JP2000316584A - カタラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高カタラーゼ細菌ヴィブリオ・ルモイエンシ
ス（Vibrio rumoiensis）Ｓ−１株のカタラーゼ遺伝子
と、この遺伝子の発現産物であるカタラーゼを提供す
る。 【解決手段】 ヴィブリオ・ルモイエンシス（Vibrio r
umoiensis）Ｓ−１株の遺伝子であって、配列番号１の
塩基配列を有するカタラーゼ遺伝子と、この遺伝子の発
現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するカ
タラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は細菌ヴィブ
リオ・ルモイエンシス（Vibrio rumoiensis）Ｓ−１株
のカタラーゼ遺伝子と、この遺伝子の発現産物であるカ
タラーゼに関するものである。さらに詳しくは、この出
願の発明は、食品等の酸化防止や、あるいは汚染水／土
壌等の浄化に有用な新規カタラーゼと、このカタラーゼ
をコードする遺伝子、並びにこの遺伝子発現のための遺
伝子工学材料に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】過酸化水素は、好気性生物における酸素
代謝の過程でごく普通に発生するが、細胞にとっては毒
性に作用するため（例えば細胞膜、タンパク質、ＤＮＡ
等への障害作用）、ほとんどの動植物組織にはこの過酸
化水素を水と酸素に分解するための酵素（カタラーゼ）
が広く分布している。

【０００３】過酸化水素はまた、例えば食品や各種化合
物等の脂質酸化等による変性の原因物質であり、あるい
は工場排水等における有害な汚染物質でもある。このた
め、この過酸化水素を分解するためのカタラーゼは、酸
化防止剤や汚染水／土壌等の浄化剤として有望視されて
おり、ウシ肝カタラーゼ標品が市販されているほか、ミ
クロコッカス（Micrococcus luteus）等のバクテリア由
来のカタラーゼも知られている。

【０００４】一方、この出願の発明者らは、高濃度の過
酸化水素を含む工場排水から新菌株ヴィブリオ・ルモイ
エンシス（Vibrio rumoiensis）Ｓ−１株を単離し、こ
の菌株が大腸菌や枯草菌由来のカタラーゼよりも遙かに
強い活性を有するカタラーゼを産生することを報告して
いる（J. Ferment. Bioeng. 85:113-116, 1998; Appl.
Environ. Microbiol. 65:67-72, 1999）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】この出願は、この出願
の発明者らが単離した新菌株ヴィブリオ・ルモイエンシ
ス（Vibrio rumoiensis）Ｓ−１株の高活性カタラーゼ
を大量かつ安価に、しかも高純度で遺伝子工学的に製造
するための新規遺伝子を提供することを課題としてい
る。

【０００６】またこの出願は、前記遺伝子の発現産物と
してのカタラーゼ（以下、「VRカタラーゼ」と記載する
ことがある）を提供することを課題としてもいる。さら
にこの出願は、前記遺伝子からVRカタラーゼを発現させ
るための遺伝子工学材料としての組換えベクターおよび
形質転換体を提供することを課題としてもいる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決する発明として、ヴィブリオ・ルモイエンシス
（Vibrio rumoiensis）Ｓ−１株の遺伝子であって、配
列番号１の塩基配列を有するカタラーゼ遺伝子を提供す
る。またこの出願は、前記遺伝子の発現産物であって、
配列番号２の第127−509のアミノ酸配列、さらに詳しく
は配列番号２のアミノ酸配列を有するカタラーゼを提供
する。

【０００８】さらにこの出願は、前記の遺伝子を保有す
る組換えベクターと、この組換えベクターによる形質転
換体を提供する。以下、これらの発明の実施形態につい
て詳しく説明する。

【０００９】

【発明の実施の形態】この発明のヴィブリオ・ルモイエ
ンシス（Vibrio rumoiensis）Ｓ−１株（以下、単に
「Ｓ−１株」と記載することがある）由来のカタラーゼ
遺伝子（以下、「vktＡ」と記載することがある）は配
列番号１に示した1,530bpの塩基配列からなり、509アミ
ノ酸残基からなるVRカタラーゼをコードする単一のオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有している。こ
の発明のVRカタラーゼは、遺伝子vktＡの発現産物であ
って、配列番号２の第127−509アミノ酸配列、さらに詳
しくは配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素である。

