JP2015510770A - 組換えペプチドの産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年3月19日に出願された米国特許出願第61/612817号に基づき優先権を主張する。同出願の全ての内容は参照によって本明細書中に組み込まれる。
ペプチドを含む融合ポリペプチドを発現する工程であって、前記ペプチドが、1つまたは2つ以上のペプチド切断部位(または複数の切断部位)によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位(または複数の切断部位)が前記ペプチドに存在しない工程と、
ペプチド切断部位(または複数の切断部位)での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位(または複数の切断部位)で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
1つまたは2つ以上のペプチド切断部位(または複数の切断部位)によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位(または複数の切断部位)が前記ペプチドに存在しないことを特徴とするペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
ペプチド切断部位(または複数の切断部位)での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位(または複数の切断部位)で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
1つまたは2つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、トリプシン切断部位が存在しないことを特徴とする少なくとも1つのVSDLペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
トリプシン切断部位での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、融合ポリペプチドをトリプシン切断部位で切断する工程と
を含む組換え血管拡張物質(VSDL)ペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)の産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
ペプチドを含む融合ポリペプチドを発現する工程であって、前記ペプチドが、1つまたは2つ以上のペプチド切断部位(または複数の切断部位)によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位(または複数の切断部位)が前記ペプチドに存在しない工程と、
ペプチド切断部位(または複数の切断部位)での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位(または複数の切断部位)で切断する工程と、
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
1つまたは2つ以上のペプチド切断部位(または複数の切断部位)によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位(または複数の切断部位)が前記ペプチドに存在しないことを特徴とするペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
ペプチド切断部位(または複数の切断部位)での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、融合ポリペプチドをペプチド切断部位(または複数の切断部位)で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。。
X1−X2−…Xn−1−Xn−(R/K) (配列番号1);
式中、Xはアルギニンまたはリジンを除く任意のアミノ酸であり、R/Kはアルギニンまたはリジンであり、およびnはアミノ酸の任意の適切な数である
によるアミノ酸配列を含む。
Ser−Ser−Asp−Xa−Ser−Ala−Leu−Leu−Xb−Ser−Xc−Leu−Xd−Ala−Leu−Leu−Thr−Ala−Pro−Arg(配列番号20);
式中、Xはアルギニンまたはリジンを除く任意のアミノ酸である
を含む、またはそれからなる修飾ヒトKPである。
Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−
Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(配列番号2)。
ポンゴ ピュグマエウス(Pongob pygmaeus)(一般的にはオランウータン)
Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Gln−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−
Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(配列番号8);
および
フェリス カトウス(Felis catus)
Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Gln−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−
Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Ala−Gly−Glu−Val−Asn−Pro−Ala−Gln−Arg(配列番号9)。
