CN113930409A - 米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括如下步骤：种子培养：将米曲霉的孢子悬液接种于种子培养基中，在温度为26～30℃、转速为100～200rpm的条件下培养，得到种子液；发酵培养：将所述种子液接种于发酵培养基中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。采用本申请的方法可以控制菌形，在氮源补料和转速控制的条件下得到了稳定的发酵体系，显著提高了发酵的有效体积，实现RML产量和酶活的提高。

Description

米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法

技术领域

本申请涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法。

背景技术

米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase，RML)是一种典型的界面酶，在非水相环境中能催化酯合成、酯交换、酯水解、醇解等反应，广泛应用于食品加工、医药、洗涤剂等行业。野生型Rhizomucor miehei菌株产米黑根毛霉脂肪酶(RML)能力低下，而且酶液成分不稳定，难以满足米黑根毛霉脂肪酶(RML)的工业应用。有的研究者们借助基因工程技术在其他菌株中构建RML的异源表达系统，主要包括毕赤酵母、米曲霉等。虽然利用毕赤酵母作为宿主生产RML已经有较多报道，而且其表达酶活也较高，但是受限于食品安全的条件，难以得到广泛的工业应用。米曲霉作为GRAS菌株，能够成功外源表达RML，但是其酶活很低完全无法满足商业化生产的需求。因此，如何通过米曲霉高效生产RML成为研究人员和生产企业的关注焦点。

丝状真菌液体培养往往伴随着菌体形态的变化，显著影响发酵液流变、传质及混合特性，进而对产物合成产生巨大影响。通常来说，丝状真菌的形态可以分为分散菌丝(Dispersed mycelia)、聚集成簇(Clumps)、结球成团(Dense pellets)三种类型。对于不同的丝状真菌发酵最终产物，其最佳菌体形态会明显不同。在黑曲霉发酵生产糖化酶(Glucoamylase)过程中，菌球被认为是最优的过程形态。相比之下，对于黑曲霉生产柠檬酸来说，菌丝则认为是较为合适的过程形态。米曲霉生产RML过程是一个复杂的发酵体系，常常因为菌丝生长过于旺盛，造成发酵罐黏壁、发酵液上方结团成网等问题，一方面形成不均一发酵环境，影响发酵液传质、混合等特性，而且容易产生逃液等现象，造成发酵提前结束；另一方面极大程度减少发酵液有效体积，从而降低生产效率。

因此，亟待提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，获得适合RML生产的菌体形态，提高了米黑根毛霉脂肪酶的生产效率。

发明内容

本申请为了克服现有技术的不足，提供了一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶(RML)的方法，可以提高米曲霉生产米黑根毛霉脂肪酶的效率。

本申请提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括如下步骤：

种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.5％～0.8％％的接种量接种于种子培养基中，在温度为26～30℃、转速为100～200rpm的条件下培养，得到种子液；

发酵培养：将所述种子液按照8～12％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述种子培养的培养时间为26～30h。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括如下步骤：

种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.6％的接种量接种于种子培养基中，在温度为28℃、转速为150rpm的条件下培养28h，得到种子液；

发酵培养：将所述种子液按照10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述孢子悬液的孢子浓度为(1～5)×10⁵个/mL。优选地，所述孢子悬液的孢子浓度为3×10⁵个/mL。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述发酵培养的时间可以为144h。

可选的，在本申请的一些实施例中，在所述发酵的过程中，转速随发酵时间变化，具体为：0～12h：300rpm；12～24h：325rpm；24～36h：350rpm；36～72h：375rpm；72～96h：450rpm；96～120h：550rpm；120～144h：600rpm。

可选的，在本申请的一些实施例中，在所述发酵培养的过程中，当发酵体系的摄氧率(OUR)降低至5.0mmol/L/h时开始进行氮源的补料。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述补料的具体方法为：将剩余的氮源平均分9次进行补料。具体地，氮源的补料可以分别在下列发酵时间进行：18h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h，例如每次补料150mL。

