BR112012015367B1 - Método para produzir etanol e processo de sacarificação-fermentação - Google Patents

Abstract

métodos para produzir etanol e sistema de sacarificação- fermentação. tratam-se métodos para a produção de altas concentrações de etanol a partir de biomassa com o uso de zymomonas como o produtor de etanol. o zymomonas é cultivado sob condições de baixa agitação de impulsor com alta concentração de sólidos insolúveis em uma mistura de sacarificação- fermentação durante uma reação de sacarificação e fermentação simultânea para a produção de altas concentrações de etanol.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório dos Estados Unidos, 61/289749, depositado em 23 de dezembro de 2009.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção refere-se a métodos para a geração de etanol a partir de biomassa celulósica. Especificamente, Zymomonas é usada sob condições específicas do processo de sacarificação e fermentação simultânea para a produção de altas concentrações de etanol.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O etanol carburante produzido a partir de recursos renováveis consiste em uma das soluções em longo prazo para escassez global de combustível fóssil, elevação de custos de energia e efeitos do aquecimento global relacionados ao dióxido de carbono atmosférico aumentado. O etanol carburante a partir de recursos renováveis é produzido por meio da fermentação de açúcares. Atualmente nos Estados Unidos, a glicose derivada a partir de grão de milho é a mais abundante fonte de açúcar para a produção de etanol. Devido às demandas por grão de milho como uma fonte de alimentação e alimento, os métodos de conversão de diversos tipos de biomassa celulósica (que inclui hemicelulose) a açúcares fermentáveis estão sendo desenvolvidos. O açúcar derivado a partir desta fonte de biomassa consiste em uma mistura de hexoses e pentoses, principalmente glicose e xilose. Como consequência dos desenvolvimentos no processamento de biomassa celulósica, estes açúcares podem ser liberados em altas concentrações e usados na fermentação em altas concentrações para produzir etanol, com consumo de água reduzido e taxa de rendimento maior. Como tal, a conversão de biomassa a etanol propõe grande possibilidade para o aperfeiçoamento de impactos ambientais mediante o fornecimento de uma alternativa de forma econômica potencialmente viável para os combustíveis fósseis.

[004] Os processos típicos para a conversão de biomassa celulósica para etanol compreendem três etapas; tratamento químico e/ou físico da biomassa para reduzir o teor de lignina da biomassa e para fazer polissacarídeos disponíveis para a hidrólise enzimática; sacarificação, digestão ou hidrólise, onde os polissacarídeos são enzimaticamente convertidos a açúcares fermentáveis; e fermentação onde os açúcares fermentáveis são consumidos por um produtor de etanol para a produção de etanol. Em alguns casos, dependendo das condições e da natureza do produtor de etanol, pode ser energeticamente mais eficaz combinar as etapas de sacarificação e fermentação. A otimização de cada uma destas etapas é necessária para a produção de altas concentrações de etanol.

[005] Os produtores de etanol têm consistido tipicamente em levedura (por exemplo, Saccharomyces) ou bactérias (por exemplo, Zymomonas). A Zymomonas também é adequada para a produção de etanol à medida que é geralmente robusta, cresce em concentrações de glicose relativamente altas e pode ser elaborada para utilizar açúcares C5, tais como xilose e arabinose (produtos comuns de sacarificação) para a geração de etanol. No entanto, a utilização eficaz de Zymomonas exige processos de aperfeiçoamento para o uso de Zymomonas como um produtor de etanol.

[006] O uso de Zymomonas como um produtor de etanol é conhecido (Saddler et al., Can. J. Microbiol. (1982), 28(12), 131 1 -19: Golias et al., J. Biotechnol., (26 de junho de 2002) (96) 2, pp. 155168; Ma et al., Renewable Energy (2009) 34:1466-1470), no entanto, a Zymomonas é sensível a altas concentrações de acetato produzido por muitos dos métodos de pré-tratamento de biomassa.

[007] A redução dos níveis de acetato pode ser alcançada por meio de métodos, tais como, lavagem de biomassa pré-tratada (Teixeira et al., Appl. Biochem. Biotechnol., (Spring, 2000) Vol. 84-86, pp.111 -127).

[008] O uso de uma xilose utilizando Zymomonas na sacarificação e fermentação simultânea também é conhecido, onde a biomassa foi tratada com hidróxido de sódio seguido por ácido peracético e lavada (Teixeira et al. Supra). Eklund et al. (Enzyme and Microbial Technology (1995), 17(3), 255-9) demonstrou a sacarificação e fermentação simultânea com o uso de Zymomonas como o produtor de etanol, onde a biomassa foi pré-tratada com vapor e dióxido de enxofre e lavada, então, a fermentação foi em uma concentração de sólidos insolúveis totais de cerca de 10% em ambos os frascos e fermentadores com alguma agitação, onde a produção de etanol foi de cerca de 28 g/L.

[009] Adicionalmente, McMillan et al., (Appl. Biochem.Biotechnol. (1999) Vol. 77-79:649-665.) demonstrou o uso de Zymomonas em um processo de sacarificação e fermentação simultâneo, onde a cepa de Zymomonas foi adaptada ao hidrolisado de choupo, a biomassa foi pré-tratada com ácido diluído, então, MTBE extraído, a enzima de sacarificação foi celulase, e onde a fermentação foi executada em um fermentador com 11,5% de sólidos insolúveis e um agitador a 150 RPM. Com o uso deste método, os autores foram capazes de alcançar a produção de cerca de 35 g/L de etanol.

[010] Os métodos acima demonstram que a Zymomonas pode ser usada em processos de sacarificação e fermentação simultânea para a produção de etanol. No entanto, a produção de etanol com o uso destes métodos é baixa e é evidente que os processos precisam ser otimizados para efetuar a produção de etanol em quantidades comerciais.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[011] Os métodos da invenção procuram resolver o problema de otimização do uso de um produtor de etanol procariótico em processos de sacarificação e fermentação simultânea (SSF) através da identificação de condições que permitem o uso de alto teor de insumos sólidos insolúveis na mistura de sacarificação e fermentação, e que suportam a produção pelo produtor de etanol procariótico de tal modo que a alta produção de etanol seja alcançada. A produção de etanol com o uso dos presentes métodos pode ser acima de 60 g/L.

[012] Consequentemente, a invenção fornece um método para produzir etanol que compreende: a)fornecer biomassa pré-tratada que compreende sólidos insolúveis e polissacarídeos; b)fornecer pelo menos uma enzima de sacarificação para a conversão de polissacarídeos a açúcares fermentáveis; c)fornecer um produtor de etanol procariótico; d)preparar, em um biorreator que compreende um agitador, uma mistura de sacarificação-fermentação que compreende a biomassa pré- tratada de a), a enzima de sacarificação de b) e o produtor de etanol procariótico de c); e e)cultivar o produtor de etanol procariótico na mistura de sacarificação-fermentação, em que a concentração de insumos totais de sólidos insolúveis na mistura de sacarificação-fermentação é de pelo menos cerca de 16% com base no peso seco por litro, e em que o produtor de etanol procariótico produz etanol. Em um aspecto da invenção, o agitador da invenção fornece não mais do que cerca de 0,2 watt/kg de potência da mistura total de sacarificação- fermentação.

[013] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir etanol que compreende: a)fornecer a biomassa pré-tratada de tamanho de partículaigual ou menor do que cerca de 100 μm ou um tamanho de partícula igual a ou maior que cerca de 600 μm, que compreende sólidos insolúveis e polissacarídeos; b)fornecer pelo menos uma enzima de sacarificação para aconversão de polissacarídeos a açúcares fermentáveis; c)fornecer um produtor de etanol procariótico; d)preparar, em um biorreator que compreende um agitador,uma mistura de sacarificação-fermentação que compreende a biomassa pré- tratada de a), a enzima de sacarificação de b) e o produtor de etanol procariótico de c); e e)cultivar o produtor de etanol procariótico na mistura desacarificação-fermentação em que: 1)a concentração de insumos totais de sólidosinsolúveis na mistura de sacarificação-fermentação é de pelo menos cerca de 16% com base no peso seco por litro; e 2)em que o produtor de etanol procariótico produzetanol.

[014] Em outro aspecto, a invenção fornece um sistema de sacarificação-fermentação que compreende: a)uma biomassa pré-tratada que compreende sólidosinsolúveis e polissacarídeos; b)pelo menos uma enzima de sacarificação para a conversãode polissacarídeos a açúcares fermentáveis; e c)um produtor de etanol procariótico; em que a biomassa de (a), enzima de (b) e produtor de etanol de (c) são combinados em uma mistura de sacarificação-fermentação, que tem uma concentração de insumos totais de sólidos insolúveis que é de pelo menos cerca de 16%, em peso, com base no peso seco por litro.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS, DEPÓSITOS BIOLÓGICOS E DESCRIÇÕES DE SEQUÊNCIA

[015] Os requerentes têm feito os seguintes depósitos biológicossob os termos do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para os propósitos do procedimento de patente: INFORMAÇÕES SOBRE CEPAS DEPOSITADAS

[016] A Figura 1 é um gráfico que mostra os efeitos de carga desólidos e RPM de agitação sobre SSF com o uso de Zymomonas recombinante e sabugo de milho pré-tratada com amônia diluída com 15 mg de proteína H3A/g de glucano+xilano.

[017] A Figura 2 é um gráfico que mostra o efeito de RPM e carga de sólidos sobre a viabilidade de Zymomonas mobilis recombinante sob condições de SSF com o uso de sabugo de milho pré-tratada com amônia diluída com 15 mg de proteína H3A/g de glucano+xilose.

[018] As Figuras 3 A e B são gráficos que mostram os efeitos de tamanhos de partícula diferentes sobre a fermentação com o uso de Zymomonas mobilis recombinante com o uso de esferas de vidro Ballotini com tamanho de partícula variado em uma 25% de carga de sólidos. A e B são experimentos diferentes que utilizam diferentes faixas de tamanho de partícula.

[019] A Figura 4 é um gráfico que mostra concentrações de etanol, xilose e glicose a partir de um aumento em escala de SSF de 1 L com dois impulsores de 6 lâminas Rushton (45 mm de diâmetro) rotativos a 100 RPM.

[020] A Figura 5 é um gráfico que mostra concentrações de etanol, xilose e glicose a partir de um aumento em escala de SSF de 1 L com dois impulsores de 6 lâminas marinhos (45 mm de diâmetro) rotativos a 150 RPM.

[021] A Figura 6 é um gráfico que mostra a produção de etanol em procedimentos de SSF com adição de 25 %, em peso, de biomassa e agitação inicial a 250 ou 750 RPM (A); ou com adição de biomassa e agitação dividida a 80 ou 250 RPM (B).

[022] A Figura 7A é um gráfico de taxa de agitação (Njs) ao longo do tempo para os procedimentos de SSF com 22,5% de sólidos com o uso da cepa AR3 7-31 com duas cargas de enzima diferentes.

[023] A Figura 7B é um gráfico de produção de etanol nos mesmos procedimentos de SSF.

[024] A Figura 8 mostra um gráfico de produção de etanol em procedimentos de SSF com o uso de hidrolisado de forragem de milho e duas cargas de enzima diferentes.

[025] A Figura 9 mostra um gráfico de concentrações de glicose, xilose, e etanol em amostras de procedimento de SSF com o uso de levedura, E. coli ou Z. mobilis como o biocatalisador.

[026] As seguintes sequências estão de acordo com a seção 37 do código de regulamentos federais (C.F.R. - Code of Federal Regulation) 1.821 -1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences e/ou Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") e consistentes com o padrão ST.25 da organização mundial de propriedade intelectual (WIPO - World Intellectual Property Organization) (1998) e as exigências da lista de sequência do EPO e PCT (regulamentações 5.2 e 49.5(a-bis), e seção 208 e Anexo C das instruções administrativas). Os símbolos e formatos usados para dados de sequência de aminoácido e nucleotídeo, obedecem as regulamentações apresentadas na seção 37 do código de regulamentos federais § 1 .822.

[027] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácido de Fv43D, a qual incorpora uma sequência de sinal previsto que corresponde às posições 1 a 20.

[028]SEQIDNO:2 é a sequência do Fv3A imaturo,a qualincorpora a sequência de sinal previsto que corresponde às posições 1 a 23.

