CN103849636A - 编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因、由该基因转化的黑曲霉菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因、由该基因转化的黑曲霉菌株及其用途。通过在黑曲霉菌株中表达编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因，显著提高了米黑根毛霉脂肪酶的活性。在缺失糖化酶的黑曲霉中表达所述优化基因时，这种效果更为明显。

Description

编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因、由该基因转化的黑曲霉菌株及其用途

技术领域

本发明涉及编码米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶的优化基因。本发明还涉及包含上述基因的表达载体。此外，本发明涉及包含上述基因或载体的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株及其用途。本发明还涉及生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其包括在黑曲霉中表达上述基因或载体。 

背景技术

脂肪酶及RML背景介绍 

脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是一类具有多种催化能力的酶。它催化天然水不溶性底物油脂及其他一些酯类水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，同时也能催化醇解、酯化和酯交换等反应。因此，该酶广泛应用于油脂加工、食品、医药、生物能源、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化工品和手性化合物有重要意义。 

不同生物来源的脂肪酶具有不同的蛋白质结构，决定了它们具有不同催化活力和催化专一性。脂肪酶对底物的专一性包括位置(或区域)专一性、脂肪酸专一性及立体专一性等。 

米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(RML)的酶学性质研究较深入且工业应用较广泛。Brady等(BradyL.，BrzozowskiA.M.，DerewendaZ.S.A serine protease triad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase.Nature.1990，343，767-770)已将该酶的高级结构阐述清楚，表明其具有优良的Sn-1，3立体特异性。Zacharis等(Zacharis E，Omar IC，Partridge J，Robb DA，Halling PJ.Selection of salt hydrate pairs for use in water control in enzyme catalysis in organic solvents.Biotechnol Bioeng.1997 Jul 20；55(2)：367-74.)以米黑根毛霉脂肪酶的转酯化和酯化反应为模型，针对特定的反应底物、反应介质、醇催化剂，选择合适的水合盐调控水活度，提高了非水相催化效 率；Pleiss等(Pleiss J，Fischer M，Schmid RD.Anatomy of lipase binding sites：the scissile fatty acid binding site.Chem Phys Lipids.1998Jun；93(1-2)：67-80)研究表明在脂肪酸链长专一性上RML对中长链脂肪酸酯较适合。因此，RML可用于制造人造黄油和具有不同熔点且不含各式脂肪酸的甘三酯以及一些“结构脂(Structured lipid)”。 

但天然的米黑根毛霉菌株产脂肪酶能力低下，且酶液成分不稳定，存在较大的缺陷，使得其应用成本明显偏高，导致大规模应用受到限制。王斌等(王斌，潘力，郭勇.丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建.华南理工大学学报(自然科学版).2009，37(6)，84-90)在米曲霉宿主菌A.oryzae niaD300中成功获得了RML的表达，但碱滴定法酶活测定表明培养液酶活仅为2.5U/mL。就如何提高米黑根毛霉脂肪酶产量和获得高酶活，国内外报道较少。利用传统方法诱变和优化发酵条件显著提高RML酶活已显得无能为力。 

黑曲霉系统的异源蛋白表达 

黑曲霉(Aspergillus niger)具有相对成熟的遗传背景和转化技术、较高的蛋白质分泌能力、高强度启动子、与高等真核生物类似的翻译后加工能力、成熟的发酵工艺和生物安全性等优点，是异源蛋白理想的宿主菌。 

黑曲霉表达系统的研究已存在很多，但大多数研究的出发点无非都是希望能提高表达系统的效率。Wai Prathumpai等(Wai Prathumpai，et al.Lipase production by recombinant strains of Aspergillus niger expressing a lipase-encoding gene from Thermomyces lanuginosus.Appl Microbiol Biotechnol 2004，65：714-719)在黑曲霉中利用米曲霉中的淀粉酶启动子系统来表达疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶，发现启动子系统的表现与米曲霉中一致，都受葡萄糖抑制，但却能被麦芽糖和淀粉高效诱导，从而能通过改变培养基成分，而轻松提高表达效率。玛丽亚.康奈利等(玛丽亚.康奈利，霍华德.布罗迪.在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法.CN101629204A.2010)对黑曲霉Bo-1进行改造，将多个基因(glaA、asa、amyA、amyB、prtT、oah)中一个或多个失活，从而希望达到提高表达效率的效果。 

随着现代生物工程产业及技术的不断发展，人们对在不同宿主中表达异源重组蛋白的需求和能力都在不断加强。如何提高外源基因在黑曲 霉中的表达效率，使之减低工业化生产的成本，同时节能环保，是黑曲霉甚至所有的表达系统最基本的需求和研究热点之一。 

几种高效重组表达策略简介 

1)密码子优化： 

根据宿主的密码子偏爱性优化异源基因的密码子能够提高蛋白表达效率，这在一些原核生物和真核生物中均有报道。 

研究结果认为密码子优化提高了翻译效率从而提高了蛋白表达水平；进一步的研究发现密码子优化能够提高异源基因在真菌中的转录活性即mRNA水平。 

HugoG Menzella(HugoG Menzella.Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli.Menzella Microbial Cell Factories，2011，10：15)对小牛前凝乳酶(calf prochymosin)基因进行密码子的优化，其采用的随机密码子优化策略获得了的5条优化序列。在大肠杆菌中表达结果发现随机密码子策略的优化序列的表达水平都较原始序列有明显提高，其中一条优化序列更是提高了70％。 

Jiangke Yang等(Jiangke Yang，Liying Liu.Codon optimization through a two-step gene synthesis leads to a high-level expression of Aspergillus niger lip2 gene in Pichia pastoris.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic.2010，63：164-169)将黑曲霉lip2基因进行密码子优化后在毕赤酵母中表达，而新的优化序列其表达在酶活和蛋白表达量都有明显提高，分别提高了11.6倍和5.3倍。 

