JPH06172391A

JPH06172391A - ａｌｅＲ遺伝子及びエラスターゼの製造法

Info

Publication number: JPH06172391A
Application number: JP4063514A
Authority: JP
Inventors: Masakari Yamazaki; 眞狩山崎; Eiketsu Sai; 英傑蔡; Hiroshi Takagi; 博史高木
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-03-19
Filing date: 1992-03-19
Publication date: 1994-06-21

Abstract

(57)【要約】【目的】鳥獣肉の肉質改良剤として有用なアルカリ性
バチルス属細菌由来のアルカリ性エラスターゼを遺伝子
工学的手法で大量に生産させることを目的とする。【構成】本エラスターゼ遺伝子の５’上流領域の構造
と機能を解析し、エラスターゼ活性発現に必須なaleR遺
伝子、及びその遺伝子産物などを特定し、大腸菌又は枯
草菌において目的とするエラスターゼ大量に生産する方
法の提供である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は鳥獣肉の肉質改良剤とし
て有用なアルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリ性エ
ラスターゼの活性発現に必須なaleR遺伝子、該遺伝子を
組み込んだプラスミド、該プラスミドが導入された形質
転換体、およびエラスターゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】牛、豚、鶏などの食肉中には、腿、すね
などのように結合組織（スジ）が多く、硬くて食べにく
い部位が大量に存在する。肉の硬さは筋細胞内の筋原線
維蛋白質の構造とエラスチン、コラーゲンなどの硬質蛋
白質による筋細胞外の構造が関与している。前者の構造
は熟成によって変化を受けるが、筋細胞外の構造は内在
するエンドペプチダーゼの作用を受けず、熟成によって
もほとんど変化を受けない。従って、従来から機械的な
破壊の他に、パパイン、ブロメライン、フィシンなど植
物由来の蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）を外部から加
えて肉の軟化を行っていた（Prusa,K.J. et al., J.Foo
d Sci., 46, 1684-1686(1981)）。しかしながら、これ
らの酵素は通常のプロテアーゼであり基質特異性が低い
ために、スジだけでなく肉の食感に関与している筋原線
維蛋白質も過剰に分解するため、軟らかくはなるが肉の
組織が脆くなり、べたつき感が生じて食感が損なわれて
しまうという欠点がある。従って、スジを特異的に分解
するプロテアーゼの提供が待ち望まれていた。

【０００３】山崎らは酵素分解を受けにくいエラスチン
を良く分解するプロテアーゼの一種であるエラスターゼ
をアルカリ性バチルス属細菌（alkalophilic Bacillus
sp.）Ya-B株（AJ 12619, FERM P-12261）の培養濾液よ
り見いだした。（Tsai,Y.C.etal., Biochem.Int., 7, 5
77-583(1983)）。本酵素はこれまでに知られているエラ
スターゼや他のプロテアーゼに比べて非常に強いエラス
チン分解力を有し、コラーゲンも分解する。また、従来
から食肉軟化剤に用いられてきたパパインなどの植物由
来のプロテアーゼに比べて筋原線維蛋白質の過剰分解を
ほとんど起こさない。従って、本酵素は肉特有の食感を
維持しながら結合組織の主成分であるエラスチンやコラ
ーゲンなどの硬質蛋白質を特異的に分解して肉を軟化さ
せる食肉軟化剤として従来の植物由来の酵素よりも効果
的であると考えられ、その利用も検討されている（特開
平3-224465）。

【０００４】また、本酵素はその酵素的性質が解析され
ており（Tsai,Y.C. et al., Biochim.Biophys.Acta., 8
83, 439-447(1986)）、遺伝子のクローニングや塩基配
列の決定も行われている（Kaneko,R. et al., J.Bacter
iol., 171, 5232-5236(1989)）。本酵素のＤＮＡ塩基配
列から推定されるアミノ酸配列は枯草菌由来のアルカリ
性セリンプロテアーゼ、サチライシンと約50％の相同性
があり、特に活性中心の近傍は良く保存されている。従
って基質特異性をはじめ、両酵素の構造と機能の解析は
極めて興味深い。