[029]SEQIDNO:3 é a sequência do Fv51A imaturo,a qualincorpora a sequência de sinal previsto que corresponde às posições 1 a 19.

[030] SEQ ID NO:4 é a sequência do Xyn3 imaturo, a qual incorpora a sequência de sinal previsto que corresponde às posições 1 a 16.

[031] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácido de T. reesei β- glucosidase Bgl1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032] A invenção se refere ao uso de um produtor de etanol procariótico, tal como Zymomonas, em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF) ou um processo de sacarificação e fermentação híbrida (HSF), para a produção de etanol a partir de biomassa celulósica. A produção de etanol a partir de recursos renováveis para o uso como aditivo de combustível irá se dirigir à escassez em combustíveis fósseis, reduzir os custos de energia e ter impacto sobre o aquecimento global. Os processos de SSF ou HSF são preferidos na geração de etanol à medida que aumentam a eficiência geral da conversão de biomassa celulósica bruta para etanol.

[033] As seguintes definições e abreviações devem ser usadas para a interpretação das reivindicações e do relatório descritivo.

[034] Exceto onde observado em contrário, todas as patentes U.S. e pedidos de patente U.S. mencionados no presente documento estão incorporados o título de referência, em suas totalidades. Adicionalmente, quando uma quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro é dado como uma faixa, uma faixa preferida, ou uma lista de valores superiores preferidos e valores inferiores preferidos, isto deve ser compreendido especificamente como apresentação de todas as faixas formadas a partir de qualquer par de qualquer limite de faixa superior ou valor preferido e qualquer limite de faixa inferior ou valor preferido, independente de se as faixas são separadamente apresentadas. Onde uma faixa de valores numéricos é relatada no presente documento, exceto onde mencionado em contrário, a faixa é destinada a incluir os pontos finais da mesma, e todos os números inteiros e frações dentro da faixa. Não se pretende que o escopo da invenção seja limitado aos valores específicos relatados quando se define uma faixa.

[035] Para uso no presente documento, os artigos "um" e "o" que precedem um elemento ou componente da invenção são destinados a serem não restritivos em relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, "um" e "o" deveriam ser interpretados para incluir um ou pelo menos um, e a forma singular da palavra do elemento ou componente também inclui o plural, exceto onde o número deve ser obviamente singular.

[036] Para uso no presente documento, o termo "compreende" significa a presença das características, números inteiros, etapas ou componentes relatados conforme mencionados nas reivindicações, mas que não exclui a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo "compreende" é destinado a incluir as modalidades incluídas pelos termos "consiste essencialmente em” e "consiste em”. Semelhantemente, o termo "consiste essencialmente em” é destinado a incluir as modalidades incluídas pelo termo "consiste em”.

[037] Para uso no presente documento, o termo "cerca de" que modifica a quantidade de um ingrediente ou reagente da invenção ou empregado se refere à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através de procedimentos típicos de manuseio de líquido e medição usados para fazer concentrados ou soluções de uso no mundo real; através de erro acidental nestes procedimentos; através de diferenças na fabricação, fonte ou pureza dos ingredientes empregados para fazer as composições ou realizar os métodos; e similares. O termo "cerca de" também inclui as quantidades que se diferem devido a diferentes condições de equilíbrio para uma composição que resulta a partir de uma mistura inicial particular. Se ou não modificadas pelo termo "cerca de", as reivindicações incluem equivalentes às quantidades.

[038] O termo "invenção" ou "presente invenção", para uso no presente documento, é um termo não limitador e não é destinado a se referir a qualquer modalidade única da invenção particular, mas inclui todas as possíveis modalidades, conforme descrito no relatório descritivo e nas reivindicações.

[039] O termo "produtor de etanol" se refere a um organismo que produz etanol através do metabolismo de fontes de carboidrato.

[040] O termo "sacarificação e fermentação simultânea (SSF)" se refere a um processo em que a biomassa é sacarificada e os açúcares fermentáveis produzidos a partir da sacarificação são usados por um biocatalisador para produzir um produto tudo ao mesmo tempo, tipicamente no mesmo recipiente de reação.

[041] O termo "sacarificação e fermentação híbrida (HSF)" se refere a um processo em que a biomassa é sacarificada a uma extensão limitada (sacarificação incompleta ou parcial), seguida pela sacarificação e fermentação contínua que ocorrem simultaneamente.

[042] O termo "açúcar(es) fermentável(is)" se refere a oligossacarídeos e monossacarídeos que podem ser usados como uma fonte de carbono por um microrganismo em um processo de fermentação.

[043] O termo "sacarificação parcial” se refere à sacarificação limitada de biomassa, onde os açúcares fermentáveis liberados são menores do que o total de açúcares fermentáveis que seriam liberados se a sacarificação executada até a completação.

[044] O termo "celulósico" se refere a uma composição que compreende celulose e componentes adicionais, que incluem hemicelulose e lignina.

[045] O termo "sacarificação" se refere à produção de açúcares fermentáveis a partir de polissacarídeos.

[046] O termo "biomassa pré-tratada" se refere à biomassa quetem sido submetida ao pré-tratamento antes da sacarificação.

[047] "Biomassa" se refere a qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui materiais que compreendem celulose e, opcionalmente, que compreende, adicionalmente, hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa também pode compreender componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídeo. A biomassa pode ser derivada a partir de uma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada a partir de mais do que uma fonte; por exemplo, a biomassa poderia compreender uma mistura de sabugos de milho e forragem de milho, ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa inclui, mas não se limita a, cultivos para bioenergia, resíduos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, forragem, resíduos florestais e de madeira. Os exemplos de biomassa incluem, mas não se limitam a, sabugos de milho, resíduos de cultivo, tais como cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, Panicum virgatum (switchgrass), resíduos de papel, bagaço de cana de açúcar, sorgo, componentes obtidos a partir da moagem de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbustos e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal.

[048] "Hidrolisato de biomassa" se refere ao produto que resulta a partir da sacarificação de biomassa. A biomassa também pode ser pré-tratada antes da sacarificação.

[049] O termo "enzima de sacarificação" se refere a uma enzima que pode catalisar a conversão de um componente de biomassa a açúcares fermentáveis. Tipicamente, a enzima é mais eficaz quando a biomassa é pré- tratada.

[050] O termo "sólidos insolúveis" se refere a sólidos que não se dissolvem em solução.

[051] O termo "insumos totais de sólidos insolúveis” se refere ao peso seco total de sólidos insolúveis de biomassa que está incluído em uma mistura de sacarificação-fermentação. Quando a biomassa é adicionada em múltiplas partes, o peso seco dos sólidos insolúveis de cada parte é adicionado em conjunto para proporcionar os insumos totais de sólidos insolúveis. A concentração de sólidos insolúveis na mistura de sacarificação-fermentação é mencionada como % com base no peso seco por litro, significando gramas em peso seco por litro da mistura total de sacarificação-fermentação. Portanto, 16% com base no peso seco por litro, por exemplo, significa 160 gramas em peso seco por litro da mistura total de sacarificação-fermentação.

[052] O termo "agitador" se refere a um mecanismo através do qual a potência pode ser aplicada a uma mistura para provocar a misturação do componente da mistura. Tipicamente, existe movimento de rotação de um mecanismo que causa a misturação através de um agitador.

[053] Deve-se compreender que, quando uma faixa de valores numéricos é aqui fornecida, a mesma abrange os pontos finais da faixa, exceto onde especificamente mencionado em contrário. Os valores numéricos devem ser considerados como tendo a precisão do número de figuras significantes fornecidas. Por exemplo, deve-se compreender que o número 1 inclui uma faixa a partir de 0,5 a 1,4, enquanto que o número 1,0 deve incluir uma faixa a partir de 0,95 a 1,04, que inclui os pontos finais das faixas mencionadas.

[054] A presente invenção se refere a métodos para a produção de etanol com o uso de uma cepa de Zymomonas em um processo de SSF. O método prossegue com uma biomassa celulósica que é pré-tratada e incluída em alta concentração de sólidos insolúveis em uma mistura de sacarificação- fermentação que compreende o produtor de etanol Zymomonas na presença de pelo menos uma enzima de sacarificação, sob condições de baixa potência de agitação. O processo resultante pode produzir etanol acima de 60 g/L.

BIOMASSA PRÉ-TRATADA

[055] A biomassa do presente método pode ser pré-tratada por meio de qualquer processo que prepara a biomassa para a liberação eficaz de açúcares fermentáveis durante a sacarificação. Os pré-tratamentos são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, os tratamentos com produtos químicos básicos ou ácidos e/ou tratamento mecânico para redução de tamanho. A biomassa pré-tratada contém sólidos insolúveis, polissacarídeos (os quais são, tipicamente, parte dos sólidos insolúveis), e outros componentes que incluem alguns que são inibitórios para o crescimento de Zymomonas e produção de etanol. Deseja-se que a biomassa pré-tratada usada no presente método tenha níveis suficientemente baixos de inibidores de fermentação para permitir o crescimento e produção máxima por um produtor de etanol procariótico, tal como Zymomonas, em uma mistura de sacarificação-fermentação que contém a biomassa pré-tratada.

[056] Por exemplo, o acetato é um componente de biomassa pré- tratada que é inibitório para Zymomonas. O teor de acetato na biomassa pré- tratada pode ser reduzido mediante a lavagem da biomassa pré-tratada para remover o acetato e outros inibidores. Alternativamente, um pré-tratamento particular pode resultar em níveis de acetato que são compatíveis com a produção e crescimento de Zymomonas. O uso de amônia no pré-tratamento pode resultar em níveis menores de inibidores, tais como acetato, na biomassa pré-tratada. Os requerentes têm revelado que a biomassa tratada com amônia pode ter uma razão molar de acetamida para acetato maior do que cerca de 1 e uma conversão de acetila de mais do que 60%, por exemplo, maior do que cerca de 65% ou maior do que cerca de 70%. Deste modo, com a concentração menor de inibidor, as etapas de filtração e lavagem não são necessárias para se obter rendimentos de açúcar aperfeiçoados, e na medida em que os custos associados a estas etapas afetam negativamente a economia do método, a filtragem elavagem da biomassa é, de preferência, omitida.

[057] Consequentemente, a biomassa pré-tratada com amônia é preferida para o uso no presente método. Prefere-se utilizar uma concentração de amônia que é menor do que cerca de 12%, em peso, em relação ao peso seco de biomassa, conforme em um método de pré-tratamento que é apresentado na patente U.S. de propriedade comum no. 7.781.191.

[058] Além disso, diferentes cepas de Zymomonas ou outras cepas de produtor de etanol podem ter diferentes níveis de tolerância ao acetato e/ou outros inibidores que estão presentes na biomassa pré-tratada. As cepas de Zymomonas podem ser sensíveis aos níveis de acetato, tais como 4 a 5 g/L. Além disso, as cepas de Zymomonas podem ser preparadas para terem tolerância aperfeiçoada ao acetato, por exemplo, por meio de engenharia genética, conforme apresentado na publicação de pedido de patente U.S copendente e de propriedade comum no. 2009-0203099 A1. Além disso, a tolerância ao acetato aperfeiçoada pode ser alcançada mediante a adaptação no meio contendo acetato, conforme apresentado no pedido de patente dos Estados Unidos copendente e de propriedade comum no. 12/641642, publicado como WO 2010/075241, o qual está aqui incorporado o título de referência. As cepas de Zymomonas produzidas com o uso do processo de adaptação apresentado são adequadamente tolerantes pelo menos cerca de 9 a 10 g/L de acetato. Para o crescimento de Zymomonas e produção de etanol máxima, há compatibilidade entre o nível de acetato na mistura de sacarificação-fermentação contendo biomassa pré-tratada e o nível de tolerância de acetato da cepa de Zymomonas usada para a produção de etanol, com base no nível de tolerância da cepa de Zymomonas, onde a tolerância se refere à capacidade de uma cepa de crescer e produzir etanol de maneira similar em um meio com o nível especificado de acetato, conforme comparado com um meio commenos ou nenhum acetato.

SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEA

[059] O presente método se aplica à sacarificação e fermentação simultânea (SSF). É preparada uma mistura de sacarificação-fermentação que inclui biomassa pré-tratada, um produtor de etanol procariótico e pelo menos uma enzima que converte polissacarídeos de biomassa pré-tratada a açúcares fermentáveis. Os componentes de meio adicionais, tais como açúcares, sais, intensificador de crescimento e/ou um antibiótico que corresponde a um gene de resistência antibiótico nas células do produtor de etanol não são tipicamente necessários, mas podem ser incluídos. Os componentes da biomassa pré- tratada são sacarificados, ou hidrolisados, por uma ou mais das enzimas de sacarificação para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose e xilose. Os açúcares são liberados no decorrer do tempo a partir da biomassa pré-tratada. Os açúcares liberados são metabolizados pelo produtor de etanol para produzir etanol como um produto.

SACARIFICAÇÃO

[060] As enzimas de sacarificação são analisadas em Lynd, L. R., et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66:506-577, 2002). Pelo menos uma enzima é usada e, tipicamente, é usado um consórcio de enzima de sacarificação que inclui uma ou mais glicosidases. As glicosidases hidrolisam as ligações de éter de di-, oligo- e polissacarídeos e são encontradas na classificação de enzima EC 3.2.1 .x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com Aditamento 1 (1993), Aditamento 2 (1994), Aditamento 3 (1995, Aditamento 4 (1997) e Aditamento 5 [em Eur. J. Biochem., 223:1 -5, 1994; Eur. J. Biochem., 232:1 -6, 1995; Eur. J. Biochem., 237:1 -5, 1996; Eur. J. Biochem., 250:1 -6, 1997; e Eur. J. Biochem., 264:610-650 1999, respectivamente]) do grupo geral "hidrolases" (EC 3.). As glicosidases úteis no presente método podem ser categorizadas pelos componentes de biomassa que hidrolisam. As glicosidases úteis para o presente método incluem glicosidases que hidrolisam celulose (por exemplo, celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β- glucosidases), glicosidases que hidrolisam hemicelulose (por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β- xilosidases, arabino-xilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases), e glicosidases que hidrolisam amido (por exemplo, amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Além disso, pode ser útil adicionar outras atividades ao consórcio de enzima de sacarificação, tal como peptidases (EC 3.4.x.y), lipases (EC 3.1 .1 .x e 3.1 .4.x), ligninases (EC 1.11.1.x), e feruloil esterases (EC 3.1 .1 .73) para ajudar a liberar polissacarídeos a partir de outros componentes da biomassa. Também é conhecido na técnica que os microrganismos que produzem enzimas que hidrolisam polissacarídeo exibem muitas vezes uma atividade, tal como degradação de celulose, que é catalisada por várias enzimas ou um grupo de enzimas (ou um "consórcio de enzima") que tem diferentes especificidades de substrato. Deste modo, uma "celulase" a partir de um microrganismo pode compreender um grupo de enzimas, cuja uma ou mais, ou todas, podem contribuir para a atividade de degradação de celulose. As preparações de enzima comerciais ou não comerciais, tais como celulase, podem compreender inúmeras enzimas dependendo do esquema de purificação utilizado para se obter a preparação de enzima.

[061] As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, na forma isolada, tal como celulase Spezyme® CP (Danisco US, Inc, Rochester, NY) e xilanase Multifect® (Danisco US, Inc.). Além disso, as enzimas de sacarificação podem ser não purificadas e fornecidas como um tipo de extrato de célula ou preparação de célula total. As enzimas podem ser produzidas com o uso de microrganismos recombinantes que têm sido elaborados para expressar múltiplas enzimas de sacarificação.

[062] Um elemento versado na técnica saberia como determinar as quantidades eficazes de enzimas para utilizar no presente método de SSF, e ajustar as condições para atividade de enzima ótima na SSF. Um elemento versado na técnica também saberia como otimizar as classes de atividades de enzima exigidas para se obter a sacarificação ótima de uma determinada biomassa pré-tratada sob as condições selecionadas.

SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO HÍBRIDA

[063] Além disso, o presente método pode ser executado como sacarificação e fermentação híbrida (HSF). Neste processo, a sacarificação ocorre por um período de tempo antes da fermentação, onde a sacarificação parcial, mas não completa, ocorre. Neste processo, o produtor de etanol é adicionado um período de tempo depois que a biomassa pré-tratada e a enzima de sacarificação são combinadas, de modo que alguma sacarificação ocorra na ausência de fermentação. O período de tempo antes do produtor de etanol ser adicionado pode variar e é tipicamente em uma faixa a partir de uma a poucas horas, de modo que os açúcares fermentáveis sejam liberados e já estejam presentes em uma concentração desejável quando o produtor de etanol é adicionado. A HSF é exemplificada no Exemplo 4, onde as células de Zymomonas são adicionadas uma hora após a adição das enzimas de sacarificação.

PRODUTOR DE ETANOL PROCARIÓTICO

[064] A presente mistura de sacarificação-fermentação inclui inicialmente um inoculo de células de semente a partir de uma cepa de um produtor de etanol procariótico. Quaisquer células procarióticas que produzem etanol podem ser usadas de modo eficaz como o produtor de etanol. As células usadas podem produzir etanol naturalmente, serem elaboradas para produzir etanol ou podem ser produtores naturais de etanol que são elaborados para a produção de etanol aperfeiçoada. Os exemplos de produtores de etanol procarióticos incluem, mas não se limitam a, Clostridium (Stevenson e Weimer (2005) Applied and Environmental Microbiology 71:4672-4678), cepas de E. coli que são are elaboradas para a produção de etanol (US 5.000.000), cepas de Geobacillus thermoglucosidasius (Cripps et al. (2009) Metabolic Engineering 1 1 :398-408) que são elaboradas para a produção de etanol, cepas de Klebsiella oxytoca que são elaboradas para produção de etanol (Ohta et al. (1991 ) Applied and Environmental Microbiology 57:2810- 2815), Zymobacter (Yanase et al. (2007) AppI. Environ. Mirobiol.73:2592- 2599) e Zymomonas.

[065] A Zymomonas é preferida como um produtor de etanol procariótico, a qual fermenta naturalmente a glicose para produzir etanol. As cepas de Zymomonas que têm sido elaboradas para a utilização de xilose (patentes U.S. nos. 5.514.583, 5.712.133, 6.566.107, publicação de patente PCT número WO 95/28476, Feldmann et al. (1992) AppI Microbiol Biotechnol 38: 354361, Zhang et al. (1995) Science 267:240-243) são úteis no presente método. As cepas de Zymomonas que têm aperfeiçoamentos em propriedades relacionadas à produção de etanol têm sido feitas por engenharia genética e/ou adaptação. Prefere-se que uma cepa de Zymomonas com múltiplos aperfeiçoamentos obtidos mediante a engenharia e/ou adaptados sejam usados no presente método para maximizar a produção de etanol. Os aperfeiçoamentos que têm sido feitos que podem estar presentes incluem, mas não se limitam a: 1) engenharia e adaptação para a utilização de xilose aperfeiçoada (patente U.S. no. 7.223.575 e patente U.S. de propriedade comum no. 7.741.119, US-2009-0246876 A1 e US- 2009-0246846 A1); 2) redução da síntese de subprodutos prejudiciais à produção de etanol (documento de propriedade comum sob o no. US 7.741.119); 3) engenharia para tolerância de acetato aperfeiçoada (publicação de pedido de patente US copendente e de propriedade comum no.: US2009-0203099 A1, e pedido de patente dos Estados Unidos 12/641642, publicado como WO 2010/075241).

[066] As cepas de Zymomonas com tolerância de acetato aperfeiçoada produzidas, tal como pelo processo apresentado no documento sob o no. WO 2010/075241, são preferidas para o uso no presente método. Com o uso destas cepas, a biomassa pré-tratada pode ser incluída na presente mistura de sacarificação-fermentação em alta concentração, enquanto que se mantém o nível de acetato que não é prejudicial para a produção de etanol, sem a lavagem extensiva para remover o acetato a partir da biomassa pré-tratada.

[067] Tipicamente, a cepa de Zymomonas desejada é cultivada como uma cultura de semente. Uma cultura de semente pode ser cultivada, por exemplo, no meio que consiste em: 5 a 20 g/L de extrato de levedura, 2 a 4 g/L de hidrogênio fosfato de potássio, 1 a 5 g/L de heptahidrato de sulfato de magnésio e 100 a 200 g/L de glicose a OD600 nm de 10 em 32 °C a 33 °C, pH 5,5 a 5,8. A cultura de semente é usada para iniciar a SSF mediante a adição de um volume que é equivalente a cerca de 10% do volume da mistura de sacarificação-fermentação.

SÓLIDOS INSOLÚVEIS EM SSF

[068] Para maximizar a produção de etanol em SSF, a quantidade de sólidos insolúveis, os quais estão presentes na biomassa pré-tratada, é incluída em um alto nível na mistura de sacarificação-fermentação. A quantidade de sólidos insolúveis da biomassa pré-tratada incluída se correlaciona com a quantidade de açúcares fermentáveis que podem ser produzidos durante a SSF, a qual, por sua vez, se correlaciona com a quantidade de etanol que pode ser produzido a partir das células de Zymomonas, mediante a metabolização dos açúcares fermentáveis.

[069] A quantidade de sólidos insolúveis em relação à quantidade de sólidos e, uma preparação de biomassa pré-tratada irá variar dependendo do pré-tratamento particular usado, assim como se qualquer etapa de lavagem está incluída. A lavagem irá solubilizar os sólidos que não são insolúveis, deixando um percentual maior de sólidos insolúveis nos sólidos totais. Alguns pré- tratamentos ácidos podem converter até 30% de sólidos da biomassa não pré- tratada para sólidos solúveis, deixando 70% de sólidos totais como insolúveis. Em contrapartida, com um pré-tratamento com baixo teor de amônia, a quantidade de sólidos e a quantidade de sólidos insolúveis podem ser similares na biomassa pré-tratada. A quantidade de sólidos insolúveis em relação aos sólidos totais em uma amostra de biomassa pré-tratada pode se situar tipicamente na faixa de cerca de 70% a cerca de 99%. Por exemplo, na biomassa pré-tratada com amônia de baixo teor usada nos exemplos do presente documento, os sólidos insolúveis consistem em 90% a 91% dos sólidos totais. No presente processo, a quantidade de insumos totais de sólidos insolúveis a partir da biomassa pré-tratada que é incluída na mistura de sacarificação- fermentação que é importante para os efeitos de entrada de potência sobre a produção de etanol pelo produtor de etanol procariótico. No presente método, a quantidade total de sólidos insolúveis que é carregada na mistura de sacarificação-fermentação é de pelo menos cerca de 160 gramas de peso seco por litro da mistura total de sacarificação-fermentação, ou 16%.

[070] Para auxiliar a misturação da mistura de sacarificação- fermentação, a biomassa pré-tratada pode ser adicionada em duas ou mais partes. Com a adição de uma parte inicial, a concentração de sólidos insolúveis pode ser menor do que 16%. O ajuste de pH e a temperatura é facilitado em concentração menor de sólidos insolúveis. A biomassa pré-tratada adicional pode, então, ser adicionada de tal modo que a carga de insumos totais de sólidos insolúveis seja de pelo menos cerca de 16%. A biomassa adicional pode ser adicionada antes ou após a enzima e/ou cargas de Zymomonas. A biomassa adicional pode ser adicionada em uma ou mais partes. Os insumos totais de sólidos insolúveis carregados podem ser de pelo menos cerca de 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21 %, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou mais, incluindo qualquer número inteiro entre os números relacionados.

[071] À medida que o procedimento de SSF prossegue a quantidade de sólidos insolúveis diminui, conforme a biomassa pré-tratada é sacarificada pelas enzimas de sacarificação presentes na SSF. Os sólidos insolúveis podem diminuir tipicamente para cerca da metade, ou menos, da quantidade original após cerca de 120 horas de um determinado procedimento de SSF.