可选的，在本申请的一些实施例中，在所述发酵培养的过程中，在温度为28℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力维持在0.03～0.04MPa，标定DO电极(溶氧电极)满度。发酵过程中，通过尾气过程质谱仪并采用Biostar软件进行在线参数采集及分析尾气，并计算摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述种子培养基包括玉米糊精、玉米浆干粉、酵母粉、泡敌粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述种子培养基包括：玉米糊精20g/L、玉米浆干粉10g/L、酵母粉10g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.244g/L、MgSO₄·7H₂O0.249g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 6g/L。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述发酵培养基包括玉米糊精、氮源、泡敌粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O；所述氮源包括大豆蛋白胨、酵母粉。

可选的，在本申请的一些实施例中，所述发酵培养基(g/L)：玉米糊精50g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母粉4g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.12g/L、MgSO₄·7H₂O 0.227g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 5.33g/L。

本申请中，所述米曲霉为米曲霉A.oryzae NCBIO，由国家生化工程技术研究中心(上海)保藏。

本申请的有益效果在于：

本申请的方法可以获得高产量的RML，并且采样本申请的发酵方法可以控制菌形，在氮源补料和转速控制的条件下，得到了稳定的发酵体系，显著提高了发酵的有效体积，实现了RML的产量和酶活的提高。

具体地，根据实施例可知，当孢子浓度为3×10⁵个/mL时，发酵所得的RML酶活最高。10％初始氮源浓度的条件能够从发酵初始阶段就维持菌体形成菌球状态，从而很好地解决现有技术中的问题，实现稳定的发酵过程至正常结束。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请试验例1提供的不同孢子浓度下培养得到米曲霉的菌体形态图；

图2是本申请试验例1提供的不同浓度孢子摇瓶发酵5天得到的菌丝形态的比较图；

图3是本申请试验例1提供的不同转速的体积氧传递系数；

图4是本申请试验例1提供的两种不同孢子浓度条件发酵的蛋白(protein)含量、酶活(Enzymatic activity)、比酶活(Specific enzyme activity)的对比图；

图5是本申请试验例2提供的不同初始氮源浓度的菌丝形态图；

图6A是本申请试验例2提供的不同初始氮源发酵的菌体干细胞重量(DCW)的对比图；

图6B是本申请试验例2提供的不同初始氮源发酵的酶活性的对比图；

图6C是本申请试验例2提供的不同初始氮源发酵的蛋白质的对比图；

图6D是本申请试验例2提供的不同初始氮源发酵的摄氧率(OUR)的对比图；

图7A是本申请试验例3提供的不同转速发酵过程的酶活性的对比图；

图7B是本申请试验例3提供的不同转速发酵过程的蛋白质的对比图；

图7C是本申请试验例3提供的不同转速发酵过程的菌体干细胞重量(DCW)的对比图；

图7D是本申请试验例3提供的不同转速发酵过程的摄氧率(OUR)的对比图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

本申请实施例提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法。以下分别进行详细说明。

在对现有技术的研究和实践过程中，本申请的发明人发现，一般来说，丝状真菌发酵过程中可以通过物理手段及生理手段来控制菌体的形态，前者包括搅拌转速、反应器结构设计等，而后者则通常可以通过孢子浓度、氮源类型及浓度、添加微粒等来实现。本研究以米曲霉发酵生产RML过程中菌体形态调控为指导，首先在摇瓶水平研究了不同孢子浓度对米曲霉形态变化和RML生产的影响，其次在5L发酵罐中优化了初始氮源浓度和转速控制策略以获得适合RML生产的菌体形态。

本申请实施例提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括：种子培养的步骤；及发酵培养的步骤。

具体地，所述种子培养的步骤包括：将米曲霉的孢子悬液按照0.6％的接种量接种于种子培养基中，在温度为28℃、转速为150rpm的条件下培养28h，得到种子液。进一步地，所述孢子悬液的孢子浓度为(1～5)×10⁵个/mL。优选地，所述孢子悬液的孢子浓度为3×10⁵个/mL。

