいずれかに記載の改変プロモー 夕一。
(7)前記プロモーターに存在する CCAAT配列よりも 5 '側上流域、 又はプロモ一 ター領域に存在する S RE領域よリも 3 '側下流域に前記第 1 DNA断片及び前記第 2 D NA断片が挿入される、 （6)に記載の改変プロモータ一。
(8)複数個の前記第 1 DNA断片及び複数個の前記第 2 DNA断片が挿入される、（1 ) ~ (7)のいずれかに記載の改変プロモーター。
(9)前記第 1 DNA断片と前記第 2 DMA断片が同じ数ずつ挿入される、（8)に記載の 改変プロモーター。
(1 0)—つの第 1 DNA断片と一つの第 2 DNA断片とが組みをなし、かつ各組におい て第 1 DNA断片が前記プロモーターの 5 '末端側に位置するように、 前記プロモー ターに前記第 1 DNA断片と前記第 2 DNA断片が挿入される、 （9)に記載の改変プロ モータ一。
( 1 1 )糸状菌で機能するプロモーターに、 配列番号 9の塩基配列を有する DNA断 片、 又は該 DNA断片の一部が改変された DNA断片であってェン八ンサ一機能を有 する DNA断片を 1 〜数個組込んでなる改変プロモーター。
(1 2)前記糸状菌で機能するプロモーターがァスペルギルス · 才リゼのタカアミ ラーゼのプロモー夕一である、 （1 )〜（1 1 )のいずれかに記載の改変プロモータ一。 尚、 以上において Nは A、 T、 C、 Gのいずれかであることを表す。 以上の改変プロモーターにおける第 1 DNA断片及び第 2 DNA断片は、例えば市販 の DMA合成機を用いて合成することができる。 また、 例えばァスペルギルス - 才 リゼの夕力アミラーゼ A遺伝子のプロモーター領域を錶型とし、 適当なプライマ 一を用いた PCR法によって調製することもできる。
第 1 DMA断片及び第 2 DNA断片を含む一つの DNA断片を調製し、これを糸状菌で 機能するプロモーターへ組込むことにより改変プロモータ一を作製することもで きる。 例えば、 ァスペルギルス属などにおけるプロモーターの中から第 1 DNA 断 片及び第 2 DMA 断片に相当する配列を内包するプロモーターを選択し、 これを鎳 型とした PC R法などを行うことによって、 このような DNA断片を調製することが できる。 鏵型として用いることができる好適なプロモーターの例としてはァスぺ ルギルス · ォリゼのタカアミラーゼ A遺伝子のプロモーター （配列番号 1 2 ) を 挙げることができる。 プロモータ一の改変に用いられる DMA断片の塩基配列の一 例を配列番号 9に示す。 この DNA断片 （CCAAT- S RE断片） はァスペルギルス - 才 リゼのタカアミラーゼ A 遺伝子におけるプロモーター領域の一部 （240 位〜 367 位 （転写開始点を + 1 として一 3 1 2位〜一 1 85位）） である。 尚、 この DNA断片に —部の改変を施した DMA断片であっても、 それが組込まれるプロモーターの活性 を高める機能 （ェンハンサー機能） を有する限りプロモーター領域の改変に利用 できる。 ここで、 一部の改変とは DNA断片を構成する一部の塩基が置換、 欠失さ れる場合、 又は 1 〜数個の塩基が付加若しくは挿入される場合をいう。 このよう な改変が許容される程度は、 改変が行われる DNA断片上の部位によって異なる。 ェンハンサー機能に重要な部分は第 1 DNA 断片及び第 2 D NA 断片に相当する配列 部分であるので、 当該配列部分の改変の程度は小さいことが好ましい。 他方、 そ の他の部分はェンハンサー機能に直接関与しないと予想されることから比較的大 きな改変が許容されると考えられる。 例えば、 1 ~ 2 0個程度、 好ましくは 1 〜 1 0個、 さらに好ましくは 1 〜 5個の塩基の置換、 欠失、 付加などを行うことが できる。 尚、 このような改変には 5 '末端、 3 '末端、 又はその他の部位への制限酵 素切断配列の導入や、シグナルペプチドをコードする配列の付加などが含まれる。 以上の改変プロモーターでは糸状菌で機能するプロモーターに第 1 DMA 断片及 び第 2 DNA断片（以下、 これらの DMA断片及びこれらを含む DNA断片をまとめて、 「ェンハンサ一機能を有する DMA断片」とも呼称する） が挿入されて改変プロモー ターが構築されるが、 これらの DNA断片の挿入部位は特に限定されない。 但し、 改変が施されるプロモーターとして CCAAT .配列及び S REを有するものを採用する 場合にはこれら二つの配列の間以外の部位に挿入することが好ましい。 即ち、 CC AAT配列よりも 5 '末端側の部位又は S REよりも 3 '末端側の部位にェンハンサ一機 能を有する DNA断片を挿入することが好ましい。 糸状菌で機能するプロモーターに複数個の第 1 D A 断片及び複数個の第 2 DNA 断片を挿入して改変プロモーターを作製することもできる。 この場合、 使用する 第 1 DNA断片と第 2 DNA断片の個数を同じとすることが好ましい。 また、 一つの第 1 DNA断片と一つの第 2 DNA断片とが組をなし、 かつ各組において第 1 DNA断片が 5'末端側に位置するようにプロモーターに挿入されることが好ましい。