Met−Lys−Glu−Val−Lys−Ser−Leu−Leu−Leu−Asp−Leu−Gln−Leu−Leu−Leu−Glu−Lys−Val−Lys−Asn−Pro−Glu−Asn−Leu−Lys−Leu−Ser−Arg−Met−His−Thr−Phe−Asp−Phe−Tyr−Val−Pro−Lys−Val−Asn−Ala−Thr−Glu−Leu−Lys−His−Leu−Lys−Ala−Leu−Leu−Glu−Glu−Leu−Lys−Leu−Leu−Glu−Glu−Val−Leu−Asn−Leu−Ala−Pro−Ser−Lys−Asn−Leu−Asn−Val−Asp−Arg(配列番号3)。
Met−Lys−Glu−Val−Lys−Ser−Leu−Leu−Leu−Asp−Leu−Gln−Leu−Leu−Leu−Glu−Lys−Val−Lys−Asn−Pro−Glu−Asn−Leu−Lys−Leu−Ser−Arg−Met−His−Thr−Phe−Asp−Phe−Tyr−Val−Pro−Lys−Val−Asn−Ala−Thr−Glu−Leu−Lys−His−Leu−Lys−Ala−Leu−Leu−Glu−Glu−Leu−Lys−Leu−Leu−Glu−Glu−Val−Leu−Asn−Leu−Ala−Pro−Ser−Lys−Asn−Leu−Asn−Val−Gln−Arg(配列番号10)。
Met−Lys−Glu−Val−Lys−Ser−Leu−Leu−Leu−Asp−Leu−Gln−Leu−Leu−Leu−Glu−Lys−Val−Lys−Asn−Pro−Glu−Asn−Leu−Lys−Leu−Ser−Arg−Met−His−Thr−Phe−Asp−Phe−Tyr−Val−Pro−Lys−Val−Asn−Ala−Thr−Glu−Leu−Lys−His−Leu−Lys−Ala−Leu−Leu−Glu−Glu−Leu−Lys−Leu−Leu−Glu−Glu−Val−Leu−Asn−Leu−Ala−Pro−Ser−Lys−Asn−Leu−Asn−Val−Asp−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)(配列番号11)。
Met−Lys−Glu−Val−Lys−Ser−Leu−Leu−Leu−Asp−Leu−Gln−Leu−Leu−Leu−Glu−Lys−Val−Lys−Asn−Pro−Glu−Asn−Leu−Lys−Leu−Ser−Arg−Met−His−Thr−Phe−Asp−Phe−Tyr−Val−Pro−Lys−Val−Asn−Ala−Thr−Glu−Leu−Lys−His−Leu−Lys−Ala−Leu−Leu−Glu−Glu−Leu−Lys−Leu−Leu−Glu−Glu−Val−Leu−Asn−Leu−Ala−Pro−Ser−Lys−Asn−Leu−Asn−Val−Asp−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)(配列番号12)。
Met−Lys−Glu−Val−Lys−Ser−Leu−Leu−Leu−Asp−Leu−Gln−Leu−Leu−Leu−Glu−Lys−Val−Lys−Asn−Pro−Glu−Asn−Leu−Lys−Leu−Ser−Arg−Met−His−Thr−Phe−Asp−Phe−Tyr−Val−Pro−Lys−Val−Asn−Ala−Thr−Glu−Leu−Lys−His−Leu−Lys−Ala−Leu−Leu−Glu−Glu−Leu−Lys−Leu−Leu−Glu−Glu−Val−Leu−Asn−Leu−Ala−Pro−Ser−Lys−Asn−Leu−Asn−Val−Asp−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(↓)Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg(配列番号13)、
(以下同様に続く)。
1つまたは2つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、トリプシン切断部位が存在しないことを特徴とする少なくとも1つのVSDLペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
トリプシン切断部位での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、融合ポリペプチドをトリプシン切断部位で切断する工程と
を含む組換え血管拡張物質(VSDL)ペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)の産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法を提供する。
リーダー融合パートナー、および、1つまたは2つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されている少なくとも1つのVSDLペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
トリプシンまたはトリプシン様酵素を用いて融合ポリペプチドを切断する工程と、
切断された融合ポリペプチドのpHを5未満に調節する工程と、
アニオン交換法(または複数の交換法)を用いて消化された融合ペプチドからペプチドを精製する工程と
を含む組換え血管拡張物質(VSDL)ペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)の産生方法
を提供する。
実施例1 大腸菌でのVSDLの組換え産生
ヒトVSDL(実施例において、VSDLと規定される)のアミノ酸配列は以下:
Glu−Val−Val−Pro−Pro−Gln−Val−Leu−Ser−Glu−Pro−Asn−Glu−Glu−Ala−Gly−Ala−Ala−Leu−
Ser−Pro−Leu−Pro−Glu−Val−Pro−Pro−Trp−Thr−Gly−Glu−Val−Ser−Pro−Ala−Gln−Arg