进一步地，所述种子培养基包括玉米糊精、玉米浆干粉、酵母粉、泡敌粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O。更进一步地，所述种子培养基包括：玉米糊精20g/L、玉米浆干粉10g/L、酵母粉10g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄1.244g/L、MgSO₄·7H₂O 0.249g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 6g/L。

具体地，所述发酵培养的步骤包括：将所述种子液按照10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶(RML)。例如所述发酵培养的时间可以为144h。

进一步地，所述发酵培养基包括玉米糊精、大豆蛋白胨、酵母粉、泡敌粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O。更进一步地，所述发酵培养基包括：玉米糊精50g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母粉4g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄1.12g/L、MgSO₄·7H₂O 0.227g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 5.33g/L。

进一步地，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。更进一步地，在所述发酵培养的过程中，当发酵体系的摄氧率(OUR)降低至5.0mmol/L/h时，可以开始进行氮源的补料。所述补料的具体方法可以为：以OUR为参考，将剩余的氮源平均分9次进行补料。进一步地，氮源的补料可以分别在下列发酵时间进行：18h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h，例如每次补料150mL。

进一步地，在所述发酵的过程中，可根据发酵时间来调整搅拌转速。例如，在一实施例中，0～12h的转速为300rpm；12～24h的转速为325rpm；24～36h的转速为350rpm；36～72h的转速为375rpm；72～96的转速为450rpm；96～120h的转速为550rpm；120～144h的转速为600rpm。本申请的发酵工艺减缓了发酵中期转速的提高，并加快了发酵末期转速的提高；进一步地，当转速提升至600rpm后便可以不再提升。

在一实施例中，所述发酵培养的过程中，在温度为28℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力维持在0.03～0.04MPa，并标定DO电极(溶氧电极)满度。并且，可通过尾气过程质谱仪并采用Biostar软件进行在线参数采集及分析反应的尾气，并计算摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)。

本申请实施例中，在所述发酵培养的过程中，可以每隔24小时进行取样，测定RML酶活、蛋白质、干重等离线参数。

下列列举本申请中的酶活、蛋白含量、菌体干重、菌形观察、发酵罐有效体积的参数的测定方法。

①酶活的测定：

采用对硝基苯酚比色法检测脂肪酶酶活：将p-NPP溶液和底物缓冲液按照1：9比例(v/v)混合，每支试管中分别加入混合液2.4mL，37℃预热3min，其中样品试管分别加入100μL稀释后的发酵上清液，对照试管中加入100μL经煮沸变性的(100℃，5min)样品溶液作为对照，每组重复三次。震荡摇匀，37℃水浴反应15min，立即加入95％乙醇2mL终止反应，4000r/min离心5min。分别测定样品和对照组在410nm处的吸光度。

②蛋白含量的测定：

采用考马斯亮蓝法检测发酵液中蛋白含量：样品试管中加入0.1mL稀释后的发酵上清液，对照试管中加入0.1mL蒸馏水，分别加入5mL考马斯亮蓝染料试剂，混合均匀后室温静置5min，重新混匀后在595nm处测吸光度。

③菌体干重的测定：

准确量取发酵液50mL，用布氏漏斗加滤纸(20μm，提前烘至恒重并称重)进行真空抽滤，并用蒸馏水反复冲洗3次，抽至滤饼无水滴滴下为止，将湿滤饼放置于80℃烘箱烘至恒重并称重，计算菌体干细胞重量(DCW)。

④菌形观察：

采用琼脂糖固定法观察菌形并稍作修改，将1mL菌悬液以固定剂(40％(V/V)甲醛与60％(V/V)乙醇组成)固定后，用无菌水稀释，然后平铺于平皿中，在环形日光灯下以平皿直径为基准进行统一大小拍照，然后用Image-pro-plus进行图像处理，计算菌球的平均直径及菌球浓度(即每1mL发酵液中所含菌球个数)。

⑤总酶活的计算：

总酶活(U)＝单位酶活(U/mL)×有效体积(L)