第 Ί DMA断片と第 2 DNA断片を含む DNA断片を用いる場合においても、これを複 数挿入してプロモーターの改変を行ってもよい。 この場合においても、 改変が施 されるプロモーターとして CCAAT配列及び SREを有するものを採用するときには、 これら二つの配列の間以外の部位に当該 DNA断片を挿入することが好ましい。 複数のェンハンサー機能を有する DNA断片を組込んでプロモーターの改変を行 うことにより更なるプロモーター活性の向上が期待できる。 改変プロモーターの作製に供される、 糸状菌で機能するプロモーターとしては 糸状菌で機能するという性質を有する限りその種類は特に限定されない。例えば、 ァスペルギルス属、 ぺニシリウ厶属、 卜リコデルマ属等の微生物におけるタンパ ク質をコードする遺伝子のプロモータ一を挙げることができる。 具体的には、 ァ スペルギルス属の α—アミラーゼ、 ダルコアミラーゼ、 α —ダルコシダーゼ等を コードする遺伝子のプロモーターを用いることができる。 中でも、 ァスペルギル ス · 才リゼのタカアミラーゼのプロモーターを用いることが好ましい。 これらの プロモーターはそれを有する微生物より、 制限酵素処理、 PCR 法などの遺伝子ェ 学的手法を用いて取得することができる。 また、 目的のプロモーターが組込まれ たべクタ一を利用できる場合には、 当該ベクターから制限酵素処理や PCR法など によって取得することができる。 本発明の形質転換体を、 導入された外来遺伝子を発現可能な条件下で培養する ことにより目的のタンパク質を産生させることができる。 培養用の培地は使用さ れる形質転換体に応じて適切なものが用いられる。 例えば市販の各種培地又はこ れらにアルギニン、 ゥリジン等の形質転換体の生育、 選択、 タンパク質の発現促 進などに必要な成分を添加した培地などを用いることができる。 所望時間培養した後の培養液又は菌体より目的のタンパク質が回収される。 分 泌型タンパク質であれば培養液より、 それ以外であれば菌体内より回収すること ができる。 培養液からの回収する場合には例えば、 培養上清をろ過、 遠心処理し て不溶物を除去した後、 硫安沈殿等の塩析、 透析、 各種クロマトグラフィーなど を組み合わせて分離、 精製を行うことにより目的のタンパク質を取得することが できる。 他方菌体内から回収する場合には例えば、 菌体を加圧処理、 超音波処理 などによって破砕した後、 上記と同様に分離、 精製を行うことにより目的のタン パク質を取得することができる。 尚、 ろ過、 遠心処理などによって予め培養液か ら菌体を回収した後に上記一連の工程 （菌体の破砕、 分離、 精製） を行ってもよ い。
[実施例]
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
[実施例 1 ] α—ダルコシダーゼ B ( agdB ) の精製と a gd B遺伝子のクローン化 ( 1 一 1 ) 0!—ダルコシダーゼ Bの精製と酵素学的性質
Aspergillus nidulans ABPU1 (pyrG89, biAl, wA3, argB2, pyroA4： Mo I . Gen. Genet. (1997) 253 : 520-528, Motoyama, T. , . Fuj i sawa, N. Koj ima, H. Horiuch i， A. Ohta and M. Takagi.)を、 炭素源として 2 %スターチを含む最小培地 2L に胞子数 10s/ml となるように接種し、 37°Cで 24時間振とう培養した。 吸引ろ過 により菌体を分離し、 液体窒素で凍結後、 液体窒素存在下で菌体を粉末状に破砕 した。 菌体湿重量 1gあたり 5ml の抽出バッファー （0.5% Tri ton X- 100， Im ED TA, 2tnM PMSFを含む 0.2M MES-K0Hバッファー， ρΗ5· 5) を加えて懸濁させ、 ポリ 卜ロンでホモゲナイズした。 16,000 X g, 4°Cで 30分間違心分離し、 得られた上 清を細胞抽出液とした。 この細胞抽出液より α—ダルコシダーゼ Bを以下のよう にして精製した。 細胞抽出液を ImM EDTA, 0.5mM PMSFを含む 20 mM MES-K0Hバッファー （pH 5. 5) に対して透析した後、 あらかじめ 20 mM MES-K0Hバッファ一 （pH 5.5) で平衡 化した DEAE- Tyopearl 65(^カラ厶（2.5 x 10 cm)に供した。 本カラムに吸着した タンパク質を 200 ml の 0-0.5 M NaCI 直線濃度勾配により溶出した。 0.1 M NaCI で溶出された主要な α _ダルコシダーゼ活性画分を回収し、 1.5 Μ 硫酸アンモニ ゥ厶を含む 20 mM MES-K0Hバッファ一 （pH 5.5) に対して透析した。 この活性画 分を同バッファーで平衡化した Phenyl Sepha roseCL- 4Bカラム（ 1 x 12 cm) に吸 着させ、 40 ml の 1· 5—0 Μ硫酸アンモニゥ厶の直線濃度勾配により溶出した。 硫 酸アンモニゥ厶 0 Μで溶出された活性画分を回収し、 20 mM HEPES- K0Hバッファ - (pH 7.4)に対して透析した後、 Centriprep YM- 10で 1 ml に濃縮した。 この濃 縮サンプルをあらかじめ同バソファ一で平衡化した Resource Qカラムに供した。