【０００５】本酵素はサチライシンと同様に遺伝子解析
の結果からシグナルペプチド（プレ配列）と成熟エラス
ターゼの間に83アミノ酸残基からなる長いプロ領域が存
在することが知られている。エラスターゼはまずプレプ
ロエラスターゼとして合成され、プロエラスターゼがシ
グナルペプチドにより細胞質膜を通過し分泌されると考
えられる。その後、プロ領域が切断されて活性型の成熟
エラスターゼに変換され、培地中に遊離すると考えられ
る。しかし、その後の研究でエラスターゼ遺伝子（プロ
エラスターゼ及びシグナルペプチドをコードする領域、
以下aleE遺伝子と称する）のほかに、その５’上流のＤ
ＮＡ配列（約760塩基対）が存在しないとエラスターゼ
の前駆体（プロエラスターゼ）のまま膜画分に蓄積し、
活性のあるエラスターゼが分泌されないことが判明して
いる（門倉、金、依田、山崎、日本農芸化学会平成３年
度大会要旨集P.335）。従って、遺伝子工学的手法でエ
ラスターゼを大量に生産する為には、エラスターゼ活性
発現に必須な５’上流領域の遺伝子配列を特定すること
が急務である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、aleE遺伝子の５’上流領域の構造と機能を
解析し、エラスターゼ活性発現に必須な５’上流領域の
遺伝子を特定し、それを利用することにより遺伝子工学
的手法で活性型エラスターゼを大量に生産する方法を提
供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】遺伝子工学的手法による
本酵素の生産をめざして、例えば、大腸菌においてaleE
遺伝子だけを大腸菌用プラスミドベクターに組み込み、
その形質転換体を培養してもエラスターゼ活性は認めら
れず、エラスターゼ前駆体（プレプロエラスターゼ）が
大腸菌内に蓄積することが知られていた。従って、本発
明者らは本酵素遺伝子の発現にはaleE遺伝子の５’側上
流域の特定の遺伝子が必須であると推定し、鋭意研究を
行なった。その結果、aleE遺伝子の５’上流にあるaleR
遺伝子と我々が命名した49アミノ酸残基からなるペプチ
ドをコードする遺伝子が大腸菌や枯草菌等の微生物で、
エラスターゼ活性を発現させるのに必要であることを見
いだし、本発明を完成するに至らしめた。

【０００８】即ち、本発明は（１）エラスターゼの活性
発現に必須なaleR遺伝子、（２）該aleR遺伝子を有する
プラスミド、（３）aleR遺伝子以外に、さらにaleE遺伝
子が組み込まれているプラスミド、（４）前記（３）記
載のプラスミド、即ち、aleR遺伝子及びaleE遺伝子の両
方の遺伝子を有するプラスミドで形質転換された形質転
換体、（５）aleR遺伝子を有するプラスミドとaleE遺伝
子を有するプラスミド、即ち両方のプラスミドを有する
形質転換体、（６）前記（４）又は（５）の形質転換体
を培養することにより目的の活性を有するエラスターゼ
を製造する方法、（７）エラスターゼの活性発現に必須
なaleR遺伝子産物、及び（８）aleR遺伝子産物をエラス
ターゼ遺伝子のみを有するプラスミドで形質転換された
形質転換体より得られたものに添加することにより、エ
ラスターゼを製造する方法である。

【０００９】以下に本発明の内容について詳細に説明す
る。本発明において、まずエラスターゼの活性発現に関
与するエラスターゼaleE遺伝子の５’上流領域822塩基
対の全塩基配列を決定した。この領域中には40アミノ酸
残基以上のペプチドをコードし得るオープンリーディン
グフレームが合計６個存在していた。次に、この中でど
の領域がエラスターゼの活性発現に必須であるかを調べ
るために、aleE遺伝子の５’上流領域を適当な制限酵素
認識部位から欠失させた後、様々な欠失を含むこの領域
を発現用のプラスミドベクターに組み込んだ。ＤＮＡの
欠失は市販のBAL31ヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、マ
ングビーンヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIIIなど
（いずれも宝酒造（株）製）を単独、またはその組み合
せによって、限定分解することによって行う。また、市
販の欠失用キット（deletion kit；宝酒造（株）製）を
用いることによっても簡便に高効率で欠失を調製するこ
とができる。