因此，密码子优化是提高外源基因高效转录和表达的途径之一。 

2)使用蛋白酶缺失及其他功能缺失的菌株： 

由于胞外蛋白酶对异源蛋白的降解作用，丝状真菌丰富的蛋白酶系被认为是限制异源蛋白高效分泌和表达的主要因素，所以筛选蛋白酶缺失突变株是提高异源蛋白表达水平的有效策略之一。 

Yoon等(Yoon J，Maruyama J，Kitamoto K.Disruption of ten pro-tease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins.Appl Microbiol Biotechnol，2011，89(3)：747-759)对tppA、pepE、nptB、dppIV和dppV蛋白酶缺失的米曲霉进一步的敲除，去除了alpA、pepA、AopepAa、AopepAd和cpI蛋 白酶基因，以10种蛋白酶基因缺失突变株作为宿主异源表达人溶菌酶(HLY)和牛凝乳酶(CHY)基因，结果与5种基因缺失的突变株相比表达量分别提高了30％和35％。 

另外，某些其他功能的缺失，例如，在黑曲霉中缺失高表达的糖化酶基因，从而降低异源蛋白的表达竞争，也能起到一定的效果。汪兵等(汪兵，王小娟，杨建国等.表达嗜热糖化酶的工程菌及其应用.CNl01503660.2009)等将黑曲霉的糖化酶基因灭活，并将硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因插入到黑曲霉的基因组中，从而提高异源糖化酶的表达。 

3)使用高效启动子： 

随着对启动子功能认识的加深，发现启动子的高启动效率对于目标蛋白高效表达是基本的。 

所以很多改进启动子性能的手段得以发展，包括在启动子序列中引入突变、构建两个或多个启动子的融合启动子，或者是构建顺排启动子或杂交启动子等，而某些改进也往往能够得到一定的效果。 

Hirokaz等(Hirokazu Tsuboi，Akio KoDA et al，Improvement the Aspergillus oryzae Enolase Promoter(P-enoA)by the Introduction of cis-Element Repeats.Biosci.Biotechnol.Biochem，69(1)，2005，206-208)将米曲霉的烯醇化酶启动子(PenoA)进行了改造，串联了12个米曲霉的regionIII序列，从而让报告基因GUS的表达水平比为改造前的启动子提高了30倍。 

4)增加编码基因拷贝数： 

增加编码基因拷贝数是一种最直接提高蛋白表达效率的方法，所以许多表达菌株都倾向于使用原生质体法进行转化，因为其可以方便地获得多拷贝的目的基因整合到宿主菌中。 

Lee等(Lee DG，Nishimura-Masuda I，Nakamura A et al，Overproduction of alpha-glucosidase in Aspergillus niger transformed with the cloned gene aglA.JGenAppl Microbiol，1998，44(3)：177～181)将黑曲霉GN-3的a-葡萄糖苷酶基因的表达盒片段连接到pUC19载体后，利用原生质体法转化入黑曲霉GN-3中，Southern杂交显示多拷贝的a-葡萄糖苷酶基因整合到了黑曲霉基因组中，a-葡萄糖苷酶的产量比原始菌株提高了11倍。 

虽然各种方法都能够达到提高表达效率的效果，但不同菌株和不同表达系统拥有自己的特点。根据菌株特性将各种策略做出有针对性的调整及组合，可能会产生意想不到的效果。另外本领域仍然需要能够稳定提高RML在异源表达系统中的表达效率的方法，所以如何能够明显且稳定提高RML表达效率的方法是需要的。 

发明内容

本发明的目的在于提高RML在异源表达系统中的表达效率。 

针对上述目的，本发明获得了能在黑曲霉表达系统中高效表达的rml优化基因序列以及RML高产黑曲霉工程菌株。此外，本发明还提供了一种新的提高目的基因在异源表达系统中表达效率的方法，其进一步提高RML在异源表达系统中的表达效率并且获得了RML高产黑曲霉工程菌株。 

具体地，本发明涉及编码米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶的优化基因，其序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。本发明还涉及包含上述基因转化的表达载体。该载体还可以包含表达调控序列。此外，本发明涉及包含上述基因或载体的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株及其在生产米黑根毛霉脂肪酶中的用途。本发明还涉及生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其包括在黑曲霉中表达上述基因。在一个实施方案中，所述黑曲霉缺失糖化酶。 

本发明实现了以下效果： 

1)获得了比原始rml基因更适合在黑曲霉表达系统中高效表达的优化基因序列rco和rsyn； 

2)本发明提供了一种新的提高目的基因在异源表达系统中表达效率的方法：对基因密码子进行优化，获得优化序列，并将该优化序列在糖化酶缺失的菌株中表达。本方法对于提高异源表达系统目的蛋白表达的效果明显优于单独采用优化密码子基因和采用糖化酶缺失菌株宿主的效果，并且大于两者之和，具有协同增效的作用。 

3)获得了用上述rco和rsyn基因转化的、能够产生高活性RML的工程菌株。 

附图说明

图1表示优化前的rml基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。rml全长基因的NCBI登录号为A02536。 

图2表示优化后的rml基因rco的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。密码子发生同义替换的位置用阴影标出。 

图3是优化后的rml基因rsyn的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。 

图4是pyrG敲除载体pAOPT质粒图。 

图5是糖化酶敲除载体pA15质粒图。 

图6是rml原始基因的表达载体示意图。其中eno-promoter为米曲霉的烯醇化酶启动子；rml为插入的基因片段，由米曲霉α-淀粉酶信号肽和rml基因组成；Terminator为米曲霉糖化酶终止子，BamHI、PstI、HindIII和XholI为酶切位点。 