Resource Qカラ厶クロマトグラフィーは AKTA explorer 10Sシステムを使用して 行った。 本カラムに吸着したタンパク質は 60 ml の 0— 1 M NaCI 直線濃度勾配に より溶出した。 塩濃度 0.3 Mで溶出された活性画分を 20 mM HEPES- K0Hバッファ 一（pH 7.4)に対して透析し、 精製酵素とした。 本精製酵素は 74 kDaと 54 kDaのサブュニッ 卜で構成され、 至適 pHは 5.5、 pH 安定性は pH 5.0から pH8.5の間、 また温度安定性は 45°Cまでは酵素活性を 90¾！ 以上保持しており、 pH 4.0 以下、 pH 11.0 以上、 60°C以上で完全に酵素活性が失 われた。
本酵素は分解活性に加えて位置選択的に α — 1 ， 6ダルコシド結合を形成する 糖転移活性を有している。 マルトオリゴ糖に対して高い加水分解活性を示し、 マ リレト 卜リオースに対して最も高い反応性を示し、 マル卜テ卜ラオース、 マル卜べ ン夕オースの順に反応性が低下することから、 重合度の高いマル卜オリゴ糖に反 応性が低いことが示唆された。 また、 本酵素はイソマルト一ス、 ニゲロース、 コ ージビオース、 α、 α— 卜レハロースに対しても加水分解活性を示した。 しかし、 ρ -二トロフエニルダルコシドおよびショ糖、 スターチに対してほとんど活性を示 さなかった。 また、 本酵素の糖転移活性により、 マルトースからグルコースと複 数の糖転移産物が合成された。 その主要な糖転移産物はイソマルト一スとパノー スであった。 反応開始から 6時間で、 基質として加えたマル卜一スの約 50 ! こ相 当する量の糖転移産物が生成し、 そのうちの 60 ¾がイソマルトースであった。 ま た、 コージビ才一ス、 ニゲロースを基質にした場合はイソマル卜一スが生成し、 イソマル卜一スを基質にした場合はイソマル卜卜リオースが生成した。
( 1 - 2 ) α—ダルコシダ一ゼ Β遺伝子のクローン化
上記精製酵素標品を SDS- PAGEに供し、 74 kDa及び 55 kDaの各サブユニッ トを 分離し、 電気泳動的に Sequi- Blot PVDF膜に転写した。 74 kDa及び 55 kDaの各 サブユニッ トに相当するバンドを膜より切り出し、 Appl i ed Biosystems model 4 73Aプロテインシークェンサ一により N末端アミノ酸配列を決定した。 74 kDa及 び 55 kDaの各サブュニッ 卜の N末端アミノ酸配列はそれぞれ SQAGVDPLDRPGNDYVK D及び QSHRQLGAGRWRSAVRHであった。 また、 74 kDa及び 55 kDaの各サブュニッ 卜 の内部アミノ酸配列を決定するために、精製酵素を SDS- PAGEに供し、 両サプュニ ッ 卜を分離し、 それぞれをアクリルアミ ドから電気溶出した。 各サブユニッ トを リジルエンドべプチダーゼで分解し、得られたペプチドを 〗5!¾ SDS-PAGEにより分 画し、電気泳動的に PVDF膜へ転写した。 それぞれの主要なバンドについてプロテ インシークェンサ一により N末端アミノ酸配列を決定した。 74 kDaサブュニッ 卜 に由来する主要べプチド （30 kDa)及び 55 kDaサブュニッ 卜に由来する主要ぺプ チド （15 kDa) の N末端アミノ酸配列はそれぞれ THLPQNPHLYGLGE及び DVSHWLGDN ISDWLSYRLSI であった。
74 kDaサブユニッ トの N末端および内部アミノ酸配列に基づいて、 N末端のプ ライマー N1 (5， -A GCNGGNGT I GAYCC I YTNGA-3 ' )， Ν2(5' -YTNGAYMG I CCNGG I AAYGA- 3' ：)および内部アミノ酸配列に相当するプライマー M (5' -CCRTANARRTGIGGRTTYT GNGG-3' )， 12(5' -TG I GGRTTYTGNGG I ARRTGNGT-3 ' )を設計し、 PCR反応に供した。
A. nidulans染色体 DMAを錶型にブラーマ一 N1， 11 を用いて PCR反応を行った。 PC R反応物の一部とプライマ一 N2， 12を用いて再度 PCR反応を行い、 agc/β遺伝子の 一部 （440bp) の DMA断片を増幅した。 ん n/'cfu/a/)s染色体 DNAを 〃/ 'fld I I I で消化 し、 W/' ?dl I I 消化 DNA断片をァガロース電気泳動で大きさにより分画した。 上述 した 440bpDNA断片とハイプリダイズする 5— 7 kbの DNA断片を pB I ues c r i p t I I KS+ (STRATAGENE社） に連結し、 大腸菌」M109 (STRATAGENE社） を形質転換した。 