【００１０】一方、aleE遺伝子も別の発現用プラスミド
ベクターに組み込んだ。本発明の発現プラスミドベクタ
ーの調製に用いることのできる公知のプラスミドとして
は、例えば大腸菌を宿主とする場合には、既に市販され
ているプラスミド pTrc99A、pKK223-3（いずれもファル
マシア社製）、pUC118、pUC18（いずれも宝酒造（株）
製）などを用いれば良い。また、枯草菌を宿主として用
いる場合は、プラスミドpHY300PLK（宝酒造（株）
製）、pUB110（シグマ社製）などを用いれば良い。こう
して、エラスターゼaleE遺伝子を組み込んだプラスミド
及び様々な欠失を含むこの領域を組み込んだプラスミド
を適当な宿主中で複製共存させると、エラスターゼ活性
の発現をスキムミルクやエラスチンを含有する寒天プレ
ートでハローを形成することにより調べることができ
る。

【００１１】この結果、aleE遺伝子の開始コドンより
５’側198塩基対上流からエラスターゼ遺伝子の相補鎖
上に逆向きのオープンリーディングフレームが存在する
領域を含む場合のみ、エラスターゼ活性が発現した。こ
のオープンリーディングフレームはＳＤ配列として機能
する AGGAGG 配列を持ち、49アミノ酸残基からなる塩基
性の蛋白質をコードするものであった。本発明における
aleR遺伝子とは、このオープンリーディングフレーム
（配列表の配列番号２記載の配列に相当する。）中の49
アミノ酸残基からなる塩基性の蛋白質をコード遺伝子を
いう。尚、aleR遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１
に記載されている。

【００１２】次に（１）該エラスターゼaleE遺伝子及び
活性発現に必須なaleR遺伝子の両方の遺伝子を有するプ
ラスミド、又は（２）aleE遺伝子を有するプラスミドと
aleR遺伝子を有するプラスミドを種々の細胞に形質転換
して形質転換体を調製する。該形質転換体となり得る細
胞には、大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞、なら
びに酵母、カビなどの真核細胞を挙げることができる。
いずれの細胞を用いても良いが、好ましくは宿主として
大腸菌、枯草菌を用いるのが良い。大腸菌の一具体例と
しては JM109株(recA1,△(lac-proAB),endA1,gyrA96,th
i-1,hsdR17,relA1,supE44,/F'traD36,pro AB ⁺、lacI ^qZ△
M15)（宝酒造（株）製）がある。また、枯草菌の一具体
例としては 207-21株(metB5,lys-21,leuA8,aroI906,amy
R2,amyE07,hs dR,hsdM)がある。

【００１３】形質転換の方法は通常用いられる塩化カル
シウム法（Cohen,S.N. et al., Proc.Natl.Acid.Sci.U.
S.A., 69, 2110(1972)）、塩化マグネシウム法（Hanaha
n,D., J.Mol.Biol., 166, 557(1983)）、塩化ルビジウ
ム法（Kushner,S.R., In Genetic Engineering(ed. Boy
er,H.B. et al.) p.17, Elsevier, Amsterdam(197
8)）、プロトプラスト法（Chang,S. et al., Molec.ge
n.Genet., 168, 111(1979)）などの中から、適宜選択し
て行えば良い。なお、枯草菌を宿主とする場合はプロト
プラスト法を用いるのが通常である。

【００１４】最後に上記の形質転換体を培養することに
より、本エラスターゼを製造する。培養条件は形質転換
体の種類に応じて適宜選択されるものである。また、必
要に応じて遺伝子発現を誘導する物質を培地に添加する
こともできる。さて、発明された該エラスターゼ酵素蛋
白質は、培養上清や宿主細胞の細胞質中やペリプラズム
から従来公知の方法で単離、精製することが可能であ
る。本発明においては（１）aleE遺伝子及び本酵素の活
性発現に必須な遺伝子であるaleR遺伝子をプラスミドベ
クター pUC118 に組み込んだ発現プラスミドpEDR1803を
含む大腸菌JM109株、または（２）aleE遺伝子をプラス
ミドベクター pHY300PLK に組み込んだ発現プラスミドp
EX1500 と本酵素の活性発現に必須なaleR遺伝子をプラ
スミドベクター pUB110 に組み込んだ発現プラスミド p
MK120 を含む枯草菌 207-21株を培養したところ、いず
れの場合も成熟型のエラスターゼが著量生産され、酵素
活性が顕著に認められた。

