CN102933714B - 用于同步糖化和发酵以生产乙醇的方法 - Google Patents

用于同步糖化和发酵以生产乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了使用发酵单胞菌属作为产乙醇生物从生物质中生产高浓度乙醇的方法。在用于生产高浓度乙醇的同步糖化和发酵反应期间，使发酵单胞菌属在低叶轮搅拌、糖化?发酵混合物中的不溶性固体的高浓度条件下生长。

Description

用于同步糖化和发酵以生产乙醇的方法
本申请要求于2009年12月23日提交的美国临时专利申请61/289749的优先权。
发明领域
本发明涉及用于由纤维素生物质生产乙醇的方法。具体地讲，在用于生产高浓度乙醇的特定同步糖化和发酵方法条件下来使用发酵单胞菌属(Zymomonas)。
发明背景
由可再生资源生产燃料乙醇是针对全球的化石燃料短缺、能源成本增加、以及与大气二氧化碳含量提高相关的全球变暖效应的一种长期解决方案。来自可再生资源的燃料乙醇通过糖发酵来生产。目前在美国来源于玉米粒的葡萄糖是用于乙醇生产的最丰富的糖来源。由于对作为饲料和食品供应的玉米粒的需求，正在研发将多种类型的纤维素生物质(包括半纤维素)转化成可发酵糖的方法。来源于这种生物质来源的糖是己糖和戊糖的混合物，主要是葡萄糖和木糖。作为开发纤维素生物质加工方法的结果，可释放高浓度的这些糖并将其用于高浓度发酵以产生乙醇，同时减少水消耗并具有较高的生产能力。同样地，将生物质转化成乙醇通过向化石燃料提供潜在地经济上可行的替代方案，提出了对于改善环境影响的极大可能性。
将纤维素生物质转化成乙醇的典型方法包括三个步骤；化学和/或物理处理生物质以降低生物质的木质素含量并制备酶水解可利用的多糖；糖化或消化或水解，其中将多糖酶促转化成可发酵糖；以及发酵，其中通过用于产生乙醇的产乙醇生物(ethanologen)消耗可发酵糖。在一些情况下，取决于条件和产乙醇生物的性质，组合糖化和发酵步骤可能是能量上最高效的。需要优化这些步骤中的每一步以生产高浓度乙醇。
产乙醇生物通常为酵母(例如糖酵母属(Saccharomyce))或细菌(例如发酵单胞菌属)。发酵单胞菌属适用于乙醇生产，因为它一般生命力强，在相对高的葡萄糖浓度下生长良好，并且能够经工程化以利用C5糖例如木糖和阿拉伯糖(常见的糖化产物)产生乙醇。然而，发酵单胞菌属的有效利用需要改善使用发酵单胞菌属作为产乙醇生物的方法。
发酵单胞菌属作为产乙醇生物的用途是已知的(Saddler等人，Can.J.Microbiol.(1982)，28(12)，1311-19：Golias等人，J.Biotechnol.，(2002年6月26日)(96)2，第155168页；Ma等人，Renewable Energy(2009)34：1466-1470)，然而发酵单胞菌属对由多种生物质预处理方法产生的高浓度乙酸敏感。可通过例如洗涤经预处理的生物质的方法降低乙酸水平(Teixeira等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，(Spring，2000)第84-86卷，第111-127页)。
在同步糖化和发酵中利用木糖的发酵单胞菌属的用途也是已知的，其中所述生物质用氢氧化钠处理，随后用过乙酸处理并洗涤(Teixeira等人，同上)。Eklund等人(Enzyme and Microbial Technology(1995)，17(3)，255-9)展示了使用发酵单胞菌属作为产乙醇生物的同步糖化和发酵，其中所述生物质用蒸汽和二氧化硫进行预处理并洗涤，然后发酵在烧瓶和发酵罐中以约10％的总不溶性固体浓度进行，同时进行一定地搅拌，其中所述乙醇产量为约28g/L。
此外，McMillan等人(Appl.Biochem.Biotechnol.(1999)Vol.77-79：649-665)展示了发酵单胞菌属在同步糖化和发酵方法中的用途，其中所述发酵单胞菌属菌株经改造以适用于杨树水解产物，所述生物质用稀酸预处理，然后用MTBE萃取，糖化酶为纤维素酶，并且其中发酵在发酵罐中以11.5％的不溶性固体浓度和150RPM的搅拌速度进行。使用这种方法，作者能够获得约35g/L的乙醇产量。
上述方法说明发酵单胞菌属可用于用来生产乙醇的同步糖化和发酵方法中。然而，使用这些方法的乙醇产量低并且清楚的是所述方法需要进行优化以影响商业数量的乙醇产量。
发明概述
通过确定允许在糖化和发酵混合物中使用的高输入不溶性固体含量并维持原核产乙醇生物生产以便获得高乙醇产量，本发明的方法寻求解决优化原核产乙醇生物在同步糖化和发酵(SSF)方法中的使用的问题。使用本发明方法的乙醇产量可超过60g/L。
因此本发明提供了用于生产乙醇的方法，包括：
a)提供包含不溶性固体和多糖的经预处理的生物质；
b)提供至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；
c)提供原核产乙醇生物；
d)在包括搅拌装置的生物反应器中制备糖化-发酵混合物，其包含a)的经预处理的生物质、b)的糖化酶、和c)的原核产乙醇生物；以及
e)在所述糖化-发酵混合物中使所述原核产乙醇生物生长，其中在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约16％，并且其中所述原核产乙醇生物产生乙醇。在本发明的一个方面，本发明的所述搅拌装置提供不超过约0.2瓦特/kg总糖化-发酵混合物的功率。
在另一方面，本发明提供了用于生产乙醇的方法，包括：
a)提供粒度等于或小于约100μm或粒度等于或大于约600μm的经预处理的生物质，所述经预处理的生物质包含不溶性固体和多糖；
b)提供至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；
c)提供原核产乙醇生物；
d)在包括搅拌装置的生物反应器中制备糖化-发酵混合物，其包含a)的经预处理的生物质、b)的糖化酶、和c)的原核产乙醇生物；以及
e)在所述糖化-发酵混合物中使所述原核产乙醇生物生长，其中：
1)在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约16％；并且
2)其中所述原核产乙醇生物产生乙醇。
在另一方面，本发明提供糖化-发酵体系，包括：
a)包含不溶性固体和多糖的经预处理的生物质；
b)至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；和
c)原核产乙醇生物；
其中(a)的生物质、(b)的酶、和(c)的产乙醇生物在糖化-发酵混合物中混合，所述混合物具有基于每升干重计至少约16重量％的总输入不溶性固体浓度。
附图简述、生物保藏和序列描述
申请人已经按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款进行了以下生物保藏：
保藏菌株信息
图1为显示了固体载量和搅拌RPM对SSF的效应的图，所述SSF使用重组发酵单胞菌属和稀氨预处理过的玉米芯，其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖。
图2为显示了在SSF条件下RPM和固体载量对重组运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)活力的效应的图，所述SSF使用稀氨预处理过的玉米芯，其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木糖。
图3A和B为显示了不同粒度对使用重组运动发酵单胞菌进行的发酵的效应的图，所述发酵在25％的固体载量中使用具有不同粒度的Ballotini玻璃小珠。A和B是使用不同粒度范围的不同实验。
图4为显示了来自1L SSF级别的乙醇、木糖和葡萄糖浓度的图，其具有两个Rushton 6叶片叶轮(直径45mm)，转速为100RPM。
图5为显示了来自1L SSF级别的乙醇、木糖和葡萄糖浓度的图，其具有两个船用式6叶片叶轮(直径45mm)，转速为150RPM。
图6为显示了在SSF运行中的乙醇产量的图，该运行具有初始的25重量％的生物质加入量并在250或750RPM下搅拌(A)；或者分开加入生物质并在80或250RPM下搅拌(B)。
图7A为显示了SSF运行中的搅拌速率(Njs)的图，该运行具有22.5％的固体，使用菌株AR3 7-31和两个不同的载入酶。图7B是在相同SSF运行中的乙醇产量图。
图8为显示了在使用玉米秸秆水解产物和两个不同载入酶的SSF运行中的乙醇产量的图。
图9为显示了在SSF运行样品中的葡萄糖、木糖和乙醇浓度的图，该运行样品使用酵母、大肠杆菌、或运动发酵单胞菌作为生物催化剂。