次に、 440bpDMA断片とハイブリダィズする形質転換株を取得した。 本形質転換株 は agc/β遺伝子を含む 5.6 kbの W/ndl I IDNA断片を保持していた。このプラスミ ド を PGBH6 と命名した。 クローン化した DNA断片の塩基配列は U- COR model 4000 DNA sequencerを使用して Sanger らの方法で決定した。 遺伝子は 57— 72 bp の 3つの短いイン卜ロンを含む 3， 055 bpからなリ、 995アミノ酸残基をコードし ている。本遺伝子の塩基配列（配列番号 2 7 )は DDBJ/EMBL/GenBankに登録した。 その accession number は AB057788である。 化学的に決定した 74 kDa及び 55 k Daの各サブュニッ 卜の N末端アミノ酸配列は、 推定アミノ酸配列の 21 から 39番 目、 515から 531 番目までのアミノ酸配列と一致し、 また、 両サブユニッ トの内 部アミノ酸配列もそれぞれ 167から 187番目、 637から 656番目までのアミノ酸 配列と一致していた。 この結果は α—ダルコシダーゼ Βが 1 本のポリペプチド前 駆体として合成され、 プロセシングを受けてヘテロ二量体構造をとることを示し ている。 Ν末端から 20番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドの典型的な特 徴を有しており、 本酵素は分泌性酵素であることを示唆している。
[実施例 2] 改変プロモーターの作製
( 2— 1 ) プロモーター領域のサブクローニング
ァスペルギルス · ォリゼ JCM02239株のタカアミラーゼ Α遺伝子 （ iaaGZ) 3164bp [Gene, 84, 319-327 (1989) D を含む pTG- taa 〔Mo Gene. Gene t .， 254, 119- 126 (19 97)〕 を出発材料としてタカアミラーゼ A遺伝子プロモーター領域およびタカアミ ラーゼ A遺伝子のコーディング領域を調製した。
まず、 pTG- taaからタカアミラーゼ A(iaai^)プロモーター領域を含む 750bpの fc oR卜 Sa/I断片を取得し、 この断片をプラスミ ド pKF18K (東洋紡績株式会社） のマ ルチクローニングサイ 卜の fcoR卜 Sa/I部位に揷入してタカアミラーゼプロモ一夕 一を含むプラスミ ド pKF- taaPを取得した。 プロモー夕一領域への変異導入操作お よび改変プロモ一夕一領域の構築はこのプラスミ ドを用いて行った。 ( 2— 2) 転写制御因子結合配列を含む DNA断片の取得 既に報告されている広域転写活性化因子 （HAP) の結合因子である CCAAT配列 〔M ol. Gen. Genet. , 237, 251-260 (1993)] およびデンプン分解酵素遺伝子群の転写 活性化因子 （AmyR)の結合因子 SRE 〔Mol. Gen. Genet. , 262, 668-676 (1999) D を 含む断片を次の様に取得した。
まず、 CCAAT配列の 5'末端側に； ΤήοΙ部位を、 3'末端側に Λ/οίΙ部位を付加した合成 隐として XNF ( 5' -CCGCTCGAGGCACCATCCAATTAGAAGCGCGGCCGCTAAACTAT-3' ：配列番 号 1 3 ) と、 この配列の相補鎖として XNR ( 5' -ATAGTTTAGCGGCCGCGCTTCTAATTGGA TGGTGCCTCGAGCGG-3' ：配列番号 1 4) を合成し、 続いてこれら合成 DMAの相補鎖同 士を混合して 98°C10分間加熱後、 2時間かけて 30°Cまで冷却し、 その後 4°Cまで冷 却してアニーリングさせることによって CCAAT配列を単独で含む DNA断片を取得し た。
—方、 SREの 5'末端側と 3'末端側に Spel部位および///' /7cl I部位を付加した合成 D NAとして SREf ( 5' -GACTAGTTAACCTAGGGGCGGAAATTTAACGGGATGTTAACTAGTC-3' ：配列 番号 1 5) と、 この配列の相補鎖として SREr ( 5' -GACTAGTTAACATCCCGTTAAATTTC CGCCCCTAGGTTAACTAGTC-3' ： 配列番号 1 6 ) を合成し、 上記と同様の方法で SREを 単独で含む DMA断片を取得した。 以後、 ここで作製した CCAAT配列のみを含む DNA 断片を「CCAAT断片」、 SREのみを含む DMA断片を「SRE断片」とそれぞれ呼ぶことにす る。 次に、 CCAAT配列から SREまでの領域を含む DNA断片 （配列番号 9。 以下、 「CCAA T-SRE断片」という） を、 以下のプライマーおよび錶型として （ 2— 1 ) で調製し た pKF- taaPを用いて、 94°C 30秒、 54°C 30秒、 72°C 1分 30秒を 1サイクルとして 3 0サイクルの PCR反応を行うことによって取得した。尚、 Psilサイ 卜を含む断片（配 列番号 1 0。 以下、 rcCAAT- SRE(Psi 断片」という） と JTfto卜 Woilサイ トを含む断 片 （配列番号 1 1 。 以下、 rCCAAT- SRE ( Tft0卜 /Voil)断片」という） の 2種類を作製 した。