POTÊNCIA DO AGITADOR

[072] A mistura de sacarificação-fermentação é agitada em um biorreator com o uso de um agitador para fornecer a misturação dos componentes que incluem a biomassa pré-tratada, as enzimas de sacarificação, células de Zymomonas e, opcionalmente, outros componentes do meio. Os requerentes revelaram que, quando uma alta quantidade de potência é fornecida na agitação de uma mistura de sacarificação-fermentação que contém, por exemplo, cerca de 25% ou mais de sólidos insolúveis, a produção de etanol pelo produtor de etanol Zymomonas é negativamente afetada. A agitação vigorosa (200 RPM) de uma mistura que tem 25% de concentração de sólidos insolúveis resultou na produção de etanol reduzida e viabilidade de Zymomonas reduzida, enquanto que a agitação vigorosa de uma mistura que tem 12% de sólidos não teve tal efeito.

[073] Deste modo, a misturação é necessária durante a SSF, ainda que a capacidade de produção de etanol das células de Zymomonas precisa ser mantida. Os requerentes têm calculado a potência que um agitador pode fornecer para uma mistura de sacarificação-fermentação que contém produtor de etanol Zymomonas e pelo menos cerca de 22,5% de sólidos insolúveis, conforme descrito no Exemplo 5 no presente documento, para suportar a produção de etanol desejada. No presente método, é fornecida a misturação em que a potência fornecida pelo agitador não é maior do que cerca de 0,2 watts por quilograma de mistura total de sacarificação-fermentação. A entrada de potência preferida para a maximização da produção de etanol é de menos que cerca de 0,2, 0,15, 0,1,0,05, 0,01,0,005 ou 0,003 watts/kg da mistura total de sacarificação-fermentação. O agitador pode consistir em qualquer agitador giratório, que inclui qualquer tipo de impulsor, tal como um Rushton (6 lâminas) e qualquer variedade de lâminas inclinadas (marinho, 4 lâminas, 3 segmentos). Duas ou mais lâminas podem ser usadas, onde a soma das potências individuais do impulsor é menor do que cerca de 0,2 watt/kg. A potência pode ser variada no decorrer do tempo, à medida que a viscosidade da mistura de sacarificação-fermentação diminuir devido à sacarificação da biomassa.

[074] Além disso, revelou-se que na presença de esferas de vidro na faixa de tamanho entre 100 μm e 600 μm, o desempenho da produção de etanol de Zymomonas é reduzido quando há agitação vigorosa. Deste modo, quando o tamanho de partícula da biomassa é nesta faixa, a agitação é reduzida conforme descrito acima para a produção de etanol máxima. Com o tamanho de partícula da biomassa menor que cerca de 100 μm ou maior do que cerca de 600 μm, a agitação vigorosa pode ser usada. No entanto, a biomassa pré-tratada pode ter inicialmente tamanho de partícula maior, mas a redução do tamanho de partícula pode ocorrer durante um procedimento de SSF. O tamanho de partícula de qualquer tipo de biomassa pode ter este efeito sobre as células de Zymomonas, conforme demonstrado pelas esferas de vidro.

CONDIÇÕES PARA SSF

[075] A mistura de sacarificação-fermentação é mantida em um biorreator com um agitador para a produção de etanol.As condições favoráveis para sacarificação e fermentação por Zymomonas são mantidas. O pH é tipicamente mantido entre cerca de 5 e cerca de 7 com o uso de solução cáustica (tal como, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio) e ácido sulfúrico ou fosfórico. Tipicamente, o pH é mantido em 5,8 com o uso de NaOH como base e H2SO4 como ácido. A temperatura é mantida entre cerca de 28 °C e cerca de 37 °C. Tipicamente, a temperatura é mantida em cerca de 33 °C ou variada entre 33 °C e 28 °C. A SSF continua por pelo menos cerca de 40 horas, com 120 horas ou mais sendo típico para um procedimento.

[076] O procedimento pode ser em lote, onde as alterações mínimas são feitas, tais como ajuste de pH, ou alimentação por lote onde os componentes podem ser alimentados à mistura de sacarificação-fermentação à medida que a SSF prossegue. Os métodos de cultura de lote e alimentação por lote são comuns e bem conhecidos na técnica e os exemplos podem ser encontrados em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger, e Brock, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, ou Deshpande, Mukund V., Appl Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992). No presente método, os componentes que podem ser adicionados durante um procedimento de alimentação por lote podem incluir a biomassa pré-tratada adicional e/ou as enzimas de sacarificação adicionais.

CONCENTRAÇÕES DE ETANOL

[077] A alta produção de etanol é alcançável com o uso do presente método. A quantidade específica de etanol produzido no presente método de SSF irá variar dependendo das condições, tais como, a cepa de Zymomonas específica usada, o tipo de biomassa, pré-tratamento da biomassa, concentração de sólidos insolúveis e enzimas de sacarificação. Tipicamente, o etanol pode ser produzido em mais do que cerca de 40 g/L. O etanol pode ser produzido em, por exemplo, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80 ou cerca de 85 g/L.

EXEMPLOS

[078] A presente invenção é adicionalmente definida nos seguintes Exemplos. Deve-se compreender que estes exemplos, enquanto que indicam as modalidades preferidas da invenção, são dados somente o título deilustração. A partir da discussão acima e destes exemplos, um elemento versado na técnica pode observar que as características essenciais desta invenção, e sem que se desvie do espírito e escopo da mesma, podem fazer diversas alterações e modificações da invenção para que se adaptem aos diversos usos e condições.

[079] O significado das abreviações usadas é conforme exposto a seguir: "min." significa minuto(s), "h" significa hora(s), "μL" significa microlitro(s), "mL" ou "ml" significa mililitro(s), "L" significa litro(s), "nm" significa nanometro(s), "mm" significa milímetro(s), "cm" significa centímetro(s), "μm" significa micrometro(s), "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "μmmol" significa micromol(es), "g" significa grama(s), " g" significa micrograma(s), "mg" significa miligrama(s), "kg" significa quilograma(s) "g" significa a constante de gravidade, "RPM" ou "rpm" significa revoluções por minuto, "h.p." significa cavalo -vapor, "v%" é % em volume, "atm" significa atmosfera, "%, em peso," é porcentagem de peso, "CFU" é unidades de formação de colônia, "~" significa aproximadamente, "h" significa hora(s), "p" significa densidade, "μ" significa viscosidade, "D|" significa diâmetro de impulsor, "RPS" significa revoluções por segundo, "EFT" significa tempo de fermentação transcorrido.

MÉTODOS GERAIS:

[080] Os materiais e métodos adequados para a manutenção e crescimento de culturas bacterianas também são bem conhecidos na técnica. As técnicas adequadas para o uso nos seguintes exemplos podem ser encontradas no Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, eds., American Society for Microbiology, Washington, DC, 1994, ou por Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, 1989. Todos os reagentes e materiais utilizados para o crescimento e manutenção de células bacterianas foram obtidos junto a Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies (Rockville, MD) ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), exceto onde especificado em contrário.

PRÉ-TRATAMENTO DO SABUGO

[081] O sabugo de milho foi pré-tratado antes da hidrólise enzimática com o uso dos métodos com baixo teor de amônia descritos na patente U.S. de propriedade comum no. 7.781.191.

[082] Um recipiente do reator horizontal de 130 L da Littleford Day contendo uma camisa para a passagem de vapor em torno do corpo do recipiente foi usado para o pré-tratamento para gerar o sabugo pré-tratado chamada SSL21. O recipiente foi carregado com sabugo a partir do processamento de semente de milho (menor do que 1 mm em tamanho) para alcançar 46 %, em volume, do preenchimento do reator em uma base de sabugo úmido (57,5 lbs). O sabugo foi reduzido a menos que 1 mm em tamanho com o uso de um grande micropulverizador (Modelo no. 1 SH, Serial no.10019) com uma peneira de 1,0mm. Uma colher de gelo seco foiadicionada, conforme necessário, ao sabugo antes da trituração para evitar que o equipamento esquente. O acionador principal do micropulverizador é um motor de 5 h.p., com uma velocidade de rotor máxima de 9.600 RPM. Tinha seis martelos giratórios; invólucro e é revestido com bordas de impacto opostas.

[083] O sabugo teve uma densidade aparente solta úmida de 0,420 g/cm3 e 7,5%, em peso, de umidade. O vácuo foi aplicado ao recipiente para alcançar 0,1 atm. antes da introdução de uma solução de hidróxido de amônio de 28,9 %, em peso (11,2 lbs) e água (20,1 lbs) próximo ao topo do recipiente para proporcionar 6 %, em peso, de NH3 em relação à biomassa de peso seco e 60 %, em peso, de sólidos dentro do recipiente. A Tabela 1 relaciona as propriedades do sabugo e quantidades de hidróxido de amônio e água usados para um segundo lote de pré-tratamento chamado SSL22. Em ambos os casos, o agitador do reator foi ajustado para 70 rpm e o vapor foi passado através da camisa do recipiente. Quando o recipiente alcançou uma temperatura interna de 80 °C, o vapor foi introduzido próximo ao topo do recipiente para elevar a temperatura interna do recipiente para 145 °C. Esta temperatura foi mantida por 20 minutos.Em 15 minutos deste tempo retido, o fluxo de vapor através da camisa foi interrompido. No final do pré-tratamento, o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação para alcançar a pressão atmosférica. O vácuo (aproximadamente a menos que 1 atm.) foi subsequentemente aplicado por 15 minutos para reduzir a temperatura para menos que 60 °C e remover a amônia e água adicional a partir do sabugo pré-tratado antes da abertura da válvula do fundo do recipiente e da recuperação da biomassa pré-tratada. A tabela 2 relaciona as especificações do sabugo pré-tratado para os lotes SSL21 e SSL22. Uma amônia residual de menos que 0,3 kg de NHa/100 kg de sólidos secos é desejada, assim como uma razão de acetamida para ácido acético maior do que 1,0.

[084] Os sólidos insolúveis foram determinados como 90% a 91 % de sólidos totais para o lote de sabugo pré-tratado SSL21.TABELA 1: PROPRIEDADES DO SABUGO E QUANTIDADES DE HIDRÓXIDO DE AMÔNIO E ÁGUA USADAS PARA O SEGUNDO LOTE DE PRÉ-TRATAMENTO (SSL 22).

TABELA 2: ESPECIFICAÇÕES DO SABUGO PRÉ-TRATADO PARA OS LOTES SSL21 ESSL22

COMPOSIÇÃO DO SABUGO

[085] A quantidade de glucano e xilano no sabugo de partida foi determinada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, tais como ASTM E1758-01 "Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC" e conforme adicionalmente detalhado em National Renewable Energy Lagoratory (Golden, CO) Technical Report NREL/TP-510-42618 (revisado em abril de 2008). A composição foi determinada como 34,8 %, em peso, de glucano, 29,2 %, em peso, de xilano e 12,8 %, em peso, de lignina com base no peso seco.

PRÉ-TRATAMENTO DE FORRAGEM

[086] As forragens de milho foram pré-tratadas antes da hidrólise enzimática com o uso de métodos com baixo teor de amônia descritos na publicação de pedido de patente dos Estados Unidos copendente e de propriedade comum no. US-2007/0031918-A1.

[087] As forragens de milho de segunda passagem foram moídas para o tamanho de partícula d50 médio de 2 mm. As forragens tiveram uma densidade aparente solta de 0,183 g/cm3 e 8,73 %, em peso, de umidade. Cerca de 109 a 117 kg das forragens pré-moídas foram carregadas em um recipiente de pressão cilíndrico horizontal de 1700 L. O vácuo foi aplicado ao recipiente para alcançar 0,1 atm. antes da alimentação da solução de hidróxido de amônio e água para atingir cerca de 11 % de NH3 em relação à matéria seca. Um impulsor no recipiente foi girado a aproximadamente 37 rpm e o vapor foi passado através da camisa do recipiente por todo o procedimento. O vapor foi introduzido ao recipiente para elevar a temperatura interna do recipiente para cerca de 150 °C. Esta temperatura foi mantida por 30 minutos sob pressão do reator constante de cerca de 8 bar (abs.; 0,8 megapascal). No final do pré-tratamento, o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação para alcançar a pressão atmosférica. O vácuo (aproximadamente a menos que 1 atm.) foi subsequentemente aplicado por 4 a 8 minutos para reduzir a temperatura para menos que 60 °C e para remover a amônia e água adicional a partir das forragens pré-tratadas antes da abertura da válvula de fundo do recipiente e da recuperação da biomassa pré-tratada.