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)，并且行政指导的208节和附录C相一致)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的规定。
SEQ ID NO：1是Fv43D的氨基酸序列，其包括对应于位点1至20的预测信号序列。
SEQ ID NO：2是未成熟的Fv3A的序列，其包括对应于位点1至23的预测信号序列。
SEQ ID NO：3是未成熟的Fv51A的序列，其包括对应于位点1至19的预测信号序列。
SEQ ID NO：4是未成熟的Xyn3的序列，其包括对应于位点1至16的预测信号序列。
SEQ ID NO：5是里氏木霉(T.reesei)β-葡糖苷酶Bgl1的氨基酸序列。
发明详述
本发明涉及原核产乙醇生物例如发酵单胞菌属在用于由纤维素生物质生产乙醇的同步糖化和发酵(SSF)方法或混合糖化和发酵(HSF)方法中的通途。由可再生资源生产用作燃料添加剂的乙醇将解决化石燃料短缺问题、降低能耗并影响全球变暖。SSF或HSF方法在乙醇生产中是优选的，因为它们提高从原料纤维素生物质到乙醇的转化过程中的总体效率。
以下定义和缩写用于权利要求和说明书的解释。
除非另外指明，本文引用的所有美国专利公开和美国专利公开申请全文以引用方式并入本文。此外，当数量、浓度或其它数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，它应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而无论所述范围是否被单独地公开。当本文描述数值范围时，除非另外指明，所述范围旨在包括其端点，以及所述范围内的所有整数和分数。当定义范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。
如本文所用，在本发明的元件或组分之前的词语“一个”、“一种”旨在表明元件或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或更多种其它特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由…组成”和“由…组成”涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由…组成”旨在包括由术语“由…组成”涵盖的实施方案。
如本文所用，术语“约”指本发明的成分或反应物的数量变化，或用于指数值数量的变化，它们可能发生在，例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还包括由于相对于由特定起始混合物所得组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
术语“产乙醇生物”指通过代谢碳水化合物原料而生产乙醇的生物。
术语“同步糖化和发酵(SSF)”指生物质被糖化并且同时糖化产生的可发酵糖通过生物催化剂被用于产生某种产物的方法，其通常在相同反应容器中进行。
术语“混合糖化和发酵(HSF)”指生物质被糖化至有限程度(不完全或部分糖化)，随后继续糖化和发酵同时进行的方法。
术语“可发酵糖”指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。
术语“部分糖化”指生物质的有限糖化，其中释放的可发酵糖少于如果糖化完全的话将释放的总可发酵糖。
术语“纤维质”指包含纤维素和包括半纤维素和木质素在内的附加组分的组合物。
术语“糖化”指由多糖产生可发酵糖。
术语“预处理的生物质”是指在糖化之前已经经过预处理的生物质。
“生物质”指任何纤维质的或木质纤维质的材料并包括包含纤维素的，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包含附加组分例如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于：生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余例如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱，得自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。
“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。也可在糖化前经预处理的生物质。
术语“糖化酶”指能够催化生物质组分转化成可发酵糖的酶。如果生物质为预处理的，所述酶通常更有效。
术语“不溶性固体”指不溶于溶液的固体。
术语“总输入不溶性固体”指在糖化-发酵混合物中包括的生物质不溶性固体的总干重。当将生物质以多个部分加入时，每部分不溶性固体的干重相加得到总输入不溶性固体。在糖化-发酵混合物中的不溶性固体的浓度用基于每升干重计的％表示，是指每升总糖化-发酵混合物的干重克数，因此例如基于每升干重计16％指每升总糖化-发酵混合物干重为160克。
术语“搅拌装置”指可通过其施用功率于混合物以混合该混合物组分的机构。通常有一个旋转运动的机构通过搅拌装置进行混合。
除非另外特别说明，当本文提供数值范围时，应理解它涵盖范围的端点。应理解，数值具有由有效数字位数提供的精度。例如，应将数值1理解为涵盖0.5至1.4的范围，而应将数值1.0理解为涵盖0.95至1.04的范围，包括所述范围的端值。
本发明涉及在SSF方法中使用发酵单胞菌属菌株来生产乙醇的方法。所述方法如下进行：在至少一种糖化酶的存在下，在低速搅拌能量条件下预处理纤维素生物质并在糖化-发酵混合物中包括高浓度不溶性固体，所述糖化-发酵混合物包含发酵单胞菌属产乙醇生物。所得方法可产生超过60g/L的乙醇。
预处理过的生物质
本发明方法的生物质可通过任何方法来预处理，所述方法使生物质在糖化期间有效释放可发酵糖。预处理是本领域熟知的并且包括例如用酸性或碱性化学制品处理和/或机械处理以减小尺寸。预处理的生物质包含不溶性固体、多糖(其通常是不溶性固体的一部分)和其它组分，所述其它组分包括一些抑制发酵单胞菌属生长和乙醇生产的组分。期望在本发明方法中使用的经预处理的生物质具有足够低的发酵抑制剂含量以使在包含经预处理的生物质的糖化-发酵混合物中原核产乙醇生物如发酵单胞菌属的生长和生产最大化。
例如，乙酸是经预处理的生物质的组分，它抑制发酵单胞菌属。可通过洗涤经预处理的生物质来降低经预处理的生物质中的乙酸含量以除去乙酸和其它抑制剂。作为另外一种选择，特定的预处理可导致乙酸含量与发酵单胞菌属生长和生产相容。在预处理中使用氨可导致经预处理的生物质中的抑制剂例如乙酸的含量降低。申请人已经发现氨处理的生物质可具有大于约1的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60％，例如大于约65％，或大于约70％的乙酰基转化率。因此由于抑制剂浓度降低，过滤和洗涤步骤不是获得改善的糖收率所必需的，并且因为与这些步骤相关联的成本可对所述方法的经济性产生不利影响，优选地不进行生物质的过滤和洗涤。
因此在本发明方法中优选使用氨预处理的生物质。按照在共有的美国专利公开7,781,191中公开的预处理方法，优选地使用相对于生物质干重小于约12重量％的氨浓度。
此外，不同的发酵单胞菌属或其它产乙醇生物菌株可具有对经预处理的生物质中存在的乙酸和/或其它抑制剂的不同耐受性水平。发酵单胞菌属菌株可对例如4-5g/L的乙酸水平敏感。此外，可制备具有改善的乙酸耐受性的发酵单胞菌属菌株，例如通过在共有的和共同未决的美国专利申请公布US 2009-0203099A1中公开的基因工程制备上述菌株。此外，可通过适应包含乙酸的培养基获得改善的乙酸耐受性，这公开于共有的和共同未决的美国专利申请12/641642中，该专利申请以WO2010/075241公布，其以引用方式并入本文。使用该公开适应方法制备的发酵单胞菌属菌株对至少约9-10g/L的乙酸具有合适的耐受性。为了最大化发酵单胞菌属的生长和乙醇产量，在包含糖化-发酵混合物的经预处理的生物质中的乙酸水平与用于乙醇生产的发酵单胞菌属菌株的乙酸耐受性水平之间存在相容性，其基于发酵单胞菌属菌株的耐受性水平，其中耐受性指菌株在具有特定乙酸水平的培养基中生长并制备乙醇的能力与在具有更少乙酸或无乙酸的培养基中生长并制备乙醇的能力相似。
同步糖化和发酵
本发明方法涉及同步糖化和发酵(SSF)。制备糖化-发酵混合物，其包括预处理的生物质、原核产乙醇生物和至少一种酶，所述酶将经预处理的生物质的多糖转化成可发酵糖。附加的培养基组分例如糖、盐、生长增强剂、和/或对应于产乙醇生物细胞中的抗生素抗性基因的抗生素通常不是必需的，但是可包括它们。通过一种或更多种糖化酶将经预处理的生物质的组分糖化、或水解以释放可发酵糖如葡萄糖和木糖。从预处理的生物质中逐渐释放糖。通过产乙醇生物代谢释放的糖以产生乙醇作为产物。
