CN101970658B - 耐热性过氧化氢酶 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是以重组蛋白质的形式大量表达耐热性过氧化氢酶，高效且廉价地生产耐热性过氧化氢酶。通过获得以重组蛋白质的形式高效地生产耐热性过氧化氢酶所必需的DNA，能够得到高效表达耐热性过氧化氢酶的重组微生物。而且，通过培养所得的重组微生物，能够高效且廉价地生产耐热性过氧化氢酶。通过用本发明的耐热性过氧化氢酶处理含过氧化氢的溶液，即使在高温下也能够有效且廉价地分解过氧化氢。

Description

耐热性过氧化氢酶
技术领域
本发明涉及耐热性过氧化氢酶，具体地，本发明涉及嗜松青霉或灰腐质霉来源的耐热性过氧化氢酶、具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质、编码该蛋白质的DNA以及生产耐热性过氧化氢酶的方法。
背景技术
过氧化氢酶是催化将过氧化氢分解成水和氧气的反应的酶。过氧化氢溶液作为消毒剂或杀菌剂有着广泛的应用。过氧化氢溶液在杀菌结束后可以用水简单地除去，且某种程度地随时间自然分解，因而，其作为食品等的杀菌剂有着广泛的应用。但是，残留的过氧化氢所产生的活性氧可能引起细胞老化或癌，因此希望能够在使用后完全分解、去除过氧化氢。过氧化氢酶对于过氧化氢的分解是非常有效的，其可以在不添加新化学物质的情况下将过氧化氢分解。实际上，过氧化氢酶已经用于棉花漂白处理后残留的过氧化氢、食品中的残留过氧化氢的分解和去除。目前为止，作为过氧化氢酶，已知有微生物来源(专利文献1～5)和猪、牛的肝脏等动物来源的过氧化氢酶等。
在上述的过氧化氢酶中，作为丝状真菌的黑曲霉(Aspergillus niger)产生的过氧化氢酶、猪肝脏来源的过氧化氢酶常用于工业用途。但是，这些过氧化氢酶的耐热性低，已知其在70℃处理30分钟后活性仅残留10％左右(专利文献6)。另一方面，特别是在纤维加工、食品加工等用途中，必须利用高温分解过氧化氢，因此需要比传统产品耐热性更高的过氧化氢酶。目前为止，作为耐热性过氧化氢酶，已经报导的有土曲霉(Aspergillusterreus)(专利文献6)、阿拉巴马顶孢霉(Acremonium alabamensis)(专利文献6)、嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)(专利文献6)、嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)(专利文献7)、特异腐质霉(Humicola insolens)(专利文献7)和嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(专利文献8)产生的过氧化氢酶。
已知丝状真菌的蛋白质分泌能力极高，适合作为生产酶等重组蛋白质的宿主。因此，如果能够将耐热性过氧化氢酶基因导入丝状真菌，并以重组蛋白质的形式进行大量表达，则可以期待与野生株相比能够以显著高的生产性生产耐热性过氧化氢酶。目前为止，在用于重组蛋白质的生产方面，有报导称在分类为曲霉属(专利文献9)、青霉属(专利文献10)、腐质霉属(专利文献11)、木霉属(专利文献12)、顶孢霉属(专利文献13)的丝状真菌中产生重组蛋白质已经取得成功。
当以这些丝状真菌作为宿主表达重组蛋白质时，并非导入宿主中的全部外源基因均能够得到表达。一般地，从导入基因所使用的密码子的角度来看，希望所导入的外源基因的来源与宿主具有尽可能近的亲缘关系。例如，当以特异腐质霉为宿主、以重组蛋白质的形式表达内切葡聚糖酶时，在导入特异腐质霉来源的NCE4、NCE5基因的情况下，确认到了显著量的内切葡聚糖酶的表达(专利文献14、15)。与此相对，在导入与NCE4、NCE5具有高氨基酸序列同一性的米根霉(Rhizopus oryzae)来源的RCEI基因的情况下，基本上未确认到内切葡聚糖酶的表达(专利文献16)。此外，当以泡盛曲霉(Aspergillus awamori)为宿主、以重组蛋白质的形式表达葡糖淀粉酶时，在导入黑曲霉来源的葡糖淀粉酶基因的情况下，葡糖淀粉酶的表达显示出高达4.6g/L的生产性，与此相对，在导入灰腐质霉来源的基因的情况下，仅显示出低至0.66g/L的生产性(非专利文献1)。而且，当以重组蛋白质的形式表达α-淀粉酶时，在以米曲霉(Aspergillus oryzae)为宿主导入米曲霉来源的α-淀粉酶基因的情况下，α-淀粉酶的表达显示出高达12g/L的生产性，与此相对，在以绿色木霉(Trichoderma viride)为宿主导入米曲霉来源的α-淀粉酶基因的情况下，α-淀粉酶的表达仅显示出1g/L的生产性(非专利文献1)。这些结果显示在以表达显著量的重组蛋白质为目标时，希望导入与宿主同种或亲缘关系近的丝状真菌来源的基因。
在以将丝状真菌作为宿主、以重组蛋白质的形式大量表达耐热性过氧化氢酶为目标时，如上述，可以认为希望所导入的耐热性过氧化氢酶基因的来源与作为宿主的丝状真菌亲缘关系近。但是，目前为止，报导的分离的耐热性过氧化氢酶基因仅有嗜热子囊菌来源的过氧化氢酶基因(专利文献17)和嗜热革节孢来源的过氧化氢酶基因(专利文献18)。关于从作为蛋白质的生产宿主开发的曲霉属、青霉属、腐质霉属、木霉属、顶孢霉属等丝状真菌中分离出耐热性过氧化氢酶基因的实例目前尚未有报导，以重组蛋白质的形式高生产性地表达耐热性过氧化氢酶仍是十分困难的。
专利文献1：日本特开昭55-135588号公报
专利文献2：日本特开昭60-083579号公报
专利文献3：日本特开昭63-003788号公报
专利文献4：日本特公昭49-004956号公报
专利文献5：日本特开平2-076579号公报
专利文献6：日本特开平5-153975号公报
专利文献7：日本特表平6-506347号公报
专利文献8：日本特开平10-257883号公报
专利文献9：国际公开第WO97/034004号小册子
专利文献10：国际公开第WO2000/068401号小册子
专利文献11：国际公开第WO98/003667号小册子
专利文献12：国际公开第WO98/011239号小册子
专利文献13：日本特开2001/017180号公报
专利文献14：国际公开第WO98/003640号小册子
专利文献15：国际公开第WO2001/090375号小册子
专利文献16：国际公开第WO2000/024879号小册子
专利文献17：特开2004-261137号公报
专利文献18：美国专利第5646025号说明书
非专利文献1：塚越規弘著，
Figure BPA00001205354200031
换えタンパク質生産法(学会出版中心)，pp.94～95
发明内容
发明所要解决的问题
在这样的背景下，希望以重组蛋白质的形式大量表达耐热性过氧化氢酶，本发明人等的课题是：从作为重组蛋白质生产宿主而开发的曲霉属、青霉属、腐质霉属、木霉属、顶孢霉属丝状真菌中寻找耐热性过氧化氢酶，分离出编码这些耐热性过氧化氢酶的基因，并大量表达耐热性过氧化氢酶。解决问题的方法
为了解决上述课题，本发明人等大量培养了分类为作为重组蛋白质生产宿主而开发的丝状真菌的曲霉属、青霉属、腐质霉属、木霉属、顶孢霉属的丝状真菌，并对所得培养液中的过氧化氢酶的热稳定性进行了反复评价，尝试了从这些丝状真菌获得耐热性过氧化氢酶。结果发现：嗜松青霉和灰腐质霉产生耐热性过氧化氢酶。
接下来，本发明人等从嗜松青霉的培养液中纯化了耐热性过氧化氢酶，结果得到了在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中在约80kDa的位置上显示单一条带、且N末端氨基酸序列为DDSNASSETEAFLSEFYLNDNDAYLTTDVGG(SEQ ID NO：5)的耐热性过氧化氢酶。此外，从灰腐质霉的培养液中纯化了耐热性过氧化氢酶，结果得到了在SDS-PAGE中在约80kDa的位置上显示单一条带、且N末端氨基酸序列为QDTTSGQSPLAAYEVDDSTG(SEQ ID NO：10)的耐热性过氧化氢酶。