图7是糖化酶缺失菌株SDS-PAGE电泳图。泳道1：蛋白marker；泳道2：TC1；泳道3：TC2；泳道4：TC3；泳道5：TC4：泳道6：TC5；泳道7：TC6；泳道8：3.795；泳道9：ANW01；泳道10：黑曲霉糖化酶。 

图8是Realtime PCR扩增曲线图-TC3与ANW01比较。①：ANW01糖化酶扩增曲线；②：ANW01参照基因Cox扩增曲线；③：TC3参照基因Cox扩增曲线；④：TC3糖化酶扩增曲线。横坐标表示PCR的循环数，纵坐标表示ΔRn：Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。ΔRn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(ΔRn＝Rn-基线)。 

图9显示脂肪酶水解活力测定步骤。 

图10显示酸碱滴定法检测发酵液上清脂肪酶水解活性的结果。 

具体实施方式

本发明将rml基因进行优化，获得优化序列rco和优化序列rsyn。 

将合成的优化基因rco和rsyn分别插入到pAZ10载体的开放读码框中(米曲霉烯醇化酶启动子及5’UTR序列，黑曲霉糖化酶终止子)，得到pAZ-rco和pAZ-rsyn载体；通过PCR定点突变替换pAZ-rco、pAZ-rsyn和pAZ10起始密码子ATG前面的PstI酶切位点为糖化酶Kozark保守序列，获得表达载体pGl-rco、pGI-rsyn和对应的编码脂肪酶rml原始基因的对照表达载体pGl-rml。 

以含amds筛选标记的质粒p3SR2为共转化筛选载体，利用原生质体转化的方法，将各表达载体导入至黑曲霉菌株3.795以及对应的糖化酶缺失菌株ANW02中。 

通过Rhodamine B平板来筛选分纯，获得优化基因rco、优化基因rsyn和原始基因rml转化黑曲霉菌株3.795的转化子，以及优化基因rco和原始基因rml转化对应的糖化酶缺失菌株ANW02的转化子，以上各类转化子数量均大于40株。通过摇瓶液体发酵，碱滴定法测定酶活，选择各类构建体转化子酶活最高的3株进行比较，对基因密码子优化效果进行评估。 

摇瓶发酵结果显示： 

原始rml基因转化3.795的3株酶活最高的转化子在发酵第6天酶活达到最高，酶活平均值为505.56U/ml； 

原始rml基因转化ANW02的3株酶活最高的转化子在发酵第6天酶活达到最高，酶活平均值为544.44U/ml； 

优化基因rsyn转化3.795的3株酶活最高的转化子在发酵第8天酶活达到最高，酶活平均值为788.89U/ml，较原始rml基因转化3.795的平均酶活提高了56.04％；优化基因rsyn转化3.795的酶活最高的转化子酶活为850.00U/ml，较原始rml基因对应的酶活最高转化子的酶活550.00U/ml提高了54.55％。 

优化基因rco转化3.795的3株酶活最高的转化子在发酵第7天酶活达到最高，酶活平均值为904.44U/ml，较原始rml基因转化3.795的平均酶活提高了78.90％；优化基因rco转化3.795的酶活最高的转化子酶活为966.67U/ml，较原始rml基因对应的酶活最高转化子的酶活550.00U/ml提高了75.76％。 

优化基因rco转化ANW02的3株酶活最高的转化子在发酵第8天酶活达到最高，酶活平均值为2122.22U/ml，较原始rml基因转化3.795平均酶活提高了319.78％；优化基因rco转化ANW02的酶活最高的转化子酶活为2373.33U/ml，较原始rml基因对应的酶活最高转化子的酶活550.00U/ml提高了331.52％。 

无论是单株转化子的活性最高值，还是3株活性最高的转化子平均值，结果都显示，优化基因rsyn和优化基因rco两种优化都能够明显提高RML在黑曲霉中表达水平。 

另外优化基因rco转化ANW02宿主对应的转化子脂肪酶酶活显著高于优化基因rco转化3.795宿主对应的转化子和rml基因转化ANW02宿主对应的转化子的酶活，并且大于两者之和。因此，根据黑曲霉糖化酶密码子优化的rml优化基因序列rco在糖化酶缺失的黑曲霉宿主中表达，能够有效地提高黑曲霉异源表达RML的水平。相较于单独使用优化基因序列rco和在糖化酶缺失的黑曲霉宿主中表达，结合以上两个因素能够显著性提高RML在黑曲霉中表达水平，二者具有协同增效的效果。 

实施例 

实验材料 

1.实验菌株和质粒 

菌株名称：黑曲霉3.795(CGMCC：3.795，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)； 

米曲霉RIB40(A.oryzae RIB40)，购自NITE Biological Resource Center(NBRC)，NBRC No.100959； 

大肠杆菌DH5a(TAKARA：Catalog#.D9057A)； 

质粒：p3SR2，含乙酰胺酶(amdS)基因(BCCM/LMBP：Accession number：2363)，pCAMBIA1300(MarkerGene：Catalog#.M1591)； 

2.培养基和溶液 

LB培养基：0.5％酵母提取物，1％胰化蛋白胨，1％NaCl，pH7.0，(固体培养基琼脂浓度1.5％) 

孢子培养基(麦芽汁培养基)：将30g麦芽浸粉溶解在1L水中，加入15g/L琼脂粉，高压灭菌。 

查氏培养基：将30g蔗糖、3g NaNO3、0.5g MgSO4.7H2O、0.5g KCl、0.01g FeSO4.7H2O、1g K2HPO4溶解在1L水中，115℃15min高压灭菌。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L。 