糖化
糖化酶参见Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶聚生体，其包括一种或更多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，CA，以及增补1(1993)、增补2(1994)中、增补3(1995、增补4(1997)和增补5[分别在Eur.J.Biochem.”，223：1-5，1994；“Eur.J.Biochem.”，232：1-6，1995；“Eur.J.Biochem.”，237：1-5，1996；“Eur.J.Biochem.”，250：1-6，1997；和“Eur.J.Biochem.”，264：610-650 1999中])中。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶)。此外，它可用于将其它活性加入到糖化酶聚生体中，例如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)以有助于从生物质的其它组分中释放多糖。本领域熟知的生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，例如纤维素降解，该活性由多种酶或一组具有不同底物特异性的酶(或“酶聚生体”)催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶、一种或更多种酶或所有酶，它们都可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶制剂时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂，如纤维素酶，可包括多种酶。
糖化酶可以分离形式商购获得，例如SpezymeCP纤维素酶(Danisco US，Inc.，Rochester，NY)和Multifect木聚糖酶(Danisco US，Inc.)。此外糖化酶可为未纯化的并以细胞提取物或完整细胞制剂的形式提供。可使用已经经工程化以表达多个糖化酶的重组微生物制备所述酶。
本领域的技术人员将懂得如何测定在本发明的SSF方法中使用的酶的有效量，以及如何调节条件以在SSF中获得最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化此类酶的所需活性，以在选择条件下获得给定经预处理的生物质的最佳糖化效果。
混合糖化和发酵
此外，本发明的方法可进行为混合糖化和发酵(HSF)。在这个方法中糖化在发酵前一段时间发生，其中发生部分而非完全的糖化。在这个方法中在经预处理的生物质和糖化酶混合后一段时间加入产乙醇生物以便在未进行发酵的情况下发生一些糖化。在加入产乙醇生物前的时间段可不同并且通常在一小时至多个小时的范围内，以便释放可发酵糖并在加入产乙醇生物时已经呈现期望的浓度。在实施例4中例示了HSF，其中在加入糖化酶一小时后加入发酵单胞菌属细胞。
原核产乙醇生物
本发明的糖化-发酵混合物最初包括来自原核产乙醇生物菌株的种子细胞种菌。高效生产乙醇的任何原核细胞可被用作产乙醇生物。使用的细胞可天然产生乙醇、经工程化以产生乙醇、或者可为经工程化以具有改善乙醇产量的天然乙醇生产者。原核产乙醇生物的实例包括但不限于梭菌属(Clostridium)(Stevenson和Weimer(2005)Applied andEnvironmental Microbiology 71：4672-4678)、经工程化以生产乙醇的大肠杆菌菌株(US 5,000,000)、经工程化以生产乙醇的嗜热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)菌株(Cripps等人(2009)Metabolic Engineering 11：398-408)、经工程化以生产乙醇的产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)菌株(Ohta等人(1991)Applied and EnvironmentalMicrobiology 57：2810-2815)、发酵杆菌属(Zymobacter)(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)、以及发酵单胞菌属。
优选的原核产乙醇生物是发酵单胞菌属，它天然发酵葡萄糖以产生乙醇。发酵单胞菌属菌株已经经工程化以用于木糖利用率(美国专利公开5,514,583、5,712,133、6,566,107、PCT专利申请号WO 95/28476，Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240-243)，它可用于本发明的方法。已经通过基因工程和/或适应制备出具有改善的与乙醇产量相关的特性的发酵单胞菌属菌株。优选地是具有多个工程化和/或适应改善的发酵单胞菌属菌株，其用于本发明方法中以最大化乙醇产量。已经进行了可存在的改善，其包括但不限于：1)工程化并适应改善的木糖利用率(美国专利公开7,223,575和共有的美国专利公开7,741,119、US-2009-0246876A1和US-2009-0246846A1)；2)减少不利于乙醇生产的副产物的合成(共有的US 7,741,119)；3)工程化以改善乙酸耐受性(共有的和共同未决的美国专利申请公布：US2009-0203099A1，以及公布为WO 2010/075241的美国专利申请12/641642)。
如WO 2010/075241中公开的方法制备的具有改善的乙酸耐受性的发酵单胞菌属菌株优选地用于本发明方法。由于使用这些菌株，在本发明的糖化-发酵混合物中可包括高浓度的经预处理的生物质，同时保留不妨害乙醇生产的乙酸水平，不需要进行大量的洗涤以从经预处理的生物质中除去乙酸。
通常期望的发酵单胞菌属菌株作为种子培养物进行培养。种子培养物可例如在由以下组分组成的培养基中生长：5-20g/L的酵母提取物，2-4g/L的磷酸氢二钾，1-5g/L的硫酸镁七水合物和100-200g/L的葡萄糖，所述培养物在32℃-33℃，pH 5.5-5.8的上述培养基中生长至OD600nm为10。种子培养物用于启动SSF，其加入体积等同于糖化-发酵混合物体积的约10％。
SSF中的不溶性固体
为了最大化SSF中的乙醇产量，在糖化-发酵混合物中包括高水平的存在于经预处理的生物质中的不溶性固体量。经预处理的生物质中包括的不溶性固体量与在SSF期间可生成的可发酵糖量相关联，它继而关联可从发酵单胞菌属细胞中代谢可发酵糖生成的乙醇量。
取决于所用的特定预处理以及是否包括任何洗涤步骤，相对于经预处理的生物质制剂中的固体量的不溶性固体量将不同。洗涤将增溶不溶解的固体，在总固体中留下较高的不溶性固体百分比。一些酸预处理可将多达30％的未预处理的生物质固体转化成可溶固体，从而留下的总固体的70％为不溶性固体。与之相反，用低氨预处理的固体量和不溶性固体量在经预处理的生物质中可能是相似的。相对于经预处理的生物质样品中的总固体的不溶性固体量通常可在约70％至约99％的范围内。例如，在本文实施例中使用的低氨预处理的生物质中，不溶性固体占总固体的90％-91％。在本发明的方法中，糖化-发酵混合物包括的来自经预处理的生物质的总输入不溶性固体量对原核产乙醇生物的乙醇生产的输入功率效应是重要的。在本发明的方法中，糖化-发酵混合物中载入的不溶性固体总量为每升总糖化-发酵混合物至少约160克干重或16％。
为了辅助混合糖化-发酵混合物，可将经预处理的生物质分成两个或更多个部分加入。当加入初始部分时，不溶性固体浓度可小于16％。在较低的不溶性固体浓度下调节pH和温度有促进作用。然后可加入附加的经预处理的生物质使得总输入不溶性固体重量为至少约16％。可在载入酶和/或发酵单胞菌属之前或之后加入附加的生物质。可将附加的生物质分成一个或更多个部分加入。载入的总输入不溶性固体可为至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更高，包括所述列出数值间的任何整数。
随着SSF运行进行，由于SSF中存在的糖化酶糖化经预处理的生物质，不溶性固体量降低。在给定的SSF运行约120小时后，不溶性固体通常可减少至约一半、或更少的初始量。
搅拌装置的功率