[088] As forragens de segunda passagem não foram analisadas acerca de sua composição, no entanto, os componentes composicionais foram estimados na Tabela 3 com base nas determinações de forragem anteriores.TABELA 3: SUPOSTA COMPOSIÇÃO DAS FORRAGENS DE MILHO DE SEGUNDAPASSAGEM

CEPA DE PRODUÇÃO DE CELULASE E HEMICELULASE

[089] A cepa H3A é uma cepa de Trichoderma reesei recombinante que foi preparada conforme exposto a seguir.Uma cepa mutante de Trichoderma reesei, derivada a partir de RL- P37 (Sheir-Neiss, G et al. Appl. Microbiol.Biotechnol. 1984, 20:46-53) e selecionada para alta produção de celulase foi cotransformada com um cassete de expressão de β- glucosidase (que compreende um promotor de cbh1, uma região de codificação de β- glucosidase1 (SEQ ID NO:5), um terminador de cbh1 e um gene amdS), e um cassete de expressão de endoxilanase (que compreende um promotor de cbhl, uma região de codificação de endoxilanase e um terminador de cbhl) (SEQ ID NO: 4) com o uso de eletroporação. Um transformante foi chamado de cepa no. 229. A cepa no. 229 foi cotransformada com um cassete de expressão de β- xilosidase Fv3A (SEQ ID INO: 2) (que compreende um promotor de cbh1, uma região de codificação de β-xilosidase, um terminador de cbh1 e um gene als), um cassete de expressão de β-xilosidase Fv43D (que compreende um promotor de eg1, uma região de codificação de β-xilosidase, (SEQ ID NO: 1 ) e um terminador nativo) e um cassete de expressão de Fv51A a- arabinofuranosidase (que compreende um promotor de eg1, uma região de codificação de L-α- arabinofuranosidase (SEQ ID NO:3) e um terminador nativo) com o uso de eletroporação. A cepa H3A foi isolada a partir desta etapa de transformação.

[090] A proteína extracelular produzida durante a fermentação da cepa H3A foi separada a partir da massa celular por meio de centrifugação, concentrada por meio de ultrafiltração por membrana através de uma membrana de peso molecular de corte 10 kD Millipore e o pH ajustado para 4,8. A proteína total foi determinada com o uso de um método de Biureto modificado, conforme modificado por Weichselbaum e Gornall com o uso de albumina sérica bovina como um calibrador (Weichselbaum, 1960, Amer. J. Clin. Path. 16:40; Gornall et al., 1949 J. Biol. Chem 177:752). Esta preparação de proteína extracelular de H3A, também chamada aqui como proteína H3A, foi usada como uma preparação de celulase e hemicelulase de combinação efetuando a hidrólise de carboidrato complexa durante o SSF.

[091] A proteína extracelular produzida durante a fermentação da cepa H3A foi separada a partir da massa celular por meio de centrifugação, concentrada por meio de ultrafiltração por membrana através de uma membrana de peso molecular de corte 10 kD Millipore e o pH ajustado para 4,8. A proteína total foi determinada com o uso de um método de Biureto modificado, conforme modificado por Weichselbaum e Gornall com o uso de albumina sérica bovina como um calibrador (Weichselbaum, 1960, Amer. J. Clin. Path. 16:40; Gornall et al., 1949 J. Biol. Chem 177:752). Esta preparação de proteína extracelular de H3A, aqui chamada de proteína H3A, foi usada como uma preparação de celulase e hemicelulase de combinação efetuando a hidrólise de carboidrato complexa durante o SSF.

PREPARAÇÃO DE INOCULO E BIOCATALISADOR ORIGEM DAS CEPAS DE ZYMOMONAS MOBILIS USADAS NA SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEA (SSF)

[092] As cepas de produção de etanol, que utilizam xilose, de Zymomonas mobilis podem ser usadas no SSF. A cepa de Zymomonas mobilis ZW705 foi produzida a partir da cepa ZW801-4, conforme brevemente aqui reiterado. A ZW801-4 é uma cepa recombinante que utiliza xilose de Z. mobilis que foi descrita no documento de propriedade comum sob o no. US 7.741.119, o qual está aqui incorporado o título de referência.A cepa ZW801-4 foi derivada a partir da cepa ZW800, a qual foi derivada a partir da cepa ZW658, todas conforme descrito no documento sob o no.US 7.741.119. A ZW658 foi construída mediante a integração de dois operões, PgapxylAB e Pgaptaltkt, contendo quatro genes que utilizam xilose codificando xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase, no genoma de ZW1 (ATCC 31821) através de eventos de transposição sequencial, e seguido pela adaptação no meio seletivo contendo xilose. A ZW658 foi depositada como ATCC PTA-7858. Na ZW658, o gene que codifica glicose-frutose oxidoredutase foi inativado por inserção com o uso de recombinação homóloga de cruzamento duplo mediada por hospedeiro e resistência a espectinomicina como um marcador selecionável para criar a ZW800. O marcador de resistência à espectinomicina, o qual foi ligado por locais de loxP, foi removido por recombinação específica por local com o uso de Crerecombinase para criar a ZW801-4.

[093] As culturas de cepa de Z. mobilis ZW801-4 foram desenvolvidas sob condições de estresse, conforme apresentado no pedido de patente U.S. no. 12/641642 publicado como WO 2010/075241, o qual está aqui incorporado o título de referência, conforme exposto a seguir. Uma cultura contínua de ZW801 -4 foi executada em fermentadores de 250 ml agitados de pH e temperatura controlada (Sixfors; Bottmingen, Suíça). O meio basal para a fermentação foi de 5 g/L de extrato de levedura, 15 mM de fosfato de amônio, 1 g/L de sulfato de magnésio, 10 mM de sorbitol, 50 g/L de xilose e 50 g/L de glicose. A adaptação ao crescimento na presença de altas concentrações de acetato e amônia foi efetuada mediante o aumento de forma gradual da concentração de acetato de amônio adicionado ao meio de cultura contínuo acima, enquanto que mantém uma taxa de crescimento estabelecida, conforme medida pela taxa de diluição específica durante um período de 97 dias. O acetato de amônio foi aumentado a uma concentração de 160 mM. Os aumentos adicionais na concentração de íon de amônio foram alcançados mediante a adição de fosfato de amônio a uma concentração de íon de amônio total final de 210 mM ao final de 139 dias de cultura contínua. A cepa ZW705 foi isolada a partir da população adaptada mediante o plaqueamento a colônias individuais e amplificação de uma colônia escolhida.

[094] A cepa de Zymomonas mobilis AR3 7-31 (também chamada de 7-31 adaptada) foi derivada a partir da cepa ZW705 mediante a adaptação para o crescimento em meio de hidrolisato, conforme descrito no número de registro legal copendente e de propriedade comum CL5332, o qual está aqui incorporado o título de referência. A adaptação foi em um turbidostato que consiste em um dispositivo de cultura de fluxo contínuo, onde a concentração de células na cultura foi mantida constante mediante o controle do fluxo do meio, de tal modo que a turbidez da cultura foi mantida dentro de determinados limites restritos, conforme descrito no documento sob o no. US6686194. Dois meios estavam disponíveis para a cultura de crescimento no dispositivo de cultura contínua, um meio de repouso (Meio A) e um meio de provocação (Meio B). Uma cultura foi desenvolvida em um meio de repouso em uma câmara de crescimento a um ponto de referência de turbidez e, então, foi diluída a uma taxa de diluição ajustada para manter esta densidade de célula. A diluição foi executada mediante a adição do meio em um volume definido uma vez a cada 10 minutos. Quando o turbidostato entrou em um modo de provocação de meio, a escolha da adição do meio de provocação ou meio de repouso foi feita com base na taxa de retorno para o ponto de referência após a adição de meio anterior. A concentração de estado estacionário do meio na câmara de crescimento consistiu em uma mistura de Meio A e Meio B, com as proporções dos dois meios dependentes da taxa de retirada a partir de cada meio que permitiu a manutenção da densidade celular ajustada na taxa de diluição ajustada. Uma amostra de células representativas da população na câmara de crescimento foi recuperada a partir do fluxo de saída do turbostato (em uma câmara de captura) em intervalos semanais. A amostra de célula foi cultivada uma vez no meio MRM3G6 e guardada como um estoque de glicerol a -80 °C.

[095] As culturas foram desenvolvidas com o uso do meio de repouso que consistiu em 50% de HAc/YE e 50% de MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3, e o meio de provocação que consistiu em HAc/YE. As amostras tomadas semanalmente foram avaliadas no meio HAc/YE acerca da utilização de glicose e xilose, e produção de etanol.As colônias foram isoladas a partir da amostra da semana 3 e aquelas com bom crescimento nas placas MRM3X2 e MRM3G2 foram escolhidas. As cepas a partir destas colônias foram verificadas quanto a utilização de glicose e xilose e produção de etanol no meio HAc/YE. A cepa 12-18X-2-36 foi escolhida para um ciclo adicional de adaptação com o uso de HAc/YE como o meio de repouso e HAc/YE + 9 %, em peso, de etanol como o meio de provocação. A partir de uma amostra da semana 2, uma cepa chamada de 7-31 adaptada (também chamada AR3 7-3) foi escolhida após a verificação de cepas a partir da adaptação, acerca de sua utilização aumentada de glicose e xilose, e produção aumentada de etanol, quando cultivadas no meio de HAc/YE + 9 %, em peso, de etanol.

MEIO USADO NA ADAPTAÇÃO

[096] HAc/YE: contém hidrolisato de sabugo de milho produzido mediante o pré-tratamento de biomassa de sabugo triturado com uma amônia de baixa concentração seguida pela sacarificação enzimática. O hidrolisato foi suplementado com 6,2 g/L de acetato de amônio e 0,5% de extrato de levedura.

[097] MRM3 contém por litro: extrato de levedura (10 g), KH2PO4 (2 g) e MgSO4.7H2O (1 g).

[098]MRM3G6.5X4.5NHAc12.3: MRM3 com 65 g/L de glicose,45 g/L de xilose e 12,3 g/L de acetato de amônio

[099]MRM3G6:MRM3 com 60g/L glicose

[100]MRM3X2:MRM3 com 20g/L de xilose

[101 ]MRM3G2:MRM3 com 20g/L de glicose

CRESCIMENTO DE CULTURA DE SEMENTES PARA SSF

[102]Zymomonas mobilis ZW705 foi mantido como estoques de glicerol a 20% congelados a -80 °C. Para começar a cultura, um estoque de 2 ml foi descongelado e usado para inocular 45 ml de meio que consiste em: 10 g/L de extrato de levedura, 2 g/L de hidrogênio fosfato de potássio, 5 g/L de heptahidrato de sulfato de magnésio e 60 g/L de glicose em pH 5,8 (MRM3G6) a OD 600 nm de 0,4. A cultura foi cultivada a 33 °C em um tubo fracamente tampado de 50 ml a cerca de 2,5 OD em 600 nm e usada para inocular uma cultura de semente final de 150 a 200 g/L de glicose, 2 g/L de dihidrogênio fosfato de potássio, 5 g/L de heptahidrato de sulfato de magnésio e 10 a 20 g/L de extrato de levedura em pH 5,5. Esta cultura foi cultivada a 33 °C em um fermentador agitado de pH controlado a um OD600 nm de cerca de 10 e uma concentração de glicose restante de tal modo que cerca de 120 g/L de glicose fosse consumida. Um volume da semente de 10 OD que é equivalente a 10% do volume de fermentação final do SSF foi retirado e usado para iniciar o SSF.

Análise de HPLC

[103]As amostras de fermentação foram tomadas em intervalos de tempo e analisadas acerca de EtOH, açúcares residuais e outros produtos metabólicos, tais como ácido acético e glicerol, com o uso de um sistema HPLC Waters (Alliance system, Waters Corp., Milford, MA) ou um LC Agilent série 1100; condições = 0,6 mL/min. de 0,01 N de H2SO4, volume de injeção = 5 μL, temperatura do mostrador automático = 10 °C, temperatura da coluna = 55 °C, tempo de execução = 25 min., detecção por índice refrativo (mantido a 40 °C). A coluna de HPLC foi adquirida junto a BioRad (Aminex HPX-87H, BioRad Inc., Hercules, CA).Os analitos foram quantificados por meio de detecção por índice refrativo e comparados aos padrões conhecidos.

SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEA

(SSF)

SSF DE FRASCO

[104]Os procedimentos de frasco de SSF foram realizados de forma anaeróbica sob condições de fermentação de Zymomonas mobilis adequadas. Exceto onde mencionado em contrário, os experimentos de SSF com o uso de substrato de sabugo de milho pré-tratado com amônia diluída foram realizados, tipicamente, a 33 °C, pH 5,8 e 25% de carga de sólidos por peso. 25% de sólidos (12,5 g de peso seco) do sabugo de milho pré-tratado foram carregados primeiro em um frasco de Erlenmeyer de 125 mL, seguida pela adição de água desionizada pré-misturada com a quantidade exigida de 6N de ácido sulfúrico para titular o pH do substrato a 5,8. A proteína H3A, descrita acima, foi usada como enzima de sacarificação e foi adicionada em uma quantidade com base em mg de proteína H3A total /g de (celulose + xilano) no substrato de biomassa. A fermentação foi iniciada pela adição de inoculo de cepa de Zymomonas mobilis a 10% ZW705 (5 g) em peso na mistura de reação com nenhum nutriente adicional adicionado. O ambiente anaeróbico e a liberação de CO2 foram mantidos por uma agulha de 23 Gauge projetada a partir de uma tampa de borracha que foi usada para cobrir o frasco. No início da fermentação, todos os procedimentos de SSF tinham um peso de reação total de 50 g inicial em um frasco e a mistura de reação consistiu em sabugo de milho pré-tratado, água, ácido sulfúrico, enzima e células ZW705. Os frascos foram agitados dentro de um incubador agitador (New Brunswick Scientific, Innova 44, Edison, New Jersey) a 50 ou 200 RPM com a temperatura diminuindo em cascata para 30 °C a partir de 33 °C no dia 1 e para 28 °C no dia 2.

AUMENTO EM ESCALA DE SSF - REATOR DE TANQUE AGITADO

[105]Um reator de vidro com fundo côncavo de 3 litros (Applikon Biotechnology Z61101C006, Foster City, CA) foi usado em vez do frasco de 125 mL. O SSF foi realizado em um peso de reação total de 1000 g no reator por 144 horas. 25% (250 g) de carga de sólidos em peso foram usados para os estudos de aumento em escala. Aproximadamente 75% dos sólidos secos foram adicionados à água MilliQ estéril e o pH ajustado com 2N de ácido sulfúrico para pH 5,8. Esta mistura inicial foi elevada para e mantida constante a 33 °C.Então, as enzimas (20 mg de proteína H3A/g de (celulose + xilano)) e o inoculo de Zymomonas foram adicionados junto com os sólidos secos restantes.Em 24 horas, a temperatura foi reduzida para 30 °C, então, para 28 °C em 48 horas. A temperatura do reator foi mantida por uma fita de aquecimento eletricamente energizada enrolada em torno da superfície externa do reator com a misturação fornecida por um impulsor Rushton ou um impulsor de lâmina inclinada marinho. O espaço livre da reação foi lavado com nitrogênio para reduzir a exposição de Zymomonas ao oxigênio e a desgaseificação foi controlada com uma tampa de borracha perfurada com umaagulha de 19 Gauge.

CONTAGEM VIÁVEL TOTAL (TVC)

[106]As contagens viáveis totais para amostras de SSF contendo células de Zymomonas mobilis foram monitoradas no decorrer do tempo mediante a medição de unidades de formação de colônia (CFU). As amostras foram diluídas em série em água MilliQ filtrada estéril, então, distribuídas em placas de MRM3 (15 g de ágar, 50 g de glicose, 10 g de extrato de levedura, 1 g de MgSO4x7H2O, 2 g de KH2PO4 ajustado para pH 5,5 e submetido ao autoclave a 121 °C por 15 min.), e incubadas de forma anaeróbica mediante a vedação da placa com parafilme a 33 °C por 48 horas. As placas de diluição com entre 10 a 1000 colônias foram consideradas como unidades de formação de colônia (CFU). Se uma contagem de placa estiver fora da faixa de diluição, as CFUs são relatadas como menores ou maiores que a placa de diluição incontável.

EXEMPLO 1 O EFEITO DE RPM E CARGA DE SÓLIDOS SOBRE SSF

[107]Este exemplo demonstra o efeito da RPM e carga de sólidos sobre o processo de SSF que utiliza o sabugo de milho pré-tratado com amônia diluída e cepa de Zymomonas mobilis recombinante ZW705.O SSF foi executado conforme descrito nos métodos gerais para SSF de frasco.Os procedimentos experimentais foram realizados em três cargas de sólidos diferentes (6%, 12% e 25%) e duas RPM diferentes (50 RPM e 200 RPM) com a proteína H3A dosada em 15 mg/g de glucano+xilano. As amostras foram tomadas após 3 dias e avaliadas por HPLC, conforme descrito em materiais e métodos.

[108]Os resultados dados na Figura 1 mostraram um efeito surpreendentemente forte de RPM sobre o processo de SSF em alta carga de sólidos (25%). O SSF com um RPM de 200 e 25% de sólidos produziu somente 7,7 g/L de EtOH no dia 3, o qual consistiu principalmente no transporte de etanol a partir do inoculo de Zymomonas. Ao mesmo tempo, 29,5 g/L de glicose e 47,8 g/L de xilose foram acumulados indicando que a preparação de enzima de H3A ainda foi eficaz sob estas condições. Em contrapartida, nas cargas de sólidos menores (6% e 12%), o aumento de RPM para 200 RPM não resultou no desempenho reduzido para o processo de SSF.

[109]As contagens de célula viáveis totais dos procedimentos acima foram monitoradas no decorrer do tempo durante o transcurso do experimento em 0, 4, 24, 48 e 72 horas, conforme descrito nos métodos gerais. Os resultados mostrados na Figura 2 indicam que a perda do desempenho de fermentação do SSF em 25% de sólidos e 200 RPM estava diretamente relacionada à perda de CFU por Zymomonas mobilis. Para todos os procedimentos de SSF, o Zymomonas experimentou um rápido crescimento entre a inoculação (0 hora) e 4 horas. As contagens de célula totais estabilizaram para 2 a 9x109 CFU/mL após 4 horas para todos os procedimentos, exceto aquele em 25% de sólidos e 200 RPM onde uma redução de 3 log. em viabilidade de Zymomonas (CFU) foi observada dentro de 24 horas e uma redução de 5 log. foi observada dentro de 48 horas. Deste modo, a viabilidade de Zymomonas foi adversamente afetada pelo aumento na RPM, mas somente em altas cargas de sólidos (25%). Um processo de SSF de menos sólidos (6% e 12%), por outro lado, não foi impactado pelo aumento em RPM.

EXEMPLO 2 O EFEITO DO TAMANHO DE PARTÍCULA SOBRE A PRODUÇÃO DE ETANOL EM SSF SIMULADO DE ALTO TEOR DE SÓLIDOS

[110]Para estudar o efeito do tamanho de partícula sobre a fermentação de Zymomonas, esferas de vidro sódico Ballotini (VWR, Cat. no. 33997-500/536/560/562/568/584, West Chester, PA) foram usadas nos procedimentos de SSF simulado em vez de sabugo de milho pré-tratado. As esferas com as seguintes faixas de diâmetro foram lavadas, esterilizadas e secas antes do uso: 0 a 50 μm, 100 a 200 μm, 400 a 600 μm, 1250 a 1550 μm (1,25 a 1,55 mm) e 2850 a 3300 μm (2,85 a 3,30 mm). Similar às condições descritas em SSF de frasco, o tamanho de reação foi fixado em 50 g e 25% de sólidos totais (esferas de vidro) em frascos de Erlenmeyer de 125 mL tampados com agulhas de 21 Gauge para a desgaseificação. A fim de imitar os carboidratos disponíveis e uma reação de SSF padrão, o meio que consiste em 80 g/L de glicose e 70 g/L de xilose foi preparado em água e carregado. O meio media foi esterilizado por meio de autoclave a 121 °C por 15 minutos. O inoculo de Zymomonas foi carregado na mistura de reação a 10% em peso, e nenhuma enzima foi adicionada neste caso. Cada reação foi realizada em um incubador de agitação agitado a 100 ou 200 RPM com temperatura mantida constante a 33 °C.

[111]Os resultados de produção de etanol mostrados na Figura 3A indicam claramente uma perda de desempenho quando a fermentação de Zymomonas foi realizada na presença de 25% de sólidos com tamanhos de partícula de 100 a 200 μm ou 400 a 600 μm e uma alta RPM (200 RPM). Nenhuma redução de desempenho mensurável foi observada com qualquer outra faixa de tamanho de partícula testada a 200 RPM, e com qualquer faixa de tamanho de partícula a 100 RPM. Um efeito similar foi observado a partir dos dados de CFU também, onde uma diminuição de 2 log em CFU foi observada para as esferas de 100 a 200 μm e 400 a 600 μm executadas a 200 RPM. Os dados na tabela 4 indicam que a perda de desempenho de fermentação consiste diretamente em uma consequência da perda de viabilidade de Zymomonas. TABELA 4. CFU DETERMINADA PARA PROCEDIMENTOS DA FIGURA 3.

[112] O experimento foi repetido com o uso de esferas com asseguintes faixas de diâmetro: 0 a 50 μm, 40 a 70 μm e 100 a 200 μm. Os resultados dados na Figura 3B mostram que a produção de etanol a partir do SSF simulado com agitação de 200 RPM e esferas de 40 a 70 μm foi similar ao etanol produzido no procedimento de 100 RPM.

[113]A faixa de tamanho de partícula crítica para a redução da produção de etanol e viabilidade de célula determinada com o uso de esferas Ballotini sob as condições testadas (25% de sólidos, 50 g de volume de reação em frasco de 125 mL, 200 RPM) se situou na faixa entre 100 μm e 600 μm.

EXEMPLO 3 SSF EM REATORES DE TANQUE AGITADO TESTE 1

[114]Dois impulsores de 6 lâminas Rushton (45 mm de diâmetro) giratórios a 100 RPM foram usados em um aumento de escala de SSF, conforme descritos em Materiais e Métodos. Os impulsores foram separados 3 cm ao longo do eixo com o impulsor de fundo separado 2 cm a partir do fundo do reator. A enzima de sacarificação consistiu na proteína H3A que foi carregada em 20 mg de proteína/g de (glucano + xilano). Com os 25% de carga de sólidos usados, os impulsores Rushton não forneceram misturação adequada. As observações visuais revelaram assentamento de sólidos significante, misturação axial insatisfatória, acúmulo de CO2 capturado dentro da pasta fluida da reação e misturação radial altamente localizada em torno dos impulsores. Devido à misturação não homogênea, as estimativas de entrada de potência durante o procedimento de SSF não poderiam ser feitas. No entanto, as concentrações de glicose, xilose e etanol foram determinadas durante 140 horas por meio da amostragem e análise de HPLC, e o padrão de acumulação de glicose, xilose e etanol (mostrado na Figura 4) indica uma taxa de sacarificação nominal, mas fermentação incompleta. A misturação não homogênea foi corrigida mediante a mudança do projeto do impulsor e um segundo teste foi executado.

TESTE 2

[115]Um segundo aumento de escala de SSF foi executado conforme acima, exceto pelo fato de que os dois impulsores Rushton foram substituídos por dois impulsores de 6 lâminas marinhos (45 mm de diâmetro). Os impulsores foram separados 3 cm ao longo do eixo com o impulsor de fundo separado 2 cm a partir do fundo do reator. A velocidade do impulsor foi aumentada para 150 RPM. Os impulsores marinhos eram conhecidos por mostrar uma taxa de cisalhamento máxima reduzida comparados com os impulsores Ruston (Shuler e Kargi, Bioprocess Engineering, 2a edição, p287 (2002) Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ).Isto pode conduzir à dispersão e transferência de gás insatisfatória no líquido, mas é menos importante desde que a fermentação seja anaeróbica.A alteração do impulsor atenuou os problemas de misturação observados anteriormente no teste 1. Uma suspensão completa de sólidos insolúveis residuais e misturação homogênea foi observada visualmente. As concentrações de glicose, xilose e etanol foram determinadas durante 140 horas mediante a amostragem e análise de HPLC. Os resultados dados na Figura 5 mostram que a melhor misturação axial resultou em uma taxa mais rápida de produção de etanol e produção de etanol continuada boa depois de 72 horas com acúmulo de açúcar minimizado. A taxa aumentada de produção de etanol indica que existe sacarificação e liquefação de substrato aperfeiçoada conforme comparado com o teste 1. O título do dia 6 para glicose, xilose e etanol consiste em 9,00, 12,64 e 85,88 g/L, respectivamente.