Psilサイ 卜を付加した上流プライマ一、
CSPf ： 5' -AAACTGCAGACCACCTCTAGGCATCGGACG-3' (配列番号 1 7 )
Psilサイ 卜を付加した下流プライマー、
CSPr: 5' -TTTCTGCAGTGTTGATTTGTGGTTGAGTGG-3' (配列番号 1 8)
Τ οΙサイ 卜を付加した上流プライマー、
CSXf： 5' -CGGCTCGAGGCATCGGACGCACCATCC-3' (配列番号 1 9 )
Woflサイ トを付加した下流プライマー、
CSNr: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCGACTGTGATTTGTGGTTGAGTGG-3' (配列番号 2 0)
( 2— 3 ) 改変プロモーターを含むプラスミ ドの構築
タカアミラーゼ A遺伝子プロモーター領域への変異導入を次のように行った。ま ず、 （ 2— 1 )で調製した pKF-taaPへプロモーター領域改変用の制限酵素サイ 卜を 導入するために、 以下に示すプライマ一および Mutan- Super Express Km Kit (TA KARA社） を用いて pKF- taaPに対する部位特異的変異導入を行った。 なお、 野生型 プロモーターの配列 （配列番号 1 2 ) を図 1 に示し、 導入した制限酵素サイ 卜の 位置を図 2に示した。 下流域（配列番号 1 2に示す夕力アミラーゼプロモーターの存在位置 465)への W oilサイ 卜導入用のプライマー、
No t-b: 5' -CGCTTGGATTCCCCGCCCGCGGCCGCAGAGCTTAAAGTATGTCCC-3' (配列番号 2 1 )
下流域（配列番号 1 2に示すタカアミラーゼプロモータ一の存在位置 440)への T οΙサイ ト導入用のプライマー、
Xho-b; 5' -GAATGCAATTTAAACTCTTCCTCGAGTCGCTTGGATTCCCCGCCC-3' (配列番号 2 2) 上流域（配列番号 1 2に示すタカアミラーゼプロモーターの存在位置 153)への W oilサイ 卜導入用のプライマ一、
No f-a: 5' -GTAGTAAAACCCCGGAGTCAGCGGCCGCCAAGCCCAAGTCCTTCACG-3' (配列番号 2 3 )
上流域（配列番号 1 2に示すタカアミラーゼプロモーターの存在位置 128)への ί οΙサイ 卜導入用のプライマー、
Xho- &: 5' -CGTCAAGGGATGCAAGACTCGAGTAGTAAAACCCCGGAGTC-3' (配列番号 2 4 )
CCAAT配列と SREに挟まれた領域（配列番号 1 2に示す夕力アミラーゼプロモー ターの存在位置 252)への Wo lサイ 卜導入用のプライマー、
Not: 5' -GCACCATCCAATTAGAAGCGCGGCCGCGAAACAGCCCAAGAAAAAGG-3' (配列番号 2 5 )
下流域（配列番号 1 2に示すタカアミラーゼプロモーターの存在位置 490)への S pelサイ 卜導入用のプライマー、
STATA: 5' -TAAAGTATGTCACTAGTCGATGCGAT-3' (配列番号 2 6 ) 次に、 （ 2— 2 ) で調製した CCAAT断片を Xfwl および Wotl で切断し、 ァガロー スゲル電気泳動に供して回収 ■精製した。 得られた DNA断片を上記のようにして プロモーター下流域に導入した Xfw卜 ΝοΠ部位に挿入し、 改変プロモータ一 PCCA ATbを含むプラスミ ド pKF- CCAATbを作製した。 同様に （ 2— 2 ) で調製した SRE 断片を Hincい で切断して得られる DNA 断片がプロモーター下流域の X/ioi - filoti 部位に挿入された改変プロモータ一 PSREbを含むプラスミ ド pKF- SREb、 （ 2 — 2 ) で調製した CCAAT- SRE(Psil)断片を Pst、で切断して得られる DNA断片がプロモー ター下流域の Psti部位に挿入された改変プロモータ一 PCSPを含むプラスミ ド pK F- PCSP、 （2— 2 ) で調製した CCAAT-SRE ( ΤΛο卜 Woil)断片を /? ol、 Λ/ofl で切断し て得られる DNA断片がプロモーター下流域の Xfw卜/ Voti部位に挿入された改変プ 口モーター PCSbを含むプラスミ ド pKF- PCSbをそれぞれ作製した。 また、 CCAAT - S RE ( ΤΛο卜 Woil)断片を； ΤΛοし Woil で切断し、 回収 .精製した断片をプロモーター 下流域のズ ο卜 Woil 部位に挿入し、 その後、 CCAAT- SRE^sil)断片を Psil部位に 挿入することによリ、 2箇所に CCAAT- SRE断片が挿入された改変プロモーター PC SPbを含むプラスミ ド pKF- PCSPbを作製した。
[実施例 3]アミラーゼ遺伝子発現ベクターの構築
