WO1997023615A1

WO1997023615A1 - Multimere formen von il-16, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung

Info

Publication number: WO1997023615A1
Application number: PCT/EP1996/005661
Authority: WO
Inventors: Kurt Lang; Reinhard Kurth; Michael Baier; Norbert Bannert; Karin Metzner; Albrecht Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh; BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND, vertreten durch den BUNDESMINISTER FÜR GESUNDHEIT
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-17
Publication date: 1997-07-03
Also published as: ZA9610766B; AU1196297A; AU701709B2; CA2240392A1; JP3172968B2; DE19547933A1; CA2240392C; DE19681159D2; JPH11503029A; EP0870029A1; MX9805060A

Abstract

Eine multimere Form von IL-16, die gegebenenfalls Metallionen in definierter Menge enthält, ist aktiver als bekanntes IL-16.

Description

Multimere Formen von IL-16, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

Gegenstand der Erfindung sind multimere Formen von Polypeptiden mit IL-16-Aktivität, Ver¬ fahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

IL-16 (Interleukin- 16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. ISL und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der WO 96/31607 sowie von Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 5109-5113 und von Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von LL-16 beschrieben. Danach ist monomeres LL-16 ein Protein mit einer molekularen Masse von 13,385 D Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsieb- chromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert. Dieser multimere Form wird die "chemoattraetant activity" zugeschrieben. Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben. Die von Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattraetant activity" und die von Baier beschriebene Aktivität von rekombinantem humanem LL-16 sind jedoch sehr gering.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von LL-16 zu verbessern und LL-16- Formen reproduzierbar bereitzustellen, die vorteilhaft für eine therapeutische Anwendung geeignet sind.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine biologisch aktive multimere Form von LL-16-Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von mindestens ca. 70 kD (gemessen mit Gelfiltrations-HPLC) und/oder mit einem definierten Metallionenanteil.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß eine multimere Form von LL-16-Untereinheiten, welche mehr als vier Untereinheiten enthält, wesentlich mehr LL-16- Aktivität zeigt als mono¬ mere, dimere oder tetramere Formen. Diese Multimeren unterscheiden sich in ihrem Moleku¬ largewicht deutlich von den von Baier et al. und Cruikshank et al. beschriebenen Formen von Überraschenderweise wurde gefunden, daß eine von Baier et al. als inaktiv beschriebene dimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD durch eine Inkubation mit Metallionen in eine höhermolekulare aktive Form mit einem Molekulargewicht von 45 + 4 kD überführt werden kann, die im folgenden zur Unterscheidung von den Dimeren als "Tetramer" bezeichnet wird.

Sowohl die Herstellung dieser tetrameren Form von IL-16 durch einen Zusatz von Metall¬ ionen zu IL-16 enthaltenden Lösungen als auch die so erhältliche tetramere Form von LL-16 mit einem Molekulargewicht von mindestens 45 + 4 kD (abhängig vom Molekulargewicht der Untereinheit) sind ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß die tetramere Form von LL-16 in eine polymere Form von LL-16 mit einem Molekulargewicht von mindestens ca. 70 kD überfuhrt werden kann, die ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung ist.

Eine multimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von mindestens ca. 70 kD ent¬ hält vorzugsweise eine definierte Anzahl von Untereinheiten, wobei die Zahl der Untereinhei¬ ten in einer solchen multimeren Form über sechs, vorzugsweise zwischen 6 und 32, besonders bevorzugt zwischen 8 und 16 liegt. Insbesondere bevorzugt sind multimere Formen von LL-16 mit 8 oder 16 Untereinheiten sowie definierte Gemische hiervon.

Es hat sich weiter gezeigt, daß die Aktivität von LL-16 durch die Gegenwart von Metallionen weiter gesteigert werden kann. Dabei ist es bevorzugt, daß eine Präparation einer aktiven monomeren oder multimeren Form von LL-16-Untereinheiten Metallionen in einer molaren Konzentration von mindestens 50% der molaren Konzentration der in der Lösung enthaltenen LL-16-Untereinheiten enthält. Vorzugsweise beträgt der Anteil der Metallionen pro Unterein¬ heit zwischen 0,5 und 2, besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 1. Auch hier ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Form von LL-16 einen definierten Gehalt an Metallionen in den genannten Bereichen besitzt.

Bevorzugte Präparationen hierbei sind:

- LL-16-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von ca. 13-35 kD, enthaltend ein Metallion pro Untereinheit,

- Dimeres aus LL-16-Untereinheiten, enthaltend ein oder zwei Metallionen, Tetrameres aus LL-16-Untereinheiten, enthaltend zwei oder vier Metallionen Eine Praparation von IL-16 im Sinne der Erfindung ist beispielsweise eine wäßrige, vorzugs¬ weise gepufferte Losung oder ein Lyophilisat Vorzugsweise ist die Praparation zur therapeu¬ tischen Anwendung oder zur Herstellung eines Arzneimittels geeignet Hierbei liegt die Kon¬ zentration von LL-16 in einem therapeutisch wirksamen Bereich. Die Praparation kann zusatz¬ lich Hilfsstoffe, insbesondere pharmazeutische Hilfsstoffe, wie Losungsvermittler, Füllstoffe, etc. enthalten

Unter einer biologischen Aktivität von LL-16 ist seine Eigenschaft zu verstehen, an T-Zellen über den CD4 Rezeptor zu binden und vorzugsweise die Replikation von HIV und SIV zu supprimieren, wie in der internationalen Anmeldung WO 96/31607 beschrieben, die Gegen¬ stand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung hierfür ist

Unter dem Ausdruck "LL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von LL-16 zu verstehen

In einer bevorzugten Ausführungsform zeigt LL-16 eine immunmodulierende Aktivität, wie sie in der WO 94/28134 beschrieben ist und die hierfür Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist Die immunmodulierende Eigenschaft kann über die Stimulierung der Zellteilung mit LL-16 mit einem Wachstumsfaktor wie LL-2 bzw mit Anti-CD3-Antikorper bestimmt werden Ein derartiges Verfahren ist in der WO 94/28134 beschrieben

Insbesondere zeigt LL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften

Bindung an T-Zellen über den CD4-Rezeptor,

- Stimulierung der Expression von LL-2-Rezeptor und/oder HLA-DR-Antigen auf CD4⁺-Lymphozyten,

Stimulierung der Proliferation von T-Helferzellen in Gegenwart von LL-2, Suppression der Proliferation von mit Anti-CD3 -Antikörpern stimulierten T- Helferzellen,

- Suppression der Replikation von Viren, vorzugsweise von HIV-1, HIV-2 oder SIV

Unter einer LL-16-Untereinheit (LL-16-Monomeres) ist ein Polypeptid zu verstehen, welches nach Multimerisierung LL-16- Aktivität zeigt und a) von einer DNA-Sequenz gemäß SEQ LD NO:l oder einer komplementären Sequenz codiert wird, b) codiert wird von DNA-Sequenzen, welche mit SEQ ED NO:l unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

Vorzugsweise zeigt das Polypeptid in dem in der internationalen Anmeldung WO 96/31607 beschriebenen Testverfahren die dort genannte Wirkung oder stimuliert die Zellteilung gemäß WO 94/28134.