EXEMPLO 4 EFEITO DE AGITAÇÃO SOBRE SSF EM UM REATOR DE TANQUE AGITADO

[116]As reações de sacarificação e fermentação simultânea (SSF) foram executadas em um reator de 1,7 L sob diferentes condições de misturação. Os procedimentos de SSF foram executados de maneira similar ao SSF de reator de tanque agitado descrito nos Métodos gerais, com lâminas de agitação descritas no Exemplo 5 abaixo, com cerca de 1040 g de peso de reação total, com o uso de sabugo de milho pré-tratado, conforme descrito acima, com cerca de 24% de carga de sólidos, em uma carga de enzima de 14 mg de proteína H3A/g de glucano + xilano presente na biomassa pré-tratada, 33 °C (não reduzida) e pH 5,8, com Z mobilis ZW705 como o organismo de fermentação. O espaço livre não foi lavado com nitrogênio.

[117]As duas reações foram executadas com agitação a 250 ou 750 rpm, com sólidos pré-tratados adicionados a água a 26 por cento em peso. A preparação de sabugo pré-tratado SSL21 foi usada.Cada mistura foi agitada para assegurar a homogeneidade enquanto a temperatura e o pH fossem ajustados.Uma vez que o pH e a temperatura alcançaram os valores desejados, a dose completa de enzima foi adicionada. Uma hora depois que a enzima foi adicionada, a misturação foi ajustada para o valor desejado e 10% (volume final) da cultura de semente de Z. mobilis ZW705 pronta para coleta, conforme descrito nos métodos gerais, foram adicionados, levando o teor de sólidos final para 23,6 por cento em peso.

[118]As duas reações foram executadas com agitação a 250 ou 80 rpm, com sólidos pré-tratados de SSL22 adicionados em três lotes conforme exposto a seguir.

[119]1)Começou com 554 g de água + 217 g de biomassapré-tratada (69,1 % de sólidos secos) + 21,81 mL (~ 21,81 g) de enzima = 792,8 g de mistura de reação com 149,9 g de sólidos secos. Resultou em 18,9 % de sólidos (com base na massa de mistura de reação neste ponto) ou 14,4 % de sólidos (com base na massa de mistura de reação final de 1040,8 g).

[120]Uma vez que o pH e a temperatura alcançaram os valores desejados, a dose completa de enzima foi adicionada.

[121]2)Cinco minutos depois que a enzima foi adicionada, amisturação foi ajustada ao valor desejado e 10% (volume final) de cultura de semente de Z mobilis ZW705 pronta para coleta foram adicionados.

[122]Adicionou-se 104 ml de cultura de semente de Zymomonas pronta para coleta (~ 104 g), então, houve 896,8 g de mistura de reação, ainda com 149,9 g de sólidos secos. Resultou em 16,7 % de sólidos (com base na massa de mistura de reação neste ponto) ou 14,4 % de sólidos (com base na massa de mistura de reação final = 1040,8 g).

[123]3)Uma hora depois quea enzima foi adicionada, outrolote de sólidos foi adicionado.

[124]Adicionou-se um segundo lote de 72 g (69,1 % de matéria seca) de sólidos = 968,8 g de mistura de reação com 199,7 g de sólidos secos. Resultou em 20,6 % de sólidos (com base na massa de mistura de reação neste ponto) ou 19,2% de sólidos (com base na massa de mistura de reação final = 1040,8 g).

[125]4)Duas horas depois que a enzima foi adicionada, umlote final de sólidos foi adicionado.

[126]Adicionou-se um lote final de matéria seca de 72 g (69,1 %) de sólidos = 1040,8 g de mistura de reação (249,5 g de sólidos secos). Resultou em 24,0% de sólidos (com base na massa de mistura de reação neste ponto) = 24,0% de sólidos (com base na massa de mistura de reação final = 1040,8 g).

[127]Em diversos momentos, as alíquotas foram removidas a partir de cada reação para a análise de HPLC do caldo de fermentação. A Figura 6A mostra a concentração de etanol no decorrer do tempo para os procedimentos de 250 rpm e 750 rpm com 25 por cento em peso inicial de sólidos. A Figura 6B mostra a concentração de etanol no decorrer do tempo para os procedimentos de 80 rpm e 250 rpm com adição dividida de sólidos. A 750 rpm, nenhum etanol foi produzido além do que foi carregado com a cultura de semente (Figura 6A). A 250 rpm, ~40 g/L de etanol foi produzido em ~50 h (Figura 6A).A 80 rpm com adição de biomassa dividida, ~65 g/L de etanol foi produzido em ~50 h (Figura 6B). A 250 RPM com adição de biomassa dividida, ~40 g/L de etanol foi produzido em ~50 h (Figura 6B).

EXEMPLO 5 CÁLCULO DE EFEITO DE ENTRADA DE POTÊNCIA SOBRE SSF

[128]O recipiente de reação de vidro usado no Exemplo 4 mediu 11 cm de diâmetro e 18 cm de altura, com um fundo côncavo. O preenchimento do recipiente a ~1 L resultou em uma altura de trabalho de ~10,5 cm, produzindo um h/d de 0,96.

[129]A misturação foi fornecida através de agitação com um sistema de impulsor duplo operando nos valores de rpm apresentados acima. O impulsor de fundo consistiu em um impulsor de 3 segmentos com um diâmetro de 4,8 cm (B Braun Biotech) localizado em um volume líquido de ~350 mL (~3,7 cm fora do fundo) com os segmentos posicionados em um ângulo de 45 graus de bombeamento ascendente. O impulsor de topo consistiu em um impulsor de turbina de 6 lâminas (Rushton) com um diâmetro de lâmina de 4,5 cm e disco de 2,5 cm, localizado em um volume líquido de ~700 mL (~7,4 cm fora do fundo). Para os cálculos de misturação, presumiu-se que a densidade (p) fosse de 1050 kg/m3 e a viscosidade (μ) fosse aquela da água a 33 °C (0,00075 kg/ms). O número Reynolds do impulsor (Re) foi calculado como RPS*DI2*p/μ, onde RPSconsiste em revoluções por segundo e Dl é o diâmetro do impulsor. Em todos os casos, o número Reynolds do impulsor foi acima de 4000, portanto, os números de potência do impulsor foram tomados como os valores de 'alta assíntota de Reynolds’ (1,5 para o impulsor de 3 segmentos, 5 para o impulsor Rushton). À medida que os impulsores são bem espaçados, a potência de misturação total do impulsor foi tomada como a soma das potências de misturação do impulsor individuais. A potência do impulsor foi calculada como o número de potência do impulsor densidade* (RPS3) * (Dl5). Potência/massa (P/m) foi obtida mediante a divisão da potência do impulsor total pela massa de reação total. A potência/massa na ponta foi calculada como a potência de impulsor total / (Dl3*p). O tamanho do remoinho foi calculado como [(μ/p)3 / (potência/massa)]1/4. Para os procedimentos de 80, 250 e 750 rpm do Exemplo 4, as potências de misturação de impulsor totais foram de 0,0032, 0,099 e 2,7 W (potência/massa de 0,0032, 0,099 e 2,7 W/kg), respectivamente. As velocidades de ponta do impulsor nestes três casos foram 0,19, 0,59 e 1,8 m/s, respectivamente. Os tamanhos de remoinhos nestes três casos foram de 104,44 e 19 μm, respectivamente. O tamanho de remoinho na ponta pode ser calculado mediante a substituição de potência/massa na ponta pela potência/massa na fórmula de tamanho de remoinho. Os resultados são exibidos na Tabela 5.TABELA 5. PARÂMETROS DE MISTURAÇÃO E TÍTULO DE ETANOL FINAL PARA ASREAÇÕES DE SSF DE Z. MOBILISZW705 EM REATORES AGITADOS (EXEMPLO 4).

*Resultados a partir do teste 2 do Exemplo 3, o qual utilizou 20 mg/g de enzima#NDI é RPS*DI

[130]A tabela 5 ilustra a forte influência da misturação sobre o sucesso de SSF. À medida que a intensidade da misturação foi aumentada, o título de etanol diminuiu. Sob condições de misturação intensa, nenhum etanol foi formado além do que foi carregado com a semente. As entradas de potência específicas abaixo de 0,2 W/kg da massa de reação total proporcionaram a fermentação eficaz em SSF em alta concentração de sólidos.

EXEMPLO 6 EFEITO DA CARGA DE ENZIMA SOBRE O TÍTULO DE ETANOL E EXIGÊNCIAS DE AGITAÇÃO

[131]As reações de sacarificação e fermentação simultânea (SSF) foram executadas em um reator de 2 L, com três conjuntos de impulsores de bombeamento descendente de 45 graus e com 4 lâminas. Os procedimentos de SSF foram executados de maneira similar ao SSF de reator de tanque agitado descrito nos métodos gerais, com cerca de 2140 g de peso de reação total, com o uso de sabugo de milho pré-tratado conforme descrito acima, com cerca de 22,5% de carga de sólidos final, em uma carga de enzima de 14 ou 28 mg de proteína H3A/g de glucano + xilano presente na biomassa pré-tratada, 33 °C (não reduzida) e pH 5,8, com Z mobilis AR3 7-31 como o organismo de fermentação. O espaço livre não foi lavado com nitrogênio.

[132]Os sólidos foram carregados em um modo de alimentação por lote. A preparação de sabugo pré-tratado SSL27 foi usada, a qual continha 65,3% de matéria seca. Inicialmente, 94 g de sabugo pré-tratado e 1120 g de água foram adicionados ao reator, criando uma pasta fluida de sólidos a 5 %. O pH e a temperatura foram ajustados para os pontos de referência de 5,8 e 33 °C, respectivamente. Então, 40,2 g (para 14 mg/g) ou 80,5 g (para 28 mg/g) de enzima H3A foram adicionados (procedimentos FBR746 e FBR747, respectivamente), quase seguido (dentro de 5 minutos) pela adição de 200 ml de células de Zymomonas. No decorrer das 7 h seguintes, os 637 g restantes de sabugo pré-tratado foram adicionados, em acréscimos iguais a cada hora (total de 7 adições). O pH foi ajustado manualmente para manter o pH 5,8, com o uso de 1 N de H2SO4 ou 1 N de NaOH.

[133]Entre cada adição de sólidos duas vezes ao dia durante o resto do procedimento, a taxa de agitação foi examinada e ajustada, se necessário, em acréscimos de 10 rpm de tal modo que os sólidos permanecessem suspensos, com base na observação visual através da parede de vidro do recipiente. Esta taxa de agitação é mencionada como NJS (JS = "apenas suspenso").

[134]Os gráficos de NJS para o reator de carga de enzima de 14 mg/g e para o reator de carga de enzima de 28 mg/g são mostrados na Figura 7A. O reator com duas vezes a carga de enzima exigiu menores taxas de agitação para manter a suspensão por todo o procedimento. A taxa de agitação máxima exigida para o procedimento que utilizou 28 mg/g de carga de enzima foi de 110 rpm, enquanto que o procedimento com 14 mg/g de carga de enzima exigiu um máximo de 140 rpm. Uma vez que a potência aumenta em escala com a taxa de agitação à terceira potência (P~N3), isto corresponde a aproximadamente duas vezes a potência para manter a suspensão no procedimento de enzima de menor teor, conforme comparado com o procedimento de enzima dobrada. A entrada de potência foi calculada conforme no Exemplo 5, proporcionando 0,025 W/kg a 110 rpm e 0,052 W/kg a 140 rpm.

[135]Em diversos momentos, as alíquotas foram removidas a partir de cada reação para a análise de HPLC (conforme nos métodos gerais) do caldo de fermentação. A Figura 7B mostra a concentração de etanol no decorrer do tempo para ambos os reatores. O reator com 28 mg/g de carga de enzima alcançou cerca de 77 g/L em 50 h, enquanto que o reator com 14 mg/g de carga de enzima alcançou cerca de 62 g/L na mesma quantidade de tempo.