【００１５】また、本発明においては以下に示す方法に
よっても、目的とするエラスターゼを製造することがで
きる。即ち、まずエラスターゼの活性発現に必須なaleR
遺伝子のみを組み込んだプラスミドが導入された形質転
換体にしかるべき誘導剤を添加し、本遺伝子の発現を誘
導し、aleR遺伝子産物を生産する。また、この場合、形
質転換体としては如何なる微生物を用いても良いが、通
常大腸菌又は枯草菌をもちいるのが好ましい。次に、こ
れとは別にエラスターゼ遺伝子aleEのみを組み込んだプ
ラスミドが導入された形質転換体にしかるべき誘導剤を
添加し、エラスターゼ遺伝子の発現を誘導した菌体から
の抽出物を得る。尚、この場合も、形質転換体としては
如何なる微生物を用いても良いが、通常大腸菌又は枯草
菌をもちいるのが好ましい。そして、このエラスターゼ
遺伝子の発現を誘導した菌体からの抽出物にaleR遺伝子
産物、即ち、aleR遺伝子が誘導、発現された菌体の抽出
物を混合する。この方法を用いても上記の結果と同様に
成熟型のエラスターゼが生成し、酵素活性が顕著に認め
らる。即ち、この結果からもin vitro においてもエラ
スターゼ遺伝子の５’上流に存在するaleR遺伝子、及び
その遺伝子産物がエラスターゼの活性発現に必須である
ことを実証している。尚、aleR遺伝子産物のアミノ酸配
列は配列表の配列番号１に記載されている。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
なお、本発明は実施例に限定されるものではない。

【００１７】（実施例１：枯草菌内でのエラスターゼの
活性発現）まずエラスターゼの活性発現に関与するaleE
遺伝子の５’上流域822塩基対の全塩基配列を決定し
た。この領域中には40アミノ酸残基以上のペプチドをコ
ードし得るオープンリーディングフレームが合計６個存
在していた。次に、この中でどの領域がエラスターゼの
活性発現に必須であるかを調べるために、エラスターゼ
遺伝子の５’上流領域約900塩基対をBglII、PvuII切断
部位から欠失させた後、様々な欠失を含むこの領域を枯
草菌用プラスミドpUB110（シグマ社製）のEcoRIとPstI
切断部位にリンカーを介して挿入し、発現プラスミドを
構築した。ＤＮＡの欠失は BAL31ヌクレアーゼ、S1ヌク
レアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、エキソヌクレア
ーゼIIIなど（いずれも宝酒造（株）製）を単独、また
はその組み合せによって、限定分解することによって行
った。図１に示すように、プラスミド中のaleE遺伝子を
pHY300PLK（宝酒造（株）製）の EcoRI切断部位に挿入
し、発現プラスミドpEX1500を構築した（図１）。ここ
で使用した枯草菌用プラスミド pHY300PLKは大腸菌と枯
草菌のシャトルベクターで、形質転換された枯草菌はテ
トラサイクリン耐性を示す。また、pUB110で形質転換さ
れた枯草菌はカナマイシン耐性を示す。

【００１８】次に（１）aleE遺伝子を組み込んだプラス
ミドpEX1500、及び（２）様々な欠失を含むこの領域を
組み込んだプラスミドを枯草菌DB104株（nprE18,nprR2,
△aprE3,his-101）に同時に形質転換した。さらにエラ
スターゼ活性の発現をスキムミルクを含有する寒天プレ
ートでハローを形成させることにより調べた。その結
果、aleE遺伝子の開始コドンより５’側198塩基対上流
からaleE遺伝子の相補鎖上に逆向きのオープンリーディ
ングフレームが存在する領域を含む場合のみ、ミルクタ
ンパクの分解を示すハローが現れ、エラスターゼ活性が
発現した。このオープンリーディングフレーム（配列
表の配列番号２に示されている）はＳＤ配列として機能
する AGGAGG 配列を持ち、Metから始まり Leuで終わる4
9アミノ酸残基からなる塩基性の蛋白質をコードしてい
る領域であった。尚、このオープンリーディングフレー
ムは配列表の配列番号２に示した。また、この Metから
始まり Leuで終わる49アミノ酸残基からなる塩基性の蛋
白質をコードする遺伝子がaleR遺伝子である。aleR遺伝
子の構造、即ち塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配
列表の配列番号１に示した。