Eine LL-16-Untereinheit kann sich in ihrer Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Proteinsequenzen in gewissem Umfang unterscheiden. Solche Sequenzvariationen können Aminosäureaustausche, -deletionen oder -additionen sein. Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz der LL-16-Untereinheit jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenigstens 90% identisch mit SEQ LD NO: l und dem darin enthaltenen aktiven Bereich von LL-16. Der aktive Bereich von SEQ LD NO: l ist der kürzeste Bereich der Sequenz, der noch LL-16- Aktivität zeigt. Dieser Bereich ist gegenüber SEQ LD NO: l N-terminal und/oder C-terminal verkürzt. Das Molekulargewicht einer Untereinheit beträgt vorzugsweise ca. 13-35 kD.

Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nuklein- säurefragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0 x SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2 x SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0 x SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2 x SSC bei 50° für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Strin¬ genz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden.

Als Metallionen im Sinne der Erfindung sind eine Vielzahl von Metallionen geeignet. Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Calcium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwer- tig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen, insbesondere Cu(II)-Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von MgCl2, CaCl2, MnCl2, BaCl2, LiCl₂, Sr(NO₃)₂, Na2MoÜ4, AgCl₂, Cu(II)-Acetat.

EL- 16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und WO 96/31607, die auch hierfür Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemaßen Formen von IL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven multimeren Form von LL-16 durch Expression einer EL- 16 codierenden Nukleinsäure in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle und Isolierung der genannten multimeren Form, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Herstellung oder Reinigung mindestens 0,25 Metallionen, vorzugsweise mindestens 0,5 Metallionen pro LL-16-Untereinheit zugegen sind und die definierte Oligomerisierung von LL-16 katalysieren. Bei dem Herstellverfahren kann auch ein Gemisch von mehreren multimeren LL-16-Formen entstehen. Dieses Gemisch kann entweder in seine Einzelbestandteile getrennt oder als Gemisch, vorzugsweise nach Aufreini- gung, zum Beispiel therapeutisch verwendet werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es überraschenderweise möglich, Polypeptide mit LL-16- Aktivität definiert und reprodu¬ zierbar zu multimerisieren. Dabei wird LL-16 je nach Reaktionsbedingungen (z.B. Temperatur, pH- Wert, etc.) in definiertem Oligomerisierungsgrad erhalten.

Die Zugabe der Metallionen kann während der Fermentation oder während der Reinigung erfolgen. Es hat sich gezeigt, daß erfindungsgemäße IL-16-Formen erhalten werden, wenn bei der Fermentation pro Gramm entstehendem rekombinanten IL-16 etwa 0,1 μmol/1 bis 10 mmol/1 Metallionen zugegen sind. Dabei ist die Obergrenze der Metallionenkonzentration an sich unkritisch und hängt lediglich von der Verträglichkeit der Mikroorganismen oder Zellinien für diese Metallionen sowie von der Löslichkeit der verwendeten Metallverbindung oder Salzes ab. Vorzugsweise wird eine Metallionenkonzentration von 0,5 μmol/1 bis 10 mmol/1 verwendet. Eine Erhöhung der Ausbeute an aktiven Metalloproteinen durch den Zusatz von Metallionen zum Fermentationsmedium ist z.B. von Hoffman et al. in Protein Expression & Purific. 6 (1995) 646-654 beschrieben.

Der Zusatz der Metallionen oder Metallverbindungen, aus denen Metallionen ablösbar sind, erfolgt vorzugsweise im Verlauf des Aufschlusses des Fermentationsansatzes, bei der Reini- gung oder auf der Stufe des gereinigten IL-16. Zweckmäßig werden die Metallionen vor oder bei einer Dialyse oder einem Chromatographie-Schritt in einem Auftrags- oder Elutionspuffer verwendet.

Bei der rekombinanten Herstellung der erfindungsgemäßen IL-16-Formen wird eine Prapara¬ tion einer multimeren Form von IL-16-Untereinheiten erhalten, in der die Anzahl der Unter¬ einheiten vorzugsweise 6 bis 32 beträgt und die als Produkt einer rekombinanten Produktion in Prokaryonten im wesentlichen frei von Säugerzellproteinen oder als Produkt einer rekombi¬ nanten Produktion in Eukaryonten im wesentlichen frei von natürlichen Humanproteinen ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mul¬ timeren LL-16-Untereinheiten durch Inkubation von monomeren IL-16-Untereinheiten oder LL-16-Dimeren mit Metallionen. Ein solches Verfahren ist unabhängig davon anwendbar, ob die EL-16-Untereinheiten auf rekombinante Weise oder anders (z.B synthetisch oder aus natürlichen Quellen) isoliert wurden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung des Multimerisie- rungsgrads einer monomeren oder dimeren Form aus LL-16-Untereinheiten. Bei einem solchen Verfahren wird die monomere oder dimere Form mit Metallionen inkubiert, wodurch eine oder mehrere höher multimerisierte Formen von LL-16-Untereinheiten entstehen.

Die Multimerisierung wird vorzugsweise im schwach-alkalischen, neutralen oder sauren Bereich, vorzugsweise zwischen pH 3 und 9, besonders bevorzugt im Bereich zwischen pH 3 und 8 durchgeführt. Die Ausbeute an multimeren Formen und die Dauer der Multimerisierung können durch Zusatz von Denaturierungsmitteln wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff verbessert werden. Zweckmäßig werden solche Denaturierungsmittel in Konzentrationen von 0 bis 8 mol/1 zugesetzt. Bei der Inkubation mit Metallionen kann die Konzentration an Denaturierungsmittel durch Verdünnung oder Dialyse vorzugsweise auf eine nicht denaturie¬ rende Konzentration (für Guanidinhydrochlorid z.B. ca. 0 bis 2 mol/1) verringert werden.