(配列番号2)
である。
はじめに、以下の2つの融合ポリペプチドが設計された:
(i)B72Rと規定される73アミノ酸融合パートナーと融合された単一のVSDL配列(B72R−VSDLと規定される、および、本明細書中において「1量体」とも称される)、ならびに
(ii)B72Rと融合された三重のVSDLの繰り返し(B72R−(VSDL)3と規定される、および、本明細書中において「3量体」とも称される)。
これらの融合ポリペプチドのアミノ酸配列を図1に示す。
初めの発現実験が10mLの振とうフラスコスケールで行われた。VSDL発現構築物、pBRE601(1量体)およびpBRE602(3量体)で大腸菌宿主株BR067(Hospira Adelaide;MM294 OmpT欠失)が形質転換され、および、形質転換株がカナマイシン(30μg/mL)を含むVAプレート上において選択された。
流加培養が、BioStat Qplus バイオプロセス制御ユニット(Sartorius)へ連結された1Lの反応容器中で行われた。実験は、BR067(pBRE601)およびBR067(pBRE602)細胞株それぞれの凍結されたグリセロールストックから開始された。栄養素供給は、バッチモードでの37℃の終夜培養に続いて開始された。培養物のOD600が40〜50に達した時点で、培養物はIPTGの添加によって誘導され、そして、培養が5時間継続された。各細胞株において達成された最終のOD600は〜70であり、そして、最終的なバイオマスの湿潤重量は〜80g/Lであった。図6に示される最終的な培養サンプルのSDS−PAGE分析は、BR72−VSDLおよびB72R−(VSDL)3の高レベルの発現がこれらの条件下で達成されることが示した。
B72R−VSDLおよびB72R−(VSDL)3融合ポリペプチドを含む細胞溶解液が解凍された。シークエンシング用グレードの修飾ブタトリプシン(Promega V511A;Promega Corporation、Fitchburg WI、米国)が25μg/mLで添加され、室温で終夜インキュベートされた。サンプルは、1.0%H3PO4/0.2%TFAと1:1で混合され、そして、沈殿物を除去するために遠心分離された。上澄み液が、Waters Alliance HPLC分離モジュールおよびUV検出器(Waters Corporation、Milford MA、米国)のRP−HPLCによって分析された。分析は、Empower 2ソフトウェア(Phenomenex、Inc、Torrance CA、米国)の制御下、Phenomenex Jupiter C4(250×2.1mm、5μm、300 Aカラム(#302))で行われた。VSDL合成ペプチド(すなわち、化学的に合成されたVSDL)の5、10および20μgの3度の注入が、検量線を作成するために使用され、この検量線が、切断された細胞溶解液中に産生された組換えVSDLの量を定量するために使用された。
この実験の目的は、
(1)1Lの発酵物あたり0.25gより高い精製VSDLの収率を与える、
(2)合成VSDLペプチドに匹敵する純度プロファイルが示す、
(3)エンドトキシンを低いレベルに低下させる、
(4)10mM HCl中にVSDLを処方する、
(5)大規模産生に使用できる有機溶媒の量を用いる、
(6)低圧クロマトグラフィー工程を用いる、および
(7)大規模に実現し得る
である精製プロセスを実証することであった。
先の実験において、以下の工程を利用する精製プロセスが開発された
(1)トリプシン切断、(2)酸性化による宿主細胞由来不純物の沈殿、(3)酸/メタノールを用いた逆相分離、(4)pH8への調整、および(5)NaClを用いたアニオン交換分離。
このプロセスは、15mLの消化された3量体細胞溶解液を、1mL Amberchrom XT30カラム(Rohm and Haas)上に、続いて、1mL Q Sepharose HPカラム(GE Healthcare、LittleChalfont、Buckinghamshire、英国)上にロードすることにより繰り返された。約10mgのVSDLが、Qカラムを用いて、1Lの発酵物あたり1.23gの収率で精製された。精製されたVSDLの、RP−HPLCによる溶出位置および不純物プロファイルは合成VSDLペプチドと比較しても遜色なく、N末端が延長されているNLNVDR−VSDL変異体は存在しなかった。しかし、この精製プロセスは、カラムから結合されたVSDLを溶出させるために100%メタノールを利用し、そして、メタノールの揮発性、可燃性および毒性はしたがって、この精製プロセスが大規模産生のためには望ましくないかもしれないことを意味している。
Amberchrom逆相レジンを用いた精製のあいだの有機溶媒の使用を低減させる可能性がまた調査された。
上記実施例に示される結果は、VSDLを安定した融合ポリペプチドとして良好な収率で発現する細胞株の開発、および、大規模産生で使用可能な方法でのVSDLの精製プロセスを示している。
B72Rと融合された単一のVSDL配列(1量体)および
B72Rと融合された三重のVSDL反復配列(3量体)
が設計され、これらは、溶解性型で発現され、これによって、単離された封入体からの発現タンパク質を精製する必要性が回避された。さらなる実験は、VSDLがまた6量体、8量体および10量体として高レベルで発現され得ることも立証した。
(1)1:120のTrypZean(登録商標):融合ポリペプチド(w/w)を用いた終夜の消化、
(2)pH4.4への調整、
(3)遠心分離、
(4)Amberchrom CG300C逆相クロマトグラフィー、および
(5)Fractogel TMAE アニオン交換クロマトグラフィー
を含む精製プロセスによってその後回収され得ることを示した。フラクトゲル由来物質が、RP−UPLC分析によって合成VSDL調製物と比較され、そして、97.0%および93.7%の純度がそれぞれ測定された。重要なことに、組換えVSDLに、新しい顕著な不純物ピークは存在せず(すなわち、合成VSDLペプチドと比較して)、そして、組換えおよび合成VSDLのUVプロファイルは、ほぼ同一であった。さらに、精製された組換えVSDLのエンドトキシン量は、5EU/mgと見積もられた。