【００１９】次にaleR遺伝子の機能を再確認するため
に、pUB110 のEcoRI切断部位にaleR遺伝子、aleR自身の
プロモーター領域、及びaleE遺伝子のＮ末端側から1073
塩基対部分、各種制限酵素切断部位を含むＤＮＡ断片を
挿入し、発現プラスミドpMK120を構築した（図２）。な
お、本プラスミドに組み込まれたエラスターゼ遺伝子は
活性残基のSer214を保持していないので酵素活性はな
く、aleR遺伝子のみ発現する。このように構築したプラ
スミドpMK120とプラスミドpEX1500を宿主である枯草菌2
07-21株にそれぞれ別々に、または共存させて形質転換
した。プラスミドpEX1500を有する枯草菌207-21株、プ
ラスミドpMK120を有する枯草菌207-21株、及び両プラス
ミドを有する枯草菌207-21株をそれぞれテトラサイクリ
ン50μg/ml、カナマイシン50μg/ml、テトラサイクリン
とカナマイシンを50μg/mlずつ含むＬＢ液体培地10mlで
37℃、24時間振盪培養した。なおその際、最初から１mM
IPTG を添加しておいた。

【００２０】さて、培養終了後の遠心分離により得た上
清液のエラスターゼ活性を基質として elastin-orcein
（E1500、シグマ社製）を用いて測定したところ、表１
に示したようにプラスミドpEX1500とプラスミドpMK120
が共存した枯草菌207-21株（AJ12676, FERM P-12861）
のみエラスターゼ活性が認められた。尚、表１中、pEX1
500とはプラスミドpEX1500を有する枯草菌207-21株を、
プラスミドpMK120とはプラスミドpMK120を有する枯草菌
207-21株、及びpEX1500＋pMK120とは両プラスミドを有
する枯草菌207-21株をそれぞれ意味する。

【００２１】

【表１】

【００２２】また、プラスミドpEX1500とプラスミドpMK
120が共存した枯草菌207-21株（FERM P-12861）のみ
が、２％スキムミルク（ディフコ社製）含有ＬＢ寒天プ
レート上で明瞭なハローを形成し、活性型の成熟エラス
ターゼを分泌生産していることが示された。さらに、成
熟エラスターゼが生成していることを確認するために精
製エラスターゼを用いてウサギで作製した抗エラスター
ゼ抗体によるウエスタン・ブロッティングをベクター社
の Vectastain ABC kit を用いて行った。即ち、各試料
のタンパク 0.5μl ずつをＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、泳動後のサンプルをメンブレン
（Immobilon；ミリポア社）にトランスファーして抗原
となるタンパク質をメンブレンに結合させた。その後、
ウサギ抗エラスターゼ抗体（抗体価８倍のものを1000倍
希釈した）によるウエスタン・ブロッティングを行い、
遺伝子産物をタンパク質レベルで確認した。尚、ウエス
タン・ブロッティングを行う際のレーン１は精製エラス
ターゼ標品（コントロール）、レーン２はプラスミドpE
X1500を含有する枯草菌由来の培養上清、レーン３はプ
ラスミドpMK120を含有する枯草菌由来の培養上清、レー
ン４はプラスミドpEX1500及び pMK120が共存する枯草菌
由来の培養上清とした。その結果、以下のレーン１、４
において同一の位置に発色したバンドが現れ、抗エラス
ターゼ抗体との反応を示すタンパク質が精製エラスター
ゼと同一分子量の位置に検出できた。

【００２３】（実施例２：大腸菌内でのエラスターゼの
活性発現）大腸菌でのエラスターゼ遺伝子の発現にはプ
ラスミド pUC118（宝酒造（株）製）を使用した。 Mess
ingらが開発した本プラスミドは既に開発されているpUC
18内に、M13ファージＤＮＡの intergenic region が挿
入されている。従って、ヘルパーファージの感染によ
り、pUC118は一本鎖ＤＮＡとなり、優先的にファージ粒
子内に包み込まれ、菌体外に放出される。また外来遺伝
子もラクトースオペロンのプロモーター、オペレーター
を利用して IPTG（イソプロピルーβーDーチオガラクトピ
ラノシド）の存在下、遺伝子発現が誘導される（Vieir
a,Jand Messing,J., Methods in Enzymology, 153, 3-1
1(1987)）。なお、pUC118で形質転換された大腸菌はア
ンピシリン耐性を示す。