EXEMPLO 7 SSF COM O USO DE FORRAGEM DE MILHO

[136]As reações de sacarificação e fermentação simultânea (SSF) foram executadas em um reator de 1,7 L conforme descrito nos Exemplos 4 e 5. A SSF realizada com forragem de milho foi executada de maneira similar ao método de SSF de reator de tanque agitado descrito nos métodos gerais.

[137]As forragens de milho, preparadas conforme descrito nos métodos gerais, foram usados com cerca de 20,6% de carga de sólidos final, em uma carga de enzima de 17 mg de proteína H3A/g de glucano + xilano (com base na composição típica de forragem), 33 °C (não reduzida) e um pH inicial de 5,3, com Z. mobilis ZW705 como o organismo de fermentação. O espaço livre não foi lavado com nitrogênio. O fermentador foi equipado com um impulsor de 3 segmentos montado em ~350 mL e um impulsor de turbina de 6 lâminas (Rushton) montado em ~700 mL, e a massa de reação final foi de cerca de 810 g. Os sólidos foram carregados em um modo de alimentação por lote. A preparação de forragem pré-tratadas usada continha 43,8% de matéria seca. Inicialmente, 95 g de forragem pré-tratadas e 279,1 g de água foram adicionados ao reator, criando uma paste fluida com 10% de sólidos. O pH e a temperatura foram ajustados para os pontos de referência de 5,3 e 33 °C, respectivamente. A taxa de misturação foi ajustada para 250 rpm. Então, 20,6 ml de enzima H3A foram adicionados, quase seguida (dentro de 20 minutos) pela adição de 100 ml de células de Zymomonas. As doses adicionais de 95 g de sólidos foram adicionadas 1, 4,3 e 7 horas após a adição de enzima. O pH foi deixado elevar durante a adição de sólidos, finalmente, alcançando um valor de 5,8 após a adição final de sólidos. A potência foi calculada como 0,111 W/kg.

[138]Em diversos momentos, as alíquotas foram removidas a partir da reação para a análise de HPLC do caldo de fermentação. A concentração de etanol alcançou 40 g/L em 27,4 h e 45,7 g/L de etanol em 44,7 h, demonstrando, adicionalmente, o uso bem sucedido de forragem de milho em SSF com o uso de cerca de 0,1 W/kg de potência de misturação.

EXEMPLO 8 SSF COM FORRAGEM DE MILHO E EFEITO DA CARGA DE ENZIMA

[139]As reações de sacarificação e fermentação simultânea (SSF) foram executadas em um reator de 1 L. Dois testes de SSF com forragem de milho foram executados de maneira similar ao SSF de reator de tanque agitado descrito nos métodos gerais.

[140]No experimento SR-12, foram usadas as forragens de milho preparadas conforme descrito nos métodos gerais, contendo 43,7% de matéria seca. Os sólidos foram carregados gradualmente, em um modo de alimentação por lote, com cerca de 23,3% de carga de sólidos final em uma massa de reação de 830 g, em uma carga de enzima de 14 mg de proteína H3A/g de glucano+xilano na biomassa, 33 °C (não reduzida) e um pH inicial de 5,5, com Z. mobilis ZW705 como o organismo de fermentação. O espaço livre não foi lavado com nitrogênio. O fermentador foi equipado com 2 conjuntos de impulsores; uma turbina de lâmina plana em aproximadamente 14% da altura de preenchimento do reator final e uma turbina de lâmina inclinada de 45 graus em aproximadamente 42% da altura de preenchimento do reator final. Inicialmente, 53,0 g de forragem pré-tratadas e 250 g de água foram adicionadas ao reator, criando uma pasta fluida com 7,6% de sólidos. O pH e a temperatura foram ajustados para os pontos de referência de 5,5 e 33 °C, respectivamente. A taxa de misturação ou agitação foi ajustada para 168 rpm. Então, 15,2 mL de enzima H3A foram adicionados, seguida pela adição de 78 ml de células de Zymomonas aproximadamente 40 minutos depois. As doses adicionais de 37,0 g de sólidos foram adicionadas em dez adições iguais durante as 36 horas seguintes, junto com 1 N de H2SO4 e 1 N de NaOH, conforme necessário para manter o pH desejado. Pelas primeiras ~20 horas, o pH foi controlado (por monitoramento periódico e ajustes manuais) a 5,5; após 20 horas, o pH foi controlado a 5,8 durante as adições subsequentes de sólidos e pelo resto do procedimento. A taxa de agitação foi mantida a 168 rpm para as primeiras 12 horas, então, elevada para 212 rpm até aproximadamente 50 horas. A entrada de potência durante as primeiras 12 horas foi de 0,042 a 0,057 W/kg; as variações foram devido ao aumento de reação devido às adições de sólidos. A entrada de potência para o resto do procedimento foi de 0,064 a 0,084 W/kg, variando novamente devido às adições de massa ao reator.

[141]O experimento SR-13 foi executado de forma idêntica ao SR-12, no entanto, somente 243 g de água e 30,5 ml de enzima foram usados. Isto representa duas vezes a carga de enzima do procedimento anterior, ou 28 mg de proteína/g de glucano+xilano. Os ajustes de pH, adições de sólidos e agitação foram manipulados pelos mesmos métodos e com o mesmo tempo aproximado que o experimento anterior, descrito acima.

[142]Em diversos momentos, as alíquotas foram removidas a partir de cada reação para a análise de HPLC do caldo de fermentação. A Figura 8 mostra a concentração de etanol no decorrer do tempo para ambos os procedimentos. O experimento SR-12 alcançou 49,5 g/L de etanol em 51,2 h, enquanto que o experimento SR-13 alcançou 52,3 g/L de etanol em 50,0 h, demonstrando que as titulações de etanol maiores e taxas mais rápidas podem ser alcançadas com carga de enzima maior em SSF de forragem de milho.

EXEMPLO 9 COMPARAÇÃO DE EFEITO DE RPM DURANTE SSF SOBRE ZYMOMONAS MOBILIS , ESCHERICHIA COLI E SACCHAROMYCES CEREVISIAE

[143]Este exemplo demonstra o efeito de RPM e carga de sólidos sobre o processo de SSF com o uso de sabugo de milho pré-tratado com amônia diluída e uma variedade de produtores de etanol, que inclui cepa recombinante de Zymomonas mobilis ZW705, Escherichia coli (células quimicamente competentes OneShot®TOP10, Invitrogen) e um Saccharomyces cerevisiae comercial (Etanol Red®; Fermentis, Lesaffre Group). A SSF foi executada conforme descrito nos métodos gerais para a SSF de frasco. A cultura iniciadora de S. cerevisiae foi preparada mediante a adição de Etanol seco Red® a uma solução de 20 g/L de glicose e a incubação a 30 °C por 1 h. Nenhuma cultura iniciadora foi preparada para E. coli, de preferência, 1 ml de células quimicamente competentes OneShot®TOP10 foi descongelado e adicionado diretamente à reação de SSF. Os procedimentos experimentais foram realizados em uma carga de sólidos (25%) e dois RPM diferentes (100 RPM e 200 RPM) com proteína H3A dosada em 14 mg/g de glucano+xilano. As amostras foram tomadas após 3 dias e avaliadas por HPLC conforme descrito em Materiais e Métodos.

[144]Os resultados dados na Figura 9 mostraram o efeito de RPM sobre o título de etanol em 48 horas durante a SSF com diferentes microrganismos. Conforme também mostrados no Exemplo 1 da Figura 1, o título de etanol durante a SSF com Z. mobils ZW705 foi sensível à misturação, com o procedimento de 100 RPM resultando em um título de etanol acima de 50 g/L, enquanto que o procedimento de 200 RPM não alcançou 10 g/L. E. coli também foi sensível à misturação, embora não ao mesmo grau que Z. mobilis, produzindo 50% mais de etanol em 100 RPM versus 200 RPM (11,8 versus 7,7 g/L, respectivamente) e deixando menos glicose residual. S. cerevisiae, em ambos os procedimentos de misturação, produziu entre 25 e 30 g/L de etanol, com título ligeiramente maior no procedimento de 200 rpm. Deste modo, os produtores de etanol procarióticos testados foram afetados de maneira adversa pelo aumento no RPM, enquanto que o produtor de etanol fúngico não foi.

Claims (14)

1.MÉTODO PARA PRODUZIR ETANOL, caracterizado porcompreender: a)o fornecimento de uma biomassa pré-tratada de um tamanho de partícula variando entre 100 μm e 600 μm que compreende sólidos insolúveis e polissacarídeos; b)o fornecimento de pelo menos uma enzima de sacarificação para a conversão de polissacarídeos a açúcares fermentáveis; c)o fornecimento de um produtor de etanol procariótico; d)a preparação, em um biorreator que compreende um agitador que compreende pelo menos um impulsor que fornece uma potência menor do que 0,2 watt/kg da mistura total de sacarificação-fermentação, de uma mistura de sacarificação-fermentação que compreende a biomassa pré-tratada de a), a enzima de sacarificação de b) e o produtor de etanol procariótico de c); e e)o cultivo do produtor de etanol procariótico na mistura de sacarificação-fermentação, em que a concentração de insumos totais de sólidos insolúveis na mistura de sacarificação-fermentação é de pelo menos 16% ou de 20% com base no peso seco por litro, e em que o produtor de etanol procariótico produz etanol.

2.MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo produtor de etanol procariótico: (i)ser um membro de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Zymomonas, Zymobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella e Geobacillus; ou (ii)ser tolerante à concentração de acetado na mistura de sacarificação-fermentação.

3.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 2, caracterizado pelo produtor de etanol de c) ser adicionado em um momento após a adição da enzima de sacarificação de b), quando a sacarificação parcial tiver ocorrido.

4.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 3, caracterizado pela biomassa pré-tratada ser adicionada em pelo menos duas partes que em combinação proporcionam uma concentração de insumos totais de sólidos insolúveis de pelo menos 16% com base no peso seco por litro.

5.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, caracterizado pela biomassa ser selecionada a partir do grupo que consiste em Panicum virgatum (switchgrass), resíduos de papel, lodo da fabricação de papel, sabugos de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, palha de cevada, palha de arroz, bagaço de cana de açúcar, sorgo, componentes obtidos a partir do processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbustos e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal.

6.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 5, caracterizado pela biomassa pré-tratada ser produzida por meio do tratamento da biomassa celulósica com amônia.

7.MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopela amônia estar presente em menos do que 12 por cento em peso em relação ao peso seco da biomassa.

8.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 7, caracterizado por a pelo menos uma enzima de sacarificação ser: (i)selecionada a partir do grupo que consiste em glicosidases que hidrolisam celulose e glicosidases que hidrolisam hemicelulose; ou (ii)um membro de um consórcio de enzima.

9.MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo consórcio de enzima de sacarificação compreender enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glucosidases, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabino-xilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases, amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α- glucosidases, isoamilases, peptidases, lipases, ligninases, e feruloil esterases.

10.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelos polissacarídeos compreenderem xilano e glucano.

11.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelos açúcares fermentáveis compreenderem xilose e glicose.

12.MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pela concentração de etanol produzido ser de pelo menos 40 g/L.

13.PROCESSO DE SACARIFICAÇÃO-FERMENTAÇÃO, caracterizado por compreender: a)uma biomassa pré-tratada de um tamanho de partícula variando entre 100 μm e 600 μm que compreende sólidos insolúveis e polissacarídeos; b)pelo menos uma enzima de sacarificação para a conversão de polissacarídeos a açúcares fermentáveis; e c)um produtor de etanol procariótico; em que a biomassa, a enzima e o produtor de etanol de (a), (b) e (c), respectivamente, são combinados em uma mistura de sacarificação- fermentação, que tem uma concentração de insumos totais de sólidos insolúveis que é de pelo menos 16% com base no peso seco por litro, e em que a biomassa, a enzima e o produtor de etanol de (a), (b) e (c), respectivamente, são contidos em um biorreator que compreende um agitador funcional que compreende pelo menos um impulsor e fornece uma potência menor do que 0,2 watt/kg da misturatotal de sacarificação-fermentação.

14.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo produtor de etanol procariótico ser selecionado a partir do grupo que consiste em Zymomonas, Zymobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella e Geobacillus.

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