尿嘧啶筛选培养基：将10.9g葡萄糖、0.52g KCl、1.497g KH2PO4、5.95g NaNO3、0.49g MgSO4.7H2O、微量元素、12g琼脂粉溶解在1L水中，115℃15min高压灭菌，待培养基冷却至60℃以下，补加10ml5-FOA(100mg/ml)和10ml尿苷+L-脯氨酸(1M)。 

诱导培养基：在查氏培养基中加入40ml 1M MES，115℃15min高 压灭菌。冷却后加入1ml 0.2M AS(乙酰丁香酮)。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L，AS的添加在培养基冷却至60℃以下。 

糖化酶(淀粉酶)筛选培养基：2％可溶性淀粉、1％玉米浆粉、1％碘化钾、0.12％硝酸钠、0.08％硫酸铵、0.1％吐温80、2％琼脂，pH5.5。115℃灭菌15分钟。冷却至60℃，倒平板。 

菌丝培养基(1L)：2％葡萄糖，6％麦芽糖(接孢子时加入)，7％柠檬酸钠，1.5％硫酸铵，4％胰蛋白酶消化的大豆培养液(Tryptic soy broth)，0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁，0.07％Tween 80，微量元素，115℃，高压灭菌15min(三角瓶为挡板三角瓶，装液量50ml/250ml)。 

再生培养基：0.1％磷酸氢二钾、0.05％氯化钾、0.05％硫酸镁、0.001％硫酸亚铁、1M蔗糖、1.5％琼脂粉，115℃，高压灭菌15min。 

PDA-Rhodamine B筛选培养基： 

PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g水1000mL，pH值自然； 

橄榄油乳化液：以1∶3体积比加入橄榄油与4％的聚乙烯醇(PVA)溶液并混合，用高速匀浆机8000rpm匀浆15min，间歇5min后再搅拌3min； 

PDA培养基和橄榄油乳化液分别115℃，高压灭菌15min；待冷却至60℃左右，按9∶1加入PDA培养基和橄榄油乳化液，再加入1/100体积的过滤灭菌的0.1％Rhodamine B溶液，混匀后立即倒平板。 

发酵培养基：2％葡萄糖，20％可溶性淀粉(上海生工)，7％柠檬酸钠，1.5％硫酸铵，4％胰蛋白酶消化的大豆培养液(组分单独加入)，0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁，0.07％Tween 80，微量元素，115℃，高压灭菌15min(三角瓶为挡板三角瓶，装液量50ml/250ml)。 

孢子洗液：可用生理盐水，0.9％NaCl，0.05％吐温80； 

渗透压稳定剂：0.6M MgSO4，10mM NaH2PO4，pH＝5.8； 

酶解液：用渗透压稳定剂配制1％裂解酶，1％纤维素酶，0.1％蜗牛酶的酶解液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 

山梨醇溶液：1.0M山梨醇，100mM Tris-HCl，pH＝7.0 

STC：1.0M山梨醇，50mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH＝7.5； 

PTC：40％PEG4000，50mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH＝7.5 

0.2M AS(乙酰丁香酮)：用DMSO溶解785mg AS，定容于20ml，0.22um有机相膜过滤除菌，-20℃，避光保存，不能反复冻融，最好分装保存； 

1M MES缓冲液：用ddH2O溶解195.24g MES，定容1L，用NaOH将pH值调节到5.5，分装后-20℃，保存； 

100mg/ml 5-FOA：用ddH2O溶解1.0g 5-FOA，定容10mL，-20℃，保存； 

1M尿苷+L-脯氨酸：用ddH2O溶解2.442g尿苷和1.151g脯氨酸，定容10mL，4度保存。 

葡萄糖氧化酶母液(1000×)：将10KU葡萄糖氧化酶用10ml 0.5MTris-HCl缓冲液溶解，过滤除菌，-20℃保存。 

实施例1：优化rml序列(rco) 

rco序列以rml基因为基础进行优化，并加入PstI酶切位点接头和米曲霉α-淀粉酶信号肽DNA序列(NCBI序列号：XM_001821384.2，前63bp序列)。 

优化后的基因具有以下特征：(1)所编码的蛋白质与rml原始基因相比没有发生改变；(2)GC含量由原先48.9％升高到60.0％；(3)共有115处同义密码子发生改变，占基因密码子个数的34％，涉及终止子和14种氨基酸，分别为苯丙氨酸(TTT换成TTC)、亮氨酸(CTT换成CTG)、丝氨酸(TCA换成TCC)、蛋氨酸(ACA换成ACC)、缬氨酸(GTT和GTA换成GTG和GTC)、脯氨酸(CCA和CCT换成CCC和CCG)、酪氨酸(TAT换成TAC)、终止密码子(TAA换成TAG)、组氨酸(CAT换成CAC)、谷氨酰胺(CAA换成CAG)、天冬酰胺(AAT换成AAC)、赖氨酸(AAA换成AAG)、谷氨酸(GAA换成GAG)、半胱氨酸(TGT换成TGC)、甘氨酸(GGT换成GGC)。 

优化前和优化后的序列分别见图1和图2。 

对检查无误后的优化基因(含米曲霉淀粉酶信号肽)进行基因合成(生工生物工程(上海)有限公司)。合成的基因用于载体构建，黑曲霉转化和基因表达。 

实施例2：优化rml序列(rsyn)及特点 

rsyn序列以rml基因为基础进行优化，并加入PstI酶切位点接头和米曲霉α-淀粉酶信号肽DNA序列(NCBI序列号：XM_001821384.2，前63bp序列)。 