而且，本发明人等成功从嗜松青霉和灰腐质霉的基因组DNA中克隆了编码这些耐热性过氧化氢酶的基因，并成功测定了其碱基序列，从而完成了本发明。
即，本发明涉及如下方面。
1)属于青霉属的微生物产生的耐热性过氧化氢酶。
2)1)所述的耐热性过氧化氢酶，其中，属于青霉属的微生物是嗜松青霉(Penicillium pinophilum)。
3)1)或2)所述的耐热性过氧化氢酶，其分子量为约80kDa。
4)灰腐质霉(Humicola grisea)产生的耐热性过氧化氢酶。
5)4)所述的耐热性过氧化氢酶，其分子量为约80kDa。
6)选自以下的(i)、(ii)和(iii)中的蛋白质：
(i)包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列的蛋白质；
(ii)包含在SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质；
(iii)包含与SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列具有70％以上同一性的氨基酸序列、且具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质。
7)由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列组成的、具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质。
8)6)或7)所述的蛋白质，其中，该蛋白质的N末端侧具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的-1～-42位的序列、或在SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的-1～-42位的序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
9)选自以下的(i)、(ii)和(iii)中的蛋白质：
(i)包含SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列的蛋白质；
(ii)包含在SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质；
(iii)包含与SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列具有70％以上同一性的氨基酸序列、且具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质。
10)由SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列组成的、具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质。
11)根据9)或10)所述的蛋白质，该蛋白质的N末端侧具有SEQ IDNO：4所述的氨基酸序列的-1～-32位的序列、或在SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的-1～32位的序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
12)选自以下的(i)、(ii)和(iii)中的DNA：
(i)编码6)～8)中任一项所述的蛋白质的DNA；
(ii)包含SEQ ID NO：1所述的碱基序列的1～2403位的序列的DNA；
(iii)与由SEQ ID NO：1所述的碱基序列的1～2403位的序列组成的DNA在严格条件下杂交的、且编码具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质的DNA。
13)由SEQ ID NO 1所述的碱基序列的1～2403位的序列组成的DNA。
14)从12)或13)所述的DNA中除去内含子序列而得到的DNA。
15)14)所述的DNA，其中，内含子序列是选自SEQ ID NO：1所述的碱基序列的322～372位、599～651位、1068～1113位或1279～1326位的序列中的1个以上的序列。
16)从12)～15)中任一项所述的DNA中除去编码信号序列的碱基序列而得到的DNA。
17)16)所述的DNA，其中，编码信号序列的碱基序列是SEQ ID NO：1所述的碱基序列的1～126位的序列。
18)选自以下的(i)、(ii)和(iii)中的DNA：
(i)编码9)～11)中任一项所述的蛋白质的DNA；
(ii)包含SEQ ID NO：3所述的碱基序列的1～2749位的序列的DNA；
(iii)与由SEQ ID NO：3所述的碱基序列的1～2749位的序列组成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有耐热性过氧化氢酶活性的蛋白质的DNA。
19)由SEQ ID NO 3所述的碱基序列的1～2749位的序列组成的DNA。
20)从18)或19)所述的DNA中除去内含子序列而得到的DNA。
21)20)所述的DNA，其中，内含子序列是选自SEQ ID NO：3所述的283～463位、667～747位、771～846位、1008～1160位、1218～1270位或1842～1895位的序列中的1个以上的序列。
22)从18)～21)所述的DNA中除去编码信号序列的碱基序列而得到的DNA。
23)22)所述的DNA，其中，编码信号序列的碱基序列是SEQ ID NO：3所述的1～96位的序列。
24)包含12)～17)中任一项所述的DNA的表达载体。
25)用12)～17)中任一项所述的DNA或24)所述的表达载体转化了的宿主微生物。
26)25)所述的宿主微生物，其中，宿主微生物是丝状真菌。
27)26)所述的宿主微生物，其中，丝状真菌是选自属于曲霉属、青霉属、腐质霉属、木霉属或顶孢霉属的丝状真菌中的丝状真菌。
28)耐热性过氧化氢酶的生产方法，该生产方法包括：培养25)～27)中任一项所述的宿主微生物，并从培养物收集耐热性过氧化氢酶。
29)包含18)～23)中任一项所述的DNA的表达载体。
30)用18)～23)中任一项所述的DNA或29)所述的表达载体转化了的宿主微生物。
31)30)所述的宿主微生物，其中，宿主微生物是丝状真菌(糸状菌)。
32)31)所述的宿主微生物，其中，丝状真菌是选自属于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)或顶孢霉属(Acremonium)的丝状真菌中的丝状真菌。
33)耐热性过氧化氢酶的生产方法，该生产方法包括：培养30)～32)中任一项所述的宿主微生物，并从培养物中收集耐热性过氧化氢酶。
发明效果
根据本发明，能够得到以重组蛋白质的形式高效地生产耐热性过氧化氢酶所必需的DNA，此外，能够得到高效表达耐热性过氧化氢酶的重组微生物。而且，通过培养所得的重组微生物，能够高效且廉价地生产耐热性过氧化氢酶。通过用本发明的耐热性过氧化氢酶处理含过氧化氢的溶液，即使在高温下也能够有效且廉价地分解过氧化氢。
附图说明
[图1]质粒pPCN的限制酶图谱。
[图2]质粒pHCN的限制酶图谱。
[图3]质粒pPTPCN的限制酶图谱。
发明的具体实施方式
在本说明书中，“耐热性过氧化氢酶”是指：采用专利文献6实施例4公开的方法测定耐热性，70℃保存30分钟后的活性残留率为50％以上的过氧化氢酶。
嗜松青霉和灰腐质霉在培养液中产生的耐热性过氧化氢酶可以采用例如专利文献6公开的方法来获得。过氧化氢酶活性的测定可以这样进行：在含过氧化氢的溶液中添加过氧化氢酶，通过对一定时间后减少的过氧化氢进行定量来进行评价，例如，可以采用专利文献6中公开的方法来测定。此外，耐热性过氧化氢酶还可以通过按照专利文献6所述的方法，将稀释成适当浓度的培养上清于70℃热处理30分钟，并测定热处理前后的过氧化氢酶活性，来进行评价。在本说明书中，按照上述定义，将该热处理中残留50％以上活性的过氧化氢酶作为耐热性过氧化氢酶。