【００１０】遺伝子vktＡは、後記する実施例の方法に
よりＳ−１株より単離・同定された遺伝子である。従っ
て、この遺伝子vktＡは、後記の実施例と同一の方法に
より取得することができる。あるいは、この遺伝子vkt
Ａは、この出願によって提供されるＤＮＡ配列（配列番
号１）の両端の一部配列に対応する合成オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、実施例と同様のＰＣＲ法
により取得することもできる。

【００１１】また、この遺伝子vktＡは、この出願によ
って提供されるＤＮＡ配列（配列番号１）に基づいて作
成したプローブを用い、ヴィブリオ・ルモイエンシス
（Vibrio rumoiensis）のゲノムライブラリー等をスク
リーニングすることによって取得することもできる。こ
の発明のVRカタラーゼは、この出願によって提供される
アミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製
する方法、あるいはこの出願によって提供される遺伝子
vktＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などに
より取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術
によってVRカタラーゼを取得する場合には、この発明の
遺伝子vktＡを有するベクターからインビトロ転写によ
ってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳
を行なうことにより、VRカタラーゼを得ることができ
る。また遺伝子vktＡを公知の方法により適当な発現ベ
クターに組換え、この組換えベクターで大腸菌、枯草
菌、酵母、動植物細胞等を形質転換すれば、これらの形
質転換体でVRカタラーゼを大量に発現させることができ
る。さらに、細胞外へタンパク質を分泌させる能力をも
つベクターとvktＡ遺伝子を共存させることにより、VR
カタラーゼを菌体外酵素として大量に調製することがで
きる。

【００１２】この発明のVRカタラーゼをインビトロ翻訳
で生産させる場合には、この発明の遺伝子vktＡをＲＮ
Ａポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換
え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含む
ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビ
トロ翻訳系に添加すればよい。ＲＮＡポリメラーゼプロ
モーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示でき
る。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベ
クターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＢluescrip
t IIなどが例示できる。

【００１３】また、この発明のVRカタラーゼを大腸菌な
どの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能
なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮ
Ａクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベ
クターに、この発明の遺伝子vktＡを組換えて発現ベク
ターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換
したのち、得られた形質転換体を培養すればよい。この
際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを
付加すれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得るこ
とができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパ
ク質として発現させることもできる。この融合タンパク
質を適当なプロテアーゼで切断することによって目的と
するVRカタラーゼのみを取得することもできる。大腸菌
用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript I
I、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが
例示できる。

【００１４】この発明のVRカタラーゼを真核細胞で発現
させる場合には、この発明の遺伝子vktＡを、プロモー
ター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有
する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導
入する。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ
８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭ
Ｖ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ
Ｓ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細
胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯな
どの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細
胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられる
が、これらに限定されるものではない。発現ベクターを
真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウ
ム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知
の方法を用いることができる。

【００１５】上記の方法により原核細胞や真核細胞でカ
タラーゼを発現させたのち、培養物から目的タンパク質
を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせ
て行う。例えば、超音波処理、塩析や溶媒沈殿法、透
析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、等電点電気泳動、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー等である。

【００１６】なお、ヴィブリオ・ルモイエンシス（Vibr
io rumoiensis）株には様々な変異株が存在し、それぞ
れのカタラーゼ活性も僅かに異なることが予想される。
従って配列番号１において、１または複数個のヌクレオ
チドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによ
る置換がなされているカタラーゼ遺伝子もこの発明のカ
タラーゼ遺伝子に含まれる。同様に、これらの塩基の変
更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠
失および／または他のアミノ酸による置換がなされてい
るカタラーゼも、配列番号２のアミノ酸配列を有するカ
タラーゼの活性を有する限り、この発明に含まれる。

【００１７】以下、実施例を示してこの出願の発明につ
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】実施例１：カタラーゼ遺伝子vktＡのクロー
ニング (1)プローブの調製 ＤＥＡＥ−Sepharose ＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラム
（Pharmacia社製）およびSephacryl S-300ゲル分画カラ
ム（Pharmacia社製）を用いてＳ−１株のカタラーゼを
精製した。さらに、この精製カタラーゼ1.6mgをポリア
クリルアミドゲル電気泳動してさらに精製したのち、ポ
リフッ化ビニリデン製メンブレン（Millipore社製）に
ブロットし、0.1％Ponceau S（Wako社製）含有の３％ト
リクロロ酢酸で染色した。メンブレンからカタラーゼの
バンドを切り出し、タンパク質自動シークエンサー（Ap
plied Biosystem 491：Perkin-Elmer社製）によりＳ−
１株カタラーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定した。

