JP7389640B2 - アルカリプロテアーゼ - Google Patents
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Description
該プロ配列が、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し且つ配列番号1の3位に相当する位置にLeuを有するアミノ酸配列からなり、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
アルカリプロテアーゼを提供する。
また本発明は、前記アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含有する形質転換体を提供する。
また本発明は、前記形質転換体を培養することを含む、アルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。
さらに本発明は、改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼの製造方法であって、
配列番号1のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号1の3位に相当する位置のアミノ酸残基をLeuに置換することを含み、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
方法を提供する。
該プロ配列が、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し且つ配列番号1の3位に相当する位置にLeuを有するアミノ酸配列からなり、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
アルカリプロテアーゼ。
〔2〕好ましくは、前記プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号3のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、〔1〕記載のアルカリプロテアーゼ。
〔3〕前記成熟酵素が、
好ましくはpH8以上のアルカリ性領域で作用するアルカリプロテアーゼであり、
より好ましくは、以下の酵素核的性質:
pH8以上のアルカリ性領域で作用する;
酸化剤耐性を有する(該アルカリプロテアーゼを50mM過酸化水素、5mM塩化カルシウムを含む20mMブリットンロビンソン緩衝液(pH10)中、30℃で20分間放置した後の残存活性が5%以上である);
50℃、pH10で10分間処理したとき80%以上の残存活性を有する;かつ、
SDS-PAGEによる分子量が43,000±2,000である、
を有するアルカリプロテアーゼである、
〔1〕又は〔2〕記載のアルカリプロテアーゼ。
〔5〕好ましくは、配列番号5のヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、〔4〕記載のポリヌクレオチド。
〔6〕前記〔4〕又は〔5〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔7〕前記〔4〕又は〔5〕記載のポリヌクレオチド、又は前記〔6〕記載のベクターを含有する形質転換体。
〔8〕枯草菌又はその変異株である、〔7〕記載の形質転換体。
〔9〕親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼを発現する細胞と比べて、アルカリプロテアーゼの成熟酵素の生産性が向上している、〔7〕又は〔8〕記載の形質転換体。
〔10〕好ましくは、前記親プロ配列が、配列番号1のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号1の3位に相当する位置に、好ましくはPhe又はPro、より好ましくはPheを有する、〔9〕記載の形質転換体。
〔11〕前記〔7〕~〔10〕のいずれか1項記載の形質転換体を培養することを含む、アルカリプロテアーゼの製造方法。
配列番号1のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号1の3位に相当する位置のアミノ酸残基をLeuに置換することを含み、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
方法。
〔13〕前記親プロ配列における配列番号1の3位に相当する位置のアミノ酸残基が、好ましくはPhe又はProであり、より好ましくはPheである、〔12〕記載の方法。
〔14〕好ましくは、前記改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号3のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、〔12〕又は〔13〕記載の方法。
〔15〕前記成熟酵素が、
好ましくはpH8以上のアルカリ性領域で作用するアルカリプロテアーゼであり、
より好ましくは、以下の酵素核的性質:
pH8以上のアルカリ性領域で作用する;
酸化剤耐性を有する(該アルカリプロテアーゼを50mM過酸化水素、5mM塩化カルシウムを含む20mMブリットンロビンソン緩衝液(pH10)中、30℃で20分間放置した後の残存活性が5%以上である);
50℃、pH10で10分間処理したとき80%以上の残存活性を有する;かつ、
SDS-PAGEによる分子量が43,000±2,000である、
を有するアルカリプロテアーゼである、
〔12〕~〔14〕のいずれか1項記載の方法。
プラスミドpHY300PLK(タカラバイオ)を鋳型としてプライマーペアpHY_KP43_fw/pHY_KP43_rv(配列番号6及び7、表1)及びPrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)を使用してPCRを行った。特開2010-273673の実施例記載の、配列番号5のヌクレオチド配列(配列番号4からなるアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質をコードする)を含むプラスミドpHA64TSAを鋳型とし、プライマーペアKP43_pHY_fw/KP43_pHY_rv(配列番号8及び9、表1)を使用して、同様にPCRを行った。得られた断片を用いて、In-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。In-Fusion反応液をECOSTM Competent E.coli DH5α(ニッポンジーン、310-06236)に形質転換してプラスミド(pHY-KP43)を構築した。このプラスミドは、配列番号4のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質(野生型KP43)をコードする。