对于通过上述方法获得的嗜松青霉和灰腐质霉的培养液上清，测定了其上清中的过氧化氢酶的热稳定性。结果是，通过70℃热处理30分钟，嗜松青霉产生的过氧化氢酶残留了50％的过氧化氢酶活性，而灰腐质霉产生的过氧化氢酶残留了57％的过氧化氢酶活性，嗜松青霉和灰腐质霉产生耐热性过氧化氢酶。
耐热性过氧化氢酶的纯化可以从采用上述方法获得的含耐热性过氧化氢酶的培养上清出发，按照蛋白质纯化的常规方法来实施。此时，所采用的蛋白质纯化方法可以使用公知的各种方法，例如可以通过组合疏水层析、阴离子交换色谱来实施。此外，纯化得到的耐热性过氧化氢酶的分子量可以通过SDS-PAGE来测定。
采用上述方法纯化了嗜松青霉和灰腐质霉所产生的耐热性过氧化氢酶，并测定了其分子量，结果从嗜松青霉和灰腐质霉分别获得了具有约80kDa的分子量的耐热性过氧化氢酶。
在本说明书中，“在氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列”是指：通过能够通过定点诱变法等公知方法或天然产生而实现的程度的多个数目的氨基酸的取代等而进行了修饰。氨基酸修饰的个数优选1～50个、更优选1～30个、更优选1～10个、更优选1～5个、最优选1～2个。
本发明的蛋白质的修饰氨基酸序列的例子优选可以是其氨基酸具有1或多个(优选1或数个或者1、2、3或4个)保守取代的氨基酸序列。
在本说明书中，“保守取代”是指：将1个或多个氨基酸残基用其它化学上类似的氨基酸残基取代。可以列举出例如：将某个疏水性残基用其它疏水性残基取代的情况，将某个极性残基用具有相同电荷的其它极性残基取代的情况。能够进行这样的取代的功能上类似的氨基酸，按氨基酸分类是本技术领域公知的。具体的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸可以列举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷(碱性)的氨基酸，可以列举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外，作为具有负电荷(酸性)的氨基酸，可以列举出天冬氨酸、谷氨酸等。
本说明书中“严格条件”是指：在高温下、低盐浓度溶液中进行杂交后的膜的洗涤操作，例如是指：0.5×SSC浓度(1×SSC：15mmol/L柠檬酸三钠、150mmol/L氯化钠)、60℃、15分钟的洗涤条件，优选0.5×SSC浓度、0.1％SDS溶液中60℃、15分钟的洗涤条件。
杂交可以按照公知方法来进行。此外，在使用市售文库的情况下，可以按照附带的使用说明书所述的方法来进行。
在本说明书中，针对碱基序列或氨基酸序列而言的“同一性”是指：在所比较的序列之间，构成各序列的碱基或氨基酸残基的一致程度。在本说明书中示出的任何“同一性”的数值，均只要是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值即可，例如，可以在FASTA等中使用默认(初期设定)参数，来容易地计算得出。
与SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列具有70％以上同一性的氨基酸序列优选是具有80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同一性的氨基酸序列。
与SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列优选是具有80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同一性的氨基酸序列。
在本发明中，如果给出SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列，则可以容易地确定编码其的碱基序列，可以选择出编码SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列的各种碱基序列。
在本发明中，如果给出SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列，则可以容易地确定编码其的碱基序列，可以选择出编码SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列的各种碱基序列。
因此，编码包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列的蛋白质的DNA是指SEQ ID NO：1所述的碱基序列的1～2403位的序列所表示的碱基序列的一部分或全部，还指具有作为编码同一氨基酸的碱基序列的、且处于简并关系的密码子作为碱基序列的序列。本发明中还包括与上述对应的RNA序列。
此外，编码包含SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列的蛋白质的DNA是指SEQ ID NO：3所述的碱基序列的1～2749位的序列所表示的碱基序列的一部分或全部，还指具有作为编码同一氨基酸的碱基序列的、且处于简并关系的密码子作为碱基序列的序列。本发明中还包括与上述对应的RNA序列。
作为编码包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列的蛋白质的DNA的优选例子，可以列举出包含SEQ ID NO：1所述的碱基序列的1～2403位的序列所表示的碱基序列的DNA。
作为编码包含SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列的1～684位的序列的蛋白质的DNA的优选例子，可以列举出包含SEQ ID NO：3所述的碱基序列的1～2749位的序列所表示的碱基序列的DNA。
编码嗜松青霉和灰腐质霉所产生的耐热性过氧化氢酶的基因的分离，可以通过从嗜松青霉和灰腐质霉制作基因组噬菌体文库、获得包含耐热性过氧化氢酶基因的阳性噬菌体克隆来实施。作为用于从基因组噬菌体文库筛选阳性噬菌体克隆的探针，可以使用耐热性过氧化氢酶基因片段。作为探针的耐热性过氧化氢酶基因片段可以通过以各基因组DNA为模板进行PCR来扩增。用于PCR的引物组可以基于已知的丝状真菌来源过氧化氢酶基因的保守序列来设计。从这样获得的阳性克隆将耐热性过氧化氢酶基因亚克隆至大肠杆菌载体中后，通过对所得载体的碱基序列进行分析，可以确定耐热性过氧化氢酶基因的碱基序列。此外，基于由该碱基序列推定的氨基酸序列与已知的过氧化氢酶的氨基酸序列之间的比较、以及内含子的保守序列，可以推定该碱基序列中的内含子序列。此外，从该基因的翻译起始密码子起直至编码纯化的耐热性过氧化氢酶的N末端氨基酸序列的序列之前，可以推定为编码信号序列的序列。
通过上述方法从嗜松青霉的基因组DNA分离出的全长耐热性过氧化氢酶基因PCN由序列表的SEQ ID NO：1所记载的2403bp的碱基组成，此外，推定该基因包含SEQ ID NO：1的322～372位、599～651位、1068～1113位和1279～1326位的碱基序列所示的4个内含子。由该基因序列推定的耐热性过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。此外，该氨基酸序列的1～31位的序列与从嗜松青霉纯化的耐热性过氧化氢酶的N末端氨基酸序列完全一致，因而推定SEQ ID NO：2的-1～-42位的氨基酸序列是信号序列，并推定编码该氨基酸序列的SEQ ID NO：1的1～126位的碱基序列是编码信号序列的碱基序列。
基于本说明书所示的嗜松青霉来源的过氧化氢酶基因PCN的碱基序列，制作用于扩增目标基因的引物，以嗜松青霉的基因组DNA作为模板来实施PCR，并将扩增出的DNA片段与适当的载体连接，这样可以制作表达载体，并可以分离目标基因。而且，本发明的嗜松青霉来源的DNA包含于质粒pPCN中，可以将其用作PCR的模板DNA。此外，可以利用适当的限制酶从所述质粒制备目标DNA片段。
