CN103638064A - 黄胡蜂属昆虫镇痛抗炎有效部位及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黄胡蜂属昆虫镇痛抗炎有效部位及其制备方法和用途。该有效部位是从黄胡蜂粗蜂毒中以截留分子量为15KDa的透析膜透析，析出液经冷冻干燥或者减压浓缩干燥而得。该有效部位多种透皮吸收制剂均能有效延长小鼠的热板刺激痛阈值，能明显抑制醋酸致小鼠疼痛的扭体反应。其还能显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀，能够显著减轻佐剂型关节炎大鼠关节肿胀，降低关节周径。可预期该昆虫多肽镇痛抗炎有效部位及其透皮吸收制剂用于制备抗炎镇痛类生化药物，用以治疗急慢性炎症，以及用于各类手术前后的止痛，美容、镜检、烧烫伤伴随疼痛、神经性疼痛以及癌症疼痛等急慢性疼痛的护理与治疗。

Description

黄胡蜂属昆虫镇痛抗炎有效部位及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种黄胡蜂属（Vespula spp.）昆虫中镇痛抗炎有效部位的制备方法及医药用途。该有效部位是从黄胡蜂属粗蜂毒中经现代提取工艺制备而成，该有效部位多种透皮吸收制剂具有显著的止痛、对抗急慢性炎症和自体免疫性炎症的功效，可预期该有效部位及其透皮吸收制剂用于制备抗炎镇痛类生化药物，用以治疗急慢性炎症，以及用于各类手术前后止痛，美容、镜检、烧烫伤伴随的疼痛、神经性疼痛以及癌症疼痛等急慢性疼痛的防治。所述抗炎镇痛类生化药物及其透皮吸收制剂包括药物、保健品、医疗器械和日化用品等形式出现。 

背景技术

炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。根据持续时间不同分为急性和慢性。急性炎症以发红、肿胀、疼痛等为主要征候，即以血管系统的反应为主所构成的炎症。从炎症的主要的组织变化可分类如下：（1）变质性炎症。（2）渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）。（3）增生性炎症。（4）特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。 

炎症的基本病理变化通常概括为局部组织的变质、渗出和增生。早在公元一世纪，罗马著述家Cornelius Celsus就已提出，炎症主要表现为患病部位发红（rubor）、肿胀（tumor）、发热（calor）和疼痛（clolor）等四大症候。直到十九世纪德国著名病理学家Virchow才把局部功能障碍列为炎症的第五个症候。慢性炎症的病程较长，数月至数年以上，可由急性炎症迁延而来，或由于致炎因子的刺激较轻并持续时间较长，一开始即呈慢性经过。如结核病或自身免疫性疾病等。慢性炎症时，局部病变多以增生改变为主，变质和渗出较轻；炎细胞浸润多以淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞为主。根据形态学特点，慢性炎症可分为非特异性慢性炎和肉芽肿性炎两大类。 

炎症分为变质性炎、渗出性炎和增生性炎三大类型。（一）变质性炎（alterative inflammation）常见于肝、肾、心、脑等实质性器官，常见于某些重症感染、中毒及变态反应等，由于器官的实质细胞变性、坏死明显，常引起相应器官的功能障碍。例如急性重型 病毒性肝炎时，肝细胞广泛坏死，出现严重的肝功能障碍；流行性乙型脑炎时，神经细胞变性、坏死及脑软化灶形成，造成严重的中枢神经系统功能障碍；又如白喉外毒素引起的中毒性心肌炎，心肌细胞变性坏死，导致严重的心功能障碍。（二）渗出性炎（exudative inflammation）是指以渗出为主要病变的炎症，以炎症灶内有大量渗出物形成为主要特征。根据渗出物的主要成分和病变特点，一般将渗出性炎分为浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎等类型。1.浆液性炎（serous inflammation）是以浆液渗出为主的炎症。皮肤的浆液性炎如皮肤Ⅱ度烫伤时，渗出的浆液积聚于皮肤的表皮内形成水疱；粘膜的浆液性炎如感冒初期，鼻粘膜排出大量浆液性分泌物；浆膜的浆液性炎如渗出性结核性胸膜炎，可引起胸膜腔积液；发生在滑膜的浆液性炎可引起关节腔积液。浆液性炎有时因浆液渗出过多可导致较严重的后果。如喉炎时严重的炎性水肿，可致呼吸困难；心包腔大量炎性积液时，可压迫心、肺而影响其功能。2.纤维素性炎（fibrinous inflammation）是以渗出物中含有大量纤维素为特征的渗出性炎症。常发生于粘膜（咽、喉、气管、肠）、浆膜（胸膜、腹膜和心包膜）和肺。流感时的假膜性气管炎，纤维素性心包炎，大叶性肺炎等。3.化脓性炎（purulent inflammation）是以中性粒细胞大量渗出并伴有不同程度的组织坏死和脓液形成为特征的一种炎症。疖（furuncle）、痈（carbuncle）、溃疡（ulcer）、蜂窝织炎（phlegmonous inflammation）、化脓性炎、出血性炎。（三）增生性炎病变主要表现为纤维母细胞、血管内皮细胞和组织细胞增生为主的炎症称增生性炎。主要见于慢性炎症。 

1979年，WHO给“疼痛”定义为：由造成或有可能造成组织损伤或潜在的组织损伤的各种刺激而引起的一种不愉快的感觉，常伴有痛苦的心理、情绪的感受。其还可能引起心血管、呼吸系统等方面的变化。它既是机体的一种保护性机制，提醒机体避开或处理伤害，也是临床许多疾病的常见症状。临床上常将疼痛分为以下几种： 

（1）按疼痛的神经生理机制可分为：①伤害感受性疼痛，包括由各种伤害性刺激所导致的躯体痛和内脏痛。②非伤害感受性疼痛，包括神经病理性疼痛（neuropathic pain）和精神性或心理性疼痛（psychogenic pain）；神经病理性疼痛指神经系统本身病变所导致的疼痛。其中，疼痛发源于脊髓或脑时，称之为中枢性疼痛（central pain）；发源于末梢神经时，则称之为外周性疼痛（peripheral pain）。精神性疼痛指无明确的伤害性刺激及神经性原因的疼痛。 

（2）按疼痛持续时间可分为：①急性疼痛（acute pain）：如发生于创伤、胃肠道穿孔、手术后的疼痛等；②慢性疼痛（chronic pain）：如慢性腰腿痛、晚期癌症痛等。 

（3）按疼痛在躯体的解剖部位可分为：头痛，颌面痛，颈项痛，肩、上肢痛，胸痛，腹痛，腰背痛，盆腔痛，下肢痛，肛门、会阴痛。 

（4）按疼痛发生的深浅部位可分为：①浅表痛，位于体表皮肤或粘膜；②深部痛，内脏、关节、胸膜、腹膜等部位的疼痛。 

（5）按疼痛的表现形式可分为：①局部痛；②放射痛；③牵涉痛等。 

（6）按疼痛的性质可分为：①刺痛；②灼痛；③酸痛；④胀痛；⑤绞痛等。 

疼痛，尤其是剧烈疼痛，不仅给患者带来痛苦、紧张不安等情绪反应，还可引起机体生理功能紊乱，甚至诱发休克、死亡，因此及时地缓解疼痛是极为重要的。目前在国际上，疼痛被认为继呼吸、脉搏、血压、体温之后的第五个生命体征。尤其是癌痛治疗，80%晚期癌症病人都有轻重不同的疼痛。每天都有400万人以上的人口在遭受癌痛的折磨，严重损害病人的生活质量，对患者及其家属和社会都造成极大的负面影响。1992年WHO推荐了癌痛病人治疗的三阶梯方案：（1）对轻中度癌痛用NSAIDs；（2）对中、重度癌痛或者不耐受及禁用NSAIDs的病人，需要增加可待因或同类弱阿片类药物；（3）严重癌痛的治疗，需要使用更有效的阿片制剂。因此，疼痛治疗（pain management）是现代医学的一个重要组成部分，并已逐渐发展成为疼痛治疗学。疼痛治疗的含义是对各种原因所致的疼痛以及某些神经血管功能障碍疾病或体征，采用药物和（或）神经阻滞等各种综合方法进行治疗，以达到缓解或消除症状，提高病人生活质量的目的。其中，药物治疗是疼痛治疗最基本、最常用的方法。一旦明确诊断的剧烈疼痛患者应及时应用镇痛药。常用的镇痛药可分为： 