优化后的基因具有以下特征：(1)所编码的蛋白质与rml原始基因相比没有发生改变；(2)GC含量由原先48.90％升高到52.75％，GC含量位于合理范围内，与黑曲霉基因组GC含量类似；(3)主要有3种稀有密码子TTA、ATA、GTA，用高频的同义密码子替换；(4)降低了mRNA的自由能来提高mRNA的稳定性。 

优化前和优化后的序列分别见图1和图3。 

对检查无误后的优化基因(含米曲霉淀粉酶信号肽)进行基因合成(生工生物工程(上海)有限公司)。合成的基因用于载体构建，黑曲霉转化和基因表达。 

实施例3：载体的构建 

1.pyrG敲除载体的pAOPT的构建 

引物如下： 

AOP-F：ACGCGTCGACAGATATGTTCAACGATCAGGATTG   (SEQ ID NO：4)

AOP-R：CCCAAGCTTCGAGAGGACTATTCCGAGGGTGTG    (SEQ ID NO：5)

AOP-TF：GAAGATCTAGCAGTACCAAACTCCTGAG        (SEQ ID NO：6)

AOP-TR：ACGCGTCGACGAGAGGACTATTCCGAGGGT      (SEQ ID NO：7)

按照DNeasy Plant Mini Kit试剂盒(Qiagen；Catalog no.69104)说明书，提取米曲霉(A.oryzae RIB40)的基因组DNA，并以此基因组DNA为模版，引物为AOP-F/AOP-R，PCR扩增乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因pyrG  (NCBI序列号：AB017705)，扩增产物全长1973bp。 

以载体pSP72(Promega：Catalog#.p2191)为骨架，将载体和1973bp长的pyrG基因片段用SalI和HindIII酶切、连接，从而将米曲霉pyrG基因连入pSP72中，构建好中间载体pAOP。 

以质粒pAOP为模版，AOP-TF/AOP-TR为引物，PCR扩增长为623bp的重复序列AOP-T，将重复片段AOP-T和质粒pAOP用BglII和HindIII酶切后连接，最终构建好pyrG敲除载体pAOPT，见图4。 

2.糖化酶敲除载体pA15的构建 

按照DNeasy Plant Mini Kit试剂盒(Qiagen；Catalog no.69104)说 明书，分别提取米曲霉(A.oryzae RIB40)和黑曲霉(A.niger 3.795)基因组DNA。以黑曲霉基因组DNA为模板，PCR扩增黑曲霉糖化酶基因序列gla(NCBI序列号：AY250996.1)，扩增产物全长为4.2kb，引物两端设计酶切位点为XhoI和EcoRV；以米曲霉基因组DNA为模板，PCR扩增乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因pyrG(NCBI序列号：AB017705)，扩增产物全长为1.9kb，引物两端设计酶切位点为MluI和BglII。 

以载体pSP72(Promega：Catalog#.p2191)为骨架，将载体用BglII酶切、补平、连接，从而使BglII酶切位点失活，再将糖化酶4.2kb的PCR产物用XhoI和EcoRV酶切后连入同样酶切处理的pSP72，得到中间载体，将此中间载体用MluI和BglII酶切，用来源于米曲霉pryG基因PCR产物1.9kb作为外源片段插入上述中间载体，得到pA14。 

根癌农杆菌载体pCAMBIA1300(MarkerGene：Catalog#.M1591)用XhoI酶切后，补平，去磷酸化，回收7.8kb载体作为骨架载体，将pA14质粒以HpaI和XhoI双酶切后，补平作为外源片段，与骨架载体连接，得到双元载体pA15，见图5。 

3.pAZ10载体的构建 

pAZ1O载体示意图如图6。用PstI和HindIII酶切位点将rml原始基因(带米曲霉α-淀粉酶信号肽(NCBI序列号：XM_001821384.2，前63bp序列))插入到以米曲霉烯醇化酶启动子(NCBI序列号：D63941.1，215-734bp  ；含12拷贝增强子序列(gtcgtgtcgggcatttatcgggggatggaccaatcagcgtagg))和米曲霉糖化酶终止子(NCBI序列号：FJ868795.1)的表达框中，将整个表达框以BamHI和XhoI插入到克隆载体pSP72的多克隆位点。 

4.pAZ-rco和pAZ-rsyn载体的构建 

用PstI和HindIII双酶切载体pAZ10和合成基因rco及合成基因rsyn(合成基因两端含PstI和HindII限制性酶切位点)，将优化的rml基因rco和rsyn插入到pAZ10载体的开放读码框中(米曲霉烯醇化酶启动子及5’UTR序列，黑曲霉糖化酶终止子)，得到pAZ-rco载体和pAZ-rsyn载体。 

5.pGl-rco、pGI-rsyn和pGl-rml载体的构建 

引物如下： 

GlF2：TTAACGCGTCGACTGACCAATTCCGCAGCTCTCAGCAATGATGGTCGCGTGGTGGTCTC(SEQ ID NO：8)

rcoR1：AGTCTTCTCGCTGTCGCCACG(SEQ ID NO：9) 

rsynR1：GCACTTTGGTTCCGCTCACT(SEQ ID NO：10) 

rmlR2：AGGTGAGATCAGCAATCCAG(SEQ ID NO：11) 

表达载体pGl-rco的构建：以质粒pAZ-rco为模板，利用引物GIF2/rcoR1进行PCR扩增。扩增片段和载体pAZ-rco分别用SalI酶切，再将扩增片段插入载体pAZ-rco中，从而进行5’UTR区域Kozark保守序列的替换，用黑曲霉糖化酶Kozark保守序列TCAGCA替换掉PstI识别序列和烯醇化酶Kozark保守序列GTCAAA。 