在生物反应器中使用搅拌装置搅拌糖化-发酵混合物以混合组分，所述组分包括经预处理的生物质、糖化酶、发酵单胞菌属细胞、以及任选的其它培养基组分。申请人已经发现当在包含例如约25％或更多不溶性固体的糖化-发酵混合物的搅拌中提供高能量时，发酵单胞菌属产乙醇生物的乙醇产量受到负面影响。剧烈振荡(200RPM)具有25％不溶性固体浓度的混合物导致乙醇产量和发酵单胞菌属活力降低，而剧烈振荡具有12％固体的混合物无此类效应。
因此在SSF期间需要混合，然而需要保持发酵单胞菌属细胞的乙醇生产能力。如本文实施例5所述，申请人已经计算出搅拌器可提供给包含发酵单胞菌属产乙醇生物和至少约22.5％不溶性固体的糖化-发酵混合物的功率以维持期望的乙醇产量。在本发明的方法中进行混合，其中通过搅拌装置提供的功率不超过约0.2瓦特每千克总糖化-发酵混合物。对于最大化乙醇产量，优选的输入功率小于约0.2、0.15、0.1、0.05、0.01、0.005、或0.003瓦特/kg总糖化-发酵混合物。搅拌装置可为任何旋转搅拌器，包括任何类型的叶轮如Rushton(6叶片)和任何类型的斜叶桨(船用式、4叶片、3片段)。可使用两种或更多种叶轮叶片，其中单个叶轮功率的总和小于约0.2瓦特/kg。功率可随时间变化，因为糖化-发酵混合物的粘度由于生物质的糖化而降低。
此外，发现在粒度范围介于100μm和600μm之间的玻璃小珠的存在下，当进行剧烈搅拌时发酵单胞菌属的乙醇生产性能降低。因此当生物质粒度在这一范围内时，如上所述减少搅拌以最大化乙醇产量。当生物质粒度小于约100μm或大于约600μm时，可使用剧烈搅拌。然而，经预处理的生物质初始可为较大粒度，但是粒度减小可在SSF运行期间发生。任何类型的生物质的粒度可对发酵单胞菌属细胞产生效应，如玻璃小珠所示。
SSF的条件
在具有搅拌装置的生物反应器中保留糖化-发酵混合物以生产乙醇。保持有利于发酵单胞菌属糖化并发酵的条件。通常使用苛性溶液(例如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)以及或者硫酸或者磷酸将pH保持在约5和约7之间。通常使用NaOH作为碱并使用H2SO4作为酸将pH保持在5.8。温度保持在约28℃和约37℃之间。通常温度保持在约33℃或在33℃和约28℃之间变化。SSF持续至少约40小时，通常120小时或更长时间为一次运行。
所述运行可为分批形式的，其中进行极小的改变如pH调节，或者可为分批补料形式的，其中当进行SSF时将组分给料于糖化-发酵混合物。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且实例可见于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger，和Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.(Sunderland，MA)或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)。在本发明方法中在分批补料运行中可加入的组分可包括附加的经预处理的生物质和/或附加的糖化酶。
乙醇浓度
使用本发明方法可获得高乙醇产量。在本发明SSF方法中产生的特定乙醇量将取决于以下条件而不同，如使用的具体发酵单胞菌属菌株、生物质类型、生物质预处理方法、不溶性固体浓度和糖化酶。通常可生产大于约40g/L的乙醇。生产的乙醇可为例如约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、或约85g/L。
实施例
本发明将在以下实施例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以使其适应多种用途和条件。
使用的缩写词的含义如下：“min”指分钟，“h”指小时，“μL”指微升，“mL”或“ml”指毫升，“L”指升，“nm”指纳米，“mm”指毫米，“cm”指厘米，“μm”指微米，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“μmole”指微摩尔，“g”指克，“μg”指微克，“mg”指毫克，“kg”指千克，“g”指引力常数，“RPM”或“rpm”指每分钟转数，“h.p.”指马力，“v％”为体积％，“atm”指大气，“wt％”为重量百分比，“CFU”为菌落形成单位数，“～”指大约，“hr”指小时，“ρ”指密度，“μ”指粘度，“DI”指叶轮直径，“RPS”指每秒转数，“EFT”指过去的发酵时间。
一般方法
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于下面实施例的技术可存在于以下文献中：Manual of Methodsfor General Bacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips，编辑，American Society for Microbiology(Washington，DC.)1994，或者Thomas D.Brock在Biotechnology中的A Textbook ofIndustrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.(Sunderland，MA)1989。使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂和材料均得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另外说明。
芯的预处理
将玉米芯在酶水解之前进行预处理，所述预处理使用如共有的美国专利公开7,781,191中所述的低氨方法。
使用水平Littleford Day 130L反应容器进行预处理以生成称为SSL21的预处理芯，所述反应容器包含围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套。容器载入来自加工种子谷物(尺寸小于1mm)的芯以达到基于湿芯的46v％的反应器填充度(57.5lbs)。使用大型微粒粉磨机(Model#1SH，Serial#10019)，用1.0mm的筛网将所述芯减小到小于1mm的尺寸。在碾磨前按需加入一匙干冰到所述芯中以防止设备升温。微粒粉磨机的主要驱动装置是5h.p.马达，其最大转速为9,600RPM。它有六个旋转锤；壳，并且沿相对作用边排列。
所述芯具有0.420g/cm3的松散湿堆积密度和7.5重量％的水分。在加入28.9重量％的氢氧化铵溶液(11.2lbs)和水(20.1lbs)到靠近容器顶部以提供容器中相对于生物质干重6重量％的NH3和60重量％的固体之前向容器施加真空以达到0.1atm。表1列出了用于二次预处理批(称为SSL22)的芯特性和氢氧化铵与水的量。在两种情况下，均将反应器搅拌器设为70rpm并且蒸汽通过容器的夹套。当容器达到内部温度80℃时，将蒸汽导入靠近容器顶部以提高容器内部温度至145℃。保持这一温度20分钟。在保持15分钟后，停止流经夹套的蒸汽流。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之前，施加真空(大约小于1atm)15分钟以将温度降至小于60℃并从预处理芯中除去多余的氨和水。表2列出了SSL21和SSL22批的预处理芯规程。期望小于0.3kg NH3/100kg干固体的残余氨以及大于1.0的乙酰胺对乙酸比率。
测得SSL21芯预处理批的不溶性固体为总固体的90％-91％。
表1：用于二次预处理批(SSL 22)的芯特性和氢氧化铵与水的量。
表2：SSL21和SSL22批的预处理芯规程
芯组合物
使用本领域熟知的方法测定在开始的芯中的葡聚糖和木聚糖的量，例如ASTM E1758-01“通过HPLC测定碳水化合物的标准方法(Standardmethod for the determination of carbohydrates by HPLC)”以及在NationalRenewable Energy Lagoratory(Golden，CO)Technical ReportNREL/TP-510-42618(2008年4月修订)中进一步详述的方法。所述组合物经测定为基于干重34.8重量％的葡聚糖，29.2重量％的木聚糖和12.8重量％的木质素。
秸秆预处理
在酶水解之前使用低氨方法预处理玉米秸秆，所述方法在共有的和共同未决的美国专利申请公布US-2007/0031918-A1中进行了描述。
将二次处理的玉米秸秆碾磨成2mm的平均d50粒度。所述秸秆具有0.183g/cm3的松散堆积密度和8.73重量％的水分。将约109-117kg预碾磨秸秆载入1700L水平圆柱压力容器中。在给料氢氧化铵溶液和水以达到针对干物质约11％的NH3之前向所述容器施加真空以达到0.1atm。容器中的叶轮转速为大约37rpm，并且在运行过程中蒸汽通过容器夹套。将蒸汽导入容器以将内部容器温度提高到约150℃。在约8巴(abs；0.8兆帕)的恒定反应器压力下保持这一温度30分钟。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之前，施加真空(大约小于1atm)4-8分钟以将温度降至小于60℃并从预处理秸秆中除去多余的氨和水。