（1）阿片类镇痛药：一类主要作用于中枢神经系统，能选择性地消除或缓解痛觉的药物，同时又能减轻不愉快的情绪反应，但并不影响其它感觉。常用的镇痛药包括阿片生物碱类（吗啡、可待因）与人工合成品（哌替啶、阿法罗定、美沙酮等）。因此对已确诊的剧烈疼痛，及时应用镇痛药既可解除病人的痛苦，有利于疾病的恢复，又可防止休克的发生，在急救中具有重要意义。但因该类镇痛药大都有强成瘾性，临床上仅适用于急救、术后疼痛治疗及晚期癌症病人镇痛。 

（2）解热镇痛药：一类具有退热和减轻外周慢性钝痛的药物。能抑制下丘脑前部神经元中的前列腺素（PGs）的合成和释放，除解热和镇痛作用外，还具有抗炎、抗风湿作用。解热镇痛类药物也可选择性作用于体温调节中枢，降低其异常兴奋性，通过神经调节使皮肤血管扩张，排汗增加，呼吸加快，增加散热，同时稳定白细胞内的溶酶体膜，阻碍白细胞内致热原的释放，使体温恢复到正常水平。一般来说，此类药物对头痛、牙痛、神经痛、关节痛、肌肉痛及月经痛等钝痛效果好，但对内脏平滑肌绞痛无效。 

（3）非甾体类抗炎药（NSAIDs）：非甾体类抗炎药是与激素相对而言的，这一类药物其化学结构中缺乏激素所具有的甾环，故而得名。它具有解热、镇痛和抗炎作用，是治疗风湿性疾病的一线药物。此类药物种类很多，目前最常用的有乙酰水杨酸(即阿司匹林)、对乙酰氨基酚（扑热息痛）、布洛芬等。尽管这—类药都是通过减少体内前列腺素的合成起作用，但各种药物之间还存在一些细微的差别。一般用于治疗轻到中度的非癌性疼痛，如骨骼肌功能紊乱、关节炎、痛经和头痛等。 

（4）其他用于缓解神经性疼痛的非镇痛药：例如，抗癫痫药可用于治疗神经病理性疼 痛，如三叉神经痛、幻肢痛等，常用药物有苯妥英钠和卡马西平；抗抑郁药可用于治疗由紧张及焦虑等精神、心理因素导致的疼痛，以及治疗慢性疼痛病人的抑郁症状，常用药有氟西汀、赛乐特、左洛复、多虑平等；催眠镇静药在慢性疼痛治疗中多用作辅助用药，以苯二氮草类最常用，如地西泮和硝西泮等，但该类药物反复应用后，可引起药物依赖和耐药性，故不应滥用。 

上述药物虽能一定程度的缓解疼痛症状，然而其具有广泛的成瘾性或药物依赖、严重胃肠道不良反应（溃疡、胃炎，甚至穿孔出血等）、伤肾、诱发心血管疾病（COX-2特异性抑制剂心类镇痛剂可引起肌梗塞、心絞痛、缺血性中風等）、过敏反应或耐药性等毒副作用。市场上抗炎镇痛的一线用药NSAIDs其不良反应大大影响了其临床使用，主要表现在以下几个方面：（1）引起严重的胃肠道损伤；包括腹胀、消化不良、恶心、呕吐、腹泻、和消化道溃疡；严重者可致穿孔或出血，乃至死亡。不良反应由重到轻顺序为：阿司匹林>萘普生>吲哚美辛>舒林酸>布洛芬。（2）引起多种血液系统的损害，包括各种血细胞减少症和缺乏。诸如粒细胞减少和再生障碍性贫血、溶血性贫血、血小板减少、过敏性血小板减少性紫癜等。对于存在出血灶（如脑出血）的患者还会引起致死性出血。不宜应用于肝损伤、低凝血酶原血症、维生素缺乏及手术前病人。（3）对肝肾的损害：多数一线用药NSAIDs可致肝损害，轻者为转氨酶升高、严重者肝细胞坏死。肾损伤则表现为急性肾炎、肾病综合征、肾乳头坏死、水肿、高血钾、低血钠等。（4）多数一线用药NSAIDs对于多数抗高血压药物有部分或完全的拮抗。高血压病人使用之会引起药物拮抗。（5）NSAIDs还易引起皮疹、荨麻疹、瘙痒、光敏等过敏反应。（6）NSAIDs过敏反应表现为头晕、头痛、耳聋、嗜睡、失眠、感觉异常、麻木等，有些出现肌痉挛、幻觉等。 

以上不良反应严重影响了服用NSAIDs药物者的健康，威胁着其正常的工作状态和治疗效果。因此，研发新型高效低毒的镇痛消炎药成为现代药物研究的热点之一。目前对镇痛消炎药物的探索研究中，中药、天然药已越来越凸显其药效良好、无成瘾性、不良反应少及资源丰富等优势，引起人们的重视。 

中医学治疗痛证已有几千年的历史，在《黄帝内经》中就已对痛证的病因、病机、病位、证候、预后等方面进行了系统的论述。中医理论认为“痛则不通，通则不痛”，据此为主治疗各种疼痛的中药及中药复方在中医临床中应用广泛。按其功用特点分成祛风散瘀止痛药、活血通络止痛药等，麻沸散就是典型的代表。中药镇痛作用明确、应用灵活，且毒副作用极小，在人类医学史上发挥着不可替代的作用，近来在各国医药界的引起广泛关注。 

而从天然产物或其衍生物中开发新型的镇痛药物的努力，也取得了较大的进展。南加州大学神经学家George Miljanich博士所领导的研究小组在海底的一种肉食性蜗牛中发现一种称为ω-芋螺毒素（ω-conotoxin或omega conopeptide）的神经毒素，它可以作用于神经细胞的钙通道，使疼痛的信号不能传送到大脑，保持其整个神经系统运作的正常性。人工合 成的ω-芋螺毒素Ziconotide的镇痛作用比吗啡强1000倍，且不具成瘾性或药物依赖性。但因其给药途径局限于髓腔给药，因此使用非常不方便。 

我国有丰富的天然药用动物、植物和矿物资源，虽然中药方剂中不乏以虫类入药者，然而在对天然药物的研究中，仍是以植物药的研究较多，对动物药的研究长期以来并未得到重视。上述欧美科学家的经验表明，动物将是开发新型镇痛药物的宝贵药用资源。而昆虫占整个动物数量的90%，是世界上最大的生物类群，据估计其种类可能达1000万种，个体数量超过10¹⁸。由于药用昆虫资源丰富、生物活性较强，因此药用昆虫作为我国中医药的一部分，是一笔宝贵的财富。 

黄胡蜂属（Vespula spp.）属昆虫纲有翅亚纲膜翅目（Hymenoptera）细腰亚目（Apocrita）针尾部（Aculeata）胡蜂总科（Vespoidea）昆虫，云贵高原广泛分布，属社会性胡蜂，结巢群居。一般将蜂巢构建在能支持的结构上面或里面。在地下，它们通常使用一个废弃的哺乳动物的洞穴作为一个基础，然后由工蜂将其扩大。蜂王也常会选择一棵中空的树、墙壁缝隙或岩石缝隙为巢址。 

由于很多独特的黄胡蜂属昆虫资源集中在云贵地区，国内其他省份及国外同行对其研究及其活性报道均较少。本发明人所在的大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心在对云贵高原的药用昆虫抗炎镇痛药物的系列研究过程中，对该属各种昆虫进行了综合全面的采集、种属鉴定；并进一步实施了各不同种黄胡蜂属胡蜂的蜂毒采集、纯化、得到不同的提取部位，比较了其抗炎镇痛的多种药效学活性，完成了药物开发前期研究工作。 