Figure BPA00001205354200111
定该基因包含SEQ ID NO：3的283～463位、667～747位、771～846位、1008～1160位、1218～1270位、1842～1895位的碱基序列所示的6个内含子。由该基因序列推定的耐热性过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。此外，该氨基酸序列的1～20位的序列与由灰腐质霉纯化的耐热性过氧化氢酶的N末端氨基酸序列完全一致，因而推定SEQ ID NO：4的-1～-32位的氨基酸序列是信号序列，而推定编码该氨基酸序列的SEQ ID NO：3的1～96位的碱基序列是编码信号序列的碱基序列。
基于本说明书所示的灰腐质霉来源的过氧化氢酶基因HCN的碱基序列，制作用于扩增目标基因的引物，以灰腐质霉的基因组DNA作为模板来实施PCR，并将扩增出的DNA片段与适当的载体相连接，这样可以制作表达载体，并可以分离目标基因。而且，本发明的灰腐质霉来源的DNA包含于质粒pHCN中，可以将其用作PCR的模板DNA。此外，可以利用适当的限制酶从所述质粒制备目标DNA片段。
Figure BPA00001205354200112
对于如上述地分离出的耐热性过氧化氢酶基因，通过将其导入宿主进行表达，可以生产耐热性过氧化氢酶。导入宿主的DNA可以是全长的耐热性过氧化氢酶基因，也可以是从该DNA除去内含子序列的一部分或全部而得到的DNA，还可以是从该DNA除去编码信号序列的碱基序列而得到的DNA。
根据本发明，提供表达载体，该表达载体以可在宿主微生物内复制、且可表达本发明的DNA所编码的蛋白质的状态包含所述的本发明的DNA。而且，根据本发明，还提供用该表达载体转化了的微生物。
对该宿主-载体系统没有特殊限制，例如可以使用利用大肠杆菌、放线菌、酵母、霉菌等的系统、以及利用它们的与其它蛋白质的融合蛋白质表达系等。作为适于本发明的宿主微生物，可以列举出丝状真菌、优选木霉属、曲霉属、青霉属(更优选嗜松青霉)、腐质霉属(更优选灰腐质霉)、顶孢霉属丝状真菌等，作为表达载体，可以使用专利文献9～13所述的表达载体等。
本发明的载体构建的规程和方法，可以使用基因工程领域惯用的规程和方法。
为了将本发明的表达载体切实导入宿主微生物并表达目标蛋白质，本发明的表达载体除了包含所述的本发明的DNA之外，还可以包含调控其表达的DNA、用于选择微生物的基因标记等。
用适当的培养基培养这样获得的转化体，可以从其培养物分离得到上述本发明的蛋白质。转化体的培养及其条件，可以根据所使用的微生物适宜设定。此外，从培养液回收、纯化目的蛋白质，也可以按照常规方法进行。
实施例
以下，为了加深对本发明的理解，借助实施例进行说明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1：嗜松青霉培养液中的过氧化氢酶活性(耐热性)的测定
将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长的嗜松青霉接种于装有包含蔗糖50g/L、麦芽提取物20g/L、酵母提取物5g/L的培养基30mL的200mL三角烧瓶中，26℃振荡培养5天后，从所得培养液离心分离除去菌体，得到了培养上清液。对于所得培养上清液中的过氧化氢酶，采用专利文献6的实施例4公开的方法测定了其过氧化氢酶活性(耐热性)，结果是，70℃保存30分钟后的活性残留率为50％。根据以上结果，可以判定嗜松青霉产生耐热性的过氧化氢酶。
实施例2：嗜松青霉培养液中的耐热性过氧化氢酶的分离纯化
在采用实施例1所述的方法获得的嗜松青霉的培养上清液中溶解终浓度1mol/L的硫酸铵后，通过使该溶液通过预先用包含1mol/L硫酸铵的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的疏水柱Phenyl Sepharose HP 26/10(GEHealthcare Bio-Science公司制造)，来进行吸附。接着，利用从包含1mol/L硫酸铵的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)至50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的线性梯度洗脱法对吸附于该疏水柱的蛋白质进行洗脱并分级。采用实施例1所述的方法测定分级的洗脱液的过氧化氢酶活性，回收了显示活性的级分。在回收的活性级分中添加终浓度1mol/L的硫酸铵，采用与上述相同的方法利用疏水柱实施了再层析。对所得活性级分采用超滤进行浓缩脱盐后，添加终浓度50mmol/L的磷酸缓冲液(pH8.0)。接下来，使该溶液通过预先用50mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)平衡的阴离子交换柱MonoQ(GE HealthcareBio-Science公司制造)，吸附了蛋白质。采用从50mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)至包含1mol/L NaCl的50mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)的线性梯度洗脱法对吸附的蛋白质进行洗脱并分级。采用实施例1所述的方法测定分级的洗脱液的过氧化氢酶活性(耐热性)，回收了显示活性的级分。对回收的活性级分采用SDS-PAGE进行了分析，结果显示约80kDa的单一条带，因而判断来源于该条带的蛋白质是耐热性过氧化氢酶。用SDS-PAGE分离出该耐热性过氧化氢酶后，将其印迹在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，分析了N末端的氨基酸序列，得到了以下的序列。
DDSNASSETEAFLSEFYLNDNDAYLTTDVGG(SEQ ID NO：5)
实施例3：从嗜松青霉中克隆耐热性过氧化氢酶基因PCN
3-1)基因组DNA文库的制作
从嗜松青霉的菌体中采用堀内等的方法[H.Horiuchi et.al.，J.Bacteriol.，170，272-278，(1988)]分离纯化了基因组DNA。对于分离出的基因组DNA利用限制酶Sau3AI进行了部分消化。使用连接试剂盒Ver.2(TAKARA Bio公司制造)将其连接到噬菌体载体·EMBL3克隆试剂盒(Stratagene公司制造)的BamHI臂上。用乙醇将其沉淀后，溶解于TE缓冲液中。对于连接混合物的总量，使用MaxPlaxλpackerging kit(Epicenter technology公司制造)使之形成噬菌体粒子，并感染大肠杆菌XL1-blue MRA(P2)株。通过该方法得到了包括1.1×104个噬菌体的基因组DNA文库。
3-2)探针的制作
基于已知的过氧化氢酶的保守区域的序列制作了以下引物。
P过氧化氢酶F：GAGGCCGGCAACTACCCNGARTGGRA(SEQ IDNO：6)
P过氧化氢酶R：CCTGCTCGGTCTCGGCRAARWARTT(SEQ ID NO：7)
使用P过氧化氢酶F和P过氧化氢酶R作为引物，以基因组DNA作为模板进行PCR。PCR使用LA Taq聚合酶(TAKARA Bio公司制造)实施。PCR以94℃30秒、退火30秒、72℃1分钟实施40个循环的程序来实施，退火温度在最初的20个循环中从63℃梯次降低至53℃，此后的20个循环中固定在53℃。对于扩增出的250bp的DNA片段，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制造)按照附带规程将其插入pCR2.1-TOPO质粒载体，得到了质粒TOPO-P过氧化氢酶。