有效体积指的是发酵结束时发酵液中可流动部分发酵液的体积。

本申请的所有数据均为三次实验的平均值±标准偏差。

本申请先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

本实施例提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括步骤：

种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.6％的接种量接种于种子培养基中，在温度为28℃、转速为150rpm的条件下培养28h，得到种子液；其中，所述孢子悬液的孢子浓度为2×10⁵个/mL；

发酵培养：将所述种子液按照10％的接种量接种于发酵培养基中，设置培养温度为28℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力维持在0.03～0.04MPa，标定DO电极(溶氧电极)满度，发酵；发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶。

本实施例中，在所述发酵的过程中，转速随发酵时间而调整，具体为：0～12h：300rpm；12～24h：325rpm；24～36h：350rpm；36～72h：375rpm；72～96h：450rpm；96～120h：550rpm；120～144h：600rpm。

本实施例中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的12％，在后续的发酵过程中，对氮源(大豆蛋白胨和酵母粉)进行补料。具体地，当发酵体系的摄氧率(OUR)降低至5.0mmol/L/h时，则可以开始进行氮源的补料。

本实施例中，发酵过程中尾气通过尾气过程质谱仪并采用Biostar软件进行在线参数采集及分析，并计算摄氧率(OUR)和二氧化碳释放率(CER)。此外，在发酵过程中，可每隔24h取样，测定RML酶活、蛋白质、干重等离线参数。

所述种子培养基包括：玉米糊精20g/L、玉米浆干粉10g/L、酵母粉10g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.244g/L、MgSO₄·7H₂O 0.249g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 6g/L。

所述发酵培养基包括：玉米糊精50g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母粉4g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.12g/L、MgSO₄·7H₂O 0.227g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 5.33g/L。

实施例2

本实施例提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括步骤：

种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.6％的接种量接种于种子培养基中，在温度为28℃、转速为150rpm的条件下培养28h，得到种子液；其中，所述孢子悬液的孢子浓度为4×10⁵个/mL；

发酵培养：将所述种子液按照10％的接种量接种于发酵培养基中，设置培养温度为28℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力维持在0.03～0.04MPa，标定DO电极(溶氧电极)满度，发酵；发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶。

本实施例中，在所述发酵的过程中，转速随发酵时间而调整，具体为：0～12h：300rpm；12～24h：325rpm；24～36h：350rpm；36～72h：375rpm；72～96h：450rpm；96～120h：550rpm；120～144h：600rpm，直至发酵结束。

本实施例中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的15％，在后续的发酵过程中，对氮源(大豆蛋白胨和酵母粉)进行补料。具体地，当发酵体系的摄氧率(OUR)降低至5.0mmol/L/h时，则可以开始进行氮源的补料。

本实施例中，发酵过程中尾气通过尾气过程质谱仪并采用Biostar软件进行在线参数采集及分析，并计算摄氧率(OUR)和二氧化碳释放率(CER)。此外，在发酵过程中，可每隔24h取样，测定RML酶活、蛋白质、干重等离线参数。

所述种子培养基包括：玉米糊精20g/L、玉米浆干粉10g/L、酵母粉10g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.244g/L、MgSO₄·7H₂O 0.249g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 6g/L。

所述发酵培养基包括：玉米糊精50g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母粉4g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.12g/L、MgSO₄·7H₂O 0.227g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 5.33g/L。

实施例3

本实施例提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括如下步骤：

将米曲霉孢子涂布于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基28℃培养2天，挑取生长较好的单个菌落于新的PDA平板中继续培养7天，将长有孢子部分菌落(青绿色)刮取于装有无菌水及玻璃珠的试管中洗脱孢子，无菌漏斗过滤，利用血球计数板进行孢子计数，然后将获得的孢子悬液用无菌水稀释至所需的孢子浓度，4℃冰箱保存备用。