根据文献，我国针对“蜂毒”的应用多为复方，且对于蜜蜂蜂毒研究的较多。对于野生胡蜂的研究，尤其是特种黄胡蜂属昆虫蜂毒中纯化得到的有效部位抗炎镇痛的相关报道尚未见到。已公开的资料有：（1）精制方法类：2007年张文礼、孙井元公开的“蜂毒的精制方法”（公开号CN101088514A）；公开了一种将粗蜂毒溶于乙醇中除去蜂胶等杂质得到精制蜂毒。同年其后，二人又公开了一种“蜂毒肽的分离提纯方法”（公开号CN101089017A），描述了将粗蜂毒用水浸洗、乙醇沉淀、氢氧化铵及正丁醇萃取，丙酮沉淀等一系列操作，最终通过G-10柱脱盐、G-25柱纯化和脱盐冻干得到电泳级蜂毒肽melittin的制备方法。2009年，张文礼又申报了“蜂毒肽的提纯方法”（公开号CN101455287A），描述了对上述专利制备方法的改进，从而保留了蜂毒肽四聚体不被截留掉，工艺步骤减少，产率提高的制备方法。1994年，刘尽晖、王远程、杨峰公开了一种用过滤、超滤、透析除掉大分子和小分子的蜜蜂毒多肽制备方法。2009年刘卫华、李明申报的“一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用”（授权号CN100547000C），描述了一种用凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到分子量为1387.7道尔顿的单链多肽。（2）蜂毒肽的应用方面：2005年，郑江等公开了一种“蜂毒肽及其应用”（公开号CN1704431A）， 描述了用树脂合成INLKAIAALAKKLL-NH2的小分子肽及其用于制备杀灭细菌和治疗脓毒症的药物。2009年赖仞、徐学清申请了“胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用”（授权号CN100475840C），描述了分子量为1316.6道尔顿的NH2-IDWKGIAAMAKI-COOH的胡蜂抗菌肽，主要是通过离心、凝胶柱层析、离子交换柱层析、反相HPLC柱纯化得到，并测试了其对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞的抑制作用。（3）生物工程及应用方面：2001年，美国泛太平洋制药公司公开了“蜂毒蛋白的有用特性和编码这种蜂毒蛋白的基因”（公开号CN1313895A），描述了从蜜蜂毒液中分离的新型蛋白、其抗体和编码改蛋白的核酸。2002年，张素方、施婉君、程家安、张传溪公开了“墨胸胡蜂蜂毒溶血肽前体基因及其编码的多肽和制备方法”（公开号CN1385526A）和“额斑黄胡蜂溶血肽前体基因及编码的多肽和制备方法”（授权号CN1385525A）。2005年，张素方、施婉君、程家安、张传溪、沈立荣等又先后公开了“大胡蜂镇静肽前体基因及其编码的多肽和制备方法”（授权号CN1194089C）和“中华蜜蜂大胡蜂溶血肽前体基因及编码的多肽和制备方法”（授权号CN1233830C）。2006年，王斌等公开了“蜂毒素与基因变构白细胞介素2嵌合体蛋白”（公开号CN1754960A），作为治疗肿瘤的基因工程药物尝试。2007年颜炜群、许天敏公开了“尿激酶型纤溶酶激活剂a链与蜂毒素的融合蛋白及其制备”（公开号CN101337992A），描述了一种由尿激酶型纤溶酶原激活剂a链与蜂毒素结合形成的融合蛋白、其制备方法及该融合蛋白在肿瘤治疗中的作用。2008年，瑞普生物药业有限公司申报了“重组ceeA-mil杂合基因抗菌肽”（公开号CN101323644A），根据天蚕素A和蜂毒素，用基因工程方法构建酵母表达一种重组蛋白，测试了其抗菌活性，借此尝试一种重组抗菌肽。2009年，重庆大学胡宗利等公开了“蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌及其构建方法和应用”（授权号CN101591622B）。同年，浙江大学沈立荣等公开了一种“中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用”（公开号CN101705231A），并测试了用发酵工程方法重组的Royalisin产物抗真菌活性。2011年华南农业大学谢青梅等公开了一种“一种重组蜂毒肽及其应用”（公开号CN102229664A），用该基因重组药物治疗鸡输卵管疾病。同年，浙江大学叶恭银等公开了一种“蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽及应用”（公开号CN102260348）；意图用于转基因作物或改造植物共生菌。（4）制剂方面，杨孟君2001年公开了一种“纳米胡蜂制剂药物及其制备方法”（公开号CN1366926A），描写了以胡蜂虫体为原料，超微粉碎后，经过系列处理，用超音速射流技术制备的纳米胡蜂制剂。沈阳药科大学崔福德、寸冬梅于2003年申报的“蜂毒的可生物降解微球注射剂及其制备方法”描述了对于蜜蜂毒的微球制剂剂型尝试，但并无药理实施例。2009年崔福德等又申报了一种“用于口服给药的蜂毒肽复合物纳米粒及其制备方法”（公开号CN101406691A）；描述了用纳米技术将蜜蜂毒制成蜂毒肽复合物纳米粒，用于口服。以上制剂均无描述纯化后的胡蜂毒有效部位，尤其是产于云南特殊种群的黄胡蜂属昆虫蜂毒有效部位的透皮吸收制剂制备方法；更无其生理活性 和对于抗炎镇痛的药效学的活性方面的相关报导。 

显然，上述公开的各项发明均未对隶属于特殊种群的黄胡蜂属昆虫种类及其抗炎镇痛方面的活性进行研究。鉴于生物界由于地理、气候环境不同造就出的丰富的生物多样性对生理活性的影响至关重要，昆虫不同的种属之间结构差异千差万别，仅仅氨基酸的排列不同就导致生物活性的巨大差异。故而，专门针对西南地区生物多样性最高的、全国昆虫种类最多的云南省之黄胡蜂属昆虫毒素进行系统采集和生物活性测定尚属首次，然对于维护生物资源安全性却十分必要。率先报道云南胡蜂总科黄胡蜂属药用昆虫资源以前未研究过的抗炎镇痛活性的意义重大。 

胡蜂总科黄胡蜂属（Vespula spp.）在我国云贵高原地区广泛分布，云南省已知有十余种，是云南省优势资源。为明确云贵高原药源广泛分布的黄胡蜂属昆虫毒素是否具有抗炎镇痛活性及其医药用途，黄胡蜂属蜂毒有效部位的经皮给药系统制剂抗炎镇痛功效的强度比较及由此指导进一步弄清其中起主要药理作用的物质结构基础，以及从分子药理学基础上阐明黄胡蜂属昆虫毒素多种生物活性的作用机制，大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心的研发团队对分布于云南省境内的民间习用黄胡蜂属昆虫进行了综合采集和药效学活性研究。 

经皮给药是药物通过皮肤给药的一种方法，药物应用于皮肤后，以恒定速度（或接近恒定速度）穿过角质层，扩散通过皮肤，由毛细血管吸收进入体循环，产生全身或局部治疗作用，通常文献上称为经皮治疗系统(transdermal therapeutic system，简称TTS)或经皮给药系统(transdermal drug delivery system，简称TDDS)，俗称透皮吸收、透皮给药等。经皮给药的特点：（1）可避免肝脏的首过效应和药物在胃肠道中的灭活，药物的吸收不受胃肠道因素的影响，减少用药的个体差异。（2）可维持恒定有效的血药浓度或生理效应，避免口服给药引起的血药浓度峰谷现象，降低毒副反应。（3）减少给药次数，提高治疗效能，延长作用时间，避免多剂量给药，使大多数病人易于接受。（4）使用方便，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药。 