克隆到质粒TOPO-P过氧化氢酶中的插入DNA片段的测序，使用BigDye(R)Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造)和ABI PRISM基因分析仪(Applied Biosystems公司制造)按照附带规程进行。对结果得到的碱基序列进行同源性检索，结果与棒曲霉(Aspergillusclavatus)来源的过氧化氢酶显示71％的同一性，因而判断该DNA片段是过氧化氢酶基因的一部分。以质粒TOPO-P过氧化氢酶作为模板采用与上述相同的方法通过PCR扩增该DNA片段，将所得PCR产物用ECL DirectSystem(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)标记，作为探针。
3-3)利用斑点杂交进行筛选
将实施例3-1中制作的噬菌体斑点转印到Hybond N+尼龙转印膜(Amersham公司制造)上，碱变性后，用5倍浓度SSC(SSC：15mmol/L柠檬酸三钠、150mmol/L氯化钠)进行洗涤，并进行干燥从而将DNA固定。杂交是在1小时的预杂交(42℃)后，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记探针，进行4小时(42℃)杂交。探针的洗涤是用添加6mol/L尿素、0.4％SDS的0.5倍浓度SSC进行2次，再用2倍浓度SSC进行2次。
对于进行过探针洗涤的尼龙膜，将其在检测溶液中浸渍1分钟浸渍后，用同一公司制造的HYPER Film ECL进行感光，得到了1个阳性克隆。使用LE392作为宿主大肠杆菌，按照Maniatis等的方法(J.Sambrook，E.F.Fritschand T.Maniatis，″Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)从阳性克隆制备DNA。首先，将LE392用LB-MM培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、10mmol/L硫酸镁、0.2％麦芽糖)培养过夜。使之感染单个斑点来源的噬菌体溶液，用LB-MM培养基培养过夜。向其中加入终浓度1mol/L的氯化钠，再加入终浓度0.8％的氯仿，促进大肠杆菌的溶菌。通过离心分离除去菌体残渣，从聚乙二醇(PEG)沉淀(10％PEG6000)回收了噬菌体粒子。在SDS存在下，用蛋白酶K消化噬菌体粒子，并通过对其进行苯酚处理、乙醇沉淀来回收了噬菌体DNA。
对于如上制备的DNA，使用ECL Direct System进行了Southern印迹分析。以实施例3-2的PCR扩增片段作为探针进行杂交，结果约7kb的PstI片段显示出与染色体DNA共同的杂交图样。
将该PstI片段克隆在pUC118上，得到了质粒pUC-PCN。对于所得质粒，采用实施例3-2所述的方法分析了其碱基序列。而且，为了亚克隆嗜松青霉来源的过氧化氢酶基因PCN，以pUC-PCN为模板，利用以下的引物组(PCNF以及PCNR)实施了PCR，扩增出PCN基因。
PCNF：ATGCGAGGATTATACTCCCTC(SEQ ID NO：8)
PCNR：CTACTCATCCACAGCGAATCG(SEQ ID NO：9)
使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制造)将扩增出的DNA插入pCR2.1-TOPO质粒载体，得到了质粒pPCN。用所得质粒pPCN转化大肠杆菌(Escherichia coli)TOP 10株(Invitrogen公司)，从而得到了Escherichia coliTOP10株/pPCN。
3-4)耐热性过氧化氢酶的氨基酸序列的推定
采用上述方法从嗜松青霉基因组DNA分离得到的全长耐热性过氧化氢酶基因PCN由SEQ ID NO：1所示的2403bp的碱基组成。基于由该碱基序列推定的氨基酸序列与已知过氧化氢酶的氨基酸序列之间的比较、以及内含子的保守序列，推定该基因包含SEQ ID NO：1的322～372位、599～651位、1068～1113位、1279～1326位所示的4个内含子。由该碱基序列推定的耐热性过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。此外，SEQ ID NO：2的氨基酸序列的1位～31位的序列与实施例2所示的从嗜松青霉纯化得到的耐热性过氧化氢酶的N末端氨基酸序列完全一致，因而推定SEQ ID NO：2的氨基酸序列的-1～-42位的序列是信号序列，并推定编码该氨基酸序列的SEQ ID NO：1的1～126位的碱基序列是编码信号序列的碱基序列。
实施例4：灰腐质霉培养液中的过氧化氢酶活性(耐热性)的测定
采用与实施例1相同的方法制备了灰腐质霉的培养上清液。对于所得培养上清液中的过氧化氢酶，采用实施例1的方法测定了其过氧化氢酶活性(耐热性)，结果于70℃保存30分钟后的活性残留率是57％。根据以上结果判断，灰腐质霉产生耐热性过氧化氢酶。
实施例5：灰腐质霉培养液中的耐热性过氧化氢酶的分离纯化
在采用实施例4所述的方法获得的灰腐质霉的培养上清液中溶解终浓度1mol/L的硫酸铵后，通过使该溶液通过预先用包含1mol/L硫酸铵的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的疏水柱Phenyl Sepharose HP 26/10(GEHealthcare Bio-Science公司制造)，来进行吸附。接着，利用从包含1mol/L硫酸铵的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)至50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的线性梯度洗脱法对吸附于该疏水柱的蛋白质进行洗脱并分级。采用实施例1所述的方法测定了分级的洗脱液的过氧化氢酶活性(耐热性)，回收了显示活性的级分。在回收的活性级分中添加终浓度1mol/L的硫酸铵，采用与上述相同的方法利用疏水柱实施了再层析。对所得活性级分采用超滤进行浓缩脱盐后，添加终浓度50mmol/L的醋酸缓冲液(pH4.0)。接下来，使该溶液通过预先用50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)平衡的阳离子交换柱MonoS(GEHealthcare Bio-Science公司制造)。因为在非吸附级分中检测到了过氧化氢酶活性，所以回收了非吸附级分作为活性级分。对回收的活性级分采用SDS-PAGE进行了分析，结果显示约80kDa的单一条带，因而判断来源于该条带的蛋白质是耐热性过氧化氢酶。用SDS-PAGE分离出该耐热性过氧化氢酶后，将其印迹在PVDF膜上，分析了N末端的氨基酸序列，得到了以下的序列。
QDTTSGQSPLAAYEVDDSTG(SEQ ID NO：10)
实施例6：从灰腐质霉克隆耐热性过氧化氢酶基因HCN
6-1)基因组DNA文库的制作
采用实施例3-1所述的方法制备了灰腐质霉的基因组DNA文库。
6-2)探针的制作
基于丝状真菌和酵母来源过氧化氢酶的保守区域的序列，制作了以下引物。
H过氧化氢酶F：GTNCGNTTYTCNACTGT(SEQ ID NO：11)
H过氧化氢酶R：AARAANACNGGNTTRTTGTT(SEQ ID NO：12)
[SEQ ID NO：12中，下划线所示的符号“N”(12位)表示脱氧肌苷]
使用H过氧化氢酶F和H过氧化氢酶R作为引物，以基因组DNA作为模板进行了PCR。PCR使用Ex Taq聚合酶(TAKARA Bio公司制造)实施。PCR通过实施30个循环的98℃10秒、55℃退火30秒、72℃延伸反应15秒的程序来实施。对于扩增出的300bp的DNA片段，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制造)按照附带规程将其插入pCR2.1-TOPO质粒载体，得到了质粒TOPO-H过氧化氢酶。