表达载体pGl-ysyn的构建：以质粒pAZ-rsyn为模板，利用引物GIF2/rsynR1进行PCR扩增。扩增片段和载体pAZ-rsyn分别用SalI和PmlI双酶切，再将扩增片段插入载体pAZ-rsyn中，从而进行5’UTR区域Kozark保守序列的替换，用黑曲霉糖化酶Kozark保守序列TCAGCA替换掉PstI识别序列和烯醇化酶Kozark保守序列GTCAAA。 

表达载体pGl-rml的构建：以质粒pAZ10为模板，利用引物GIF2/rmlR2进行PCR扩增。扩增片段和载体pAZ10分别用SalI和PmlI双酶切，再将扩增片段插入载体pAZ10中，从而进行5’UTR区域Kozark保守序列的替换，用黑曲霉糖化酶Kozark保守序列TCAGCA替换掉PstI识别序列和烯醇化酶Kozark保守序列GTCAAA。 

实施例4：黑曲霉尿嘧啶缺陷菌株ANW01的获得 

通过原生质体法将pyrG敲除载体的pAOPT转化入黑曲霉3.795中，具体转化步骤如下： 

用孢子洗液洗脱新鲜的黑曲霉3.795孢子，通过mircloth过滤制备成孢子悬液，并调整至1×10⁷个/mL。接种1mL孢子悬液至菌丝培养基中，28℃，150rpm，培养42-48小时，用灭菌Mircloth过滤收集长出的菌丝。 

收集的菌丝体用灭菌的渗透压稳定剂冲洗三次，压干。菌丝转移至100mL三角瓶中，每0.8g菌丝体重悬在20mL的酶解液中，30℃，60rpm，60-90min，得到原生质体混合液。酶解好的原生质体混合液用Mircloth过滤，收集滤液，4℃，1000g离心10min，用5mL预冷 1.0mol/L山梨醇溶液重悬原生质体沉淀，800g，4℃离心10min，弃上清。再用预冷的STC溶液将原生质体调整至适宜浓度(1×10⁷个/mL)，冰浴待用。 

向200μL原生质体悬液中，加入10μg DNA(pAOPT质粒)和50μLPTC溶液，混匀后冰浴30min。加入0.2mL PTC溶液，混匀后再加入0.8mL PTC溶液，混匀，室温保持30min。 

上述混合液中加入200μL再生培养基(上层，0.6％琼脂糖)中，铺于再生培养基(1.5％琼脂糖)上，此处再生培养基中均补加10ml 5-FOA(100mg/ml)和10ml尿苷+L-脯氨酸(1M)。28℃，培养10天以上，待菌落长出，统计转化子。 

将在平板上长出的菌落，分别接种于尿嘧啶筛选培养基和不含尿苷+L-脯氨酸和5-FOA的尿嘧啶筛选培养基，最终筛选出一株对尿嘧啶核苷依赖的黑曲霉突变株，命名为ANW01。方法可参考：CN101629204A。 

实施例5：黑曲霉菌株ANW01糖化酶敲除菌株ANW02的获得 

1.农杆菌转化黑曲霉ANW01 

pAZ15质粒(实施例3中构建)转化入农杆菌EHA105(Tiandz，Inc：Catalog#.12-153)后获得的农杆菌菌株，命名为EpAZ15。将农杆菌EpAZ15单菌落接种至20mL LB(20ug/mL Rif+50ug/mL Kan)液体培养基中，28℃ 250rpm培养24小时。离心收集菌液后用液体诱导培养基悬浮，并将OD600调整为0.4，28℃ 250rpm诱导培养6小时。 

将100μL诱导后的农杆菌EpAZ15和100μL 1×10⁷个/mL黑曲霉ANW01孢子悬液混匀，涂布在诱导培养基平板上，23℃黑暗共培养3天。 

共培养后的培养基平板转移至28℃培养7-10天，平板上长出的菌落即为转化子，共获得146株转化子，挑取转化子至查氏培养基(250μg/mL cefotaxim)上，28℃培养，进行再筛选并去除农杆菌的干扰。 

2.糖化酶检测平板初筛 

农杆菌EpAZ15侵染黑曲霉ANW01后获得146株转化子，接种在筛选平板上，28℃培养5-7天，待菌落长成合适大小。 

葡萄糖氧化酶母液用0.5M Tris-HCl缓冲液稀释至2U/mL，取1.50mL稀释好的葡萄糖氧化酶液，均匀滴加在已长出菌落的平板上(勿滴在菌落上)。15分钟后，每隔3分钟观察菌落周围的颜色。 

菌落周围棕色出现的越早，颜色越深，说明该菌落的糖化酶活力越高。菌落周围的棕色出现的越晚，颜色越浅，说明该菌落的糖化酶活力越低。 

结果筛选出14株疑似糖化酶缺失菌株。 

3.蛋白水平检测糖化酶敲除 

通过糖化酶检测平板来对菌株产糖化酶能力进行检测，筛选出14株疑似糖化酶敲除菌株，进行下一步SDS-PAGE电泳检测来确认菌株是否缺失糖化酶。 

SDS-PAGE电泳实验的结果见图7，如图所示，TC3、TC4、TC5没有与黑曲霉糖化酶一致的大小的蛋白条带。14株疑似菌株共确定了4株糖化酶缺失菌株。 

4.mRNA水平检测验证糖化酶敲除 

分别收集糖化酶缺失菌株TC3与出发菌株ANW01发酵第4、5、6天的菌丝体，按照RNeasy Mini Kit For purification of total animal cells，animal tissues，bacteria，and yeast，and for RNA cleanup (QIAGEN公司)产品说明书实验步骤提取RNA。并马上按照ReverTraAce-a-逆转录试剂盒(TOYOBO：Catalog#.FSK-101)产品说明书实验步骤将提取的RNA反转录成cDNA。 