正因为这些优点，TTS系统的研发是目前药物制剂研发的热点之一，并且发展迅速，如硝酸甘油贴片自80年代问世以来一直是世界上最畅销的50种药物之一。TTS系统是被国内医药界普遍认可的继口服和注射之后的第三代药物制剂新剂型，是当代制药业理应掌握的高新技术，在药物制剂学上具有里程碑的意义。作为第三代药物新剂型，TTS系统不仅是世界上发展最快的药物研究领域之一，而且在欧、美等发达国家已经产生了巨大的经济效益。自1981年第一个TTS产品东莨菪碱贴片问世以来，TTS立即受到了广大患者的欢迎。据报道，在1992年Nicotin-TTS（尼古丁贴剂）的销售额就达到10亿美元，远远超过其他戒烟产品，被美国《时代》杂志评为当年美国最受欢迎的十大产品之一；1999年仅Voltaren公司和Lamisil公司生产的Estraderm（雌二醇贴剂）和Nitroderm（硝化甘油贴剂） 的销售额分别达到3.8亿和3.3亿美元。具有强效麻醉性镇痛药芬太尼贴片在2002年开始销售就达年销售额15.9亿美元。TTS是当今世界一种科技含量高、范围广、使用方便的新型外用贴剂，开发前景广阔，潜在经济效益巨大。 

TTS产品中透皮给药已选用的药物主要有以下几类：【性激素】–黄体酮、睾酮、炔诺酮、18-甲基炔诺酮、雌二醇、前列腺素、加压素、雌孕激素+黄体酮等；【心血管药】–硝苯地平、尼群地平、氨氯地平、消心痛、硝酸甘油、尼卡地平、普萘洛尔等；【神经系统药】–毒扁豆碱、吗啡、二氢埃托啡、酮洛酸、芬太尼等；【消炎镇痛药】–消炎痛、酮洛芬、氟比洛芬、布洛芬、双氯芬酸等；【平喘药】–妥洛特罗、特布他林等。目前，国际经皮给药市场发展迅猛，日新月异，根据世界卫生组织（WHO）预测，到2025年，将有1/3的现用药将采用经皮吸收制剂，TTS系统的产值将达到数百亿美元。因此，TTS给药产品的研发受到广泛关注，将在药物使用史上翻开新的一页。 

国内贴剂市场中，传统狗皮膏(古老的经皮给药方式)类中药贴片占据了一大半以上的市场份额，而中药和化学药品透皮贴剂的市场份额则微不足道。目前国内透皮制剂市场规模之所以比较小，主要是受国内制剂技术水平的限制。我国TTS系统在研究和开发方面与发达国家相比还存在比较明显的差距，特别是工业生产配套水平较低，尚未能形成规模生产能力。大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心承担的动物药经皮给药科研平台建设项目对此做了大量准备。不仅购置了世界先进的巴布膏涂布机等一批TTS专用仪器，还大力引进了专攻透皮制剂的科研团队。本发明中的各类蜂毒TTS制剂，即是在大理学院云南省创新团队昆虫药物透皮制剂GMP车间制备的。 

在对云贵高原采集得到的胡蜂总科昆虫的研究中，我们发现黄胡蜂属胡蜂粗胡蜂毒有抑制二甲苯小鼠耳肿胀和延长小鼠对热板刺激痛阈值的作用，继而多次试验发现小于15KDa的有效部位作用最强。本发明人还发现：鉴于实验结果，外用于小鼠、大鼠等动物皮肤及鼻部的原料药物效果优于其他口服、肌注、静注等给药途径。因此，本发明人特意以现代制剂技术制备出一系列透皮吸收制剂，并将各种该TTS制剂应用于抗炎镇痛动物药物药理及药效实验中，发现：胡蜂毒有效部位透皮制剂有着无可替代的优势，其起效时间快，毒性低，作用强度大，使用剂量小。最重要的是，一旦发现施用对象有不适症状或毒性反应后可以随时停药，保证了实验动物和临床使用之病人的安全性。 

本发明使用不同体内外药效学模型，测试了黄胡蜂属粗蜂毒经由透析膜制备出的黄胡蜂属蜂毒有效部位及其透皮吸收制剂（以水凝胶、巴布剂、涂膜剂为例）对小鼠热板刺激痛阈、醋酸致小鼠疼痛扭体、等疼痛实验模型的药理活性。又测试了上述透皮吸收制剂抑制二甲苯致小鼠耳肿胀、减轻佐剂型关节炎大鼠关节肿胀的抗炎免疫药效学活性。试验结果发现：黄胡蜂属蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂具有显著的镇痛、对抗急慢性炎症的功效。有部分TTS药物制剂的药效活性超过多种抗炎镇痛的一线用药和NSAIDs重磅炸 弹类畅销药，因此，可以作为抗炎镇痛创新性天然药物进一步深入开发，从而构成本发明。 

发明内容

本发明的目的是提供一种从黄胡蜂属胡蜂中提取的多肽有效部位及其制备方法，其特征是：该多肽有效部位中多肽含量占比在80%以上；且有效部位物质分子量小于15千道尔顿即15KDa。具体而言，该有效部位是从黄胡蜂属胡蜂的粗蜂毒中以截留分子量（MWCO）为15KDa的透析膜透析，析出液经冷冻干燥或者减压浓缩干燥而得。 

本发明中的黄胡蜂属胡蜂多肽有效部位其动物原料药物蜂毒多肽采自黄胡蜂即膜翅目胡蜂总科（Vespidae）黄胡蜂属（Vespula spp.）昆虫。 

本发明的另一目的是提供了黄胡蜂属胡蜂多肽有效部位及其TTS制剂在制备抗炎镇痛药物中的应用。黄胡蜂属胡蜂多肽有效部位可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有消除或缓解疼痛功效的药物组合物。该类药物组合物可以采用注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、气雾剂、透皮贴剂、栓剂、滴丸剂、栓剂、外用搽剂、软膏剂等剂型。 

本发明的另一目的是提供了黄胡蜂属胡蜂多肽有效部位在制备抗炎镇痛药物中的应用。该多肽有效部位可以与药学上常用的辅料、载体或敷料结合，或制成TTS制剂从而制备得到具有减缓或终止炎症疼痛，抑制急性慢性炎症的药品或保健产品，用以治疗急性慢性炎症及其疼痛，减轻手术前后、美容、镜检、烧烫伤时产生的疼痛，牙痛，癌性疼痛等中枢性、外周性疼痛。 

本发明所述的经透析膜制备出的多肽有效部位其原料药或其可药用盐为主药进行配制的水凝胶、巴布剂、涂膜剂等透皮吸收制剂，及其控释或缓释剂型或其纳米制剂还可以与现已上市的抗炎镇痛药物组合，制备得到具有抗炎镇痛功效的组合物或复方制剂，可预期成为抗炎镇痛的药品、保健品、日化用品和医疗器械。上述各类药物组合物或者药品、保健品、日化用品和医疗器械可以采用多种制剂，包括水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、涂膜剂、软膏剂等透皮吸收剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。 

至今为止，以往文献中并未发现有以此MWCO为15KDa的透析膜工艺对黄胡蜂属昆虫蜂毒进行提取的文献报道，本发明人所述之用特定15KDa孔径的透析膜制备黄胡蜂属蜂毒有效部位法具有意想不到的新的效果。并且，迄今为止，中外文献并无针对云南采集到的黄胡蜂属蜂毒多肽有效部位进行针对抗炎镇痛活性研究的详尽报道，更没有将该属蜂毒有效部位制成TTS（透皮吸收制剂）用于抗炎镇痛模型动物的报道。本发明针对性的关于黄胡蜂属蜂毒多肽有效部位TTS制剂抗炎镇痛之全面研究尚属首次。此外，黄胡蜂属蜂毒透析膜制备出的有效部位其原料药及其透皮吸收制剂均具有显著的抑制疼痛、降低炎症和 免疫性炎症反应的功效；亦均属于意想不到的结果，因而可以预期进一步开发成为抗炎镇痛类的药物或药物组合物。由此完成了本发明。 