不分析二次处理秸秆的组成，然而，在表3中基于之前的秸秆测定结果预测了组成组分。
表3：推定的二次处理玉米秸秆的组成
生物质编号 葡聚糖 木聚糖 阿拉伯聚糖 木质素 乙酰基
2次处理玉米秸秆 32.96％ 20.06％ 2.66％ 24.14％ 2.76％
纤维素酶和半纤维素酶生产菌株
菌株H3A是重组里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株，该菌株如下制备。里氏木霉突变株来源于RL-P37(Sheir-Neiss，G等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.1984，20：46-53)并经选择具有高纤维素酶产量，它与β-葡糖苷酶表达盒(包含cbh1启动子、β-葡糖苷酶1编码区(SEQID NO：5)、cbh1终止子和amdS基因)和内切木聚糖酶表达盒(包含cbh1启动子、内切木聚糖酶编码区和cbh1终止子)(SEQ ID NO：4)联合使用电穿孔共转化。一个转化体称为菌株#229。菌株#229与β-木糖苷酶Fv3A(SEQ ID INO：2)表达盒(包含cbh1启动子、β-木糖苷酶编码区、cbh1终止子和als基因)、β-木糖苷酶Fv43D表达盒(包含eg1启动子、β-木糖苷酶编码区、(SEQ ID NO：1)和天然终止子)和Fv51Aα--阿拉伯呋喃糖苷酶表达盒(包含eg1启动子、L-α--阿拉伯呋喃糖苷酶编码区(SEQ ID NO：3)和天然终止子)联合使用电穿孔共转化。从这个转化步骤中分离出菌株H3A。
在菌株H3A发酵期间产生的细胞外蛋白通过离心从细胞群中分离出来，通过经由Millipore 10kD分子截留分子量膜进行的膜超滤进行浓缩，并将pH调节至4.8。使用Weichselbaum和Gornall修改的改性的缩二脲方法测定总蛋白，该方法使用牛血清白蛋白作为校准物(Weichselbaum，1960，Amer.J.Clin.Path.16：40；Gornall等人，1949 J.Biol.Chem 177：752)。这种H3A细胞外蛋白制剂本文也称为H3A蛋白，它用作组合纤维素酶和半纤维素酶制剂，在SSF期间影响络合碳水化合物水解。
在菌株H3A发酵期间产生的细胞外蛋白通过离心从细胞群中分离出来，通过经由Millipore 10kD分子截留分子量膜进行的膜超滤进行浓缩，并将pH调节至4.8。使用Weichselbaum和Gornall修改的改性的缩二脲方法测定总蛋白，该方法使用牛血清白蛋白作为校准物(Weichselbaum，1960，Amer.J.Clin.Path.16：40；Gornall等人，1949 J.Biol.Chem 177：752)。这种H3A细胞外蛋白制剂本文称为H3A蛋白，它用作组合纤维素酶和半纤维素酶制剂，在SSF期间影响络合碳水化合物水解。
生物催化剂和种菌制剂
同步糖化和发酵(SSF)中使用的运动发酵单胞菌菌株的起源
可在SSF中使用利用木糖的乙醇生产的运动发酵单胞菌菌株。运动发酵单胞菌菌株ZW705如本文简要重述从菌株ZW801-4中制得。ZW801-4是重组的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株，其描述于共有的US 7,741,119中，所述文献以引用方式并入本文。菌株ZW801-4衍生自菌株ZW800，菌株ZW800衍生自菌株ZW658，它们均描述于US7,741,119中。ZW658通过经由序贯转座事件将两个操纵子(PgapxylAB和Pgaptaltkt)整合到ZW1(ATCC 31821)基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基改型进行构建，所述操纵子包含四个编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的木糖利用基因。ZW658被保存为ATCC PTA-7858。在ZW658中，使用宿主媒介的基因双交换同源重组和作为选择性标记的奇放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因插入失活以产生ZW800。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组移除由loxP位点束缚的奇放线菌素抗性标记以产生ZW801-4。
如公布为WO 2010/075241的美国专利申请12/641642中所公开的那样，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZW801-4的培养物如下在胁迫条件下生长，所述文献以引用方式并入本文。ZW801-4的连续培养在250ml搅拌的、pH和温度受控的发酵罐(Sixfors；Bottmingen，Switzerland)中进行。发酵基础培养基是5g/L酵母提取物，15mM磷酸铵，1g/L硫酸镁，10mM山梨醇，50g/L木糖和50g/L葡萄糖。通过在97天中逐渐提高加到上述连续培养基中的乙酸铵浓度，同时保持通过特定稀释速率测得的确定生长速率来影响在高浓度乙酸和氨的存在下的适应生长。奖乙酸铵浓度提升至160mM。通过加入磷酸铵至在连续培养139天的末期最终总铵离子浓度为210mM来实现铵离子浓度的进一步提高。通过接种单菌落并扩增一个选择的菌落来从适应种群中分离菌株ZW705。
如共有的和共同未决的Attorney Docket#CL5332所述，运动发酵单胞菌菌株AR37-31(也称为Adapted 7-31)通过在水解产物培养基中的适应生长衍生自菌株ZW705，该文献以引用方式并入本文。适应在恒浊器中进行，恒浊器是一种连续流动培养装置，其中通过控制培养基流速使培养物中的细胞浓度保持恒定，使得培养物的浊度保持在有限范围内，如US6686194所述。培养物在连续培养装置中可利用两种培养基生长，一种为静息培养基(培养基A)，一种为挑战培养基(培养基B)。培养物在生长室中的静息培养基上生长至浊度设置点，然后将其以设置以保持细胞密度的稀释速率稀释。通过每10分钟加入一次限定体积的培养基来进行稀释。当恒浊器进入培养基挑战模式时，基于在前一次培养基添加后返回设置点的速率选择加入挑战培养基或静息培养基。在生长室中的稳态浓度培养基是培养基A和培养基B的混合物，两种培养基的比例取决于从每种培养基中回收的速率，所述速率允许在设置的稀释速率下保持设置的细胞密度。每周从恒浊器(在捕集室)流出液中回收在生长室中的代表性种群细胞样品。细胞样品在MRM3G6培养基中生长一次并在-80℃保存为甘油原液。
培养物在静息培养基和挑战培养基中生长，静息培养基为50％HAc/YE和50％MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3，而挑战培养基为HAc/YE。每周采集的样品在HAc/YE培养基中检测其葡萄糖和木糖利用率以及乙醇产量。从第3周样品中分离菌落并选择那些在MRM3X2和MRM3G2平板上生长良好的菌落。从这些菌落中筛选利用木糖和葡萄糖并在HAc/YE培养基中生产乙醇的菌株。选择菌株12-18X-2-36再进行一轮适应，使用HAc/YE作为静息培养基并使用HAc/YE+9重量％乙醇作为挑战培养基。在筛选来自适应菌株的菌株后选择来自第2周样品的菌株，其称为Adapted 7-31(也称为AR37-3)，当该菌株在HAc/YE+9重量％乙醇培养基中生长时具有提高的葡萄糖和木糖利用率以及提高的乙醇产量。
适应使用的培养基
HAc/YE：包含玉米芯水解产物，其通过用低浓度氨预处理碾磨芯生物质、然后通过酶糖化制得。所述水解产物补充有6.2g/L乙酸铵和0.5％的酵母提取物。
MRM3每升包含：酵母提取物(10g)，KH2PO4(2g)和MgSO4.7H2O(1g)。
MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3：MRM3具有65g/L的葡萄糖，45g/L的木糖，和12.3g/L的乙酸铵
MRM3G6：MRM3具有60g/L的葡萄糖
MRM3X2：MRM3具有20g/L的木糖
MRM3G2：MRM3具有20g/L的葡萄糖
SSF的种子培养物的生长