Die Metallionen-abhängige Multimerisierung kann durch Chelatbildner wie EDTA oder durch freie Bindungsstellen für Metallionen auf der für die Reinigung verwendeten Metallaffinitäts- Chelat-Sepharose inhibiert werden.

Eine besonders effiziente Tetramerisierung wird in kurzer Zeit erzielt, wenn Metallionen in annähernd äquimolarer Konzentration oder im Überschuß bezüglich IL- 16 mit DL- 16 inkubiert werden, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit von der Konzentration der Reaktanden abhängt. Bei niedrigeren Metallionenkonzentrationen ist daher entsprechend länger zu inkubieren. Die Tetramerisierung erfolgt in einem breiten pH-Bereich, insbesondere im Bereich pH 2,5 bis 10. Anschließend an die Tetramerisierung kann die weitere Multimerisierung vorzugsweise zwischen pH 5 bis 7 oder 7,5 auch ohne Zusatz von weiteren Metallionen durchgeführt werden.

Besonders bevorzugt sind LL-16-Multimere, die als diskreter peak von einer analytischen Molekularsieb-HPLC-Säule mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. über 70 kD, vor¬ zugsweise 90 bis 150 kD eluieren. Die Polymerbildung kann durch eine vorhergehende Metall¬ ionen-abhängige Tetramerisierung induziert werden. Weiterhin wird der Multimerisierungs- grad von der jeweiligen Pufferzusammensetzung (Art des Puffers, z.B. Imidazol, MES, Acetat, Glycin, Citrat,pH-Wert, GdmCl-Konz.) beeinflußt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform von biologisch aktivem LL-16 besitzt ein Moleku¬ largewicht von mindestens 45 + 4 kD und ist nach Inkubation von Monomeren oder Dimeren mit Metallionen erhältlich.

Derartige LL- 16-Präparationen sind besonders zur therapeutischen Verwendung in therapeuti¬ schen Zusammensetzungen geeignet. Solche Zusammensetzungen enthalten zweckmäßig noch die üblichen Füll-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

Die folgenden Beispiele und Publikationen, das Sequenzprotokoll sowie die Abbildungen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikatio¬ nen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.

Fig. 1 : SDS-PAGE von LL- 16 unter reduzierenden Bedingungen (Probe mit 0, 1 M DTE)

1) vor Spaltung mit Thrombin, 2) nach Spaltung mit Thrombin und 3)-5) nach Spal¬ tung und Reinigung mittels Q-Sepharose (verschiedene Fraktionen).

Fig. 2: RP-HPLC-Elutionsdiagramm von LL-16 nach Spaltung mit Thrombin und Reini¬ gung mittels Q-Sepharose.

Fig. 3A,

Fig. 3B: Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm

A) des LL-16-Fusionsproteins vor Spaltung mit Thrombin, B) von LL-16 nach Spal¬ tung mit Thrombin und Reinigung mittels Q-Sepharose. Fig. 4: Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm von dimeren (RT = 11,4 min.) und tetra¬ meren (RT = 10,06 min.) LL-16 nach Renaturierung von denaturierten LL-16 in 0,1 M Tris/HCL, 250 μM Cu(II)-Acetat, pH 8,5 (siehe Beispiel 4).

Fig. 5: Eichlauf der HPLC-Siebsäule mit BSA (MW 66 kD; RT 9,17 min ), Ovalbumin (MW 43 kD; RT 9,98 min.), Chymotrypsinogen (MW 25 kD, RT 11,89 min.) und Ribonuklease A (MW 13,7 kD; RT 12,87 min.).

Fig. 6: Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm von tetrameren LL-16 nach Inkubation von 137 μM LL-16 mit 250 μM Cu(II)-Acetat (siehe Beispiel 10).

Fig. 7: Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm von Dimeren (3%; RT 11,66 min.), Tetrameren (32%; RT 10,30 min.) und Polymeren (65%; RT 7,93 min.) nach Inku¬ bation von LL-16 für 16 Stunden in 50 mM MES, 250 μM Cu(II)-Acetat, pH 5,5.

SEQ ED NO:l zeigt die Sequenz von humanem LL-16.

SEQ LT) NO:2 zeigt die Aminosäuresequenz gemäß SEQ LD NO: 1.

SEQ TD NO:3-8 zeigen Primersequenzen.

SEQ ID NO:9-l 1 zeigen Peptidsequenzen.

Beispiel 1

Klonierung und Expression von LL-16

1.1 RNA Isolierung

5 x lO^PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 μg/ml Concanavalin A und 180 U/ml LL-2 kultiviert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslösung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert. Nach Zugabe von 1 ml Na- Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl- Alkohol (24: 1) wurde das Lysat 15 min. auf Eis gehalten. Die wäßrige Phase wurde anschließend mit

6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufällen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert. Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 μl H2O gelöst. Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 μg. 1.2 cDNA Synthese

Die Mischung für die cDNA Synthese enthielt 10 μg RNA, 0,2 μg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 μl "bulk first Strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 μl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur späteren Verwendung gelagert.

1.3 Amplifikation und Klonierung von EL- 16 cDNA

Zur Amplifikation von LL-16 cDNA mittels PCR und zur anschließenden Klonierung wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:

Primer 1: GCTGCCTCTCATATGGACCTCAACTCCTCCACTGACTCT (SEQ ID NO:3)

Primer 2: GATGGACAGGGATCCCTAGGAGTCTCCAGCAGCTGTGG (SEQ ID NO:4)

Die Primer führen zusätzliche Ndel oder BamHI Schnittstellen ein.

Die PCR-Mischungen (100 μl Reaktionsvolumina) enthielten jeweils 1 μl cDNA (aus der Syn¬ these in Abschnitt 3), 50 pmol Primer 1 und 2, 12,5 μmol dNTPs, 10 μl lOxTAQ Puffer und 2,5 Einheiten Taq Polymerase (Perkin-Elmer).

Die Zyklusbedingungen waren 30 see, 94°C, 1 min., 53°C und 1 min., 72°C. Es wurden 35 Zyklen durchgeführt.

1.4 Herstellung eines Expressionsklons mit Thrombinspaltstellen

Die PCR-Produkte wurden gereinigt und 16 Stunden bei 37°C mit Ndel und BamHI verdaut. Für die Klonierungspräparation wurde der Vektor pET15b (Novagen) ebenfalls mit Ndel und BamHI gespalten und anschließend über Agarosegel gereinigt.