【００１９】次いで、精製したＳ−１株カタラーゼ50μ
gを、１mlの10mM Tris-HClバッファー（pH 9.0）中で0.
5μgのリシル−エンドペプチダーゼ（Wako社製）を37℃
一晩反応させて切断した。６Ｍグアニジン−HClを反応
溶液に添加し、室温で30分間以上インキュベートしてペ
プチダーゼを不活性化したのち、ＴＳＫ-80Ｔsカラム
（Tosoh社製）を備えた逆相高速液体クロマトグラフィ
ーシステムによってペプチドを溶出した。溶出条件は、
0.1％トリフルオロ酢酸中における０〜100％アセトニト
リルの直線勾配で、流速は1ml／分とした。得られた各
ペプチドを凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸で希釈し、シ
ークエンサー（Applied Biosystem 491）により配列を
決定した。

【００２０】以上のとおりにして決定したＮ末端配列と
ペプチド断片ＰＦ-１、ＰＦ-３およびＰＦ-4.1のそれぞ
れのアミノ酸配列から、４種類のオリゴヌクレオチドＰ
-Ｎ、Ｐ-１、Ｐ-３およびＰ-4.1を合成した。そして、
これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｓ−１
株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ
反応溶液（全量50μl）の組成は以下のとおりである。

【００２１】・10×ＰＣＲバッファー（Takara社製）：
5μl ・2.5mM デオキシヌクテオシド三リン酸塩混合液（Taka
ra社製）：5μl ・ゲノムＤＮＡ：0.7μg ・オリゴヌクレオチドプライマー：各１pmol ・ＴaqＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）：1.25Ｕ ・蒸留水 また、ＰＣＲ条件は以下のとおりとした。

【００２２】・（93℃：５分間、50℃：２分間、72℃：
３分間）×１サイクル； ・（94℃：１分間、50℃：２分間、72℃：３分間）×30
サイクル； ・（94℃：１分間、50℃：２分間、72℃：５分間）×１
サイクル 以上のとおりのＰＣＲにより、プライマーＰ-３（配列
番号３）およびプライマーＰ-4.1（配列番号４）を用い
た場合のＰＣＲ産物（327bpＤＮＡ断片：PP-327）の塩
基配列が、大腸菌E.coli ＨＰII型カタラーゼ（KatE）
およびHaemophilus influenzae HtkEカタラーゼと高い
相同性を示すことが確認された。このため、このＤＮＡ
断片PP-327をカタラーゼ遺伝子のクローニング用プロー
ブとした。 (2)ライブラリーの構築とスクリーニング Ｓ−１株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＳalＩで37℃１時間
処置して切断し、アガロースゲル電気泳動した。プロー
ブPP-327がハイブリダイズした２kbＤＮＡ断片をゲルか
ら切り出し、ライゲーションキット（Takara社製）を用
いてプラスミドpBluescript SKII+のＳalＩ部位にライ
ゲーションし、この組換えプラスミドによって大腸菌E.
coli XL1-blueを形質転換してライブラリーを構築し
た。

【００２３】次いで、PP-327をプローブとしてコロニー
ハイブリダイゼーションを行い、プローブに対して陽性
反応を示すコロニーＸＬＳalを得た。このコロニーＸＬ
Ｓalを培養して、菌体からプラスミドｐＢＳsalを抽出
した。このｐＢＳsalのインサートＤＮＡ断片の全塩基
配列を、ＤＮＡシークエンサー（model 377：Perkin-El
mer社製）を用いて決定した。その結果、このｐＢＳsal
のインサートＤＮＡ断片は、５０９アミノ酸配列（配列
番号２）をコードする塩基数1527個の単一のＯＲＦを含
む全1530bpの配列（配列番号１）であることが確認され
た。

【００２４】さらに、配列番号２の全509アミノ酸配列
について、大腸菌E.coli ＨＰII型カタラーゼKatEおよ
びHaemophilus influenzae HtkEカタラーゼの対応する
アミノ酸配列と比較した結果、図１および図２に示した
とおり、３者間には高い相同性が認められたことから、
配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ断片をカタラーゼ
遺伝子として同定し、遺伝子vktＡと命名した。 実施例２：遺伝子vktＡの大腸菌での発現 実施例１でクローニングしたカタラーゼ遺伝子vktＡを
保有するプラスミドｐＢＳsa1をヒートショック法によ
り大腸菌XL1-blueに、またエレクトロポレーション法に
より大腸菌のカタラーゼ欠損株UM2に導入した。プラス
ミドの導入後、それぞれの菌体をアンピシリンを50 mg/
lの濃度で含むLB液体培地に接種し37℃、12時間振等培
養後、菌体を遠心回収した。菌体を超音波破砕機により
破砕し菌体の全蛋白質を含む抽出液を得た。