(1)1Lの発酵物あたり1.2〜1.4gである精製組換えVSDL収率を与え、
(2)合成VSDL調製物に匹敵する純度プロファイルを示し、
(3)エンドトキシンを低いレベルへと減少させ、
(4)10mM HCl中にVSDLが処方され、
(5)大規模産生使用できる有機溶媒の量を使用し、
(6)低圧クロマトグラフィー工程を用い、および
(7)大規模に実現し得る
ことが発見された。
細胞溶解液が、VSDLペプチドの10個のコンカテマー型体コピーを有するB72R−(VSDL)10融合ポリペプチド(すなわち10量体)をエンコードする、実施例1に記載のpBRE606発現構築物をもつBR067大腸菌株の発酵物から、実施例1の「流加発酵」の項に記載されるように産生された。
BR067大腸菌株が、VSDLペプチドの3個のコンカテマー型体コピーを有するB72R−(VSDL)3融合ポリペプチド(すなわち3量体)をエンコードする、実施例1に記載のpBRE602発現構築物をもつ点を除いて、VSDL細胞溶解液が実施例2と同様に取得された。
B72R融合パートナーの最後から2番目のアスパラギン酸残基の、グルタミン残基との置換が、リーダーペプチドのC末端アルギニン残基におけるトリプシン切断の向上について調べられた。前記置換をもつリーダー融合ペプチドは、本明細書中においてB72(Q)Rと称される(配列番号10を参照のこと)。実施例1に記載されるものと類似の技術を用いて、B72(Q)Rリーダーペプチドに融合されている、新規のVSDL6量体、8量体および10量体構築物が作製された。得られた構築物は、BR067大腸菌株へと形質転換され、そして、実施例1に記載されるようにスクリーニングされた。
天然のヒトグルカゴン様ペプチド(GLP、NCBIの登録番号NP_002045由来)をエンコードするヌクレオチド配列が、対応するアミノ酸配列から2つの配列内リジン(K)残基を除去し、リジン残基がグルタミン(Q)残基へと変換されるように修飾される。天然のアミノ酸配列は生来、C末端アルギニン(R)残基を有する。N末端Hisタグとその後に続く、修飾GLPヌクレオチド配列の3個のまたは8個のいずれかの数のコンカテマー型コピーに作動可能に連結されるアルギニン残基(トリプシン切断部位を提供するため)をエンコードする発現構築物が、標準の大腸菌発現ベクター内に作製される。発現ベクターは大腸菌に形質転換され、そして、形質転換体が選択され、そしてその後実施例1に記載されるように培養される。
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Claims (36)
- ペプチドを含む融合ポリペプチドを発現する工程であって、前記ペプチドが、1つまたは2つ以上のペプチド切断部位(または複数の切断部位)によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位(または複数の切断部位)が前記ペプチドに存在しない工程と、
前記ペプチド切断部位(または複数の切断部位)での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、前記融合ポリペプチドを前記ペプチド切断部位(または複数の切断部位)で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法。 - ペプチド切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位がペプチドに存在しないことを特徴とするペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
前記ペプチド切断部位での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、前記融合ポリペプチドを前記ペプチド切断部位で切断する工程と
を含む組換えペプチドの産生方法であって、
前記融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法。 - 前記ペプチドが、以下の式
X1−X2−…Xn−1−Xn−(R/K)(配列番号1)
であるアミノ酸配列を含み;
式中、Xは、アルギニンまたはリジン以外の任意のアミノ酸であり、R/Kは、アルギニンまたはリジンであり、および、nは、アミノ酸の任意の適切な数である
請求項1または2記載の方法。 - 前記ペプチドが、天然の配列を有する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドが、血管拡張物質(VSDL)ペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチドを含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるVSDLペプチドである請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド切断部位が、トリプシン切断部位である請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記切断剤が、トリプシンまたはトリプシン様酵素である請求項7記載の方法。
- 1つまたは2つ以上のトリプシン切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、トリプシン切断部位が存在しないことを特徴とする少なくとも1つのVSDLペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)を含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