【００２４】さて、まずエラスターゼ遺伝子(aleE)をpU
C118のEcoRI、SalI切断部位に挿入した発現プラスミドp
ED1803を構築した（図３）。次に、エラスターゼの活性
発現に必須なaleR遺伝子をpUC118のSmaI切断部位に挿入
した発現プラスミドpED45を構築した（図４）。さらに
プラスミドpED1803とプラスミドpED45をScaIで連結し、
aleEとaleRを同一プラスミド内に組み込んだ発現プラス
ミドpEDR1803を構築した（図５）。その後、プラスミド
pED1803、pED45、及びpEDR1803を宿主である大腸菌JM10
9株にそれぞれ別々に形質転換した。pED1803を有するJM
109株、pED45を有するJM109株、及びpEDR1803を有するJ
M109株をそれぞれアンピシリンを50μg/ml含むＬＢ液体
培地（バクトトリプトン10g、バクトイーストエキスト
ラクト５g、塩化ナトリウム10ｇ、pH7.5）10mlで37℃、
２〜３時間振盪培養後（OD＝0.4）、IPTGを 0.1mMとな
るよう添加し、さらに37℃、４時間振盪した。

【００２５】次いでこの培養液から浸透圧ショック法
（Koshland,D. and Botstein, D., Cell, 20, 749-76
0）10mlを遠心分離により集菌後、菌体を20％シューク
ロース、30mM Tris-HCl(pH7.5)、 2mM EDTA(pH8.0) 1.0
mlに懸濁し、24℃、８分間放置した。12,000 rpm、10分
間遠心し、上澄と菌体を分離後、菌体画分を蒸留水1.0m
lに懸濁し、10分間氷中に放置した。さらに12,000 rp
m、10分間遠心し、上澄と菌体を分離し、この上澄液を
ペリプラズム画分とした。さらに菌体画分を超音波破砕
し（200W、５分間）、遠心分離した上澄を40,000rpm、4
0分間超遠心し、残査を膜画分、上澄を細胞質画分とし
た。

【００２６】調製した各画分のエラスターゼ活性を ela
stin-orceinを基質とした比色法（Sachar,L.A. et al.,
Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 90, 323-326(1955)）により
測定した。水平部４cmのミニＬ字管に15mgの elastin-o
rcein（E1500、シグマ社）を取り、１mlの 50mM NaHCO₃
-Na₂CO₃緩衝液(pH10.5)と適当量の酵素溶液を添加し
て、37℃で振動しながら反応させ、30分後、２mlの反応
停止液（0.7M リン酸緩衝液、pH6.0）を添加、遠心分離
により基質を除去して、上清の 590nmでの吸光度を測定
する。その結果を表２に示したが、プラスミドpEDR1803
を有する大腸菌JM109株（AJ12677, FERM P-12862）のみ
エラスターゼ活性が認められた。また、活性はほとんど
ペリプラズム画分に集中していた。尚、表２中pED1803
とはプラスミドpED1803を含有する大腸菌JM109株、pED4
5とはプラスミドpED45を含有する大腸菌JM109株、pEDR1
803とはプラスミドpEDR1803を含有する大腸菌JM109株の
略である。

【００２７】

【表２】

【００２８】また、プラスミドpEDR1803を有する大腸菌
JM109株（FERM P-12862）のみが２％スキムミルク（デ
ィフコ社製）含有ＬＢ寒天プレート上で明瞭なハローを
形成し、活性型の成熟エラスターゼを生産していること
が示された。

【００２９】さらに、成熟エラスターゼが生成している
ことを確認するために精製エラスターゼを用いてウサギ
で作製した抗エラスターゼ抗体によるウエスタン・ブロ
ッティングをベクター社の Vectastain ABC kit を用い
て行った。即ち、各画分からのタンパク 0.5μlずつを
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動
後のサンプルをメンブレン（Immobilon；ミリポア社）
にトランスファーして抗原となるタンパク質をメンブレ
ンに結合させた。その後、ウサギ抗エラスターゼ抗体
（抗体価８倍のものを1000倍希釈した）によるウエスタ
ン・ブロッティングを行い、遺伝子産物をタンパク質レ
ベルで確認した。尚、ウエスタン・ブロッティングを行
う際のレーン１は精製エラスターゼ標品（コントロー
ル）、レーン２はプラスミドpED1803を含有する大腸菌
のペリプラズム由来のもの、レーン３はプラスミドpED4
5を含有する大腸菌のペリプラズム由来もの、レーン４
はプラスミドpEDR1803含有する大腸菌のペリプラズム由
来のものした。その結果、以下のレーン１、４において
同一の位置に発色したバンドが現れ、抗エラスターゼ抗
体との反応を示すタンパク質が精製エラスターゼと同一
分子量の位置に検出できた。