将运动发酵单胞菌ZW705作为20％的甘油原液保存在-80℃冷冻条件下。为了开始培养，解冻2ml原液并用于接种45ml培养基，所述培养基由以下组分组成：10g/L酵母提取物，2g/L磷酸氢二钾，5g/L硫酸镁七水合物和60g/L葡萄糖，pH为5.8(MRM3G6)，OD 600nm为0.4。培养物在33℃下，在未盖严的50ml管中生长至600nm约2.5OD并用于接种最终种子培养物，其包含150-200g/L的葡萄糖，2g/L的磷酸氢二钾，5g/L的硫酸镁七水合物和10-20g/L的酵母提取物，pH为5.5。该培养物在pH受控并搅拌的发酵罐中，在33℃生长至OD600nm为约10，并且保持葡萄糖浓度使得约120g/L的葡萄糖被消耗。回收等同于10％的SSF最终发酵体积的10OD种子的体积并用于启动SSF。
HPLC分析
在固定的时间间隔采集发酵样品并分析EtOH、残余糖和其它代谢产物如乙酸和甘油，所述分析使用Waters HPLC系统(Alliance system，Waters Corp.，Milford，MA)或Agilent 1100Series LC进行；条件＝0.6mL/分钟的0.01N H2SO4，注射体积＝5μL，自动取样机温度＝10℃，柱温＝55℃，运行时间＝25分钟，通过折射率进行检测(保持在40℃)。HPLC柱购自BioRad(Aminex HPX-87H，BioRad Inc.，Hercules，CA)。通过折射率检测定量分析物并与已知的标准品进行比较。
同步糖化和发酵(SSF)
烧瓶SSF
SSF烧瓶运行在合适的运动发酵单胞菌发酵条件下厌氧地进行。除非另外指明，使用稀氨预处理的玉米芯底物的SSF实验通常在33℃，pH5.8，和按重量计25％的固体载量下进行。将25％固体(12.5g干重)的预处理玉米芯首先载入125mL锥形瓶中，随后加入与所需量6N硫酸预混的去离子水以将底物pH滴定至5.8。如上所述的H3A蛋白被用作糖化酶并基于生物质底物中的mg总H3A蛋白/g(纤维素+木聚糖)被加入一定量。将按重量计10％的运动发酵单胞菌菌株ZW705种菌(5g)加到反应混合物中开始发酵，不加入附加的营养物质。通过从用于封盖烧瓶的橡胶塞子上突出的23Gauge针来保持无氧环境和CO2除气作用。在开始发酵后，所有SSF运行具有初始50g的烧瓶内总反应重量并且反应混合物由预处理玉米芯、水、硫酸、酶和ZW705细胞组成。在振荡器培养箱(New Brunswick Scientific，Innova 44，Edison，New Jersey)中以50或200RPM振荡烧瓶，温度在第1天从33℃降至30℃，并且在第2天降至28℃。
SSF放大-搅拌槽反应器
使用3升凹底玻璃反应器(Applikon Biotechnology Z61101C006，Foster City，CA)取代125mL的烧瓶。在反应器中以1000g的总反应重量进行SSF 144小时。按重量计25％(250g)的固体载量被用于放大研究。将大约75％的干固体加到无菌MilliQ水中并用2N硫酸将pH调节至pH 5.8。将这一初始混合物升温并保持恒温在33℃。然后，将酶(20mgH3A蛋白/g(纤维素+木聚糖))和发酵单胞菌属种菌与剩余的干固体联合加入。在24小时时，降温至30℃，然后在48小时时降温至28℃。通过包裹在反应器外表面的电加热带保持反应器的温度，通过Rushton或船用式斜叶片叶轮进行混合。用氮清除反应的顶部空间以减少暴露于氧气的发酵单胞菌属，并且用19Gauge针刺穿的橡胶塞子来控制漏气。
活体总数(TVC)
通过测量菌落形成单位数(CFU)随时监控包含运动发酵单胞菌细胞的SSF样品的活体总数。在无菌过滤的MilliQ水中连续稀释样品，然后置于MRM3平板(15g琼脂，50g葡萄糖，10g酵母提取物，1gMgSO4x7H2O，2g KH2PO4，调节至pH 5.5并在121℃下高压蒸汽灭菌15分钟)上，并通过用石蜡膜密封该平板在33℃下无氧培养48小时。计数具有10至1000个菌落的稀释平板的菌落形成单位数(CFU)。如果平板计数超出稀释范围，将CFU报告为小于或大于不可计数的稀释平板。
实施例1
RPM和固体载量对SSF的效应
这个实施例展示了RPM和固体载量对使用稀氨预处理的玉米芯和重组运动发酵单胞菌菌株ZW705的SSF方法的效应。如烧瓶SSF的一般方法所述进行SSF。以三个不同的固体载量(6％、12％和25％)和两个不同的RPM(50RPM和200RPM)进行实验运行，使用的H3A蛋白剂量为15mg/g葡聚糖+木聚糖。在3天后采集样品并如Materials andMethods所述，通过HPLC进行分析。
图1所示结果显示RPM对在高固体载量(25％)下的SSF方法的令人惊讶的强效应。具有200的RPM和25％的固体的SSF在第3天仅产生7.7g/L的EtOH，其主要从发酵单胞菌属种菌中带来乙醇。同时积聚了29.5g/L的葡萄糖和47.8g/L的木糖，这表明H3A酶制剂在这些条件下仍然有效。与之相反，在较低的固体载量(6％和12％)下，将RPM提高到200RPM不导致SSF方法的性能降低。
如一般方法所述，在实验期间的0、4、24、48和72小时监控上述运行的总活体细胞数。图2所示结果指示在25％固体和200RPM条件下SSF发酵性能的损失直接与运动发酵单胞菌的CFU的损失相关。对于所有SSF运行，发酵单胞菌属在接种(0小时)和4小时之间经历快速生长。在所有运行的4小时后总活体细胞数稳定在2至9×109CFU/mL，不同的是在25％固体和200RPM条件下发酵单胞菌属菌落数(CFU)中的3对数减少在24小时内出现，并且5对数减少在48小时内出现。因此，发酵单胞菌属菌落数受到RPM提高的不利影响，但是仅在高固体载量下(25％)出现这种情况。另一方面，较低固体的SSF方法(6％和12％)不受RPM提高的影响。
实施例2
在高固体模拟SSF中粒度对乙醇产量的效应
为了研究粒度对发酵单胞菌属发酵的效应，在模拟SSF运行中使用Ballotini Soda玻璃小珠(VWR，Cat#33997-500/536/560/562/568/584，West Chester，PA)而不是预处理玉米芯。在使用前洗涤、消毒并干燥具有以下直径的小珠：0-50μm、100-200μm、400-600μm、1250-1550μm(1.25-1.55mm)和2850-3300μm(2.85-3.30mm)。使用类似于烧瓶SSF中所述的条件，将反应规模固定在50g和25％的总固体(玻璃小珠)，在具塞125mL Erlenmeyer烧瓶中进行，使用21Gauge针除气。为了模拟在标准SSF反应中可利用的碳水化合物，培养基由80g/L的葡萄糖和70g/L的木糖组成，其在水中制备并将其载入。通过高压蒸汽灭菌，在121℃将所述培养基灭菌15分钟。将按重量计10％的发酵单胞菌属种菌载入反应混合物，并且在这种情况下不加入酶。在100或200RPM下进行搅拌的振荡培养箱中进行每个反应，培养箱温度保持在恒温33℃。
图3A显示的乙醇产量结果清楚地表明当发酵单胞菌属发酵在25％固体的存在下，粒度为或者100-200μm或者400-600μm并且在高RPM(200RPM)下进行时，发生性能损失。在200RPM下用任何其它测试粒度范围，并且在100RPM下用任何粒度范围未发现可测量的性能下降。从CFU数据中也发现类似的效应，其中在200RPM下运行的100-200μm和400-600μm小珠发现在CFU中的2对数降低。表4中的数据表明发酵性能损失是发酵单胞菌属活力降低的直接结果。
表4图3的运行中测定的CFU
使用小珠，利用以下直径范围：0-50μm、40-70μm和100-200μm重复所述实验。图3B中给出的结果显示以200RPM搅拌并使用40-70μm小珠的模拟SSF中的乙醇产量与100RPM的运行中的乙醇产量类似。
使用Ballotini小珠在测试条件下(25％固体，在125mL烧瓶中的50g反应体积，200RPM)测定的降低乙醇产量和细胞活力的关键粒度范围介于100μm和600μm的范围内。
实施例3
在搅拌槽反应器中的SSF
试验1
如Materials and Methods所述，在SSF放大试验中使用两个在100RPM下旋转的Rushton 6叶片叶轮(直径45mm)。沿轴的叶轮彼此间隔3cm，底部叶轮与反应器底部间隔2cm。糖化酶是H3A蛋白，其载量为20mg蛋白/g(葡聚糖+木聚糖)。使用25％的固体载量，Rushton叶轮不提供足够的混合。目测发现显著的固体沉降、不良的轴向混合、在反应浆液内的CO2积聚、以及围绕叶轮的高度局部化的径向混合。由于混合不均匀，不能估计SSF运行期间的输入功率。然而经过140小时通过取样和HPLC分析测定葡萄糖、木糖和乙醇浓度，并且葡萄糖、木糖和乙醇积聚(如图4所示)的模式指示正常的糖化速率但不完全的发酵。通过改变叶轮设计修正不均匀的混合并进行第二次试验。
试验2