无菌条件下，取300μL孢子悬液添加至具有种子培养液的种子摇瓶中，摇瓶的装液量为20％，在温度为28℃、转速为150rpm的条件下培养28h，得到种子液。所述孢子悬液的孢子浓度为3×10⁵个/mL。

向5L发酵罐中加入适量水，进行空消(121℃、30min)；称取除玉米糊精外的发酵培养基组分于烧杯中，加水溶解，后倒入罐中，补水至2.0L；插入pH电极和DO电极并标定，气密性检验合格后进行实消(121℃、30min)；冷却后补入灭菌后的玉米糊精溶液(115℃、15min)；将所述种子液按照10％的接种量接种于5L发酵罐中，设置培养温度为28℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力维持在0.03～0.04MPa，标定DO电极(溶氧电极)满度；发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶。发酵过程中尾气通过尾气过程质谱仪并采用Biostar软件进行在线参数采集及分析，计算OUR、CER。每隔24h取样，测定RML酶活、蛋白质、干重等离线参数。

本实施例中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10％，在后续的发酵过程中，当发酵体系的摄氧率(OUR)降低至5.0mmol/L/h时，则可以开始进行氮源(大豆蛋白胨和酵母粉)的补料。

所述种子培养基包括：玉米糊精20g/L、玉米浆干粉10g/L、酵母粉10g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.244g/L、MgSO₄·7H₂O 0.249g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 6g/L。

所述发酵培养基包括：玉米糊精50g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母粉4g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄ 1.12g/L、MgSO₄·7H₂O 0.227g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 5.33g/L。

试验例1探究孢子浓度对米曲霉菌形及RML生产的影响

①为探究孢子浓度对米曲霉菌形的影响。具体地，将孢子悬液经过计数后，以10⁷个/mL孢子浓度作为对照，分别考察了10⁴个/mL、10⁵个/mL、10⁶个/mL孢子浓度在种子培养阶段对米曲霉生长和菌体形态的影响。结果见下表和图1所示。

表1

孢子浓度(个/mL)	残糖(g/L)	DCW(g/L)	纤维形态
				10<sup>4</sup>	19.9±0.3	7.8±0.3	较大的菌球(S1)
10<sup>5</sup>	18.0±0.5	8.8±0.2	放射状菌丝球(S2)
				10<sup>6</sup>	12.6±0.4	13.3±0.2	聚集的菌丝体(S3)
10<sup>7</sup>	10.4±0.2	14.2±0.2	较为分散的菌丝(S4)

根据表1可知，种子培养28h后，DCW随初始孢子浓度的升高而升高，相对应的，残糖浓度则逐渐降低。并且值得注意的是，4种条件下(10⁴个/mL、10⁵个/mL、10⁶个/mL、10⁷个/mL孢子浓度)，米曲霉表现出完全不同的菌体形态，分别为较大的菌球(S1)、放射状菌丝球(S2)、聚集的菌丝体(S3)和较为分散的菌丝(S4)，请参见图1所示。图1米曲霉的菌体形态图，其中，第一行为显微照片在40倍显微镜下拍摄，第二行为宏观照片在圆形日光灯下拍摄。

将上述四种不同孢子浓度培养所得的种子液接种到发酵培养基中进行5天的摇瓶发酵，结果见图2和表2所示。

可以发现虽然在对照10⁷个/mL孢子浓度的条件下，菌体生长最好(DCW最高)，相对应的耗糖也最多，但是其RML酶活不是最高。相比之下，以10⁵个/mL孢子浓度进行发酵其RML酶活最高，达到209.0U/mL，比对照(10⁷个/mL孢子浓度)高了37.8％(见表2)。虽然4种条件下种子的菌体形态差异很大，但是发酵培养5天后均为菌球状态，不过需要指出的是，发酵液中菌球数量和大小仍有显著区别(图2)。随着孢子浓度的增加，菌球浓度逐渐增加，菌球直径逐渐减小；10⁴个/mL孢子浓度条件下，其发酵液菌球浓度仅为22个/mL，菌球直径可以达到3.0mm；而对照条件下，其菌球直径最小为0.5mm、菌球浓度最高为2154个/mL。相比之下，酶活最高条件(10⁵个/mL孢子浓度)的菌球浓度和菌球直径则分别为1495个/mL和0.8mm(表2)。这说明对于米曲霉发酵生产RML来说，存在最适的菌球大小以及最适的菌球浓度以利于RML的生产。