【００２５】得られた抽出液を常法に従いSDS-ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動終了後、ゲ
ルを常法に従いPVDF膜にエレクトロブロッターを用いて
ブロッティングし、精製カタラーゼ酵素を使って作成し
た抗血清でカタラーゼの発現を膜上で検出した。その結
果、抗血清に対して陽性のバンドが得られたことから、
この発明のカタラーゼ遺伝子vktＡを大腸菌で発現させ
ることによって、この発明のVRカタラーゼを取得可能で
あることが確認された。

【００２６】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願に
よって、高カタラーゼ細菌ヴィブリオ・ルモイエンシス
（Vibrio rumoiensis）Ｓ−１株のカタラーゼ遺伝子
と、この遺伝子の発現産物であるカタラーゼが提供され
る。これによって、抗酸化物質として、あるいは食品加
工、水産加工、半導体製造等を行う工場の排水に含まれ
る過酸化水素を分解する酵素剤として有用な高活性カタ
ラーゼを大量かつ安価に製造することが可能となる。

【００２７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 科学技術振興事業団 <120> カタラーゼ遺伝子 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1530 <212> DNA <213> Vibrio rumoiensis <220> <221> CDS <222> (1)..(1527) <400> 1 atg agc gac gac acc aaa aag tgc ccc gta acc cac atg act act gac 48 Met Ser Asp Asp Thr Lys Lys Cys Pro Val Thr His Met Thr Thr Asp 1 5 10 15 ttc ggc gcc ccc gtg gtc act aac cgc gac agc ctc act gca ggt cct 96 Phe Gly Ala Pro Val Val Thr Asn Arg Asp Ser Leu Thr Ala Gly Pro 20 25 30 cgc ggc ccc tta ttg gct cag gat gtc tgg ctg aat gaa aag ctg gcc 144 Arg Gly Pro Leu Leu Ala Gln Asp Val Trp Leu Asn Glu Lys Leu Ala 35 40 45 ggt ttt gtg cgc gag gtc atc cca gag cgc cgc atg cac gcc aag gga 192 Gly Phe Val Arg Glu Val Ile Pro Glu Arg Arg Met His Ala Lys Gly 50 55 60 tcg ggt gcc ttc ggc aca ttc acg gtc acg cac gac atc acc aag tac 240 Ser Gly Ala Phe Gly Thr Phe Thr Val Thr His Asp Ile Thr Lys Tyr 65 70 75 80 acc cgc gct aag att ttc agc gag gta gga aag aag acg gag atg ttt 288 Thr Arg Ala Lys Ile Phe Ser Glu Val Gly Lys 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Ser Ser His Thr Tyr Ser Leu 195 200 205 tgg aac cag gcc ggc gag cgt ttc tgg gtc aag atg cat ttc cgg acc 672 Trp Asn Gln Ala Gly Glu Arg Phe Trp Val Lys Met His Phe Arg Thr 210 215 220 cag cag ggc atc aag aac ctt acc gat gca gag gcc ggc gaa ttg gtc 720 Gln Gln Gly Ile Lys Asn Leu Thr Asp Ala Glu Ala Gly Glu Leu Val 225 230 235 240 gcc cag gat cgt gaa agc cat cag cgc gat ctg tat gaa gcc atc gaa 768 Ala Gln Asp Arg Glu Ser His Gln Arg Asp Leu Tyr Glu Ala Ile Glu 245 250 255 cgt ggc gaa tat ccc aag tgg acg atg ttt att cag gtc atg cca gag 816 Arg Gly Glu Tyr Pro Lys Trp Thr Met Phe Ile Gln Val Met Pro Glu 260 265 270 gct gat gcg gag aag tac gcc ttg cat ccg ttc gat ctg acc aag gtc 864 Ala Asp Ala Glu Lys Tyr Ala Leu His Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val 275 280 285 tgg tac aag ggc gac tat ccg ctc atc gaa gtt ggt gag ttc gag ctg 912 Trp Tyr Lys Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Glu Val Gly Glu Phe Glu Leu 290 295 300 aac aaa aac tcc gag aac ttt ttc gcc gac gtt gaa cag gtg gcc ttt 960 Asn Lys Asn Ser Glu Asn Phe Phe Ala Asp Val Glu Gln Val Ala Phe 305 310 315 320 tcc cct agc aat ctg gta cct ggt atc ggt gtc agt ccg gac cgt atg 1008 Ser Pro Ser Asn Leu Val Pro Gly Ile Gly Val Ser Pro Asp Arg Met 325 330 335 ctg caa gca cgc ctt ttc aac tac gcc gat gct cag cgc tat cga ctg 1056 Leu Gln Ala Arg Leu Phe Asn Tyr Ala Asp Ala Gln Arg Tyr Arg Leu 340 345 350 ggc gta aat tac cac cag atc cct gtc aat cag gct cgc tgc cca gtg 1104 Gly Val Asn Tyr His Gln Ile Pro Val Asn Gln Ala Arg Cys Pro Val 355 360 365 cac agc aac cac cgc gat ggt cag ggg cgg gtc gat ggc aac tat ggt 1152 His Ser Asn His Arg Asp Gly Gln Gly Arg Val Asp Gly Asn Tyr Gly 370 375 380 gct ttg ccg cac tac gaa ccc aac agc ttt ggc caa tgg cag ggc cag 1200 Ala Leu Pro His Tyr Glu Pro Asn Ser Phe Gly Gln Trp Gln Gly Gln 385 390 395 400 ccg cag ttc tcg gag ccg ccg ctc aag ctc acc ggc aat gca gcc cac 1248 Pro Gln Phe Ser Glu Pro Pro Leu Lys Leu Thr Gly Asn Ala Ala His 405 410 415 tgg agc tac gac aaa gat gac cac aac tac ttc gag caa cct ggc aag 1296 Trp Ser Tyr Asp Lys Asp Asp His Asn Tyr Phe Glu Gln Pro Gly Lys 420 425 430 ttg ttc cgt cta atg aac gac ggt cag