CN1161377C - 大蹼铃蟾皮肤肽及其制备方法和在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域。大蹼铃蟾皮肤肽，是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2674.2道尔顿，等电点9.8，多肽全序列一级结构为：NH₂-GIGTKILGGVKTALKGALKELASTYAN-NH₂。其制备方法是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经离子交换、凝胶过滤柱层析分离纯化后得到。大蹼铃蟾皮肤肽作为制备真菌感染疾病治疗药物、肿瘤治疗药物的应用。具有显著的抑制细菌和真菌生长、肿瘤细胞抑制活性高等优点。

Description

大蹼铃蟾皮肤肽及其制备方法和在制药中的应用

技术领域：

本发明提供一种大蹼铃蟾皮肤肽及其制备方法和在制药中的应用，属于生物医学领域。

背景技术：

自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就，但随着药物的持续使用，目前微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。万古霉素抗性的葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病目前均是世界范围内的临床难题。三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉素脑膜炎双球菌，肺炎球菌，对抗新头孢菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现。因此新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局部感染和全身感染都有效，正成为新一类抗生素，其研制目前受到广泛重视。

肿瘤也是危害人类健康的另一类主要疾病，而且治疗药物匮乏，目前在化疗中所使用的药物，如阿霉素，环磷酰胺等等均具有较大的人体毒性，副作用非常大，因而肿瘤治疗药物的开发是药物研制的热点。

很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。由于两栖类皮肤中含有大量结构简单、抗菌谱广的抗菌肽，因此从两栖类皮肤获得临床可用的抗菌肽已引起世界的广泛关注，据国外文献报道从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，为此在美国以爪蟾皮肤抗菌肽Magainin为名成立了Magainin制药公司。他们生产的爪蟾皮肤抗菌肽Magainin类似物MSI-78已进入三期临床。在用抗菌肽nisin治疗母牛乳房皮肤感染时，发现用药仅一分钟后，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎球菌的数量成4倍对数的减少而不产生任何副作用。在国外，抗菌肽已开始用于抗肿瘤的研究和治疗，但未见详细的报道。国外学者也已报道从东方铃蟾(Bombinaorientalis)和花铃蟾(Bombina variegata)中分离出若干具广谱抗微生物活性的多肽类物质，如Bombinin和BLP-like多肽。

我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究还较少。大蹼铃蟾(Bombinamaxima)主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。

发明人将本发明的大蹼铃蟾皮肤肽全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。

发明内容：

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌、真菌)，抗肿瘤活性的大蹼铃蟾皮肤肽及其制备方法和在制药中的应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

大蹼铃蟾皮肤肽，为我们首次从两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2674.2道尔顿，等电点9.8，多肽全序列一级结构为：甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—苏氨酸—赖氨酸—异亮氨酸—亮氨酸—甘氨酸—甘氨酸—缬氨酸—赖氨酸—苏氨酸—丙氨酸—亮氨酸—赖氨酸—甘氨酸—丙氨酸—亮氨酸—赖氨酸—谷氨酸—亮氨酸—丙氨酸—丝氨酸—苏氨酸—酪氨酸—丙氨酸—酰胺化天冬酰胺(NH₂-GIGTKILGGVKTALKGALKELASTYAN-NH₂)。

大蹼铃蟾皮肤肽的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后，经DEAE-Sephadex A-50离子交换后，收取所得峰I经Sephadex G-50凝胶过滤后取峰IV，峰IV再经CM-Sephadex C-25离子交换，取第三步柱层析分离出的峰I即可。然后用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

大蹼铃蟾皮肤肽作为制备真菌感染疾病治疗药物、肿瘤治疗药物的应用。

下面用本发明的大蹼铃蟾皮肤肽的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果：

1、大蹼铃蟾皮肤肽抑制细菌生长的作用：

抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。

表1，大蹼铃蟾皮肤肽抑制细菌生长的作用：

菌株                                 最小抑菌浓度(μg/ml)

                                   粗样品        大蹼铃蟾皮肤肽

大肠杆菌ATCC25922                  150           19.5

(Escherichia coli ATCC25922)

金黄色葡萄球菌ATCC2592              75           19.5

(Staphylococcus auneus ATCC2592)

绿脓杆菌CMCCB10104                  75           19.5

(Pseudomonas aeruginosa CMCCB10104)

巨大芽胞杆菌                        150           9.7

(Bacillus megaterium)

痢疾杆菌                            37.5          2.7

(Bacillus dysenteriae)

肺炎球菌                            150           15.8

(Klebsiella pneumoniae)

由表1可见，大蹼铃蟾皮肤肽第一步DEAE-Sephadex A-50离子交换粗品及纯化大蹼铃蟾皮肤肽均具有显著的抑制细菌(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌)生长的作用。

2、大蹼铃蟾皮肤肽抑制真菌生长的作用：

抗真菌活性检测，采用杯碟法。培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基，分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration，MIC)。真菌株来源于云南大学微生物研究所，此试验重复三次，取平均值，结果如表2。

表2，大蹼铃蟾皮肤肽抑制真菌生长的作用：

菌株                                 最小抑菌浓度(μg/ml)

                                    粗样品      大蹼铃蟾皮肤肽

白色念珠菌ATCC2002                  25          2.73

(Candida albicans ATCC2002)

黄曲霉IFFI4015                      75          6.5

(Aspergillus flavus sp IFFI4015)

青霉IFFI2001                        ＞300       50

(Penicillium sp IFFI2001)

微小毛霉                            50          10.5

(Mucor pusillus)