第二次SSF放大试验如上运行，不同的是用两个船用式6叶片叶轮(直径45mm)取代两个Rushton叶轮。沿轴的叶轮彼此间隔3cm，底部叶轮与反应器底部间隔2cm。将叶轮速度提高到150RPM。已知船用式叶轮与Ruston叶轮相比显示降低的最大剪切速率(Shuler和Kargi，Bioprocess Engineering，第2版，第287页(2002)Prentice Hall，UpperSaddle River，NJ)。这可导致气体分散不良并转移到液体中，但是因为发酵是厌氧的，因此不需要对其关注太多。叶轮的变化减轻了以前在试验1中观察到的混合问题。目测到残余的不溶性固体的完全悬浮和均匀混合。经过140小时通过取样和HPLC分析来测定葡萄糖，木糖和乙醇浓度。图5中提供的结果显示较好的轴向混合经72小时导致较快的乙醇生产速率和良好的乙醇连续生产，同时最小化糖积聚。与试验1相比，乙醇生产速率的提高指示改善的底物液化和糖化。第6天葡萄糖、木糖和乙醇的滴度分别为9.00、12.64和85.88g/L。
实施例4
在搅拌槽反应器中搅拌对SSF的效应
在不同混合条件下同步糖化和发酵(SSF)反应在1.7L反应器中进行。SSF运行的进行类似于一般方法所述的搅拌槽反应器SSF，具有下文实施例5所述的搅拌叶片，具有约1040g的总反应重量，使用如上所述的预处理玉米芯以及约24％的固体载量，在经预处理的生物质中存在的酶载量为14mg H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖，温度为33℃(不降低)，并且pH为5.8，使用运动发酵单胞菌ZW705作为发酵生物。不用氮清除顶部空间。
在250或750rpm下搅拌来进行两个反应，其中将预处理固体加到水中达到26重量百分比。使用预处理的芯制剂SSL21。搅拌每个混合物以确保同质，同时调节温度和pH。一旦pH和温度达到期望值，则加入全剂量的酶。在加入酶一小时后，设置混合至期望值并如一般方法所述加入10％(终体积)的即收获运动发酵单胞菌ZW705种子培养物，使得最终固体含量达到23.6重量百分比。
在250或80rpm下搅拌来进行两个反应，在三批中如下加入SSL22预处理固体。
1)开始用554g水+217g经预处理的生物质(69.1％干固体)+21.81mL(～21.81g)酶＝具有149.9g干固体的792.8g反应混合物。产生18.9％的固体(在这个点基于反应混合物的质量计)或14.4％的固体(基于最终反应混合物的质量1040.8g计)。
一旦pH和温度达到期望值，则加入全剂量的酶。
2)在加入酶五分钟后，设置混合至期望值并加入10％(终体积)的即收获运动发酵单胞菌ZW705种子培养物。
加入104ml即收获发酵单胞菌属种子培养物(～104g)，以产生896.8g的反应混合物，其仍有149.9g的干固体。产生16.7％的固体(在这个点基于反应混合物的质量计)或14.4％的固体(基于最终反应混合物的质量＝1040.8g计)。
3)在加入酶一小时后，加入另一批固体。
加入72g(69.1％干物质)第二批固体＝具有199.7g干固体的968.8g反应混合物。产生20.6％的固体(在这个点基于反应混合物的质量计)或19.2％的固体(基于最终反应混合物的质量＝1040.8g计)。
4)在加入酶二小时后，加入最后一批固体。
加入72g(69.1％)干物质最后一批固体＝1040.8g反应混合物(249.5g干固体)。产生24.0％的固体(在这个点基于反应混合物的质量计)＝24.0％的固体(基于最终反应混合物的质量＝1040.8g计)。
在不同时间从每个反应中移出等分试样进行发酵液的HPLC分析。图6A显示初始25重量％的固体的250rpm和750rpm的运行的随时间的乙醇浓度。图6B显示分开加入固体的80rpm和250rpm的运行的随时间的乙醇浓度。在750rpm，除了种子培养物带来的乙醇外无乙醇产生(图6A)在250rpm，在～50小时内产生～40g/L的乙醇(图6A)。在分开加入生物质的80rpm，在～50小时内产生～65g/L的乙醇(图6B)。在分开加入生物质的250rpm，在～50小时内产生～40g/L的乙醇(图6B)。
实施例5
计算输入功率对SSF的效应
测得在实施例4中使用的玻璃反应容器的直径为11cm并且高度为18cm，具有凹底。填充所述容器至～1L，导致工作高度为～10.5cm，产生0.96的h/d。通过用两个叶轮系统搅拌提供混合，所述系统在上文给出的rpm值下运行。底部叶轮是具有4.8cm直径(B Braun Biotech)的3片段叶轮，其位于液体体积～350mL处(距离底部～3.7cm)，片段位于泵上45度角。顶部叶轮是6-叶片涡轮叶轮(Rushton)，其具有4.5cm的叶片直径和2.5cm的盘，位于～700mL的液体体积处(距离底部～7.4cm)。对于混合计算，推定密度(ρ)为1050kg/m3并且粘度(μ)为33℃水的粘度(0.00075kg/ms)。叶轮雷诺数(Reynolds number，Re)用RPS*DI2*ρ/μ计算，其中RPS是每秒转数而DI为叶轮直径。在所有情况下叶轮雷诺数超过4000，因此叶轮功率数取‘高雷诺渐近线’值(3片段叶轮为1.5，Rushton叶轮为5)。因为叶轮布局良好，总叶轮混合功率取单个叶轮混合功率的总数。将叶轮功率计算为叶轮功率数*密度*(RPS3)*(DI5)。通过将总叶轮功率除以总反应质量得到功率/质量(P/m)。端部的功率/质量计算为总叶轮功率/(DI3*ρ)。涡旋尺寸计算为[(μ/ρ)3/(功率/质量)]1/4。对于实施例4的80、250和750rpm的运行，总叶轮混合功率分别为0.0032、0.099和2.7W(功率/质量为0.0032、0.099和2.7W/kg)。在这三种情况下的叶轮端部速度分别为0.19、0.59和1.8m/s。在这三种情况下的涡旋尺寸分别为104、44和19μm。在端部的涡旋尺寸可通过将端部的功率/质量取代为涡旋尺寸式中的功率/质量进行计算。表5显示结果。
表5.在搅拌反应器中的运动发酵单胞菌ZW705SSF反应的混合参 数和最终乙醇滴度(实施例4)。
*实施例3的试验2的结果，它使用20mg/g的酶
#NDI是RPS*DI
表5示出混合对SSF成功的强影响。当混合强度提高时，乙醇滴度降低。在强混合条件下，除种子带来的乙醇外无乙醇形成。总反应质量的低于0.2W/kg特定输入功率为高固体浓度SSF提供有效的发酵。
实施例6
酶载量对乙醇滴度和搅拌需求的效应
在2L反应器中进行同步糖化和发酵(SSF)反应，该反应器具有三组4叶片的、45度泵下叶轮。SSF运行的进行类似于一般方法所述的搅拌槽反应器SSF，具有约2140g的总反应重量，使用如上所述的预处理玉米芯以及约22.5％的最终固体载量，在经预处理的生物质中存在的酶载量为14mg或28mg H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖，温度为33℃(不降低)，并且pH为5.8，使用运动发酵单胞菌AR37-31作为发酵生物。不用氮清除顶部空间。
固体以分批补料模式载入。使用预处理的芯制剂SSL27，其包含65.3％的干物质。开始将94g预处理芯和1120g水加到反应器中，产生5％的固体浆液。分别调节pH和温度至设置点5.8和33℃。然后加入40.2g(14mg/g)或80.5g(28mg/g)的H3A酶(分别为FBR746和FBR747运行)，紧接着(在5分钟内)加入200ml发酵单胞菌属细胞。接下来经7小时后，以每小时平均递增的方式加入剩余的637g预处理芯(总计加7次)。使用1N H2SO4或1N NaOH人工调节pH以保持pH为5.8。
如果需要，在每次加入固体之间并且在剩余的运行时间中每天两次检查并调节搅拌速率，搅拌速率以10rpm递增使得固体保持悬浮，这通过容器上的玻璃墙目测悬浮状态。此搅拌速率被称为NJS(JS＝“正处于悬浮状态”)。
14mg/g酶载量反应器和28mg/g酶载量反应器的NJS的图如图7A所示。具有两次酶载入的反应器需要较低的搅拌速率以在整个运行过程中保持悬浮状态。使用28mg/g酶载量的运行所需的最大搅拌速率是110rpm，而使用14mg/g酶载量的运行所需的最大搅拌速率是140rpm。因为功率与搅拌速率的三次方(P～N3)成比例，这对应于在较低酶运行中与两倍酶运行相比大约两倍的功率以保持悬浮。如实施例5所述来计算输入功率，结果是在110rpm下为0.025W/kg并且在140rpm下为0.052W/kg。
在不同时间从每个反应中移出等分试样进行发酵液的HPLC分析(如一般方法所述)。图7B示出两个反应器随时间的乙醇浓度。具有28mg/g酶载量的反应器在50小时内达到约77g/L，而具有14mg/g酶载量的反应器在相同时间内达到约62g/L。
实施例7
使用玉米秸秆的SSF