Realtime PCR检测，设立两对引物，分别为检测糖化酶用的糖化酶基因引物与用于对照作用的参照基因引物，序列如下： 

糖化酶基因引物序列： 

GLA6-F：GGCTGGTGAGTCGTTTGA(SEQ ID NO：12)； 

GLA6-R：CGGTGTATTCTCGGTTGG(SEQ ID NO：13)； 

参照基因(Cytochrome oxidase subunit V)引物序列： 

CoxF2：GACCAAGGAGTGGCAGGAG(SEQ ID NO：14)； 

CoxR2：GAACTGGGTGGGAGGCAGCAGtTC(SEQ ID NO：15)； 

反应体系(总体积20μL)：IQ SYBR Green Supermix 10μL，模板0.5μL，上、下游引物各0.5μL，纯水8.5μL； 

反应条件：95℃ 5min、95℃ 15s、60℃ 1min、循环数40、溶 解曲线反应。 

通过PCR实验获得每个样品所对应的扩增曲线，在合理基线和阀值内，可以得到所对应的扩增初始循环数，即CT值，以参照基因为对照，将PCR扩增CT值差异换算成表达倍数差异(换算公式为2-ΔΔCT)，最后可以针对表达的差异性来确定糖化酶是否被敲除。 

实验结果见图8，实验样本均为发酵第6天样品，曲线①：ANW01糖化酶扩增曲线；曲线②：ANW01参照基因Cox扩增曲线；曲线③：TC3参照基因Cox扩增曲线；曲线④：TC3糖化酶扩增曲线，以上各曲线均由3条平行样扩增曲线组成。 

将基线设立在指数增长阶段，图中设在ΔRn为1.000e+004处，从而获得对应的扩增初始循环数(CT值)。 

ANW01糖化酶CT值：12.1；ANW01参照基因Cox CT值：16.7；TC3参照基因Cox CT值：18.1；TC3糖化酶CT值：27.1。所以，表达量的比值＝2-ΔΔCT＝2-[(ANW01糖化酶CT值-ANW01参照基因CT值)-(TC3糖化酶CT值-TC3参照基因CT值)]＝213.6＝12416.75。 

结果显示，ANW01糖化酶的表达量是与TC3的12416.75倍，差异性明显。所以认定糖化酶在TC3菌株中无表达，且Realtime PCR结果与SDS-PAGE蛋白电泳结果一致，之后将糖化酶缺失菌株TC3命名为ANW02。 

实施例6：表达载体转化黑曲霉 

用质粒大提试剂盒(AxyPrep^TM Plasmid Maxiprep Kit)大量提取表达载体质粒pGl-rco、表达载体质粒pGl-rsyn、对照表达载体pGl-rml和共转化筛选载体质粒p3SR2，备用于黑曲霉3.795和ANW02菌株转化。 

转化方法为原生质体法，具体参考实施例4中的转化步骤，此处转化DNA为20μL，表达载体和共转化筛选载体质粒各10μL(1μg/μL)。再生培养基中需待冷却后加入终浓度15mM的乙酰胺和20mM的CsCl。 

黑曲霉菌丝由有隔细胞组成，且细胞为多核体。原生质体转化法产生的转化子每个核基因组由于发生转化事件的频率和位点不同而成为异核体菌株，因此，需要通过形成分生孢子变成单核细胞使转化子分纯。对获得的转化子，需要进行单孢分离的工作，具体如下： 

将转化子孢子制备成均匀的孢子悬液，调整孢子浓度至1×10³个/mL，取100μＬ孢子悬液涂布于PDA-Rhodamine B筛选培养基平板上，28℃，静置培养4天，挑取荧光表现最强的单菌落。 

分离获得的单菌落接种至孢子培养基平板上，28℃，静置培养7-9天，用孢子洗液洗脱产孢培养基上的黑曲霉孢子，通过mircloth过滤制备成孢子悬液，并调整至1×10⁷个/mL。接种1mL孢子悬液至菌丝培养基中，28℃  200rpm培养发酵，并进行酶活测定。 

最终，把表达载体pGl-rco、表达载体pGl-rsyn、对照表达载体pGl-rml，分别按上述方法转化进黑曲霉3.795和ANW02菌株，具体见表1。 

表1不同优化策略产RML黑曲霉转化子编号及个数 

优化对应编号	转化的表达载体	宿主菌	转化子个数
				3-	pGl-rco	3.795	60
g3-	pGl-rco	ANW02	43
				S	pGl-rsyn	3.795	45
5-	pGl-rml	3.795	40
				g5-	pGl-rml	ANW02	41

实施例7：酶活测定和蛋白检测 

1.发酵液样品处理 

将黑曲霉菌株摇瓶发酵至6-8天的发酵液摇匀，取1mL到离心管中，12000rpm离心1min；取上清，根据酶活取0.5-5U脂肪酶水解活力的发酵液到总体积1mL的无菌水，作为酸碱滴定法检测酶活的样品。 

2.脂肪酶水解活力酸碱滴定法测定 

方法参考QB/T 1803-1993工业酶制剂通用试验方法。 

橄榄油乳化液：量取4％PVA溶液150mL，加橄榄油50mL，用高速匀浆机8000rpm匀浆15min，间歇5min后再搅拌3min，即制备成酶活测定底物溶液(此溶液需现配现用)。 

具体步骤如图9所示。 

脂肪酶酶活力单位定义为：每分钟催化底物释放出1μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位(U)。酶活计算公式： 