プラスミドpHY-KP43を鋳型としてプライマーペアF34L_fw/F34L_rv(配列番号10及び11、表1)及びPrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)を使用してPCRを行った。PCR反応液をECOSTM Competent E.coli DH5α(ニッポンジーン、310-06236)に形質転換してプラスミド(pHY-KP43 F34L)を構築した。このプラスミドは、配列番号1の3位に相当する位置(配列番号4の34位)のPheをLeuに置換した以外は配列番号4のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質(KP43 F34L変異体)をコードする。
宿主には、枯草菌168株(Bacillus subtilis Marburg No.168株:Nature,390,1997,p.249)を使用した。プラスミドpHY300PLK(タカラバイオ)、pHY-KP43及びpHY-KP43 F34Lをそれぞれ以下の方法によって導入した。1mLのLB培地に枯草菌168株を植菌し、30℃、200rpmで一晩振盪培養した。1mLの新たなLB培地にこの培養液を10μL植菌して37℃、200rpmで3時間培養した。この培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに4mg/mLのリゾチーム(SIGMA)を含むSMMP(0.5Mシュークロース、20mMマレイン酸二ナトリウム、20mM塩化マグネシウム6水塩、35%(w/v)Antibiotic medium 3(Difco))を500μL添加し、37℃で1時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、400μLのSMMPに懸濁した。懸濁液33μL、各プラスミド20ngを混合し、さらに100μLの40%PEGを加え攪拌し、さらにSMMPを350μL加えた後、30℃で1時間振盪した。この液200μLを、テトラサイクリン(15μg/mL、SIGMA)を含むDM3再生寒天培地(0.8%寒天(和光純薬)、0.5%コハク酸2ナトリウム6水塩、0.5%カザミノ酸テクニカル(Difco)、0.5%酵母エキス、0.35%リン酸1カリウム、0.15%リン酸2カリウム、0.5%グルコース、0.4%塩化マグネシウム6水塩、0.01%牛血清アルブミン(SIGMA)、0.5%カルボキメチルセルロース、0.005%トリパンブルー(Merck)及びアミノ酸混液(トリプトファン、リジン、メチオニン各10μg/mL);%は(w/v)%)に塗抹して30℃で3日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。
15ppmテトラサイクリンを添加したLB培地5mLを分注した試験管に(3)で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、30℃、250spmで一晩培養した。翌日、培養液500μLを2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、0.04%塩化カルシウム二水和物、15ppmテトラサイクリン;%は(w/v)%)20mLを分注したひだ付きフラスコに植菌し、30℃、210rpmで3日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。
培養上清のタンパク質濃度測定にはプロテインアッセイラピッドキット ワコーII(富士フイルム和光純薬株式会社)を用いた。KP43発現カセットを持たないpHY300PLK導入株の培養上清のタンパク質濃度をブランクとすることで、培養上清中のKP43の濃度を概算した。測定の結果、野生型KP43を発現するpHY-KP43導入株では、培養上清中のKP43濃度は17.2mg/Lであった。一方、KP43 F34L変異体を発現するpHY-KP43 F34L導入株では、培養上清中のKP43濃度は48.6mg/Lであった。プロ配列中の変異F34Lの導入によって、野生型KP43と比べて、KP43成熟酵素の生産性が2.8倍に向上した(表2)。
Claims (10)
- 改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼであって、
該改変プロ配列は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号1の3位に相当する位置のアミノ酸残基をLeuに置換したアミノ酸配列からなり、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素は、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
該改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼは、該親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼと比べて、該成熟酵素の生産性が向上している、
アルカリプロテアーゼ。 - 前記改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号3のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、請求項1記載のアルカリプロテアーゼ。
- 請求項1又は2記載の改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項3記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項3記載のポリヌクレオチド又は請求項4記載のベクターを含有する形質転換体。
- 枯草菌又はその変異株である、請求項5記載の形質転換体。
- 請求項5又は6記載の形質転換体を培養することを含む、アルカリプロテアーゼの製造方法。
- 改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼの製造方法であって、
配列番号1のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号1の3位に相当する位置のアミノ酸残基をLeuに置換することを含み、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素は、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
該改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼは、該親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼと比べて、該成熟酵素の生産性が向上している、
方法。 - 前記親プロ配列における配列番号1の3位に相当する位置のアミノ酸残基がPheである、請求項8記載の方法。
- 前記改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号3のアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、
請求項8又は9記載の方法。
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