Die Ligationen wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in 20 μl Mischungen, welche 100 ng Vektor, 25 ng PCR Produkt (Insert), 2 μl 10 x Ligasepuffer und 0,2 μl Ligase (New England Biolabs) enthielten, durchgeführt. Nach Transformation durch Elektroporation bei 2,5 kV, 25 μ Farad, 200 Ohm (BIO-RAD Elektroporator) in E.coli wurden die Zellen auf Ampicillin- resistente Platten aufgetragen. Geeignete E.coli, z.B. DH5, sind dem Fachmann bekannt. Rekombinante Klone wurden durch Restriktionsanalyse von Plasmidpräparationen (pMISLB) identifiziert und in einen E.coli- Stamm für die beabsichtigte Proteinexpression transformiert. Die Klonierung von LL-16 cDNA konnte zusätzlich durch Bestimmung der Nukleotidsequen- zen bestätigt werden. Die gefundenen Sequenzen stimmten mit der publizierten LCF Sequenz (Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 5109-5113) bis auf eine Diskrepanz in Codon 96 überein. Im Gegensatz zur veröffentlichten Sequenz besteht Codon 96 nicht aus der Basensequenz TTG, sondern aus der Sequenz TTT. Die Sequenzierung von weiteren IL-16-Klonen, die aus unabhängigen PCR Amplifikationen erhalten wurden, zeigte deutlich, daß die authentische LL-16-Sequenz in Codon 96 tatsächlich von der Sequenz TTT dargestellt wird.

1.5 Herstellung von Expressionsklonen für verkürztes LL-16

Klonierungsbeispiel LL-16:

Zur Amplifikation von LL-16cDNA und zur anschließenden Expressionsklonierung wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:

Primer ISL1: (SEQ LD NO:5) cec gaa tte tat gca tea cca cca cca cca ega tga ega ega caa acc ega ect caa etc etc cac t

Primer ISL2: (SEQ LD NO:6) cec gaa tte tat gec ega ect caa etc etc c

Primer ISL3: (SEQ LD NO:7) cec gaa tte tat gca tea cca cca cca cca ega tga ega ega caa aat gec ega ect caa etc etc c

Primer ISL4: (SEQ LD NO:8) geg gat cca age tta gga gtc tec age age tgt

Primer ISL1 fügt nach PCR am LL-16-Gen eine EcoRI Schnittstelle, sowie ein "t" zur Erzeu¬ gung von lacZ Fusionen in pUC, 6 Histidin-Codons, und die Codons für eine Enterokinase- Schnittstelle ein (DDDDK; SEQ LD NO:9).

Primer ISL2 fügt nach PCR am IL-16-Gen eine EcoRI Schnittstelle, sowie ein "t" zur Erzeu¬ gung von lacZ Fusionen in pUC ein. Primer ISL3 fügt dieselben Eigenschaften ein wie Primer ISLl und zusätzlich noch ein weite¬ res ATG nach dem AAA (Lys) Codon.

Primer ISL4 ist der Gegenprimer zu ISLl bis ISL3, er fügt am 3'-Ende des LL-16-Gens eine BamHI sowie eine Hindlü-Spaltstelle ein.

Durch geeignete Kombination der obigen Primer und Einklonierung der PCR-Produkte in geeignete Vektoren ist es möglich, in E. coli verschiedene Arten von IL-16 zur Expression zu bringen:

Eine Kombination von ISLl mit ISL4 ergibt z.B. nach PCR, Nachschneiden des Produktes mit EcoRI und Hindlll und Einklonieren hinter z.B. einen lac-Promoter bei Expression ein LL-16, das N-terminal 6 Histidine und eine Enterokinase-Schnittsteüe enthält und nach Aufarbeitung und Schnitt mit Enterokinase reifes LL-16 ohne N-terminales Met ergibt (N-terminus PDLNS; SEQ LD NO: 10).

Eine Kombination von ISL2 mit ISL4 ergibt nach PCR, Nachschneiden des Produktes mit EcoRI und Hindlll sowie Einklonieren hinter z.B. einen lac-Promoter nach Expression direkt ein reifes LL-16, welches mit der Sequenz MPDLNS (SEQ ID NO: 11) beginnt.

Eine Kombination von ISL3 mit ISL4 ergibt nach PCR, Nachschneiden des Produktes mit EcoRI und Hindlll sowie Einklonieren hinter z.B. einen lac-Promoter nach Expression und Schnitt mit Enterokinase reifes LL-16 mit der N-terminalen Sequenz MPDLNS (SEQ LD NO: l l).

Je nach verwendetem Plasmid kann eine lacZ-Fusion (z.B. beim Klonieren in pUC-Plasmide) entstehen.

Es liegt auf der Hand, daß außer dem lac Promoter jeglicher in E. coli gut funktionierender Promoter verwendet werden kann. Beispiele wären z.B. der tac-Promoter oder auch der mgl- Promoter. Als Plasmide kommen sowohl low-copy als auch high-copy Plasmide in Frage. Beispiel 2

10 I Fermentation eines E. coli Expressionsklons für LL-16 und Hochdruckaufschluß

Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkultu¬ ren angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden Das Uberimpfvolumen in die nächst¬ höhere Dimension betragt jeweils 1-10 Vol -% Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/1) eingesetzt.

Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C- Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusatzliche C-Quelle verwendet Das Medium wird auf pH 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch vertraglichen Konzentrationen zugesetzt Die Fermentation wird als Feed- batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt Die Fermentations¬ temperatur betragt 25-37°C Über Beluftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosage- geschwindigkeit wird der geloste Sauerstoffpartialdruck (pθ2) < 20% gehalten

Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt Mittels LPTG wird die Expression des LL-16 induziert Nach einer Fermentationsdauer von ca 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geemtet. Die Biomasse wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das geloste LL-16 enthalt, wird weiterverarbeitet

Beispiel 3

Reinigung von rekombinantem LL-16

550 ml Aufschlußuberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8,0 versetzt, 30 min. gerührt und anschließend 30 min bei 20.000 g zentrifugiert 400 ml des Uberstandes wurden auf eine Nickel-Chelat-Sepharose-Saule (V=60 ml, Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 μMol NiCl₂/ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 aquilibriert wor¬ den war Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0 gespult und das LL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imidazol, pH 7,0 in 50 mM Natπumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2* 0,5 1 Gradientenvolu- men) eluiert. EL- 16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und ver¬ einigt.