本发明的有益之处在于：首次用截留分子量（MWCO）为15KDa的透析膜制备出黄胡蜂属昆虫蜂毒多肽有效部位，并首次发现了该有效部位在开发抗炎镇痛药物领域中的潜力，作为一种多肽物质为主的NSAIDs潜在先导有效部位，其对于开发治疗急慢性炎症，以及用于各类手术止痛，美容、镜检、烧烫伤所需的止痛、神经性疼痛以及癌症疼痛等急慢性疼痛的创新生化药物提供了新的胡蜂科动物药物之物质基础。本发明又一特点是：根据黄胡蜂属昆虫蜂毒有效部位制成的透皮吸收制剂具有起效快、活性广泛、安全性高的优势，使得该有效部位许多TTS制剂活性优于抗炎镇痛临床一线用药，具有相当广阔的市场前景。本发明再一特点是：该属膜翅目昆虫生长繁殖能力旺盛，在云贵高原广泛分布，便于养殖，每头蜂王每年可以孵育数百只子代，有利于成为稳定的和可持续开发生物药物资源，同时也有利于贫困山区农民养殖此类药源性动物达到脱贫目的。具有潜在的巨大社会效益和经济效益。该药物原料来源于天然养殖的胡蜂总科昆虫，其蜂毒有效部位制备步骤简便，绿色天然，成本低，污染小，利于大规模生产。 

具体实施方案

为了更好地理解本发明的实质，下面分别以实施例和药理实施例说明使用经透析膜制备出的黄胡蜂属蜂毒有效部位为主药分别配制的水凝胶、巴布剂、涂膜剂等透皮吸收制剂对延长小鼠热板刺激痛阈值、醋酸扭体法刺激痛阈值的试验结果，说明其在制备镇痛药物中的用途。 

在药学研究中筛选镇痛药的常用致痛方法概括有物理法（热、电、机械）和化学法。动物的疼痛反应常表现出嘶叫、舔足、翘尾、蹦跳及皮肤、肌肉抽搐。化学法，即将某些化学物质，如强酸、强碱、钾离子、缓激肽等，涂布于动物的的某些敏感部位或腹腔注射。热板法为物理致痛，借助热的刺激使动物产生疼痛，这种刺激通过传入神经传给中枢，产生疼痛的感觉，使用吗啡可以抑制痛觉向中枢的传递，而达到镇痛的目的。而扭体法为化学致痛，借助致痛物质的化学刺激而产生疼痛，同时还会出现炎症反应，非甾抗炎药对这类疼痛有镇痛作用。本发明同时应用2种试验方法，能够全面地评价黄胡蜂属蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂的镇痛作用。 

为了更好地理解本发明的实质，发明人又以黄胡蜂属蜂毒经透析膜制备出的有效部位为主药分别配制的水凝胶、巴布剂、涂膜剂等透皮吸收制剂对二甲苯致小鼠耳肿胀、佐剂型关节炎大鼠关节肿胀等药理实验结果，说明其在防治抗炎镇痛生化药物开发领域中的新用途。本发明还观察了小鼠和大鼠急性毒性试验及一般药理学实验，说明该有效部位对动物的毒性，由此来反映在人体使用时的安全性。若无特别说明，本发明的百分比指的是重 量百分比。 

必须说明，本发明的实施例和药理实施例均是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。 

实施例1：额斑黄胡蜂蜂毒多肽有效部位及水凝胶剂的制备 

1.1额斑黄胡蜂粗蜂毒的采集： 

额斑黄胡蜂采自云南省香格里拉境内，蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为Vespula maculifrons Buysson（额斑黄胡蜂）。采集胡蜂毒装置：使用经过本工程研究中心改装的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压10V，输出自动间歇脉动电压；采集胡蜂毒方法：将采毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，对该巢额斑黄胡蜂蜂群职蜂采毒30分钟。打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引额斑黄胡蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的额斑黄胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。合并数次收集得到的额斑黄胡蜂粗蜂毒共计352毫克。 

1.2透过透析膜进行粗蜂毒的纯化： 

按照常规透析膜截留大分子方法，使用美国光谱医学（spectrum）品牌的透析袋，即用型纤维素酯膜，截留分子量（MWCO）15000道尔顿。使用前处理及操作均按照说明书进行。加7毫升蒸馏水溶解黑盾胡蜂蜂毒，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，在4℃温度环境摇床震荡透析过夜，并不断搅拌。16小时后取透出液冷冻干燥，G-10柱脱盐后，再冻干，即为下一步制剂使用之原料药。依此法得到额斑黄胡蜂蜂毒多肽有效部位286毫克。经福林酚法检查，该有效部位中多肽含量大于80%。 

1.3额斑黄胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂的制备： 

制水凝胶剂方法：称取150克甘油，放入500毫升烧杯中，依次称取甘羟铝和EDTA各1克，先后溶解于甘油中，搅拌均匀，再加入25克NP-700，混匀，得到A液；将卡波姆5.0克溶解4个小时，加双蒸水200克，得到B液；将A、B混合得到C液。取酒石酸1.0克，加双蒸水117.5克混匀得到D溶液。将D液分次倒入C液中，并搅拌均匀，即得到水凝胶基质。根据药理实施例需要的水凝胶剂浓度，向水凝胶基质中加入额斑黄胡蜂蜂毒有效部位原料药，充分搅拌均匀。即可用于药理实施例中的动物实验。使用于小鼠足趾时，配制成的水凝胶剂终浓度为3.0毫克/30微升。 

实施例2：细黄胡蜂蜂毒多肽有效部位及涂膜剂的制备 

2.1细黄胡蜂粗毒的采集： 

细黄胡蜂采自云南省梁河县境内，蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心郭云胶教授鉴定为Vespula flaviceps Smith（细黄胡蜂）。采集胡蜂毒装置：使用经过本工程研究中心改装的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压12V，输出自动间歇脉动电压；采集胡蜂毒方法：将未经涂装的采毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，对该巢细黄胡蜂蜂群职蜂采毒30分钟。打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引细黄胡蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的细黄胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。合并数次收集得到的细黄胡蜂粗蜂毒共计277毫克。 

2.2透过透析膜进行粗蜂毒的纯化： 

按照常规透析膜截留大分子方法，使用美国光谱医学（spectrum）的透析袋，即用型纤维素酯膜，截留分子量15000道尔顿。使用前处理及操作均按照说明书进行。加8毫升蒸馏水溶解细黄胡蜂粗蜂毒，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，在4℃温度环境摇床震荡透析过夜，并不断搅拌。17小时后取透出液冷冻干燥，G-10柱脱盐后，再冻干，即为下一步制剂使用之原料药。得到细黄胡蜂蜂毒多肽有效部位213毫克。经福林酚法检查，该有效部位中多肽含量为88.7%。 

2.3细黄胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂的制备： 

制涂膜剂方法：称取0.5克EG40，加6倍量的蒸馏水（即3.0克）浸泡溶胀至于90℃水浴上加热溶解。将细黄胡蜂蜂毒多肽有效部位原料药溶于适量水中与0.2克甘油、0.01克吐温-80和剩余的水混匀，加入到上述EG40中，搅拌均匀，放置过夜除去气泡。便可适用于药理实施例中的动物实验。使用给小鼠时，配制成的涂膜剂终浓度为3.0毫克/30微升。 

实施例3：怒江黄胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂的制备 

3.1怒江黄胡蜂粗毒的采集： 

怒江黄胡蜂采自云南省怒江州六库境内，蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为Vespula nujiangensis Dong et Wang（怒江黄胡蜂）。采毒基本装置使用经过本工程研究中心改装的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压12V，输出自动间歇脉动电压；木框事先以红色油漆涂成红色；木框上预先涂抹20毫升浓度为15毫克/毫升的另外一窝怒江黄胡蜂的蜂巢及蜂体提取物挥发性溶液（制备方法：将100克蜂巢及80只职蜂蜂体匀浆磨碎，加入20毫升蒸馏水，以醋酸乙酯萃取2次、每次20毫升；萃取液减压蒸干溶剂后，以乙醚溶解，配制成15毫克/毫升的提取物挥发性溶液）；采集怒江黄胡蜂蜂毒 前20分钟涂抹。将该取毒器放置于铺有大红色塑料布的地上，略微倾斜15度，形成对蜂巢蜂群的强烈刺激信号。然后打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引怒江黄胡蜂出来攻击蜂毒采集器。采毒结束后，关闭电源，扫掉不再排毒的怒江黄胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。合并数次收集得到的怒江黄胡蜂粗蜂毒331毫克。 