アミラーゼ遺伝子発現ベクターの作製過程を図 3に示す。 まず、 プラスミ ド pU C18 (東洋紡績株式会社） を Sa/Iで消化後、 Klenow処理によって平滑末端化し、 セ ルフライゲーションすることによって Sa/I部位の欠失したプラスミ ド PUC18(S-) を取得した。一方、 プラスミ ド pTG- taaよリタ力アミラーゼ A遺伝子の fcoRI断片を 単離し、 この断片を pUC18(S- )のマルチクローニングサイ 卜の fcom部位に挿入し て pUC- taa(S- )を取得した。 このプラスミ ド pUC- taa (S- )を fcoR Iで部分分解し、 t aaG 遺伝子の 3'末端側の fcoRIサイ 卜が欠失したプラスミ ド pUC- taaを取得した。 同様にして、 pBiuescriptl I KS(+)のズ οし Sa/し SaroH Iを欠失させたプラスミ p Blue(XSE- )を取得した。 次に、 pUC- taaから taaG2を含む EcoR Hind\ I I断片を単離して、 この断片をプラ スミ ド pBlue(XSE- )のマルチクローニングサイ 卜の £coR I - W/nrfl I I部位に挿入して、 taaG2を含むプラスミ ド pB I ue- taaを取得した。 続いて、 （ 2— 3 ) で得られた改変プロモーターを含むプラスミ ド pKF- taaPM シリーズ （pKF- CCAATb、 p F-SREb, pKF-PCSP, pKF- PCSb、 または pKF- PCSPb) か ら改変プロモーター領域の £coR卜 Sa/I 断片を単離して、 プラスミ ド pBlue- taa のマルチクローニングサイ 卜の fcoR卜 Sa/I に挿入し、 改変プロモーター領域と t aa 遺伝子が連結したプラスミ ド pBlue-taaMを取得した。 pB I ue-taaMから改変 プロモーターを含んだ iaaG 遺伝子の Xba卜 Bam 断片を単離し、 プラスミ ド pBA R7 (pBluescriptl I KS (+)にァスペルギルス '二ドランス由来の C末が欠失した argfl遺伝子が挿入されたプラスミ ド） のマルチクローニングサイ 卜の 卜 Sa/nH I に組み込み、 プロモーター活性測定用プラスミ ド pBAR- taaMシリーズ （pBAR - CC AATb、 pBAR-SREb. pBAR- PCSP、 pBAR- PCSb、 及び pBAR- PCSPb) とした。 尚、 野生 型プロモーターを有するプラスミ ドを同様の手順で作製し、これを pBAR- taaとし た。
[実施例 4] α—ダルコシダーゼ B欠損株を宿主とした形質転換体の取得
( 4— 1 ) α—ダルコシダーゼ B (agdB) 遺伝子破壊株の構築
( 1 - 2 ) で得られたプラスミ ド PGBH6に含まれる agrfS遺伝子の一部 （4.9 k b) の cl 断片 （-3， 132から +1， 689) を pB I uesc r i p 11 I KS (+)にサブクローン化 して pGBS5を構築した。 pGBH6の C/a卜 W/nd I I I 4· 9 kb断片 （ + 222から +4, 726) と PGBS5から調製した / Ipa卜 C/al3.1 kb断片 （-2， 834から + 221) を pal、 C/al 消 化した pBluescript I I KS+に連結して pGBA8を構築した。 agciS遺伝子破壊用ブラ スミ ド PGBAP2は、 pGBA8の Sa/I 1断片 （ agciS遺伝子の- 181から +3, 435に相当） を crassa py 遺伝子を含む Sspl 2.0 kb断片と置換して構築した。 なお、 B sp\ 2.0 kb断片は pyr4遺伝子を含む pTG1 (Mol. Gen. Genet. (1997) 254:119-12 6, M. Kato, A. Aoyama, F. Naruse, T. Kobayash i , and N. Tsukagosh i )より調製した。 次に卩08ム？2から破壊された 遺伝子を含む 5.9 kb / - Spel断片を調製し、 A. nidulans ABPU1 を形質転換して Δ agrfg株 DBP9を得た。 部位に； oyM遺伝 子が挿入されていることはサザンプロッ ト解析により確認した。 尚、 この菌株は 以下のとおり寄託されている。
受託番号 ： F E R M P - 1 9 0 7 0
国際寄託機関 ： 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、 〒 305-8566 茨城県つくば巿東 1 丁目 1 番 3号 中央第 6
寄託日 ： 2 0 0 2年 （平成 1 4年） 1 0月 1 8日
( 4 - 2 ) 形質転換