【００３０】（実施例３：in vitro でのエラスターゼ
の活性発現）aleE遺伝子を組み込んだ発現プラスミドpE
D1803、及びエラスターゼの活性発現に必須なaleR遺伝
子を組み込んだ発現プラスミドpED45を宿主である大腸
菌JM109株にそれぞれ別々に形質転換した。各形質転換
体をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ液体培地10mlで37
℃、２時間振盪培養後（OD＝0.4）、IPTGを１mMとなる
よう添加し、さらに４時間37℃で振盪した。次いでこの
培養液10mlを遠心分離により集菌後、菌体を50mM Tris-
HCl(pH9.0)、１mM EDTA １mlに懸濁し、超音波破砕（20
0W、５分間）を行った後、遠心分離（5,000rpm、10分
間）により分けた上澄に３mM CaCl₂を加えたものを菌体
抽出液とした。その後、両方の菌体抽出液を同量ずつ混
合し、37℃、20分間インキュベーション後、エラスター
ゼ活性を測定した。なお活性は基質として 0.2〜2mM su
ccinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide（シグマ社
製）を含む0.2mM Tris-HCl(9.0)、１％N-methyl pyroli
done 溶液に試料を添加し、30℃で反応後、遊離した p-
nitroanilide を410 nm での吸収を測定することにより
定量した。その結果を表３に示した。表３に示したよう
にエラスターゼ活性は両方の菌体抽出液を混合した場合
のみ認められた。尚、pED1803とはプラスミドpED1803を
有する大腸菌JM109株の菌体抽出液、pED45とはプラスミ
ドpED45を有する大腸菌JM109株の菌体抽出液、及びpED1
803＋pED45とはプラスミドpED1803を有する大腸菌JM109
株の菌体抽出液とプラスミドpED45を有する大腸菌JM109
株の菌体抽出液を混合したものの略である。

【００３１】

【表３】

【００３２】さらに、成熟エラスターゼが生成している
ことを確認するために精製エラスターゼを用いてウサギ
で作製した抗エラスターゼ抗体によるウエスタン・ブロ
ッティングをベクター社の Vectastain ABC kit を用い
て行った。即ち、各画分からのタンパク 0.5μl ずつを
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動
後のサンプルをメンブレン（Immobilon；ミリポア社）
にトランスファーして抗原となるタンパク質をメンブレ
ンに結合させた。その後、ウサギ抗エラスターゼ抗体
（抗体価８倍のものを1000倍希釈した）によるウエスタ
ン・ブロッティングを行い、遺伝子産物をタンパク質レ
ベルで確認した。尚、ウエスタン・ブロッティングを行
う際のレーン１は精製エラスターゼ標品（コントロー
ル）、レーン２はプラスミドpED1803を含有する大腸菌
由来の抽出液、レーン３はプラスミドpED45を含有する
大腸菌由来の抽出液、レーン４はプラスミドpED1803含
有する大腸菌由来の抽出液とプラスミドpED45を含有す
る大腸菌由来の抽出液をまぜたものとした。その結果、
以下のレーン１、４において同一の位置に発色したバン
ドが現れ、抗エラスターゼ抗体との反応を示すタンパク
質が精製エラスターゼと同一分子量の位置に検出でき
た。

【００３３】

【発明の効果】エラスターゼの活性発現に必須なaleR遺
伝子及びaleR遺伝子産物を有効に利用することにより、
本エラスターゼの生産量を従来の製造方法に比べて著し
く増加させることが可能とすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】発現プラスミドpEX1500の構築図である。