对克隆在质粒TOPO-H过氧化氢酶中的插入DNA片段的碱基序列进行了分析，对所得碱基序列的同源性检索结果是与核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)来源的过氧化氢酶显示出高达97％的同一性，因而判断该DNA片段是过氧化氢酶基因的一部分。以质粒TOPO-H过氧化氢酶作为模板，采用与上述相同的方法通过PCR扩增了该DNA片段，使用ECL DirectSystem(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)对所得PCR产物进行了标记，作为探针。
6-3)利用斑点杂交进行筛选
采用实施例3-3所述的方法对基因组DNA文库进行筛选，结果得到了1个阳性克隆。对所得阳性克隆进行了Southern印迹分析，结果约7kb的XhoI片段与约4kb的BamHI片段显示出与染色体DNA共同的杂交图样。将所述XhoI片段与BamHI片段克隆在pUC118中，分别得到了质粒pUC-HCN-XhoI和pUC-HCN-BamH1。对这些质粒的碱基序列进行了分析，结果确认XhoI片段中的SEQ ID NO：3的碱基序列的616位～3’末端的序列，以及BamHI片段中的5’末端～SEQ ID NO：3的碱基序列的1675位的序列包含耐热性过氧化氢酶基因片段。通过将这些碱基序列结合，确定了全长耐热性过氧化氢酶基因的碱基序列。为了对灰腐质霉来源的过氧化氢酶基因HCN实施亚克隆，以灰腐质霉的基因组DNA作为模板，利用以下引物组(HCNF以及HCNR)实施PCR，扩增了HCN基因。
HCNF：ATGAACAGAGTCACGAATCTC(SEQ ID NO：13)
HCNR：TCAAAAAACAAAGGCACCAAG(SEQ ID NO：14)
使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制造)将扩增得到的DNA插入pCR2.1-TOPO质粒载体，得到了质粒pHCN。通过用所得质粒pHCN转化大肠杆菌(Escherichia coli)TOP 10株(Invitrogen公司)，得到了Escherichiacoli TOP10株/pHCN。
6-4)耐热性过氧化氢酶的氨基酸序列的推定
采用上述方法从灰腐质霉基因组DNA分离出的全长耐热性过氧化氢酶基因HCN由SEQ ID NO：3所示的2749bp的碱基组成。基于由该碱基序列推定的氨基酸序列与已知过氧化氢酶的氨基酸序列之间的比较、以及内含子的保守序列，推定该基因包含SEQ ID NO：3的碱基序列的283～463位、667～747位、771～846位、1008～1160位、1218～1270位、1842～1895位所示的6个内含子。由该碱基序列推定的耐热性过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。此外，SEQ ID NO：4的氨基酸序列的1～20位的序列与实施例5所示的从灰腐质霉纯化得到的耐热性过氧化氢酶的N末端氨基酸序列完全一致，因而推定SEQ ID NO：4的氨基酸序列的-1～-32位的氨基酸序列是信号序列，并推定编码该氨基酸序列的SEQ ID NO：3的碱基序列的1～96位的序列是编码信号序列的碱基序列。
实施例7：重组PCN表达载体的制备
使用下述表达载体来实施以黑曲霉大孢子变种(Aspergillus niger var.macrosporus)为宿主的重组PCN的表达，所述表达载体是在黑曲霉大孢子变种中显著量表达的Proctase B基因的启动子与终止子之间插入PCN基因而得到的。该表达载体是按以下规程制备的。
7-1)基因组DNA文库的制作
从黑曲霉大孢子变种的菌体按照堀内等的方法[H.Horiuchi et.al.，J.Bacteriol.，170，272-278，(1988)]分离纯化基因组DNA。将分离出的基因组DNA用Sau3AI部分消化。使用连接试剂盒Ver.2(TAKARA Bio公司制造)将其连接到噬菌体载体λEMBL3克隆试剂盒(Stratagene公司制造)的BamHI臂上。用乙醇将其沉淀后，溶解于TE缓冲液中。对于连接混合物的总量，使用MaxPlaxλ packerging kit(Epicenter technology公司制造)使之形成噬菌体粒子，并感染大肠杆菌XL1-blue MRA(P2)株。通过该方法得到了包括1.25×105个噬菌体的基因组DNA文库。
7-2)探针的制作
对于黑曲霉大孢子变种的基因组DNA文库，通过以Proctase B基因的翻译区域作为探针实施Southern印迹，分离出了包含Proctase B基因的启动子和终止子区域的克隆。Proctase B基因的翻译区域是以黑曲霉大孢子变种的基因组DNA作为模板、使用基于特开平5-68570号公报记载的Proctase B基因的翻译区域的5’末端和3’末端序列设计的引物(ProctaseB-N和ProctaseB-C)进行PCR扩增得到的。
ProctaseB-N：ATGGTCGTCTTCAGCAAAACC(SEQ ID NO：15)
ProctaseB-C：CTAAGCCTGAGCGGCGAATCC(SEQ ID NO：16)
PCR使用LA PCRTM KIT Ver2.1(TAKARA Bio公司制造)进行。反应条件：94℃保温1分钟后，进行30个循环的(94℃、30秒)-(52℃、30秒)-(72℃、90秒)的循环，最后72℃处理7分钟，结束反应。结果扩增得到了约1.2kb的DNA。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制造)按照试剂盒附带的规程将扩增得到的1.2kb的DNA片段插入pCR2.1-TOPO质粒载体，得到了质粒TOPO-ProB。克隆至质粒TOPO-ProB中的插入DNA片段的测序使用BigDye(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造)和ABI PRISM基因分析仪(Applied Biosystems公司制造)按照附带规程进行。其结果是所得碱基序列与特开平5-68570号公报记载的Proctase B基因的序列一致，因而判断该DNA片段是Proctase B基因的翻译区域。将该DNA片段用ECL Direct System(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)标记，作为探针。
7-3)利用斑点杂交筛选包含Proctase基因的启动子区域和终止子区域的克隆
对于实施例7-1中制作的噬菌体斑点，将其转印在Hybond N+尼龙转印膜(Amersham公司制造)上，碱变性后用5倍浓度SSC(SSC：15mmol/L柠檬酸三钠、150mmol/L氯化钠)洗涤，进行干燥从而固定DNA。杂交是在1小时的预杂交(42℃)后，添加采用实施例7-2所述的方法制备的探针，进行20小时(42℃)杂交。探针的洗涤是用添加6mol/L尿素、0.4％SDS的0.5倍浓度SSC进行2次，再用2倍浓度SSC进行2次。对于进行过探针洗涤的尼龙膜，将其在检测溶液中浸渍1分钟浸渍后，用同一公司制造的HYPER FilmECL进行感光，得到了8个阳性克隆。
使用LE392作为宿主大肠杆菌，按照Maniatis等的方法(J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，″Molecular Cloning″，Cold SpringHarbor Laboratory Press.1989)从阳性克隆制备DNA。首先，将LE392用LB-MM培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、10mmol/L硫酸镁、0.2％麦芽糖)培养过夜。使之感染单个斑点来源的噬菌体溶液，用LB-MM培养基培养过夜。向其中加入终浓度1mol/L的氯化钠，再加入终浓度0.8％的氯仿，促进大肠杆菌的溶菌。通过离心分离除去菌体残渣，从聚乙二醇(PEG)沉淀(10％PEG6000)回收了噬菌体粒子。在SDS存在下，用蛋白酶K消化噬菌体粒子，并通过对其进行苯酚处理、乙醇沉淀来回收了噬菌体DNA。