aag gaa gcg ctt ttt ggc aac 1344 Leu Phe Arg Leu Met Asn Asp Gly Gln Lys Glu Ala Leu Phe Gly Asn 435 440 445 acc ggc aga gcc atg ggc gac gct cca gag ttc atc aag ttc cgt cac 1392 Thr Gly Arg Ala Met Gly Asp Ala Pro Glu Phe Ile Lys Phe Arg His 450 455 460 atc cgc aat tgc cac gcc gca gac cct gca tac ggt gca ggc gta gcc 1440 Ile Arg Asn Cys His Ala Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Ala Gly Val Ala 465 470 475 480 aag gcc ctg ggc atc aac ctt gaa aag gca ctg gcc tca aaa aag gat 1488 Lys Ala Leu Gly Ile Asn Leu Glu Lys Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp 485 490 495 gac cct atg tac gga aac cca ctg gtc gcc ctg cct gcg tag 1530 Asp Pro Met Tyr Gly Asn Pro Leu Val Ala Leu Pro Ala 500 505 <210> 2 <211> 509 <212> PRT <213> Vibrio rumoiensis <400> 2 Met Ser Asp Asp Thr Lys Lys Cys Pro Val Thr His Met Thr Thr Asp 1 5 10 15 Phe Gly Ala Pro Val Val Thr Asn Arg Asp Ser Leu Thr Ala Gly Pro 20 25 30 Arg Gly Pro Leu Leu Ala Gln Asp Val Trp Leu Asn Glu Lys Leu Ala 35 40 45 Gly Phe Val Arg Glu Val Ile Pro Glu Arg Arg Met His Ala Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ala Phe Gly Thr Phe Thr Val Thr His Asp Ile Thr Lys Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Ala Lys Ile Phe Ser Glu Val Gly Lys Lys Thr Glu Met Phe 85 90 95 Ala Arg Phe Thr Thr Val Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ala Asp Ala Glu 100 105 110 Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ala Leu Lys Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn 115 120 125 Trp Asp Met Val Gly Asn Asn Thr Pro Val Phe Phe Ile Arg Asp Pro 130 135 140 Arg Gln Phe Pro Asp Leu Asn Lys Ala Val Lys Arg Asp Pro Arg Thr 145 150 155 160 Asn Leu Arg Ser Ala Thr Asn Asn Trp Asp Tyr Trp Thr Leu Leu Pro 165 170 175 Glu Ala Leu His Gln Val Thr Val Val Met Ser Asp Arg Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Ser Tyr Arg His Met His Gly Phe Ser Ser His Thr Tyr Ser Leu 195 200 205 Trp Asn Gln Ala Gly Glu Arg Phe Trp Val Lys Met His Phe Arg Thr 210 215 220 Gln Gln Gly Ile Lys Asn Leu Thr Asp Ala Glu Ala Gly Glu Leu Val 225 230 235 240 Ala Gln Asp Arg Glu Ser His Gln Arg Asp Leu Tyr Glu Ala Ile Glu 245 250 255 Arg Gly Glu Tyr Pro Lys Trp Thr Met Phe Ile Gln Val Met Pro Glu 260 265 270 Ala Asp Ala Glu Lys Tyr Ala Leu His Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val 275 280 285 Trp Tyr Lys Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Glu Val Gly Glu Phe Glu Leu 290 295 300 Asn Lys Asn Ser Glu Asn Phe Phe Ala Asp Val Glu Gln Val Ala Phe 305 310 315 320 Ser Pro Ser Asn Leu Val Pro Gly Ile Gly Val Ser Pro Asp Arg Met 325 330 335 Leu Gln Ala Arg Leu Phe Asn Tyr Ala Asp Ala Gln Arg Tyr Arg Leu 340 345 350 Gly Val Asn Tyr His Gln Ile Pro Val Asn Gln Ala Arg Cys Pro Val 355 360 365 His Ser Asn His Arg Asp Gly Gln Gly Arg Val Asp Gly Asn Tyr Gly 370 375 380 Ala Leu Pro His Tyr Glu Pro Asn Ser Phe Gly Gln Trp Gln Gly Gln 385 390 395 400 Pro Gln Phe Ser Glu Pro Pro Leu Lys Leu Thr Gly Asn Ala Ala His 405 410 415 Trp Ser Tyr Asp Lys Asp Asp His Asn Tyr Phe Glu Gln Pro Gly Lys 420 425 430 Leu Phe Arg Leu Met Asn Asp Gly Gln Lys Glu Ala Leu Phe Gly Asn 435 440 445 Thr Gly Arg Ala Met Gly Asp Ala Pro Glu Phe Ile Lys Phe Arg His 450 455 460 Ile Arg Asn Cys His Ala Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Ala Gly Val Ala 465 470 475 480 Lys Ala Leu Gly Ile Asn Leu Glu Lys Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp 485 490 495 Asp Pro Met Tyr Gly Asn Pro Leu Val Ala Leu Pro Ala 500 505 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Synthesized DNA <220> <221> i <222> (3)(6)(9)(12)(15)(21) <400> 3 acigaigaig giaaitgggc iatg 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Synthesized DNA <220> <221> i <222> (3)(6)(9)(12)(15)(18) <400> 4 tciccigcit cigcitcigt 20