表2

本试验例中的体积氧传递系数见图3所示。根据图3可以发知，通过发酵液流变特性的改变，其体积氧传递系数(KLa)也呈现显著差异。

②为探究孢子浓度对米曲霉发酵生产RML的影响，本试验例分别考察了7×10⁴个/mL、9×10⁴个/mL、3×10⁵个/mL、5×10⁵个/mL、1×10⁵个/mL的孢子浓度对RML发酵生产的影响。结果见表3和图4所示。

表3摇瓶发酵5天后菌丝形态的比较

根据表3中的可以看出，孢子浓度在3×10⁵个/mL、5×10⁵个/mL、1×10⁵个/mL的条件下发酵所得的酶活较高，均高于200U/mL；其中，在3×10⁵个/mL孢子浓度的条件下发酵所得的酶活最高，为217.5U/mL，较1×10⁵个/mL孢子浓度(209.0U/mL)进一步提高了4.1％。

此外，通过菌体形态的分析也可以发现，孢子浓度增加可以获得更多更小的菌球，菌球的数量和直径与孢子浓度密切相关。当孢子浓度为3×10⁵个/mL时，发酵所得的RML酶活最高，此时较为合适的菌球平均直径为0.77mm，菌球浓度为1516个/mL。另一方面，孢子浓度为1×10⁷个/mL发酵后的酶活为151.7U/mL，蛋白(protein)含量为0.79g/L；而当孢子浓度在3×10⁵个/mL时，其RML酶活(Enzymatic activity)达到217.5U/mL，蛋白含量为1.06g/L；两种情况下的RML的比酶活(Specific enzyme activity)并没有显著性差异，均为0.21U/g蛋白左右，可参考图4。

可以发现，3×10⁵个/mL孢子浓度的菌球浓度为1516个/mL，菌球平均直径为0.77mm；而1×10⁷个/mL孢子浓度条件下的菌球浓度为2145个/mL，菌球平均直径为0.5mm。可见，孢子浓度会改变菌体形态，从而影响菌体的代谢环境，合适的孢子浓度的条件下发酵可以增加细胞的整体蛋白合成能力，促进RML的生产。

试验例2发酵培养中的初始氮源浓度的探究

本试验例通过设置三种不同的初始氮源浓度来观察发酵情况，以获得最佳的初始氮源的量。具体地，三种初始氮源的量分别为全部氮源量的10％、20％、50％，剩余氮源则以脉冲形式在发酵过程中间断性补入，观察菌体生长及发酵体系的稳定情况；结果请参见图5和图6所示。图5为菌丝形态图，其中A显示初始氮源为50％的菌丝形态，B显示初始氮源为20％的菌丝形态，C显示发酵结束时初始氮源为10％的菌丝形态。图6A、图6B、图6C和图6D分别为不同初始氮源下菌体干细胞重量(DCW)、酶活性、蛋白质和摄氧率(OUR)的比较图。

以大豆蛋白胨和酵母粉作为氮源，并采用初始氮源和氮源补料方式进行发酵，从发酵过程发酵液状态可以看出，降低了初始氮源后能够一定程度上改变发酵液流变状态。但是，初始氮源为50％和20％条件下仍无法正常发酵至结束(144h)，当其分别培养了72和96h后，会出现大量菌丝结块的固形物，造成有效体积降低和逃液。相比之下，10％的初始氮源的条件能够从发酵初始阶段就维持菌体形成菌球状态，从而很好地解决上述问题，实现稳定的发酵过程至正常结束，参考图5所示。