3.2透过透析膜进行粗蜂毒的纯化： 

按照常规透析膜截留大分子方法，使用美国光谱医学（spectrum）的透析袋，即用型纤维素酯膜，MWCO为15KDa。使用前处理及操作均按照说明书进行。加9毫升蒸馏水溶解怒江黄胡蜂蜂毒，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，在4℃温度环境摇床震荡透析过夜，并不断搅拌。14小时后取透出液冷冻干燥，G-10柱脱盐后，再冻干，即为下一步制剂使用之原料药。得到怒江黄胡蜂多肽有效部位249毫克。经福林酚法检查，该有效部位中多肽含量为83.4%。 

3.3怒江黄胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂的制备： 

制巴布剂方法：将卡波姆5克溶解4个小时，加双蒸水200克，得到A液；称取150克甘油，放入500毫升烧杯中，依次称取甘羟铝和EDTA各1克，先后溶解于甘油中，搅拌均匀，再加入25克NP-700，混匀，得到B液；将A、B混合得到C液。取酒石酸1克，加双蒸水117.5克混均匀得到D液。将D液分次倒入C液中，并搅拌均匀，即得到基质E。向合适量的基质中加入3.2中制备出的怒江黄胡蜂蜂毒有效部位原料药，充分搅拌均匀。制成药理实验所需要的单位面积要求的终浓度（小鼠实验时保证1.0公分×1.0公分的巴布剂含量为3.0毫克）。于大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心GMP中试车间用巴布剂机器涂布成5公分×7公分的巴布剂。使用时剪成1.0公分×1.0公分的块状贴于小鼠体肤，并用胶布固定好。 

实施例4：玉龙黄胡蜂蜂毒多肽有效部位及其涂膜剂的制备 

4.1玉龙黄胡蜂粗毒的采集： 

玉龙黄胡蜂采自云南省丽江玉龙境内，蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为Vespula yulongensis Dong et Wang（玉龙黄胡蜂）。取毒装置使用经过本工程研究中心改装的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压12V，输出自动间歇脉动电压；玻璃板下面加装一层光电二极管灯泡承载层，使用郑州恒光科技有限公司LED灯泡，以电线与蓄电池相连。将红色、白色、橙色LED灯交叉排列；使用闪烁其控制器使各色灯泡以每10秒钟交替闪烁6次为佳。木框四角以对角形式安装蓄电池驱动的小型28千赫兹和40千赫兹的超声波发生器各2台（THD-2012Q小型超声波发生器及5120型喇叭超声波发生器 组合）。在穿戴好防护设备后，将超声波发生器打开，喇叭对准玉龙黄胡蜂蜂巢所在位置；同时打开控制LED灯闪烁电源控制器，使安装在采毒器玻璃板下方的红色、白色、橙色LED灯依次闪亮，并反复循环闪烁。之后打开蜂巢口，吸引玉龙黄胡蜂出来攻击蜂毒采集器。20分钟后，先关掉取毒器开关，再顺次关闭超声波发生器电源和LED灯电源；收集取毒玻璃板上的玉龙黄胡蜂蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。合并数次采集蜂毒，得到玉龙黄胡蜂粗蜂毒342毫克。 

4.2透过透析膜进行粗蜂毒的纯化： 

按照常规透析膜截留大分子方法，使用美国光谱医学（spectrum）的透析袋，即用型纤维素酯膜，截留分子量15KDa。使用前处理及操作均按照说明书进行。加8毫升蒸馏水溶解玉龙黄胡蜂蜂毒，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，在4℃温度环境摇床震荡透析过夜，并不断搅拌。15小时后取透出液冷冻干燥，G-10柱脱盐后，再冻干，即为下一步制剂使用之原料药。得到玉龙黄胡蜂蜂毒多肽有效部位287毫克。经福林酚法检查，该有效部位中多肽含量为87.2%。 

4.3玉龙黄胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂的制备： 

制涂膜剂方法：称取0.5克EG40，加6倍量的蒸馏水（即3.0克）浸泡溶胀至于90℃水浴上加热溶解。将玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位原料药溶于适量水中与0.2克甘油、0.01克吐温-80和剩余的水混匀，加入到上述EG40中，搅拌均匀，放置过夜除去气泡。便可适用于药理实施例中的动物实验。涂膜剂使用在大鼠足趾部时，浓度配置为6.4毫克/60微升，相当于给药浓度92.3毫克/毫升。 

药理实施例1：以热板法测试额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂对小鼠痛阈值的作用 

实验原理：小鼠足底无毛，皮肤裸露，所以对刺激敏感。将雌性小鼠置于一定温度的热板上，热刺激小鼠足部产生痛反应，即舔足反应。以小鼠出现舔足的时间作为痛反应指标，评价测试药物的镇痛效果。 

1.1.实验材料： 

1.1.1药物与试剂： 

1.1.1.1阳性药物及配制：阿司匹林肠溶片，0.3克/片，湖南新汇制药有限公司，批号：080903，以生理盐水配制成0.04克/毫升浓度供实验用。阿司匹林水凝胶剂的配制按照实施例1中1.3所述之相同工艺，称取150克甘油，放入500毫升烧杯中，依次称取甘羟铝和EDTA各1克，先后溶解于甘油中，搅拌均匀，再加入25克NP-700，混匀，得到A液；将卡波姆5.0克溶解4个小时，加双蒸水200克，得到B液；将A、B混合得到C液。取酒石酸1.0克，加双蒸水117.5克混匀得到D液。将D液分次倒入C液中，并搅拌均匀，即得到水凝胶基质。向水凝胶基质中加入阿司匹林片溶液，充分搅拌均匀。即可用于药理实施例中的动物 实验。配制成的水凝胶剂终浓度为12.0毫克/30微升。 

1.1.1.2测试药物及配置：将根据实施例1之1.3部分制备得到的额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂配制成3.0毫克/30微升的终浓度。 

1.1.2动物：雌性昆明种小鼠60只，体重20±2克，由大理学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK。 

1.1.3仪器：RB-200智能热板仪，成都泰盟科技有限公司出品；TP电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。 

1.2方法与结果： 

1.2.1实验前，在55±0.5℃的热板上测定健康的雌性昆明种小鼠之基础痛阈值，选痛阈值范围在5～30秒的小鼠供实验用。 

1.2.2合格雌性小鼠依体重随机分为4组，每组10只：阳性对照阿司匹林灌胃组（“阿司匹林组”）按0.3毫升/20克·体重（gBW）灌胃阿司匹林；“阿司匹林水凝胶组”于小鼠两后足各自涂抹30微升浓度为12.0毫克/30微升的阿司匹林水凝胶；“空白对照组”灌服等体积生理盐水；额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂组（“胡蜂毒水凝胶组”）于小鼠两后足各自涂抹30微升浓度为3.0毫克/30微升的水凝胶剂；每日给药1次，连续给药5天。于最后一次给药后30、60、90分钟测定小鼠的痛阈值，痛阈值超过60秒者按60秒计。 

1.2.3结果如表1所示：阳性药物阿司匹林两种剂型组均能明显能够延长小鼠痛阈值，但灌胃组优于水凝胶组。额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂组小鼠在给药后各时间点的痛阈值均明显大于空白对照组，并且其镇痛（延长痛阈值）作用高于阳性对照（阿司匹林灌胃）组，更远高于阳性对照水凝胶剂组；且有统计学上的显著性差异。 