对于如上制备的DNA，使用ECL Direct System进行了Southern印迹分析。以采用实施例7-2所述的方法制备的探针进行杂交，结果约5.5kb的XhoI-EcoRI片段显示出与染色体DNA共同的杂交图样，因而判断该片段是包含Proctase B基因的片段，并实施了亚克隆。将从噬菌体DNA中切下的XhoI-EcoRI片段插入pUC119的SalI、EcoRI部位，得到了质粒pPROB/119E.X。对所得质粒的碱基序列进行了分析，测定了Proctase B基因的启动子、终止子区域的碱基序列。
7-4)基因表达用重组载体pPTB-EX的构建
从采用实施例7-3记载的方法制备的质粒pPROB/119E.X中删除Proctase B基因的翻译区域，将该基因的启动子的3’末端与终止子区域的5’侧末端通过XbaI识别序列连接起来，由此得到的载体为表达载体pPTB-EX。pPTB-EX是以pPROB/119E.X作为模板，通过使用作为Proctase B基因的启动子的3’侧末端的引物(ProctaseBNxba)、作为Proctase B基因的终止子的5’侧末端的引物(ProctaseBCxba)的反向PCR来制备的。
ProctaseBNxba：GGTCTAGAATGTCAAGCAAGAGAGT(SEQ ID NO：17)
ProctaseBCxba：GGTCTAGAATCAACCACTGAAGTGGA(SEQ ID NO：18)
而且，在两引物5’侧末端添加了XbaI识别序列。PCR是使用PrimestarMAX DNA POLYMERASE(TAKARA Bio公司制造)，进行30个循环的(98℃、10秒)-(55℃、5秒)-(72℃、60秒)的反应。其结果，扩增出了约7kb的DNA。对于PCR反应液，使用QIAQUICK PCR PURIFICATIONKIT(QIAGEN公司制造)进行DNA的纯化，将其洗脱到50μL的TE缓冲液中，将所得DNA片段用XbaI进行限制酶处理后，使用连接试剂盒Ver.2(TAKARA Bio公司制造)进行再连接，得到了表达载体pPTB-EX。对所得质粒的碱基序列进行分析，确认反向PCR未引入突变。
7-5)重组PCN表达用载体pPTPCN的构建
对于采用实施例3所述的方法分离得到的PCN基因，将其插入表达载体pPTB-EX的XbaI位点，从而构建了重组PCN表达用载体pPTPCN。为了在PCN基因翻译区域的5’侧末端和3’侧末端添加XbaI识别序列，以pPCN为模板，使用在PCN基因的翻译区域的5’侧末端和3’侧末端添加XbaI识别序列而得到的引物PCN-XbaIPtN和PCN-XbaIPtC进行了PCR。
PCN-XbaIPtN ：GGTCTAGAGGTCAAAATGCGAGGATTATACTCCCT(SEQ ID NO：19)
PCN-XbaIPtC：GGTCTAGACTACTCATCCACAGCGAATCGG(SEQ IDNO：20)
PCR是使用Primestar MAX DNA POLYMERASE(TAKARA Bio公司制造)，进行30个循环的(98℃、10秒)-(55℃、5秒)-(72℃、60秒)的反应。其结果，扩增得到了约2.3kb的DNA。对于PCR反应液，使用QIAQUICK PCRPURIFICATION KIT(QIAGEN公司制造)进行了DNA的纯化，将其洗脱到50μL的TE缓冲液中，将所得DNA片段用XbaI进行限制酶处理后，使用同样用XbaI消化后再进行脱磷酸化处理而得到的pPTB-EX和连接试剂盒Ver.2(TAKARA Bio公司制造)进行连接，从而得到了质粒pPTPCN(SEQ IDNO：21，图3)。对该质粒中插入的PCN的DNA序列进行分析，确认了PCR未引入突变。
实施例8：用PCN表达载体pPTPCN转化黑曲霉大孢子变种以及重组PCN的表达
基于PCN表达载体pPTPCN的黑曲霉大孢子变种的转化，通过以niaD基因作为选择标记基因转化该株的niaD缺损株来实施。·
8-1)niaD缺损株Nia2株的分离
将黑曲霉大孢子变种的孢子涂布于在SPEC培养基-N(0.1％K2HPO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％KCl、0.001％FeSO4·2H2O、3％蔗糖、1.5％PurifiedAgar(精制琼脂)、pH5.5～6.0)中添加0.188％谷氨酸钠和3％KClO3而得到的培养基。将30℃培养5～7天后所得的菌落分别复制到以NO3、NH4或谷氨酸作为SPEC培养基的N源而得到的培养基上，30℃培养5～7天。在复制的菌落中，分离出能够在以NH4和谷氨酸作为N源的培养基上生长繁育、但不能在以NO3作为N源的培养基上生长繁育的菌株，此为niaD缺损株Nia2株。
8-2)选择标记基因niaD基因的分离
基于Uncle等[Uncle，S.E.，Cambell，E.I.，Punt，P.J.，Hawker，K.L.，Contreras，R.，Hawkins，A.R.，Van Den Hondel，C.A.and Kinghorn，J.R.，″TheAspergillus niger niaD gene encoding nitrate reductase：upstream nucreltide andamino acid sequence comparisons″，Gene 111(2)，149-155(1992)]报告的黑曲霉niaD基因翻译区域的5’末端和3’末端设计引物Nia-N和Nia-C，通过使用引物Nia-N和Nia-C进行PCR，扩增了黑曲霉大孢子变种的niaD基因的翻译区域。
Nia-N：ATGGCGACTGTCACTGAGGTG(SEQ ID NO：22)
Nia-C：TTAGAAGAAATGAAGGTCCGA(SEQ ID NO：23)
PCR如下实施：以黑曲霉大孢子变种的基因组DNA为模板，使用LAPCRTM KIT Ver2.1(TAKARA Bio公司制造)，94℃1分钟后，进行30个循环的(94C、30秒)-(55℃、30秒)-(72℃、3分钟)的循环，最后72℃处理7分钟。其结果，扩增得到了约3kb的DNA。将扩增得到的3kb的DNA片段用ECL Direct System(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)进行标记，作为探针。
接着，以采用所述方法制备的niaD基因的翻译区域为探针，从采用实施例7-1所述的方法制备的黑曲霉大孢子变种的基因组DNA文库分离出了包含niaD基因的启动子区域、终止子区域的克隆。采用与实施7相同的方法对基因组DNA文库进行筛选，得到了1个阳性克隆。对于所得噬菌体克隆，采用与实施例7相同的方法进行了Southern印迹分析。其结果，约6.5kb的XbaI消化片段显示出与染色体DNA共同的杂交图样，因而将该XbaI片段克隆到pUC118的XbaI识别序列部位，从而得到了质粒pPTnia118。对所得质粒的碱基序列进行了分析，测定了包含niaD基因的启动子和终止子区域的6416bp的碱基序列(SEQ ID NO：24)。
8-3)将PCN基因导入黑曲霉大孢子变种Nia2株