300 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 1 20 mM Imidazol, pH 5,5 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit NaOH auf pH 8,5 eingestellt, mit 0,3 mg Thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) versetzt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCI auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdün¬ nung mit H₂O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (45 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquilibriert worden war. Die Elution von DL- 16 erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. LL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt. Die Identität von LL-16 wurde durch Massenanalyse (Molekulargewicht 13.566 ± 3 D) und automatisierte N-terminale Sequenzanalyse bestätigt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die UV- Absorption von LL-16 bei 280 nm und ein berechneter molarer Extinktionskoeffizient von 5540 M 'cm ' bei dieser Wellenlänge (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) und ein Molekulargewicht von 13566 D verwendet.

Das so erhaltene LL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein¬ heit von mehr als 95% auf.

Von einer analytischen HPLC-Gelfiltrationssäule (Superdex HR 75; Pharmacia), die mit BSA, Ovalbumin, Chymotrypsinogen und Ribonuklease A geeicht worden war, eluierte LL-16 mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 27.000 D (siehe Fig. 3), weshalb diese Molekül¬ spezies im folgenden als "Dimer" bezeichnet wird.

Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min. eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 μl betrug 1,5 bis 15 μg Protein. Die Detek¬ tion erfolgte bei 220 nm.

Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein ffe Peptide Cl 8, 4x180 mm Säule verwendet. Die Elution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0,1% TFA in H2O) inner¬ halb von 30 min. mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm. Da von Cruikshank, W.W., et. al., in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 5109-5113 eine polymere Form von IL-16 mit einem apparenten Molekulargewicht von 50-60 kD als aktive Molekülspezies beschrieben worden war, wurde durch De- und Renaturierungsexperimente mit dem derart isolierten hochreinen DL- 16 versucht, die dimere Form in eine polymere Form zu überführen.

Beispiel 4

De- und Renaturierung von IL-16

(a) Einfluß von pH-Wert, EDTA und Kupfer(II)-Acetat auf die Renaturierung/- Tetramerisierung von LL-16

37 mg LL-16 wurden gegen 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0 dialysiert und anschließend auf eine Konzentration von 7,1 mg/ml konzentriert. Die Denaturierung von EL- 16 erfolgte durch die Zugabe von 1 ml 8 M GdmCl, 0,1 M Glycin/HCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTE, pH 1,8 zu 0,5 ml des LL-16 Konzentrates. Nach 1 Stunde Inkubation wurden je 100 ul dieser Lösung in je 2,2 ml der in Tabelle 1 beschriebenen Renaturierungspuffer bei Raumtemperatur (23+/ -3°C) verdünnt. Die Bildung von polymeren LL-16 wurde nach einer Inkubtion von mindestens 2 Stunden mittels Molekularsieb-HPLC analysiert.

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurden bei Renaturierung in Puffern mit vorheriger N₂-Bega- sung und EDTA unabhängig vom pH- Wert keine höhermolekularen IL-16-Spezies gebildet. Höhermolekulare IL-16-Assoziate wurden überraschenderweise nur in Puffern ohne EDTA und ohne Stickstoffbegasung, sowie insbesondere in Gegenwart von Kupferacetat gebildet. Die höhermolekulare Form eluiert als homogener peak von einer analytischen Molekularsieb- HPLC-Säule (siehe Fig. 4) und hat ein apparentes Molekulargewicht von ca. 45 + 4 kD. Zur Unterscheidung von der "dimeren" Form wird diese Molekülspezies im weiteren als "Tetramer" bezeichnet.

Da Kupferionen auch zur oxidativen Herstellung von Disulfidbrücken verwendet werden, wurde der Einfluß von Redox- Systemen auf die Tetramerisierung im folgenden näher unter¬ sucht. Tabelle 1 Einfluß von pH-Wert, EDTA und Kupfer(LT)-Acetat auf die Renaturierung von EL- 16

(b) Einfluß der Denaturierung, von Redox-Systemen und von Metallionen auf die "Tetramerisierung" von IL-16

Je 400 ul des in Beispiel 1 beschriebene Konzentrates von LL-16 mit einer Konzentration von 7, 1 mg/ml wurden in

1) 800 ul 8,0 M GdmCl, 0, 1 M Glycin/HCl, 1 mM DTE, pH 1,8 (=denaturiertes D_-16) oder

2) 800 ul 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0 (=natives EL- 16)

verdünnt und 1 Stunde inkubiert. Je 100 ul dieser Verdünnungen wurden anschließend in je 2,2 ml einer wässrigen Lösung aus 0,1 M Tris/HCI, pH 8,5 sowie der in Tabelle 2 beschriebe¬ nen Zusätze verdünnt, wobei die Puffer, in die das "native IL-16" aus 2) verdünnt wurden, zusätzlich 0,23 M GdmCl enthielten, so daß alle Renaturierungslösungen identische Konzen¬ trationen auch an GdmCl aufwiesen. Wie Tabelle 2 zeigt, scheinen Redox-Reaktionen keinen Einfluß auf die Tetramerisierung zu haben, da die üblichen Redox-Syteme für Proteine aus GSH und GSSG keinen Einfluß haben. Vielmehr scheinen Metallionen für eine Stabilisierung des Tetramers essentiell zu sein, da neben Kupfer- auch Magnesium- und Calciumionen die Tetramerisierung induzieren können. Eine Denaturierung von IL-16 durch hohe Konzentrationen an Denaturierungsmittel ist offen¬ bar für eine Tetramerisierung nicht erforderlich, da diese auch ohne vorhergehende Denaturie¬ rung von IL-16 erfolgt.

Wie bei einer Gleichgewichtseinstellung und auch bei einer Assoziationsreaktion zweiter Ord¬ nung zu erwarten, nimmt weiterhin die Ausbeute an Tetrameren D--16 mit der Konzentration an Metallionen zu, wie es in der Tabelle 2 für Cu- Acetat ersichtlich ist.

Tabelle 2 Einfluß der Denaturierung, von Redox-Systemen und Metallionen auf die Tetramerisie-

^υ Die Zwischenverdünnung der LL-16-Stammlösung erfolgte in 8 M GdmCl. ²⁾ Die Zwischenverdünnung der IL-16-Stammlösung erfolgte in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0.