表1额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂对小鼠热痛阈值的影响 

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。 

1.3.实验结论： 

小鼠的爪趾对热刺激非常敏感，其表现为跳跃、缩足和舔后足。热板法适合于评价中枢镇痛药物的效果。实验结果显示：以额斑黄胡蜂蜂毒有效部位配制成浓度为3.0毫克/30 微升的水凝胶剂给药后，可显著延长热刺激致小鼠舔后足的潜伏期，说明额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂能明显提高热板小鼠的痛阈值。在给药后的30分钟、60分钟、90分钟测试小鼠的痛阈值结果表明：额斑黄胡蜂蜂毒有效部位涂水凝胶剂药效强于两组阳性对照，其与空白对照相比，延长的痛阈值均具统计学意义；而在末次给药后90分钟阳性对照阿司匹林的作用已不显著，但额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂仍能显著增加小鼠的痛阈值，且具有统计学意义。实验表明，额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂能有效提高热板小鼠的痛阈值，即额斑黄胡蜂蜂毒有效部位水凝胶剂有中枢镇痛的功效，表明黄胡蜂属胡蜂蜂毒及其相关透皮吸收制剂有望发展成为新的具有中枢镇痛作用的生化药物。 

药理实施例2：以扭体法测试细黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂对醋酸致小鼠疼痛的影响 

实验原理：应用化学刺激物注入小鼠腹腔内刺激腹膜，引起深部的大面积而较久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体反应”（腹部内凹、收缩成“S”形，躯干与后腿伸张、臀部高起及蠕行等）。以小鼠出现扭体的次数为痛反应指标，镇痛药物可以抑制动物的“扭体反应”，因此可从受试动物的扭体次数判断药物是否具有镇痛作用。 

2.1实验材料： 

2.1.1药物与试剂： 

醋酸：分析纯，广东汕头新宁化工厂，批号：950517，使用前配置成浓度为0.6%； 

阿司匹林肠溶片：0.3克/片，湖南新汇制药有限公司，批号：080903，以生理盐水配制成0.04克/毫升浓度供实验用； 

阿司匹林涂膜剂的配制按照实施例2中2.3所述之相同工艺，取甘油0.25克、0.1克吐温-80和阿司匹林片溶解于5毫升蒸馏水中，微加热震荡使之溶解。然后与20毫升2%CMC-Na胶浆搅拌混匀，40℃保温，待气泡消除，便可适用于药理实施例中的动物实验。使用给小鼠时，配制成的涂膜剂终浓度为12.0毫克/30微升； 

细黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂：将根据实施例2之2.3部分制备得到的细黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂配制成3.0毫克/30微升配制成的终浓度。 

2.1.2动物：昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重20±2克，由大理学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK。 

2.1.3仪器：TP电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。 

2.2方法与结果： 

2.2.1挑选出的40只合格小鼠依体重随机分为4组，每组10只，雌雄各半：“阳性对照组”灌胃阿司匹林；“空白对照组”灌服生理盐水；“阿司匹林涂膜组”于小鼠两后足各自涂抹30微升浓度为12.0毫克/30微升的涂膜剂；细黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂组（“胡蜂毒涂膜组”）于小鼠两后足各自涂抹30微升浓度为3.0毫克/30微升的涂膜剂；每日给药1次，连 续给药5天。于末次给药后30分钟，每只小鼠腹腔注射0.2毫升的0.6%醋酸，观察并记录各鼠在腹腔注射醋酸后的15分钟内扭体次数，计算抑制率。抑制率=（空白对照组平均扭体次数-实验组平均扭体次数）/空白对照组平均扭体次数×100%。 

2.2.2结果如表2所示。 

表2细黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂对冰醋酸所致小鼠扭体反应的影响 

注：均值±标准差，与空白对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。 

2.3实验结论： 

小鼠扭体实验是通过注射冰醋酸刺激腹膜，小鼠因疼痛而表现出扭体反应。扭体实验适用于外周镇痛的评价研究。本扭体实验结果证明细黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂对醋酸所致小鼠扭体反应的抑制作用明显，超出阳性对照药物阿司匹林的功效，且具有统计学意义。实验结果说明细黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂具有较强的外周性疼痛的镇痛功效，表明黄胡蜂属胡蜂蜂毒及其相关透皮吸收制剂有望发展成为新的具有镇痛功效的生化药物。 

药理实施例3：怒江黄胡蜂蜂毒有效部位巴布剂抑制二甲苯致小鼠耳肿胀作用 

3.1实验目的： 

了解受试药对动物急性炎症的作用，为研究受试药抗炎作用机理提供依据。 

3.2小鼠耳肿胀模型的筛选实验： 

3.2.1实验仪器与试剂：剪刀、电子天平、直径打孔器、注射器；二甲苯、阿司匹林片、生理盐水。 

3.2.2受试物与动物： 

阳性药物：阿司匹林肠溶片，0.3克/片，湖南新汇制药有限公司，批号：080903； 

阳性药物：复方地塞米松凝胶，厦门金日制药有限公司，批号：1209040； 

阳性药物：地塞米松磷酸钠注射液，天津药业集团新郑股份有限公司，批号：1301251。 

怒江黄胡蜂蜂毒有效部位巴布剂：取自实施例3中3.3部分制备而得的巴布剂。 

动物：昆明种小鼠，2～3月龄，70只，雌雄各半，体重18～22克。 

3.3实验步骤： 

3.3.1试验分组：70只昆明种小鼠，按体重随机分成7组，每组10只，雌雄各半，分为： 生理盐水组、空白基质巴布剂组、阿司匹林组（灌胃给药）、阿司匹林巴布剂组、复方地塞米松凝胶剂组、地塞米松磷酸钠注射液组、怒江黄胡蜂蜂毒有效部位巴布剂组。 

3.3.2空白基质巴布剂及阿司匹林巴布剂制备方法：将卡波姆5克溶解4个小时，加双蒸水200克，得到A液；称取150克甘油，放入500毫升烧杯中，依次称取甘羟铝和EDTA各1克，先后溶解于甘油中，搅拌均匀，再加入25克NP-700，混匀，得到B液；将A、B混合得到C液。取酒石酸1克，加双蒸水117.5克混均匀得到D液。将D液分次倒入C液中，并搅拌均匀，即得到基质E。向合适量的基质中加入阿司匹林药物，充分搅拌均匀。制成药理实验所需要的单位面积要求的终浓度（小鼠实验时保证1.0公分×1.0公分的巴布剂之阿司匹林含量为12.0毫克），于大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心GMP中试车间用巴布剂机器涂布成5公分×7公分的巴布剂，即为阿司匹林巴布剂。不含药物的巴布剂即为空白基质巴布剂。使用时剪成1.0公分×1.0公分的块状贴于小鼠褪毛后腹部，并用胶布固定好。 

3.3.3造模：用微量进样器给小鼠右耳廓涂以二甲苯40微升/只，诱导小鼠右耳肿胀。 

3.3.4给药方案：分别以生理盐水，阿司匹林溶液给小鼠灌胃，给药体积为0.4毫升/只；一天一次，连续三天；复方地塞米松凝胶剂组（1.0毫克/20克·体重）及地塞米松磷酸钠注射液组每天涂抹小鼠褪毛后腹部（1.0毫克/20克·体重），一天一次，连续三天；空白巴布剂基质组及怒江黄胡蜂蜂毒有效部位巴布剂组每天给1.0×1.0公分巴布剂，黏贴于小鼠褪毛后腹部，纱布固定，一天换一次药物，连续三天；末次给药60分钟后，左耳做对照不涂二甲苯，用微量进样器给小鼠右耳廓涂以二甲苯40微升/只，复制局部炎症，左耳做对照。致炎后60分钟，小鼠颈椎脱臼处死，剪下左右耳廓，用直径8毫米的打孔器冲下左右耳片，称重。以同一小鼠左右耳片的重量差表示“肿胀度”，统计比较阳性组和试药组与生理盐水组小鼠耳廓肿胀度的差异是否显著。计算肿胀抑制率。注：肿胀度(毫克)＝右耳片重(毫克)－左耳片重(毫克)。 