式中：V：滴定样液所消耗的NaOH溶液体积(mL)；V₀：滴定空白样所 消耗的NaOH溶液体积(mL)；t：反应时间(min)；n：酶液体积(mL)；M：滴定用的NaOH溶液的浓度(mmol/L) 

根据转化子紫外照射下在Rhodamine B平板上荧光圈的大小及亮度选择转化子菌株。通过摇瓶发酵检测酶活备进一步筛选高产脂肪酶菌株。 

摇瓶发酵前菌株在产孢培养基培养6-10天，接种新鲜孢子，并统一接种量。发酵时采用一定的平行重复(通常为3个)。 

此后，采用Novozymes专利的酶活评价方法(Novozymes专利公开号：CN 101629204)，即筛选每种构建体转化子30个，发酵评估产酶的转化子和选择酶活最高个体；或者筛选40个转化子，选择发酵评估酶活最高的3个转化体比较。将选择比较的转化子菌株统一接种量和发酵条件(同时做3个平行样)，通过酶活平均值以及酶活最高值，判定优化效果。 

经过摇瓶发酵筛选和酶活测定结果如图10和表2所示。 

原始rml基因转化3.795宿主对应的3株酶活最高的转化子分别为5-1、5-5、5-24，3个转化子在发酵第6天酶活达到最高，酶活分别为550.00、516.67、450.00U/ml； 

优化基因rsyn转化3.795宿主对应的3株酶活最高的转化子分别为s6-4、s6-12、s7-6，3个转化子在发酵第8天酶活达到最高，酶活分别为716.67、800.00、850.00U/ml，优化基因rsyn对应的3株转化子酶活平均值为788.89U/ml，较原始rml基因对应的3株转化子酶活平均值505.56U/ml提高了56.04％；优化基因rsyn对应的酶活最高的转化子s7-6酶活为850.00U/ml，较原始rml基因对应的酶活最高转化子5-1的酶活550.00U/ml提高了54.55％。因此，根据黑曲霉糖化酶密码子优化的rml优化基因序列rsyn能够有效提高黑曲霉异源表达系统表达RML的水平。 

优化基因rco转化3.795宿主对应的3株酶活最高的转化子分别为3-37、3-43、3-46，3个转化子在发酵第7天酶活达到最高，酶活分别为833.33、913.33、966.67U/ml，优化基因rco对应的3株转化子酶活平均值为904.44U/ml，较原始rml基因对应的3株转化子酶活平均值505.56U/ml提高了78.90％；优化基因rco对应的酶活最高的转化子3-43酶活为966.67U/ml，较原始rml基因对应的酶活最高转化子5-1的酶活550.00U/ml提高了75.76％。因此，根据黑曲霉糖化酶密码子优化的rml优化 基因序列rco能够有效提高黑曲霉异源表达系统表达RML的水平。 

原始rml基因转化ANW02宿主对应的3株酶活最高的转化子分别为g5-7、g5-13、g5-19，3个转化子在发酵第6天酶活达到最高，酶活分别为626.67、500.00、506.67U/ml，酶活平均值为544.44U/ml，较rml基因转化3.795宿主对应的3株转化子酶活平均值505.56U/ml略有提高，但是效果不明显；rml基因转化ANW02宿主对应的酶活最高的转化子g5-7酶活为626.67U/ml，较原始rml基因对应的酶活最高转化子5-1的酶活550.00U/ml提高了13.94％，效果不明显。 

优化基因rco转化ANW02宿主对应的3株酶活最高的转化子分别为g3-3、g3-21、g3-24，3个转化子在发酵第8天酶活达到最高，酶活分别为1753.33、2373.33、2240.00U/ml，优化基因rco转化ANW02宿主对应的3株转化子酶活平均值为2122.22U/ml，较原始rml基因转化3.795宿主对应的3株转化子酶活平均值505.56U/ml提高了319.78％；rco转化ANW02宿主对应的酶活最高的转化子g3-21酶活为2373.33U/ml，较原始rml基因对应的酶活最高转化子5-1的酶活550.00U/ml提高了331.52％。无论是单株转化子的活性最高值，还是3株活性最高的转化子平均值，优化基因rco转化ANW02宿主对应的转化子脂肪酶酶活显著高于优化基因rco转化3.795宿主对应的转化子和rml基因转化ANW02宿主对应的转化子的酶活，并且大于两者之和。因此，根据黑曲霉糖化酶密码子优化的rml优化基因序列rco在糖化酶缺失的黑曲霉宿主中表达，能够有效地提高黑曲霉异源表达RML的水平。相较于单独使用优化基因序列rco和在糖化酶缺失的黑曲霉宿主中表达rml，结合以上两个因素能够显著性提高RML在黑曲霉中表达水平，二者具有协同增效的效果。 

表2不同优化策略产RML黑曲霉转化子酶活比较 

Claims (12)

1.编码米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶的优化基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。

2.包含权利要求1的基因的表达载体。

3.黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其包含权利要求1的基因或权利要求2的载体。

4.权利要求3的菌株，其中所述黑曲霉菌株缺失糖化酶。

5.生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其包括在黑曲霉中表达权利要求1的基因或权利要求2的载体。

6.权利要求5的方法，其中所述黑曲霉缺失糖化酶。

7.权利要求3或4的菌株在生产米黑根毛霉脂肪酶中的用途。

8.编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因，其序列如SEQ ID NO：3所示。

9.包含权利要求8的基因的表达载体。

10.黑曲霉菌株，其包含权利要求8的基因或权利要求9的载体。

11.生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其包括在黑曲霉中表达权利要求8的基因或权利要求9的载体。

12.权利要求10的菌株在生产米黑根毛霉脂肪酶中的用途。

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