Beispiel 5

Einfluß von GdmCl auf die Tetramerisierung

Da eine vollständige Denaturierung von LL-16 für eine Tetramerisierung offenbar nicht erfor¬ derlich ist, wurde der Einfluß niedriger GdmCl-Konzentrationen untersucht. Dazu wurde das in Beispiel 4a beschriebene LL-16-Konzentrat 71-fach in 0,1 M Tris/HCI, pH 8,5 verdünnt, das zusätzlich die in Tabelle 3 beschriebenen Zusätze enthielt.

Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, kann bei geringen LL-16 Konzentrationen für verschiedene Metallionen durch den Zusatz von nicht-denaturierenden Konzentrationen an Denaturie¬ rungsmittel die Tetramerisierung unterstützt werden.

Tabelle 3 Einfluß von GdmCl auf die Tetramerisierung von IL-16 durch Metallionen

Beispiel 6

Kinetik der Tetramerisierung von IL-16 mit Cu(II)-Acetat

Da es sich bei der Tetramerisierung von LL-16 um eine Reaktion zumindest 2. oder höherer Ordnung handelt, wurde die Geschwindigkeit der Tetramerisierung in Gegenwart von Cu(II)- Acetat untersucht.

Dazu wurden 20 ul eines in Beispiel 4a beschriebenen LL-16-Konzentrates in 800 ul 0,1 M Tris/HCI, 250 uM Cu(II)- Acetat, 0,25 M GdmCl, pH 8,5 verdünnt und nach unterschiedlichen Inkubationszeiten Proben mittels einer analytischen Molekularsieb-HPLC-Säule auf ihren Tetramergehalt analysiert. Wie Tabelle 4 zeigt, ist die Tetramerisierung eine relativ langsame Reaktion, deren Geschwindigkeit jedoch von der Konzentration der Reaktanden abhängt. Tabelle 4 Kinetik der Tetramerisierung von IL-16 mit Cu(H)-Acetat

Inkubationzeit (min.) Tetramere (%

5 min. 12

60 min. 75

150 min. 81

Beispiel 7

Einfluß von EDTA auf die Tetramerisierung von LL-16 durch Cu(H)-Acetat

EDTA bildet mit 2-wertigen Metallionen einen hochaffinen Komplex. Die Inhibition der Tetramerisierung durch EDTA sollte daher beweisen, daß diese durch 2-wertige Metallionen induziert wird.

Dazu wurde ein in Beispiel 4a beschriebenes IL-16-Konzentrat 40-fach in Puffer verdünnt, die sich aus 0,1 M Tris/HCI, 0,25 M GdmCl, 250 uM Cu(II)- Acetat, pH 8,5 und steigenden Kon¬ zentrationen an EDTA zusammensetzten. Der Tetramergehalt wurde wiederum mittels Mole- kularsieb-HPLC nach einer Inkubationszeit von mindestens 1 Stunde ermittelt.

Wie die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, sind äquimolare Konzentrationen an EDTA bezüglich Cu(II)-Acetat tatsächlich in der Lage, die Tetramerisierung von LL-16 zu inhibieren.

Tabelle 5 Inhibition der Tetramerisierung von IL-16 durch EDTA

EDTA-Konzentration [uM] Tetramere (%)

0 77

125 69

250 0

500 0

1000

2000 0 Beispiel 8 a) Einfluß der Konzentration von Cu(H)-Acetat auf die Tetramerisierung von LL-16 bei kurzer Inkubationszeit

Sollte es sich bei LL-16 um ein Metalloprotein handeln, ist zu erwarten, daß stöchiometrische Mengen bzgl. Monomer oder Dimer zur Stabilisierung der tetrameren Form erforderlich sind. Im Gegensatz dazu sollten für eine katalytische Funktion der Cu²⁺-Ionen, z.B. bei einer Oxi¬ dation von DL- 16 unter optimalen Bedingungen, geringere Mengen ausreichend sein.

Ein in Beispiel 4a beschriebenes LL-16-Konzentrat wurde zu einer Konzentration von 15 uM in Puffer verdünnt, die 50 mM MES, 250 mM GdmCl, pH 6,5 und zusätzlich zunehmende Konzentrationen an Cu(II)-Acetat enthielten. Proben dieser Verdünnungen wurden nach min¬ destens 9 Stunden Inkubationszeit mittels Molekularsieb-HPLC auf ihren Tetramergehalt analysiert.

Wie aus Tabelle 5a hervorgeht, sind unter diesen Bedingungen katalytische Mengen an Cu(II)- Acetat für eine Tetramerisierung nicht ausreichend.

Tabelle 5a

b) Einfluß der Konzentration von Cu(H)-Acetat auf die Tetramerisierung von IL-16 bei längerer Inkubationszeit

Das LL-16-Konzentrat wurde zu einer Konzentration von 10 uM (0, 14 mg/ml) in Puffer ver¬ dünnt, die 50 mM HEPES, 250 mM GdmCl, pH 7,5 und zusätzlich zunehmende Konzentra¬ tionen an Cu(II)- Acetat enthielten. Proben dieser Verdünnungen wurden nach ca. 100 Stunden Inkubationszeit mittels Molekularsieb-HPLC auf ihren Tetramergehalt analysiert.

Wie aus der folgenden Tabelle 5b hervorgeht, sind katalytische Mengen an Cu(II)-Acetat für eine Tetramerisierung unter diesen Bedingungen ausreichend, da die niedrigste hier verwen¬ dete Konzentration an Cu- Acetat (2,5 uM) wesentlich geringer ist als die LL-16-Konzentration (10 uM) und dennoch eine Tetramerisierung von ca. 80% der Moleküle erfolgt.

Tabelle Sb

Beispiel 9

Einfluß von verschiedenen Metallionen auf die Tetramerisierung von LL-16

Um einen Eindruck über die Spezifität der Metallbindung von LL-16 und der Affinität für ver¬ schiedene Metallionen zu erhalten, wurde ein in Beispiel 4 a beschriebenes IL-16-Konzentrat zu einer Konzentration von 0,2 mg/ml in einen Puffer (0, 1 M Tris/HCI, 0,23 M GdmCl, 1 mM EDTA, pH 8,5) verdünnt, der unterschiedliche Metallsalze in einer Konzentration von jeweils 500 uM enthielt. Der Tetramergehalt der Proben wurde mittels Molekularsieb-HPLC ca. 3 Stunden nach der Verdünnung, sowie nach aufeinanderfolgenden Dialysen gegen Puffer, die kein GdmCl (1. Dialyse) bzw. kein Metallsalz (2.Dialyse) enthielten, analysiert. Wie aus Tabelle 6 hervorgeht, sind verschiedene Metallionen prinzipiell in der Lage, eine Tetramerisierung von LL-16 zu induzieren. Die im Vergleich zu Cu(II)- Acetat geringeren Ausbeuten an Tetramer können durch die spezifischen unphysiologischen Pufferbedingungen verursacht werden und unter anderen Bedingungen eventuell wesentlich höher sein.

