JP2015510770A5 - - Google Patents
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Claims (17)
- Ｎ末端に位置するペプチド切断部位およびＣ末端に位置するペプチド切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位がＶＳＤＬペプチドに存在しないＶＳＤＬペプチドのコンカテマー型コピーを含む融合ポリペプチドを発現する工程と、
前記ペプチド切断部位での切断を行う切断剤を用いて、前記融合ポリペプチドを前記ペプチド切断部位で切断する工程と
を含む組換え血管拡張物質（ＶＳＤＬ）ペプチドの産生方法であって、
前記融合ポリペプチドを切断する工程が、前記融合ポリペプチドから前記ＶＳＤＬペプチドを切り出し、ならびに
前記ＶＳＤＬペプチドがＣ末端アルギニン残基を含む天然の配列を含み、前記ＶＳＤＬペプチドのそれぞれのコンカテマー型コピーのＣ末端に位置しているペプチド切断部位がＣ末端アルギニン残基を含み、および、前記融合ポリペプチド中の最後のＶＳＤＬペプチドを除くそれぞれの前記ＶＳＤＬペプチドの前記Ｃ末端アルギニン残基が追加で次のＶＳＤＬペプチドの前記Ｎ末端に位置するペプチド切断部位として機能する方法。 - 前記ＶＳＤＬペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる請求項１記載の方法。
- 前記ペプチド切断部位が、トリプシン切断部位であり、および、切断剤がトリプシンまたはトリプシン様酵素である請求項１または２記載の方法。
- 切断された融合ポリペプチドのｐＨを５未満に調整する工程と、
少なくとも１つのアニオン交換法を用いて、消化された融合ポリペプチドから前記ペプチドを精製する工程と
をさらに含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 前記ペプチドを噴霧乾燥または凍結乾燥することをさらに含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの２個〜２０個のコンカテマー型コピーを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの３個のコンカテマー型コピーを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、前記ペプチドの１０個のコンカテマー型コピーを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、Ｃ末端ペプチド切断部位を有するリーダー融合パートナーを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リーダー融合パートナーが、Ｃ末端アルギニンまたはリジン残基を含む請求項９記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドを発現する工程が、発現宿主として大腸菌を用いて行われる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＶＳＤＬペプチドの２個〜２０個のコンカテマー型コピーをエンコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に融合されるリーダー融合パートナーをエンコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、
前記リーダー融合パートナーがＣ末端トリプシン切断部位を有し、ならびに
前記ＶＳＤＬペプチドがＮ末端に位置するペプチド切断部位およびＣ末端に位置するペプチド切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位がＶＳＤＬペプチドに存在せず、前記ＶＳＤＬペプチドがＣ末端アルギニン残基を含む天然の配列を含み、前記ＶＳＤＬペプチドのそれぞれのコンカテマー型コピーのＣ末端に位置しているペプチド切断部位がＣ末端アルギニン残基を含み、および、前記融合ポリペプチド中の最後のＶＳＤＬペプチドを除くそれぞれの前記ＶＳＤＬペプチドの前記Ｃ末端アルギニン残基が追加で、次のＶＳＤＬペプチドの前記Ｎ末端に位置するペプチド切断部位として機能する発現構築物。 - 前記ＶＳＤＬペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる請求項１２記載の発現構築物。
- ペプチドを組換えによって発現するための宿主細胞であって、請求項１２または１３記載の発現構築物を含む宿主細胞。
- 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により産生される組換えペプチド。
- 前記ＶＳＤＬペプチドの２個〜２０個のコンカテマー型コピーに連結されたリーダー融合パートナーを含む組換え融合ポリペプチドであって、
前記リーダー融合パートナーがＣ末端トリプシン切断部位を有し、ならびに
前記ＶＳＤＬペプチドがＮ末端に位置するペプチド切断部位およびＣ末端に位置するペプチド切断部位によって隣接されており、および、そうではない場合、前記ペプチド切断部位がＶＳＤＬペプチドに存在せず、前記ＶＳＤＬペプチドがＣ末端アルギニン残基を含む天然の配列を含み、前記ＶＳＤＬペプチドのそれぞれのコンカテマー型コピーのＣ末端に位置しているペプチド切断部位がＣ末端アルギニン残基を含み、および、前記融合ポリペプチド中の最後のＶＳＤＬペプチドを除くそれぞれの前記ＶＳＤＬペプチドの前記Ｃ末端アルギニン残基が追加で、次のＶＳＤＬペプチドの前記Ｎ末端に位置するペプチド切断部位として機能する組換え融合ポリペプチド。 - 前記ＶＳＤＬペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる請求項１６記載のポリペプチド。
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