酵母：

啤酒酵母                            80          12.5

(Sacharomyces cerervisiae)

由表2可见，除抑制细菌生长外，大蹼铃蟾皮肤肽第一步DEAE-Sephadex A-50离子交换粗品及纯化大蹼铃蟾皮肤肽均具有显著的抑制真菌生长的作用。

表3，大蹼铃蟾皮肤肽抑制肿瘤细胞生长的作用：

化合物                              EC50(μg/ml)

                               C8166           Molt-4

大蹼铃蟾皮肤肽粗品             18.8            78

大蹼铃蟾皮肤肽(批号1)          2.1             24.3

大蹼铃蟾皮肤肽(批号2)          4.2             31.0

大蹼铃蟾皮肤肽(批号3)          3.5             20.5

3、大蹼铃蟾皮肤肽抑制肿瘤细胞生长的作用

在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常细胞对照。每孔滴加3×10⁵/ml的C8166细胞或Molt-4细胞100μl。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。72小时(C8166)或48小时(Molt-4)用MTT方法测定待测化合物对细胞的毒性作用。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度。

目前临床上所用大部分抗生素类药物不具有抑制肿瘤细胞作用。从表3可见，大蹼铃蟾皮肤肽粗品及不同批号的纯化大蹼铃蟾皮肤肽均有显著的体外抑制杀灭肿瘤细胞的作用。

从上述实验结果可得出本发明大蹼铃蟾皮肤肽的有益效果在于：

大蹼铃蟾皮肤肽粗品及不同批号的纯化大蹼铃蟾皮肤肽均有显著的抑制细菌和真菌生长作用，所用微生物菌株包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、白色念珠菌、青霉、米曲霉等，结果表明大蹼铃蟾皮肤肽具广谱抗微生物活性(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，真菌；MIC在3-20μg/ml范围内)。同时大蹼铃蟾皮肤肽具有显著地抑制肿瘤细胞生长的作用，大蹼铃蟾皮肤肽对C8166，Molt-4肿瘤细胞的抑制率EC50平均分别为3.3μg/ml，25μg/ml，与文献报道的同时具有肿瘤细胞抑制活性的其他来源抗菌肽相比，大蹼铃蟾皮肤肽的肿瘤细胞抑制活性高5-10倍。因此，本发明的大蹼铃蟾皮肤肽是一种首次从中国特色药用生物资源中研制的新的具有抗微生物，抗肿瘤的生物活性多肽。

附图说明：

图1为本发明大蹼铃蟾皮肤肽的DEAE-Sephadex A-50离子交换层析图。

图2为本发明大蹼铃蟾皮肤肽的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。

图3为本发明大蹼铃蟾皮肤肽的CM-Sephadex C-25离子交换层析图。

具体实施方式：

下面结合附图用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

1、制备大蹼铃蟾皮肤肽：

活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。第一步：DEAE Sephadex A-50离子交换，按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉，冻干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3的缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；DEAE Sephadex A-50(Pharmacia产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，经两个柱体积同样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集穿透峰I。

第二步，Sephadex G-50凝胶过滤：第一步得到的活性成分穿透峰I冻干，溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液，上样于Sephadex G-50(Pharmacia产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集峰IV。

第三步，CM Sephadex C-25离子交换：凝胶过滤得到的活性成分峰IV上样品于经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25(Pharmacia产品)阳离子交换柱(300mm长，26mm直径)，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集活性成分峰I即为大蹼铃蟾皮肤肽。

2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

3、纯化大蹼铃蟾皮肤肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

通过上述方法制备的大蹼铃蟾皮肤肽，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2674.2道尔顿，等电点9.8，多肽全序列结构为甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—苏氨酸—赖氨酸—异亮氨酸—亮氨酸—甘氨酸—甘氨酸—缬氨酸—赖氨酸—苏氨酸—丙氨酸—亮氨酸—赖氨酸—甘氨酸—丙氨酸—亮氨酸—赖氨酸—谷氨酸—亮氨酸—丙氨酸—丝氨酸—苏氨酸—酪氨酸—丙氨酸—酰胺化天冬酰胺(NH₂-GIGTKILGGVKTALKGALKELASTYAN-NH₂)。作为制备制备真菌感染疾病治疗药物、肿瘤治疗药物的应用。

Claims (3)

1、大蹼铃蟾皮肤肽，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2674.2道尔顿，等电点9.8，多肽全序列一级结构为：甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—苏氨酸—赖氨酸—异亮氨酸—亮氨酸—甘氨酸—甘氨酸—缬氨酸—赖氨酸—苏氨酸—丙氨酸—亮氨酸—赖氨酸—甘氨酸—丙氨酸—亮氨酸—赖氨酸—谷氨酸—亮氨酸—丙氨酸—丝氨酸—苏氨酸—酪氨酸—丙氨酸—酰胺化天冬酰胺。

2、大蹼铃蟾皮肤肽的制备方法，其特征是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经离子交换、凝胶过滤柱层析分离纯化，即可制备得到大蹼铃蟾皮肤肽；其中：

2.1凝胶过滤为：将得到的活性成分穿透峰I冻干，溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 6.0缓冲液，上样于Sephadex G-50凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长1000mm、直径为26mm，用同样缓冲液洗脱，收集峰IV；

2.2离子交换：凝胶过滤得到的活性成分峰IV上样品于经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25阳离子交换柱长300mm、直径为26mm，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集活性成分峰I即为大蹼铃蟾皮肤肽。

3、权利要求1中的大蹼铃蟾皮肤肽作为制备真菌感染疾病治疗药物、肿瘤治疗药物的应用。