Tabelle 6 Einfluß von verschiedenen Metallionen auf die Tetramerisierung von LL-16

Beispiel 10

Tetramerisierung von DL- 16 bei hohen Proteinkonzentrationen mit und ohne GdmCl und Stabilität des Komplexes

Für die präparative Herstellung von tetramerem LL-16 wurde eine LL-16-Lösung mit 1,85 mg IL-16/ml (137 uM LL-16) in 20 mM Imidazol, 150 mM NaCl, pH 6,5 mit 250 uM Cu(II)Acetat in An- und Abwesenheit von 0,25 M GdmCl versetzt und der Tetrameranteil nach 90 min. mittels Molekularsieb-HPLC analysiert. Wie Tabelle 7 zeigt, ist die Tetramerisie¬ rung nahezu vollständig und unabhängig von der GdmCl-Konzentration unter diesen Bedin¬ gungen. Bei einer anschließenden Dialyse dieser Proben mit überwiegend Tetrameren für bis zu 4 Tage gegen 20 mM Na-Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0 wurde keine signifikante Abnahme der Tetramere beobachtet.

Tabelle 7 Tetramerisierung von LL-16 bei hohen Proteinkonzentrationen mit und ohne GdmCl

Beispiel 11

Abhängigkeit der Tetramerisierung und Polymerisierung von LL-16 vom pH-Wert in

Gegenwart von 0,25 GdmCl

Eine in Beispiel 4a beschriebene IL-16 Stammlösung wurde zu einer Konzentration von 0,2 mg/ml in Puffer mit verschiedenen pH-Werten verdünnt, die jeweils 250 uM Cu(π)Acetat und 0,25 M GdmCl enthielten.

Der Anteil an Tetrameren wurde mittels Molekularsieb-HPLC analysiert. Dabei wurde eine neue polymere Spezies von LL-16 detektiert, die im sauren pH-Bereich gebildet wird, mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 100 kD eluiert und zur Unterscheidung von der Dimeren und tetrameren Form von LL-16 im folgenden als "Polymer" bezeichnet wird. Offen¬ bar kann LL-16 abhängig von den Pufferbedingungen in drei diskreten Assoziationszuständen vorliegen (Dimer, Tetramer und Polymer).

Die Tetramerisierung ist im wesentlichen Metallionen-abhängig und hat ein breites pH-Opti¬ mum, während die Polymerisierung in einem relativ engen pH-Bereich erfolgt. Tabelle 8 Abhängigkeit der Tetramerisierung und Polymerisierung von IL-16 vom pH- Wert in

Gegenwart von 0,25 GdmCl

Beispiel 12

Abhängigkeit der Tetramerisierung und Polymerisierung von LL-16 vom pH-Wert in

Abwesenheit von GdmCl

Da aus obigen Beispielen ersichtlich ist, daß eine Tetramerisierung auch in Abwesenheit von GdmCl erfolgen kann, wurde die pH- Wert-Abhängigkeit dieser Reaktion in Analogie zu Bei¬ spiel 10 auch in Abwesenheit von GdmCl untersucht.

Wie Tabelle 9 zeigt, ist der pH-Bereich der Tetramerisierung unter diesen Bedingungen enger, und vor allem werden Polymere fast ausschließlich bei pH 5,5 gebildet.

Eine erhöhte Ausbeute an polymeren LL-16 von 65% wurde erzielt, wenn die Inkubation von LL-16 in 50 mM MES, pH 5,5 bei einer Proteinkonzentration von 0,4 anstelle von den in Tabelle 9 verwendeten 0,2 mg/ml LL-16 erfolgte und die Inkubationszeit vor der Analytik von ca. 3 Stunden auf 16 h verlängert wurde. Durch eine Optimierung der Bedingungen kann also voraussichtlich annähernd quantitativ polymeres LL-16 hergestellt werden. Tabelle 9 Abhängigkeit der Tetramerisierung und Polymerisierung von IL-16 vom pH-Wert in

Abwesenheit von GdmCl

Referenzliste

Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563

Cruikshank, W.W., et al., J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934

Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 5109-5113

Hoffman et al. in Protein Expression & Purific. 6 (1995) 646-654

Mack et al., Analyt. Biochem. 200 (1992) 74-80

Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA WO 94/28134 WO 96/31607 SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

(B) STRASSE: Sandhofer Str. 116

(C) ORT: Mannheim

(E) LAND: Germany

(F) POSTLEITZAHL: D-68305

(G) TELEFON: 08856/60-3446 (H) TELEFAX: 08856/60-3451

(A) NAME: Bundesrepublik Deutschland vertreten durch den Bundesminister fuer Gesundheit

(B) STRASSE: -

(C) ORT: Bonn

(E) LAND: Germany

(F) POSTLEITZAHL: D-53108

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Multimere Formen von IL-16, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 11

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30B (EPA)

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 195 47 933.5

(B) ANMELDETAG: 22-DEC-1995

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1005 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Doppelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1..1005

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1 ATG AAA TCC TTG CTG TGC CTT CCA TCT TCT ATC TCC TGT GCC CAG ACT 48 Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr

1 5 10 15

CCC TGC ATC CCC AAG GAA GGG GCA TCT CCA ACA TCA TCA TCC AAC GAA 96

Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu

20 25 30

GAC TCA GCT GCA AAT GGT TCT GCT GAA ACA TCT GCC TTG GAC ACA GGG 144

Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala Glu Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly

35 40 45

TTC TCG CTC AAC CTT TCA GAG CTG AGA GAA TAT ACA GAG GGT CTC ACG 192

Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu Arg Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr

50 55 60

GAA GCC AAG GAA GAC GAT GAT GGG GAC CAC AGT TCC CTT CAG TCT GGT 240

Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly Asp His Ser Ser Leu Gin Ser Gly

65 70 75 80

CAG TCC GTT ATC TCC CTG CTG AGC TCA GAA GAA TTA AAA AAA CTC ATC 288

Gin Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser Ser Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile

85 90 95

GAG GAG GTG AAG GTT CTG GAT GAA GCA ACA TTA AAG CAA TTA GAC GGC 336

Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu Ala Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly