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明のカタラーゼ遺伝子vktＡが発現する
カタラーゼと、公知のカタラーゼ（H.influenzae HktＥ
およびE.coli KatE）のアミノ酸配列との比較図であ
る。３者の配列下の「＊」は同一アミノ酸残基、「．」
は類似アミノ酸残基であることを示す。

【図２】図１から連続するアミノ酸配列の比較図であ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年６月１５日（１９９９．６．１
５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】次いで、PP-327をプローブとしてコロニー
ハイブリダイゼーションを行い、プローブに対して陽性
反応を示すコロニーＸＬＳalを得た。このコロニーＸＬ
Ｓalを培養して、菌体からプラスミドｐＢＳsalを抽出
した。このｐＢＳsalのインサートＤＮＡ断片の全塩基
配列を、ＤＮＡシークエンサー（model 377：Perkin-El
mer社製）を用いて決定した。その結果、このｐＢＳsal
の4904bpのインサートＤＮＡ断片中に、５０９アミノ酸
配列（配列番号２）からなるタンパク質をコードする塩
基数1530bpの単一のＯＲＦ（配列番号１）が存在するこ
とが確認された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/08 9/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:63）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヴィブリオ・ルモイエンシス（Vibrio r
   umoiensis）Ｓ−１株の遺伝子であって、配列番号１の
   塩基配列を有するカタラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子の発現産物であっ
   て、配列番号２の第127−509アミノ酸配列を有するカタ
   ラーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１記載の遺伝子の発現産物であっ
   て、配列番号２のアミノ酸配列を有するカタラーゼ。
4. 【請求項４】 請求項１記載の遺伝子を保有する組換え
   ベクター。
5. 【請求項５】 請求項３記載の組換えベクターによる形
   質転換体。