前記トリプシン切断部位での切断を行う切断剤(または複数の切断剤)を用いて、前記融合ポリペプチドを前記トリプシン切断部位で切断する工程と
を含む組換え血管拡張物質(VSDL)ペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)の産生方法であって、
融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドから前記ペプチドを切り出す方法。 - 前記ペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるVSDLペプチドである請求項9記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドをトリプシンまたはトリプシン様酵素によって切断することを含む請求項9または10記載の方法。
- 切断された融合ポリペプチドのpHを5未満に調整する工程と、
少なくとも1つのアニオン交換法を用いて、消化された融合ポリペプチドから前記ペプチドを精製する工程と
をさらに含む請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ペプチドを噴霧乾燥または凍結乾燥することをさらに含む請求項12記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの2個〜20個のコンカテマー型コピーを含む請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの3個のコンカテマー型コピーを含む請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの10個のコンカテマー型コピーを含む請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドが、一末端に前記ペプチド切断部位を含む請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドが、C末端アルギニンまたはリジン残基を含む請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、C末端ペプチド切断部位を有するリーダー融合パートナーを含む請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リーダー融合パートナーが、C末端アルギニンまたはリジン残基を含む請求項19記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドを発現する工程が、発現宿主として大腸菌を用いて行われる請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- C末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピーをエンコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されるリーダー融合パートナーをエンコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物。
- C末端トリプシン切断部位を有するVSDLペプチド(またはその変異体もしくは修飾ペプチド)をエンコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されるリーダー融合パートナーをエンコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物。
- 前記リーダー融合パートナーが、C末端トリプシン切断部位を有する請求項22または23記載の発現構築物。
- 前記リーダー融合パートナーをエンコードしている前記ヌクレオチド配列が、前記ペプチドをエンコードしている前記ヌクレオチド配列の2個〜20個のコンカテマー型コピーに連結されている請求項22〜24のいずれか1項に記載の発現構築物。
- ペプチドを組換えによって発現するための宿主細胞であって、請求項22〜25のいずれか1項に記載の発現構築物を含む宿主細胞。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法により産生される組換えペプチド。
- C末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピーに連結されたリーダー融合パートナーを含む組換え融合ポリペプチド。
- 前記リーダー融合パートナーが、C末端トリプシン切断部位を有する請求項28記載のポリペプチド。
- 前記リーダー融合パートナーが、前記ペプチドの2個〜20個のコンカテマー型コピーに連結されている請求項28または29記載のポリペプチド。
- C末端トリプシン切断部位を有するペプチドのコンカテマー型コピーを含む、またはそれからなる組換え融合ポリペプチド。
- 前記ペプチドの2個〜20個のコンカテマー型コピーを含む請求項31記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドの3個〜10個のコンカテマー型コピーを含む請求項32記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドが配列内トリプシン切断部位をもたない請求項28〜33のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドが、VSDLペプチドまたはその変異体もしくは修飾ペプチドである請求項28〜34のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるVSDLペプチドである請求項28〜35のいずれか1項に記載のポリペプチド。
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