糸状菌の形質転換を次のように行った。 まず、 実施例 3で得られた pBAR- taa、 p BAR- PCSb、 pBAR- PCSPbの各プラスミ ドを fcoRVで消化後、 フエノール/クロ口ホル 厶抽出およびエタノール沈殿の操作を行い、 精製したプラスミ ドを形質転換に用 いた。 形質転換は次のように行った。 （4一 1 ) で得られたァスペルギルス■ニド ランスの α—ダルコシダーゼ欠損株 DBP9 ( (pyrG89) biAl wA3 argB2 pyroA4 A a gdB::pyr4) と、 コントロール株としてァスペルギルス ' 二ドランス ABPU1株 (b iAI pyrG89 wA3 argB2 pyroA4) をコンプリート培地 （2% マル卜エキス、 2% グルコース、 0.1 % パク 卜ペプトン） に必要な栄養源 （アルギニン、 ゥリジン、 ピリ ドキシン、 及びビ才チン） を添加した培地で、 37°C、 一晚振とう培養した後、 得られた菌体を細胞壁溶解液 〔20 mg/ml Yatal ase (宝酒造社） ， 0.8 M NaCI , 1 0 m リン酸緩衝液 （pH6.0)〕 に懸濁し、 30°Cで 1〜 2時間緩やかに振とうすること によりプロ トプラスト化した。 得られたプロ トプラストをナイロンフィルタ一で 濾過することにより、 残存する菌体を除去した。 次にこのプロ トプラスト及び上 記精製した各プラスミ ドを用いて、 Turnerらの方法 〔Gene， 36, 321-331 (1985)] により形質転換を行い、 アルギニンを含まない培地 （ッァペック · ドックス培地 (0.2% NaNOい 0. 1 % Κ,ΗΡΟハ 0.05% KCし 0.05% MgS04 ■ 7Η20、 2% ダルコ一 ス （pH5.5)) にゥリジン、 ピリ ドキシン、 及びビ才チンを添加した培地） で生育 可能な形質転換体をそれぞれのプラスミ ドにっき、 20から 40株ずつ取得した。
( 4 - 3 ) サザンプロッ 卜解析による形質転換体の選択
各形質転換株から染色体 DMAを次のように調製した。 まず、 形質転換株をコンプ リー卜培地に必要な栄養源 （ゥリジン、 ピリ ドキシン、 及びピオチン） を添加し た培地で 37°C、一晩振とう培養後、得られた菌体をブフナー漏斗と No.2のろ紙（ァ ドバンテック社） で集めて滅菌水で洗浄した。 余分な水分を除去したあと、 - 80°C で凍結し、 FREEZONE (LABCONCO社） を用いて乾燥させた。 乾燥後、 1關のガラス玉 を加えて、 マルチビーズショッカー （安井器械社） を用いて 2000rpm、 5分間破砕 して微粉末状にし、 この菌体破砕物に抽出溶液 〔1 % へキサデシルメチルアンモ ニゥ厶ブロマイ ド、 0.7M NaCし 50mM Tris-HCU lOmM EDTA, 1 % ;8 -メルカプ卜 エタノール〕 を加えて撹拌後、 室温で 30分間放置した。 得られた溶菌液をフエノ ール /クロ口ホルム抽出して、 夾雑するタンパク質を除去後、等量のイソプロパノ ールを加えて、 DNAを沈殿させた。 この沈殿物を 0.1mg/mlの RNaseを含む TE溶液に 溶解して、 37°C、 30分間反応させた後、 さらに 0.2mg/mlの protei naseKを含む TE 溶液を加え、 37° (：、 30分間反応させた。 この溶液をフエノール/クロ口ホルム抽出 した後、 2.5倍容の冷エタノールで沈殿させた。 この沈殿物を 70% エタノールで リンスして乾燥後、 TE溶液に溶解したものを染色体 DNA溶液とした。 サザンプロッ 卜解析は、 染色体 DNAを/ l Iあるいは fcoRVで消化後、 ァガロース ゲル電気泳動で分離してナイロンメンプレン （ロシュ社） にプロッ トした後、 ia 3 の約 1000bpの Sg/I卜 Sfflal消化物をプローブとして検出した。 このとき、 プロ一 ブのラベリングおよびシグナルの検出は DIG核酸検出キッ 卜 （ロシュ社）を用いて 行った。 サザンブロッ 卜解析の結果より、 宿主として用いた菌株のアミラーゼ生産能の 比較に適した形質転換体、即ちプラスミ ドが a S座位へ相同的に 1コピー組み込ま れた株で、 染色体に組み込まれるときの位置による影響と、 導入される遺伝子の コピー数の影響を受けずにアミラーゼ生産能を比較できる形質転換体を、 使用し たプラスミ ドにっき、 任意に 2株以上選択した。
[実施例 5 ] アミラーゼ活性の比較
実施例 4で得られた、 pBAR- taa、 pBAR- PCSb、 及び pBAR- PCSPbがそれぞれ組み込 まれた各形質転換体を用いて、 α —ダルコシダーゼ B欠損株を宿主とした場合と A
BPU1株を宿主とした場合のアミラーゼ生産性を以下の手順で比較した。
まず、 各形質転換体を最少培地 （0.9% Na 03、 0.05% KCU 0.15% KH2P04、 0.
15% Trace element, 0.05% MgS04 · 7H20、 〗％ グルコース（ρΗ6· 5) ) に必要な栄 養源 （ゥリジン、 ピリ ドキシン、 及びビ才チン） を添加した寒天培地に放射状に 植菌し、 37°C、 3日間培養した後、この寒天培地から分生胞子を胞子懸濁用溶液（0.
01 % tween80、 0.8% NaCI) に懸濁して綿で濾過し、 胞子懸濁液を調製した。 こ の胞子懸濁液から、 分生胞子 1 X 108個を SP培地 （1 % Starch, 1 % polypeptone.