100 105 110

ATC CAT GTC ACC ATC TTA CAC AAG GAG GAA GGT GCT GGT CTT GGG TTC 384

Ile His Val Thr Ile Leu His Lys Glu Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe

115 120 125

AGC TTG GCA GGA GGA GCA GAT CTA GAA AAC AAG GTG ATT ACG GTT CAC 432

Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu Asn Lys Val Ile Thr Val His

130 135 140

AGA GTG TTT CCA AAT GGG CTG GCC TCC CAG GAA GGG ACT ATT CAG AAG 480

Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys

145 150 155 160

GGC AAT GAG GTT CTT TCC ATC AAC GGC AAG TCT CTC AAG GGG ACC ACG 528

Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr

165 170 175

CAC CAT GAT GCC TTG GCA ATC CTC CGC CAA GCT CGA GAG CCC AGG CAA 576

His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin

180 185 190

GCT GTG ATT GTC ACA AGG AAG CTG ACT CCA GAG GCC ATG CCC GAC CTC 624

Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu Thr Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu

195 200 205

AAC TCC TCC ACT GAC TCT GCA GCC TCA GCC TCT GCA GCC AGT GAT GTT 672

Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val

210 215 220 TCT GTA GAA TCT ACA GCA GAG GCC ACA GTC TGC ACG GTG ACA CTG GAG 720 Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu 225 230 235 240

AAG ATG TCG GCA GGG CTG GGC TTC AGC CTG GAA GGA GGG AAG GGC TCC 768 Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser

245 250 255

CTA CAC GGA GAC AAG CCT CTC ACC ATT AAC AGG ATT TTC AAA GGA GCA 816 Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala 260 265 270

GCC TCA GAA CAA AGT GAG ACA GTC CAG CCT GGA GAT GAA ATC TTG CAG 864 Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val Gin Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin 275 280 285

CTG GGT GGC ACT GCC ATG CAG GGC CTC ACA CGG TTT GAA GCC TGG AAC 912 Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn 290 295 300

ATC ATC AAG GCA CTG CCT GAT GGA CCT GTC ACG ATT GTC ATC AGG AGA 960 Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg 305 310 315 320

AAA AGC CTC CAG TCC AAG GAA ACC ACA GCT GCT GGA GAC TCC TAG 1005 Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser *

325 330 335

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 335 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr 1 5 10 15

Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu 20 25 30

Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala Glu Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly 35 40 45

Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu Arg Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr 50 55 60

Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly Asp His Ser Ser Leu Gin Ser Gly 65 70 75 80 Gln Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser Ser Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile

85 90 95

Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu Ala Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly 100 105 110

Ile His Val Thr Ile Leu His Lys Glu Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe 115 120 125

Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu Asn Lys Val Ile Thr Val His 130 135 140

Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys 145 150 155 160

Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr

165 170 175

His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin 180 185 190

Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu Thr Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu 195 200 205

Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val 210 215 220

Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu 225 230 235 240

Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser

245 250 255

Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala 260 265 270

Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val Gin Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin 275 280 285

Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn 290 295 300

Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg 305 310 315 320

Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser ⁺

325 330 335

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 39 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3: GCTGCCTCTC ATATGGACCT CAACTCCTCC ACTGACTCT 39

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 38 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4: GATGGACAGG GATCCCTAGG AGTCTCCAGC AGCTGTGG 38

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 67 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAACCCG ACCTCAACTC 60 CTCCACT 67

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 31 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6: CCCGAATTCT ATGCCCGACC TCAACTCCTC C 31

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 67 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAAATGC CCGACCTCAA 60 CTCCTCC 67

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 33 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8: GCGGATCCAA GCTTAGGAGT CTCCAGCAGC TGT 33

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Pro Asp Leu Asn Ser 1 5

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11

Met Pro Asp Leu Asn Ser 1 5

Claims

Patentansprüche

1. Biologisch aktive multimere LL-16-Form mit einem Molekulargewicht von mindestens ca. 70 kD (Gelfiltrations-HPLC).

2. LL-16-Form nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die IL-16-Form aus einer definierten Anzahl von Untereinheiten besteht, wobei die Anzahl der Untereinheiten zwi¬ schen 6 und 32, vorzugsweise zwischen 8 und 16 liegen kann.

3. Biologisch aktive Form einer monomeren LL-16-Untereinheit oder multimeren LL-16- Untereinheiten mit einem definierten Gehalt an Metallionen, wobei die Anzahl der Metallionen zwischen 0,5 und 2 pro Untereinheit, vorzugsweise zwischen 0,5 und 1 pro Untereinheit beträgt.

4. Biologisch aktive dimere oder tetramere Form von LL-16-Untereinheiten, die einen Metallionengehalt von 0,5-2 Metallionen pro Dimer oder Tetramer besitzt.

5. Praparation einer biologisch aktiven monomeren oder multimeren Form von LL-16- Untereinheiten, enthaltend Metallionen in einer molaren Konzentration von mindestens 50% der molaren Konzentration der enthaltenen LL-16-Untereinheiten.

6. Praparation einer LL-16-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von ca. 13-35 kD, enthaltend ein Metallion pro Untereinheit.

7. Praparation eines Dimeren, Tetrameren oder Oktameren der LL-16-Untereinheit gemäß Anspruch 6.

8. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Form eines Multimeren von LL-16- Untereinheiten durch Expression einer LL-16 codierenden Nukleinsäure in einer pro¬ karyontischen oder eukaryontischen Wirtszelle und Isolierung des LL-16-Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß im Verlauf der Herstellung oder Reinigung Metallionen zugegen sind.

9. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven multimeren Form von LL-16-Unter- einheiten, dadurch gekennzeichnet, daß LL-16-Untereinheiten in monomerer Form und/oder dimerer Form mit Metallionen inkubiert werden und die dabei entstandene multimere Form aus IL-16-Untereinheiten entweder einzeln oder als Gemisch isoliert wird.

10. Verfahren zur Erhöhung des Multimerisierungsgrads einer monomeren und/oder multi¬ meren Form von IL-16-Untereinheiten (Ausgangsform), dadurch gekennzeichnet, daß die monomere oder multimere Form mit Metallionen inkubiert wird, wobei eine oder mehrere höher multimerisierten Form oder Formen von LL-16-Untereinheiten entstehen, und die höher multimerisierten Form oder Formen von den Ausgangsformen abgetrennt werden.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Denaturierungsmittel wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff zugesetzt wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 1 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation bei pH 3-9, vorzugsweise bei pH 5-7,5 durchgeführt wird.