【図２】発現プラスミドpMK120の構築図である。

【図３】発現プラスミドpED1803の構築図である。

【図４】発現プラスミドpED45の構築図である。

【図５】発現プラスミドpEDR1803の構築図である。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：147 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：アルカリ性バチルス属細菌(alkalophilic Baci
llus) 株名：Ｙａ−Ｂ(FERM p-12261) 配列 ATG GAA CTA CTT CAC CGT GTA AAT CAT GAG GAT AAA TCG ATC AAA CTC Met Glu Leu Leu His Arg Val Asn His Glu Asp Lys Ser Ile Lys Leu 1 5 10 15 CCT ACA AAT AAA CGC TTA TCC CGC CAC ATC CTC ACA TAT AGT CAT TGG Pro Thr Asn Lys Arg Leu Ser Arg His Ile Leu Thr Tyr Ser His Trp 20 25 30 TAC GAT CAA TCA ACG ATC GAA AAA GCC AAA GCA GAT TTA AAA CAA TTG Tyr Asp Gln Ser Thr Ile Glu Lys Ala Lys Ala Asp Leu Lys Gln Leu 35 40 45 CTG Leu 配列番号：２配列の長さ：259 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：アルカリ性バチルス属細菌(alkalophilic Baci
llus) 株名：Ｙａ−Ｂ(FERM p-12261) 配列ＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＧＣＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣ
ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＴＡＡＴＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡ６０ＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＡＣＴＴＣＡＣ
ＣＧＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＡＡＡ１０８ＭｅｔＧｌｕＬｅｕＬｅｕＨｉｓ
ＡｒｇＶａｌＡｓｎＨｉｓＧｌｕＡｓｐＬｙｓ１５
１０ＴＣＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＧＣ
ＴＴＡＴＣＣＣＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＡＣＡ１５６ＳｅｒＩｌｅＬｙｓＬｅｕＰｒｏＴｈｒＡｓｎＬｙｓＡｒｇ
ＬｅｕＳｅｒＡｒｇＨｉｓＩｌｅＬｅｕＴｈｒ１５２０
２５ＴＡＴＡＧＴＣＡＴＴＧＧＴＡＣＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＣＧ
ＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴ２０４ＴｙｒＳｅｒＨｉｓＴｒｐＴｙｒＡｓｐＧｌｎＳｅｒＴｈｒ
ＩｌｅＧｌｕＬｙｓＡｌａＬｙｓＡｌａＡｓｐ３０３５
４０ＴＴＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＣＴＧＴＡＡＣＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＴ
ＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＴＴ２５９ＬｅｕＬｙｓＧｌｎＬｅｕＬｅｕ４５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/31 15/57 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エラスターゼ遺伝子の活性発現に必須な
aleR遺伝子の遺伝子産物。
【請求項２】遺伝子産物が配列表の配列番号１記載の
アミノ酸配列を有するペプチドである請求項１記載の遺
伝子産物。
【請求項３】エラスターゼ遺伝子の活性発現に必須な
aleR遺伝子。
【請求項４】 aleR遺伝子が配列表の配列番号１記載の
アミノ酸配列をコードするものである請求項３記載のal
eR遺伝子。
【請求項５】 aleR遺伝子が配列表の配列番号１記載の
塩基配列を有するものである請求項３記載のaleR遺伝
子。
【請求項６】請求項３，４又は５記載のaleR遺伝子を
有するプラスミド。
【請求項７】エラスターゼ遺伝子をコードする遺伝子
を更に有する請求項６記載のプラスミド。
【請求項８】請求項６記載のプラスミドで形質転換さ
れた形質転換体。
【請求項９】請求項７記載のプラスミドで形質転換さ
れた形質転換体。
【請求項１０】請求項３，４又は５記載のaleR遺伝子
を組み込んだプラスミド及びエラスターゼをコードする
遺伝子を組み込んだプラスミドの双方を有する形質転換
体。
【請求項１１】形質転換体が大腸菌である請求項８，
９又は１０記載の形質転換体。
【請求項１２】形質転換体が枯草菌である請求項８，
９又は１０記載の形質転換体。
【請求項１３】請求項８、９，１０，１１又は１２記
載の形質転換体を培養してエラスターゼを生産させた
後、目的とするエラスターゼを取得することを特徴とす
るエラスターゼの製造法。
【請求項１４】 aleR遺伝子の遺伝子産物をエラスター
ゼ遺伝子のみを有するプラスミドで形質転換された形質
転換体より得られたものに添加することにより、エラス
ターゼを生産させた後、目的とするエラスターゼを取得
することを特徴とするエラスターゼの製造法。
【請求項１５】 aleR遺伝子産物が配列表の配列番号１
記載のアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１４
記載の製造法。
【請求項１６】 aleR遺伝子産物が請求項８記載の形質
転換体から得られたものである請求項１４記載の製造
法。
【請求項１７】形質転換体が大腸菌又は枯草菌である
請求項１４記載の製造法。