0.5% KH2P04、 0.1 % NaN03、 0.05% MgS04 - 7H20 (pH6.5)) または MP培地 （1 % M al tose、 1 % polypeptone. 0.5% KH2P04、 0. 1 % NaNOい 0.05% MgS04 - 7H20 (pH 6.5) ) にアルギニン以外の必要な栄養源 （ゥリジン、 ピリ ドキシン、 及びビ才チ ン） を添加した培地 ΙΟΟηΗに接種し、 37°C、 36時間振とう培養後、 ブフナー漏斗と ろ紙で菌体と上清を分離して、 上清を酵素溶液とした。 アミラーゼ活性は 20mM 酢酸ナトリウム buf fer、 lOmM CaCI2、 2% So l ubl e Sta rch (ナカライテスク社）に酵素溶液を加えて Iの反応系を調製し、 これを 3 7 °Cで 20分間反応させて生成した還元糖量を N e I s o n - S o m o g y i法により定量した。ま た、 1分間に Ι μ πιο Ιのグルコースを遊離する酵素量を l u n とした。 次に、 測定し たアミラーゼ活性値からアミラーゼ生産量を求めて、 α —ダルコシダーゼ B欠損株 を宿主とした場合と、 ABPU 1株を宿主とした場合のアミラーゼ生産性を比較した。 アミラーゼ活性測定の結果を図 4に示す。 A agdB株を宿主とした ta a G2遺伝子の 形質転換体を、 デンプンを C源とする培地で培養したときのアミラーゼ生産量は、 ABPU 1株を宿主としたときの約 6倍の生産量であった。 これは、 α —ダルコシダー ゼ Βが欠損していることにより、誘導物質であるイソマルトースの分解が抑えられ、 誘導効果が持続することに因ると考えられる。 この結果から、 α—ダルコシダー ゼ Βの欠損が、 ァミラーゼ生産能の増強に非常に有効であることが確認できた。 次に、マルトースを C源とする MP培地で培養した時のアミラーゼ活性を測定し た。 A agdB株を宿主とした iaaG 遺伝子の形質転換体を用いた場合のアミラーゼ 生産量は、 ABPU 1株を宿主としたときの約 7倍であり、 A agrfS株を宿主として改 変プロモーター （PCS b又は PCS P b) を組み込んだ株のアミラーゼ生産量は、 AB PU 1 株を宿主としたときの約 2倍の生産量であった。 この結果から、 イソマルトー スを合成しやすいマル卜一スなどの C源を培地に利用した場合には、 agdB遺伝子 を欠損した宿主を用いることにより、 アミラーゼ生産能を一層増強できることが 分った。 また改変プロモーターを用いることによりさらに高い生産性が得られる ことが明らかとなった。 尚、 図 4の表に示されるように、 本実施例の系において は最高で 1 g/Lのアミラーゼの生産が認められた。 本出願は文部科学省の科学技術振興調整費による委託業務として実施した平成 1 4年度「力ビの酵素高生産能を利用した環境調和型工業プロセス技術の基盤研究」 の成果である。 産業上の利用の可能性
本発明により、 遺伝子を外来的に導入した際に当該遺伝子の発現を効率的に高 めることが可能な宿主微生物が提供される。 目的タンパク質をコードする遺伝子 を当該宿主微生物に導入して得られる形質転換体を用いれば、 目的タンパク質を 高い生産性で生産することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 .真菌類に属し且つ主たるイソマルトース生成酵素の遺伝子を欠損した微生物。
2 . 糸状菌に分類される微生物である、 請求の範囲第 1 項に記載の微生物。
3 . α —ダルコシダ一ゼ Β遺伝子が欠損したァスペルギルス · 二ドランス。
4. 真菌類に属し且つ主たるイソマルトース生成酵素の遺伝子を欠損した微生物 に、 イソマルトースでその発現が誘導される外来遺伝子を導入してなる形質転換 体。
5 . 前記微生物が糸状菌に分類される微生物である、 請求の範囲第 4項に記載の 形質転換体。
6 . α—ダルコシダーゼ Β遺伝子を欠損したァスペルギルス · ニドランスに、 ィ ソマル卜ースでその発現が誘導される外来遺伝子を導入してなる形質転換体。
7. 前記外来遺伝子が次の改変プロモーターを含有する、 請求の範囲第 4項に記 載の形質転換体、
糸状菌で機能するプロモーターに、 CCAATNNMNNN (第 1 塩基配列 ： 配列番号 1 ) を含む第 1 DNA断片と、 CGGNNNNNNNNN GG (第 2塩基配列 ： 配列番号 2 ) を含む第 2 DMA断片と、 を挿入してなる改変プロモーター。
8. 前記外来遺伝子が発現可能な条件下で請求の範囲第 4項の形質転換体を培養 するステップ、 及び
産生されたタンパク質を回収するステップ、 を含む、 タンパク質の生産方法。
PCT/JP2003/013353 2002-10-23 2003-10-20 イソマルトース生成酵素の遺伝子が欠損した、真菌類に属する微生物 WO2004038017A1 (ja)

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