通过对比三种条件下细胞生长、RML生产和蛋白合成曲线可以发现，降低初始氮源浓度可减缓发酵初期(24h前)菌体的生长(见图6A)，同时RML的生产及蛋白的合成速度也会呈现一定程度的降低(见图6B和图6C)。但是，虽然降低初始氮源浓度会一定程度上降低发酵初期RML及蛋白的合成速率，但在10％条件下进行发酵，发酵结束时，发酵液有效体积可到2.0L，比50％和20％条件下的有效体积增加1倍左右。

此外，通过对比不同初始氮源浓度下OUR的变化曲线可知，由于较高浓度初始氮源条件下进行发酵容易形成菌丝块，降低发酵液流动特性，导致传质速率较差，因此其OUR一直处于较低的水平(参见图6D)。相比之下，10％初始氮源条件因为处于较好的供氧水平，所以发酵结束时所得的酶活最高，可以达到188.7U/mL，同时结合有效体积变化的考虑，10％初始氮源条件的RML总酶活能够达到377466U，而以50％及20％的初始氮源进行发酵其总酶活仅分别为121940U和76890U。

进一步地，对10％初始氮源的条件下不同发酵时间的菌体形态进行分析，结果见表4所示。表4中，Mode1是在原始转速(初始转速为300rpm，每发酵12h提高25rpm，直到提升至500rpm维持至发酵结束)策略下以10％初始氮源进行发酵所得的菌形，Mode2为优化后转速(即0～12h：300rpm；12～24h：325rpm；24～36h：350rpm；36～72h：375rpm；72～96h：450rpm；96～120h：550rpm；120～144h：600rpm)策略下10％初始氮源浓度发酵所得的菌形。

表4不同发酵条件下不同发酵时间下菌丝形态的变化

根据表4可以发现，在整个发酵过程中，菌球平均直径先变大，后又逐渐减小，而菌球浓度先减少而后又逐渐增加,。这可能是由于发酵初期菌体快速生长，菌丝伸长，菌球逐渐变大，而在发酵中后期，由于搅拌转速的增加造成较大的剪切力作用，因此会出现较小的细碎菌球，这可能一方面来源于前期形成的较大空心球在剪切力作用下逐渐被切碎，形成的细碎小球，另一方面由于也可能是较大的剪切力使菌球表面的菌丝被打掉形成了小菌球(PAGibbs et al.,2000)。可以看到，在此发酵条件下(Mode1)，发酵144h后菌球平均直径仍然较大(1.01mm)，菌球浓度也较低(994个/mL)，与前期摇瓶获得的最优菌形结果仍有较大差距。分析发酵过程中菌球的大小变化，发现在发酵48-72h由于菌体快速生长，造成菌球过大，因此可以在发酵中期通过减缓转速提升来抑制菌体的生长，而发酵后期加快转速的提高增加剪切力来获得更小更多的菌球(Mode2)，以期以进一步提高RML酶活。

试验例3转速控制策略的优化

为探究转速的改变对发酵过程中菌的生长以及菌体形态的具体影响，本试验例通过对比两种转速控制条件下细胞生长、RML生产和蛋白合成曲线，可参见图7A、图7B、图7C和图7D所示。

根据图7A、图7B、图7C和图7D可以发现：与Mode1相比，Mode2在发酵中期减缓了转速的提高，菌的生长受到一定程度抑制(DCW较低)，而且此时OUR水平也相对较低，因此其RML及蛋白合成速率也有所降低。发酵后期Mode2随着加快转速的提高，供氧水平更好(OUR更高)，菌体生长表现出比Mode1更好的状态(DCW较高)，而且在发酵后期，Mode2条件下的RML和蛋白合成水平要明显优于Mode1，因此至发酵结束(144h)，Mode2酶活比Mode1提高了22.9％，达到232.0U/ml，而且有效体积也有小幅度增加，使得总酶活较Mode1提高29.1％。另一方面，值得注意的是，Mode2条件在发酵中后期(48h后)能够显著降低菌球的大小，并增加菌球的浓度(表4)。发酵结束时菌球平均直径由1.01mm降低到0.97mm，其菌球浓度也由994增加到1072个/mL。