3.4实验结果： 

实验结果见表3。 

表3怒江黄胡蜂蜂毒有效部位巴布剂抑制小鼠耳肿胀试验结果（抑制率％） 

注：均值±标准差，与空白对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。 

3.5结果说明： 

实验结果表明：怒江黄胡蜂蜂毒有效部位巴布剂对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀有显著抑制作用，且有良好的统计学意义（P<0.01），其抑制率为57.2%。4种对照药物制剂对二甲苯致小鼠耳肿胀亦有显著抑制作用，地塞米松组作用强于阿司匹林组。实验结果说明怒江黄胡蜂蜂毒有效部位巴布剂具有较强的抑制急性炎症的功效，在本实验浓度下，其显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀功效超过阳性用药阿司匹林，与地塞米松接近。表明黄胡蜂属胡蜂蜂毒及其相关透皮吸收制剂有望发展成为新的具有抗炎功效的生化药物。 

药理实施例4：玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂对大鼠佐剂性关节炎关节肿胀程度的影响 

4.1实验目的： 

测定玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂对大鼠佐剂关节炎的治疗作用。免疫后的大鼠因病情不同的不同变化，会出现足趾部的肿胀。通过对给药前后的大鼠关节肿胀程度的变化进行评定，可以进行抗风湿免疫调节类药物的抗炎药效评定。 

4.2实验原则： 

对大鼠进行造模后，每天检测大鼠的足趾容积、踝关节的周长，检测7天，筛选合格的大鼠进行治疗给药。 

4.3实验材料： 

4.3.1实验动物：SD大鼠，6～8周龄，体重180～220克，购于昆明医科大学实验动物学部，合格证号：SCXK(滇)2011-0004。饲养条件：温度25～27℃，湿度70±10℃，动物自由摄食饮水。 

4.3.2实验试剂、阳性药物及试药： 

完全弗氏佐剂：Sigma公司，批号：F5881-10； 

蜂毒注射液：长春博奥生化药业有限公司；国药准字H22024384； 

云南白药膏：云南白药集团有限公司无锡药业有限公司，批号PAD1354； 

红药气雾剂：沈阳精诚药业有限公司，批号130202； 

万通筋骨喷剂：通化万通药业股份有限公司，批号130503； 

玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂：参见实施例4中的4.3部分。涂膜剂使用在大鼠足趾 部时，浓度配置为6.4毫克/60微升，相当于给药浓度92.3毫克/毫升。 

4.3.3实验器材： 

足趾容积测定仪：成都泰盟科技有限公司，型号：PV-200； 

游标卡尺：上海力衡仪器仪表有限公司； 

1毫升注射器及军工出品的普通直尺。 

4.4实验方法： 

4.4.1实验前测定大鼠的足趾容积及踝关节周长，注意如下：大鼠足趾容积的测定采用记号笔，于踝关节上方6毫米处，用条带辅助标记。 

4.4.2测定好数据，建好初步档案后，进行造模，造模方法：踝关节处，1毫升的注射器踝关节进针，将注射器中预先抽取好的0.2毫升完全弗氏佐剂注射到大鼠关节腔，确保注射结束后，约5秒以后抽出针尖，防治试剂外露。 

4.4.3造模后拍照，建立档案：造模后开始测定大鼠的各项指标，连续测定7天。筛选出大鼠足趾造模成功的大鼠，进行给药。 

4.4.4根据大鼠的各项指标，进行随机分组，分为6组，每组8只；另从未进行造模的健康大鼠中随机挑选8只，作为空白涂膜剂对照组。给药方式如下： 

健康基质组（空白涂膜剂对照组）：每次涂抹右爪记号笔标记处下方足趾部分60微升，每天一次； 

模型组：给予生理盐水，每次涂抹右爪记号笔标记处下方足趾部分60微升，每天一次； 

蜂毒注射液：每次如上述涂抹足趾部分60微升，每天一次； 

云南白药贴；给药方式为包裹上述右爪足趾肿胀部分，胶带扎紧，每天一次； 

红药喷剂；喷涂整个足趾部分60微升，每天一次； 

万红筋骨喷剂；喷涂整个足趾部分60微升，每天一次； 

玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂组：每次涂抹右爪记号笔标记处下方足趾部分60微升，相当于给药量为6.4毫克/只，每2天给药一次； 

4.4.5连续给药21天，每天拍照，测量关节周径2个指标（大鼠的足趾容积、脚踝周长）的变化情况。 

4.5实验结果： 

实验结果见表4、表5。表4中报道了给药第3、9、21天时大鼠的足趾容积的变化（平均值），表5中报道了给药第3、13、17、21天时大鼠的脚踝周长的变化（平均值），以说明测试药物的药效趋势。 

表4给药前后各实验组大鼠足趾容积记录表（毫升） 

表5给药前后各实验组大鼠脚踝周长记录表（公分） 

4.6实验结论： 

从实验结果（表4、5）中可以明显看出，受试药物（玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂组）效果十分显著，其涂膜剂的效果超过云南白药贴和万红筋骨喷剂，还超过蜜蜂蜂毒注射液。在较低的浓度下，玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂组便能使大鼠关节肿胀显著减轻，关节周径减少。从表4和表5中，给药后的关节肿胀程度与造模后的关节肿胀程度之差异可以看出，玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂第21天的效果超过了试用的数只阳性对照药物。说明玉龙黄胡蜂蜂毒有效部位涂膜剂组治疗佐剂型关节炎疗效相当显著。该结果说明：黄胡蜂属胡蜂蜂毒有效部位的透皮吸收制剂有望发展成为新型的治疗类风湿关节炎相关疾病的生物毒素多肽类透皮制剂创新抗炎药物。 

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。 

Claims (8)

1.一种从黄胡蜂属胡蜂中提取的多肽有效部位，其特征是：该多肽有效部位中多肽含量占比在80%以上；且有效部位物质分子量小于15千道尔顿即15KDa。

2.一种制备权利要求1所述的从黄胡蜂属胡蜂中提取的多肽有效部位的方法，其特征是：该多肽有效部位是从黄胡蜂属胡蜂的粗蜂毒中以截留分子量为15KDa的透析膜透析，析出液经冷冻干燥或者减压浓缩干燥而得。

3.权利要求1所述的从黄胡蜂属胡蜂中提取的多肽有效部位用于制备抗炎镇痛的药物的用途，其特征是：所述抗炎是指防治急性和/或慢性炎症；镇痛是指减缓或终止中枢性疼痛、外周性疼痛。

4.根据权利要求3的用途，其特征是：所述镇痛是指减缓或终止炎症疼痛，术前、术后疼痛，美容、镜检、烧烫伤时产生的疼痛，牙痛，癌性疼痛。

5.根据权利要求3的用途，其特征是：该药物用途是通过药物制剂、医疗器械、日化用品形式得以体现；所述药物制剂、医疗器械、日化产品的形式是水凝胶、泡沫凝胶、涂膜剂、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、外用搽剂、软膏剂。

6.一种具有抗炎镇痛活性的药物组合物，其特征是：该药物组合物含有治疗有效量的根据权利要求1的从黄胡蜂属胡蜂中提取的多肽有效部位、药用辅料、药用载体或敷料。

7.根据权利要求6的药物组合物，其特征是：该药物组合物是以经皮治疗系统形式得以实施的，具体是指经皮肤给药吸收后起作用的贴剂、水凝胶、泡沫凝胶、涂膜剂、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、外用搽剂、软膏剂。

8.根据权利要求1-3任一所述的多肽有效部位，其特征是：动物原料药物粗蜂毒采自膜翅目胡蜂总科黄胡蜂属昆虫额斑黄胡蜂、细黄胡蜂、怒江黄胡蜂、玉龙黄胡蜂中的一种或多种。