将黑曲霉大孢子变种Nia2株用S培养基(3.0％葡萄糖、0.1％多蛋白胨、1％酵母提取物、0.14％硫酸铵、0.2％磷酸钾、0.03％硫酸镁、pH6.8)于30℃培养24小时，通过离心分离(3500rpm、10分钟)回收了菌体。将所得菌体用0.5mol/L蔗糖洗涤，将其悬浮于用0.45μm的滤膜过滤过的原生质体化酶溶液(10mg/mL β-葡糖醛酸糖苷酶、3mg/mL甲壳酶、3mg/mL消解酶(zymolase)、0.5mol/L蔗糖)中。30℃振荡60分钟，将菌丝原生质体化。用脱脂棉过滤该悬浮液后，2500rpm离心10分钟回收原生质体，并用SUTC缓冲液(17.1％蔗糖、10mmol/L Tris-HCl pH7.5、10mmol/L CaCl2)洗涤。将如上制备的原生质体再悬浮于100μL的SUTC缓冲液后，添加pPTPCN7.5μL(1μg/μL)和pPTnia1182.5μL(1μg/μL)，冰上静置5分钟。然后，添加400μL的PEG溶液(60％PEG4000、10mmol/L Tris-HCl pH7.5、10mmol/LCaCl2)并于冰上静置20分钟后，添加SUTC缓冲液10mL，2500rpm离心10分钟。将离心分离出的原生质体悬浮于1mL的SUTC缓冲液后，4000rpm离心5分钟，最后将其悬浮于100μL的SUTC缓冲液中。
将经过以上处理得到的原生质体与软琼脂一起铺层在SPEC再生培养基(0.085％NaNO3、0.1％K2HPO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％KCl、0.001％FeSO4·2H2O、17.1％蔗糖、1.5％Purified Agar、pH5.5～6.0)上，将30℃培养5～7天而形成的菌落作为转化体。
8-4)黑曲霉大孢子变种Nia2株转化体中PCN的表达与酶活性的测定
将所得转化体用P培养基(1.0％淀粉、6.0％脱脂大豆粕、1.0％玉米浆、0.3％硫酸铵、1％碳酸钙)28℃培养6天。通过SDS-PAGE对培养后的上清进行了分析，得到了能够观察到重组PCN来源的分子量约80kDa的条带的菌株(No.16株)。对于No.16株的培养上清、以及同样培养Nia2株所得的培养上清，采用实施例1所述的方法测定了过氧化氢酶活性。其结果如表1所述，No.16显示出亲本株的77倍以上的活性，确认到了重组PCN的表达。
[表1]
  过氧化氢酶活性(u/mL)
  亲本株   小于300u/mL
  No.16株   23300u/mL
而且，在过氧化氢酶活性方面，以1分钟分解1μmol的过氧化氢的酶量为1个单位。而且，测定了采用实施例1所述的方法得到的嗜松青霉的培养上清的过氧化氢酶活性，其活性为385U/mL。该结果显示：通过以黑曲霉大孢子变种作为宿主表达PCN，其生产性显著提高。
8-5)N末端氨基酸序列的分析
对实施例8-4所得转化体No.16株的培养上清进行SDS-PAGE，并转印到Millipore公司制造的PVDF膜(Immobilon-PSQ)上。将该PVDF膜用考马斯亮蓝染色，切下印迹出约80kDa的蛋白质的部分，用Model 492氨基酸测序仪进行分析，解读出氨基末端侧11个残基的氨基酸序列。该序列如下。
DDSNASSETEA(SEQ ID NO：5的1～11位)
该氨基酸序列与嗜松青霉来源PCN的N末端氨基酸序列相同，因此，确认约80kDa的蛋白质是重组PCN。
8-6)重组PCN的热稳定性研究
如实施例1所述，嗜松青霉产生的天然PCN的热稳定性是50％。采用实施例1所述的方法对通过实施例8-4所述的方法得到的重组PCN的热稳定性进行了评价，结果其稳定性是71.3％。以上结果表明：重组PCN的热稳定性与天然PCN相比显著提高。
以上，通过具体实施方式对本发明进行了说明，而本发明的范围中包括对本领域技术人员而言显而易见的变形和改良。
序列表的SEQ ID NO：6-9、11-20、22-23的各碱基序列是人工合成的引物序列，其分别为：引物P catalase F(SEQ ID NO：6)、P catalase R(SEQ IDNO：7)、PCNF(SEQ ID NO：8)、PCNR(SEQ ID NO：9)、H catalase F(SEQ IDNO：11)、H catalase R(SEQ ID NO：12)、HCNF(SEQ ID NO：13)、HCNR(SEQID NO：14)、ProctaseB-N(SEQ ID NO：15)、ProctaseB-C(SEQ ID NO：16)、ProctaseBNxba(SEQ ID NO：17)、ProctaseBCxba(SEQ ID NO：18)、PCN-XbaIPtN(SEQ ID NO：19)、PCN-XbaIPtC(SEQ ID NO：20)、Nia-N(SEQID NO：22)、Nia-C(SEQ ID NO：23)。
SEQ ID NO：21的碱基序列是质粒pPTPCN。
SEQ ID NO：6的符号“N”(18位)、SEQ ID NO：11的符号“N”(3、6、12位)、SEQ ID NO：12的符号“N”(6、9位)分别表示任意碱基，而SEQ IDNO：12的符号“N”(12位)表示脱氧肌苷。
Figure IPA00001205353700011
Figure IPA00001205353700031
Figure IPA00001205353700041
Figure IPA00001205353700051
Figure IPA00001205353700061
Figure IPA00001205353700071
Figure IPA00001205353700081
Figure IPA00001205353700091
Figure IPA00001205353700101
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Figure IPA00001205353700161
Figure IPA00001205353700171
Figure IPA00001205353700191
Figure IPA00001205353700201
Figure IPA00001205353700211
Figure IPA00001205353700221
Figure IPA00001205353700231

Claims (11)

1.选自以下的(i)～(ii)中的蛋白质：
(i)由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～692位的序列组成的蛋白质；
(ii)由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.选自以下的(i)～(iv)中的DNA：
(i)编码权利要求1所述的蛋白质的DNA；
(ii)由SEQ ID NO：1所述的碱基序列的1～2403位的序列组成的DNA；
(iii)从所述(i)～(ii)的DNA中除去内含子序列而得到的DNA；
(iv)从所述(i)～(iii)的DNA中除去编码信号序列的碱基序列而得到的DNA。
3.根据权利要求2所述的DNA，其中，内含子序列是选自SEQ ID NO：1所述的碱基序列的322～372位、599～651位、1068～1113位或1279～1326位的序列中的1个以上的序列。
4.根据权利要求2所述的DNA，其中，编码信号序列的碱基序列是SEQID NO：1所述的碱基序列的1～126位的序列。
5.包含权利要求2～4中任一项所述的DNA的表达载体。
6.用权利要求2～4中任一项所述的DNA或包含该DNA的表达载体转化的宿主微生物。
7.根据权利要求6所述的宿主微生物，其中，该宿主微生物为丝状真菌。
8.根据权利要求7所述的宿主微生物，其中，丝状真菌是选自属于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)或顶孢霉属(Acremonium)的丝状真菌中的丝状真菌。
9.耐热性过氧化氢酶的生产方法，该生产方法包括：培养权利要求6所述的宿主微生物，并从培养物收集耐热性过氧化氢酶。
10.耐热性过氧化氢酶的生产方法，该生产方法包括：培养权利要求7所述的宿主微生物，并从培养物收集耐热性过氧化氢酶。
11.耐热性过氧化氢酶的生产方法，该生产方法包括：培养权利要求8所述的宿主微生物，并从培养物收集耐热性过氧化氢酶。
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