同步糖化和发酵(SSF)反应在1.7L反应器中如实施例4和5所述进行。用玉米秸秆进行的SSF的进行类似于一般方法中所述的搅拌槽反应器SSF方法。
使用的如一般方法所述制备的玉米秸秆具有约20.6％的最终固体载量，17mg H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖(基于典型秸秆组合物计)的酶载量，温度为33℃(不降低)，并且初始pH为5.3，使用运动发酵单胞菌ZW705作为发酵生物。不用氮清除顶部空间。发酵罐配有安装在～350mL处的3片段叶轮和安装在～700mL处的6叶片涡轮叶轮(Rushton)，并且最终反应物料为约810g。固体以分批补料模式载入。使用的预处理秸秆制剂包含43.8％的干物质。开始将95g预处理秸秆和279.1g水加到反应器中，产生10％的固体浆液。分别调节pH和温度至设置点5.3和33℃。将混合速率设为250rpm。然后加入20.6ml的H3A酶，紧接着(在20分钟内)加入100ml的发酵单胞菌属细胞。在加入酶后的1、4.3和7小时后加入附加剂量的95g固体。在加入固体期间提高pH，在最后一次加入固体后最后达到pH 5.8。功率经计算为0.111W/kg。
在不同时间从反应中移出等分试样进行发酵液的HPLC分析。乙醇浓度在27.4小时时达到40g/L并且在44.7小时时达到45.7g/L乙醇，进一步证明在SSF中使用约0.1W/kg混合功率成功地应用于玉米秸秆。
实施例8
使用玉米秸秆的SSF和酶载量的效应
同步糖化和发酵(SSF)反应在1L反应器中进行。用玉米秸秆进行的两组SSF试验类似于一般方法中所述的搅拌槽反应器SSF。
在实验SR-12中，使用如一般方法所述制备的玉米秸秆，其包含43.7％的干物质。以分批补料模式逐批加入固体，在830g反应物料中有约23.3％的最终固体载量，在生物质中有14mg H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖，温度为33℃(不降低)，并且初始pH为5.5，使用运动发酵单胞菌ZW705作为发酵生物。不用氮清除顶部空间。发酵罐配有2组叶轮；平叶片涡轮在大约14％的最终反应器填充度的高度，而45度斜叶桨在大约42％的最终反应器填充度的高度。开始将53.0g预处理秸秆和250g水加到反应器中，产生7.6％的固体浆液。分别调节pH和温度至设置点5.5和33℃。将搅拌或混合速率设为168rpm。然后加入15.2ml H3A酶，随即在大约40分钟后加入78ml发酵单胞菌属细胞。在接下来的36小时内分十次平均加入附加剂量的37.0g固体，同时按需加入1N的H2SO4和1N的NaOH以保持期望的pH。在随后的固体添加期间以及剩余的运行期间，对于最初的～20小时，将pH控制(通过定期监控并人工调节)在5.5；在20小时后将pH控制在5.8。开始的12小时将搅拌速率保持在168rpm，然后提高到212rpm，保持大约50小时。在开始的12小时内输入功率为0.042-0.057W/kg；变化随着加入固体导致的反应增加而发生。运行剩余阶段的输入功率为0.064-0.084W/kg，其由于加入物料到反应器中而再次变化。
实验SR-13的运行与SR-12相同，然而仅使用243g的水和30.5ml的酶。这代表以前的运行载入两次酶或28mg蛋白/g葡聚糖+木聚糖。通过相同方法进行pH调节、固体添加和搅拌并采用与如上所述的以前实验大约相同的时间表。
在不同时间从每个反应中移出等分试样进行发酵液的HPLC分析。图8示出两个运行随时间的乙醇浓度。实验SR-12在51.2小时内达到49.5g/L的乙醇，而实验SR-13在50.0小时时达到52.3g/L的乙醇，证明在玉米秸秆SSF中使用较高的酶载量能达到较高的乙醇滴度和较快的速率。
实施例9
比较在SSF期间RPM对运动发酵单胞菌、大肠杆菌(ESCHERICHIA COLI)和啤酒糖酵母(SACCHAROMYCES CEREVISIAE)的效应
这个实施例展示了RPM和固体载量对SSF方法的效应，所述方法使用稀氨预处理的玉米芯和多种产乙醇生物，包括重组运动发酵单胞菌菌株ZW705、大肠杆菌(OneShotTOP10化学感受态细胞，Invitrogen)和商业啤酒糖酵母(Ethanol Red；Fermentis，Lesaffre Group)。SSF如一般方法所述进行烧瓶SSF。啤酒糖酵母(S.cerevisiae)起始培养物通过加入干燥Ethanol Red到20g/L葡萄糖溶液中并在30℃孵育1小时来进行制备。不制备大肠杆菌的起始培养物，而是解冻1ml的OneShotTOP10化学感受态细胞并直接加到SSF反应中。所述实验运行在一次固体载量(25％)和两个不同的RPM(100RPM和200RPM)下进行，H3A蛋白的剂量为14mg/g葡聚糖+木聚糖。在3天后采集样品并如Materials and Methods所述，通过HPLC进行分析。
图9给出的结果显示在使用不同微生物的SSF期间，在48小时时RPM对乙醇滴度的效应。还如实施例1的图1所示，在使用运动发酵单胞菌(Z.mobils)ZW705的SSF期间的乙醇滴度对混合敏感，100RPM的运行导致乙醇滴度超过50g/L，而200RPM的运行未达到10g/L。大肠杆菌也对混合敏感，尽管其程度与运动发酵单胞菌不同，在100RPM产生比200RPM多50％的乙醇(分别是11.8对7.7g/L)并留下较少的残余葡萄糖。啤酒糖酵母在两个混合运行中产生介于25和30g/L之间的乙醇，其在200rpm的运行中的滴度略高。因此，测试的原核产乙醇生物受到RPM提高的不利影响，而真菌产乙醇生物不受影响。

Claims (17)

1.用于生产乙醇的方法，包括：
a)提供包含不溶性固体和多糖的经预处理的生物质；
b)提供至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；
c)提供原核产乙醇生物；
d)在包括叶轮的生物反应器中制备糖化-发酵混合物，其包含a)的经预处理的生物质、b)的糖化酶、和c)的原核产乙醇生物；以及
e)在所述糖化-发酵混合物中使所述原核产乙醇生物生长，其中在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约16％，其中所述叶轮在粒度为100μm-600μm的生物质微粒存在下提供不超过约0.2瓦特/kg总糖化-发酵混合物的功率，并且其中所述原核产乙醇生物产生乙醇。
2.权利要求1的方法，其中所述原核产乙醇生物是选自下组的属的成员：发酵单胞菌属、发酵杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属和地芽孢杆菌属。
3.权利要求1的方法，其中所述生物反应器包括至少一个叶轮。
4.权利要求1的方法，其中c)的产乙醇生物在加入b)的糖化酶后已经发生部分糖化的时间加入。
5.权利要求1的方法，其中经预处理的生物质以至少两份被加入，所述至少两份联合提供基于每升干重计至少约16％的总输入不溶性固体浓度。
6.权利要求1的方法，其中在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约20％。
7.权利要求1的方法，其中所述原核产乙醇生物耐受所述糖化-发酵混合物中的乙酸浓度。
8.权利要求1的方法，其中生物质选自柳枝稷、废纸、来自造纸业的淤渣、玉米芯、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、稻秆、甘蔗渣、高粱，得自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、蔬菜、水果、花和动物粪肥的加工的组分。
9.权利要求1的方法，其中生物质选自(i)干草，或(ii)灌木及灌丛。
10.权利要求1的方法，其中所述经预处理的生物质通过用氨处理纤维素生物质而制成。
11.权利要求10的方法，其中所述氨相对于生物质的干重为小于约12重量％。
12.权利要求1的方法，其中所述至少一种糖化酶选自纤维素水解糖苷酶和半纤维素水解糖苷酶。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种糖化酶是酶聚生体中的一员。
14.权利要求13的方法，其中所述糖化酶聚生体包含选自以下的酶：纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
15.权利要求1的方法，其中所述多糖包括木聚糖和葡聚糖。
16.权利要求1的方法，其中所述可发酵糖包括木糖和葡萄糖。
17.权利要求1的方法，其中所述产生的乙醇的浓度为至少约40g/L。
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