值得注意的是，菌球直径较大，会导致传质、传氧速度慢，对营养的利用及细胞代谢减慢，产量较低，而菌球直径过小则数量较多，会使发酵液粘度增加，同样不利于营养物质及O₂的传递与利用，从而导致产量的降低。本研究通过孢子浓度的优化找到了米曲霉高效生产RML较为合适的菌球大小及数量范围，并用于指导后续发酵罐中菌体形态的控制。与碳源相比，氮源在发酵过程中不仅能控制菌体生长，某些氮源对脂肪酶等的生产也具有重要意义。

本研究通过初始氮源的调控来调节菌体形态和生长速率，有效解决了发酵罐培养过程中存在的粘壁等难题，显著增加了发酵的有效体积，但是其发酵过程中菌球仍较大，因此结合发酵中后期搅拌速率的优化，进一步通过菌体形态控制提高了RML的产量。不同转速搅拌带来的流体流动与剪切力会显著影响菌体的形态，搅拌转速越大，液体流动速度越快，剪切力越大，更利于形成数量多的小直径菌球。在这里，我们发现通过发酵液流变特性的改变，其体积氧传递系数(K_La)也呈现显著差异(图3)，进而对菌体代谢产生影响。

综上所述，本申请在生产RML过程中，控制孢子浓度为3×10⁵个/mL，能够使得米曲霉菌球直径在0.77mm左右且菌球浓度在1516个/mL左右，实现酶活由151.7U/mL到218.6U/mL的提升。此外，在5L发酵体系中，通过降低初始氮源浓度以及调控过程转速，能够较好地控制发酵过程菌体形态，从而建立稳定的发酵体系，并进一步提高RML酶活至232.0U/mL；更为重要的是，总酶活从98080U提高至487179U。

据发明人所知，本申请是首次在发酵罐中实现米曲霉生产RML的，而且产量也是已知情况中最高的。本申请的米曲霉生产米黑根毛霉脂肪酶(RML)的工艺有望进一步应用到工业RML的生产中，具有很高的经济价值。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上对本申请实施例所提供的一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.5％～0.8％％的接种量接种于种子培养基中，在温度为26～30℃、转速为100～200rpm的条件下培养，得到种子液；

发酵培养：将所述种子液按照8～12％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。

2.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述孢子悬液的孢子浓度为(1～5)×10⁵个/mL；和/或

所述发酵培养的时间为144h。

3.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，在所述发酵的过程中，转速随发酵时间变化，具体为：

0～12h：300rpm；12～24h：325rpm；24～36h：350rpm；36～72h：375rpm；72～96h：450rpm；96～120h：550rpm；120～144h：600rpm。

4.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，在所述发酵培养的过程中，当发酵体系的摄氧率降低至5.0mmol/L/h时开始进行氮源的补料。

5.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述补料的具体方法为：将剩余的氮源平均分9次进行补料；和/或

在所述发酵培养的过程中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力维持在0.03～0.04MPa，标定溶氧电极满度。

6.根据权利要求5所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述发酵过程中还包括在线检测发酵参数的步骤，具体如下：通过尾气过程质谱仪并采用Biostar软件进行在线参数采集及分析尾气，并计算摄氧率和二氧化碳释放率。

7.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述种子培养基包括玉米糊精、玉米浆干粉、酵母粉、泡敌粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O；和/或

所述种子培养基包括：玉米糊精、玉米浆干粉、酵母粉、泡敌粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O。

8.根据权利要求1或4所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括玉米糊精、氮源、泡敌粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O；所述氮源包括大豆蛋白胨、酵母粉。

9.根据权利要求8所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基(g/L)：玉米糊精50g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母粉4g/L、泡敌粉1g/L、KH₂PO₄1.12g/L、MgSO₄·7H₂O 0.227g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 5.33g/L。

10.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述米曲霉为米曲霉A.oryzae NCBIO，由国家生化工程技术研究中心(上海)保藏。

Images