CN109758572A - N6衍生肽的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了N6衍生肽的应用，所述N6衍生肽是由序列如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽N6的羧基末端经酰胺化得到的。本发明通过对抗菌肽N6分子结构进行优化设计，得到衍生肽。实验证明衍生肽对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果。羧基末端的酰胺化衍生肽具有更好的耐酸性、更低的溶血性和细胞毒性，使得衍生肽具有比N6更好的体内治疗小鼠毒血症效果；衍生肽分子量小，人工合成方便，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物，具有良好的应用前景。此外，本发明为新型抗菌药物的创制提供理论参考依据。

Description

N6衍生肽的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种N6衍生肽(N6NH₂)的应用。

背景技术

抗菌肽是由生物有机体产生的前体经蛋白酶降解生成的具有生物学活性的小分子多肽，主要构成了机体防御的第一道防线。专抗革兰氏阴性菌的抗菌肽对细菌的作用机制主要是以膜作为靶点，通过静电力和受体介导的细胞膜作用力，引起膜通透性改变，降低细胞膜稳定性，或插入细胞膜中形成跨膜孔洞，最终导致细菌内容物外泄而死亡。由于抗菌肽特殊的作用机制，使其不易产生耐药性，并且对许多临床耐药菌同样具有杀菌作用。因此，抗菌肽被认为可以替代传统抗生素，应用于饲料添加剂、医药卫生和食品防腐等领域。

抗菌肽N6是海蚯蚓肽NZ17074的衍生物，在体外具有较强的杀灭革兰阴性菌活性，其抗菌活性、细胞毒性有待进一步改善。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构稳定性基本不变的情况下体内抗菌效果得以显著提升的N6衍生肽的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种N6衍生肽(N6NH₂)，由序列如SEQID NO:1所示的抗菌肽N6的羧基末端(C端)经酰胺化得到的，其结构如下：GFAWNVCVYRNGVRVCHRRAN-NH₂。所述N6衍生肽带5个正电荷，1对二硫键(Cys7-Cys16)，分子量为2476.8Da，等电点为11.64。

第二方面，本发明提供所述N6衍生肽在制备治疗细菌感染的抗菌药物或组合物中的应用。

本发明所述细菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。所述革兰氏阴性菌包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌。

进一步地，所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)。例如，E.coli CVCC195。

所述革兰氏阳性菌包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌。优选金黄色葡萄球菌(S.aureus)、猪葡萄球菌(S.hyicus)。

第三方面，本发明提供所述N6衍生肽在制备抗毒血症药物或组合物中的应用。

第四方面，本发明提供由所述N6衍生肽制备的治疗细菌(特别是革兰氏阴性菌)感染的抗菌药物或组合物。

第五方面，本发明提供由所述N6衍生肽制备的抗毒血症(特别是由革兰氏阴性菌所致毒血症)药物或组合物。

本发明对N6NH₂的抗菌活性、血清稳定性、pH稳定性、溶血性、细胞毒性和体内外药效进行了评价，结果表明N6NH₂与母体肽N6的MIC值相同，其血清稳定性与N6相当；N6NH₂比N6具有更强的耐酸性、更低的溶血性和细胞毒性；在小鼠毒血症模型的试验中能够显著提高小鼠的存活率，4μmol/kg N6NH₂对致死剂量大肠杆菌攻毒小鼠的存活率为100％，明显高于等当量的N6(80％)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过对抗菌肽N6分子结构进行优化设计，得到衍生肽N6NH₂。实验证明N6NH₂对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果。羧基末端的酰胺化使得衍生肽N6NH₂的耐酸性(pH＝2)比N6提高了3.1％；在浓度为256μg/mL时，N6NH₂的溶血性比N6下降了1.5％；在128μg/mL时，N6NH₂的细胞毒性比N6下降了6.2％。小鼠毒血症动物试验结果表明4μmol/kg N6NH₂比N6的治疗效果提高了20％；N6NH₂分子量小，人工合成方便，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物，具有良好的应用前景。此外，本发明为新型抗菌药物的创制提供理论参考依据。

附图说明

图1为本发明衍生肽N6NH₂的质谱图。

图2为本发明实施例3中对衍生肽N6NH₂的血清稳定性测定结果。

图3为本发明实施例3中衍生肽N6NH₂的pH稳定性测定结果。

图4为本发明实施例4中衍生肽N6NH₂的溶血性测定结果。

图5为本发明实施例5中衍生肽N6NH₂的细胞毒性测定结果。

图6为本发明实施例6中对毒血症小鼠的保护实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 N6NH₂衍生肽的设计与合成

1、以N6母体肽序列为基础，通过对抗菌肽N6的羧基末端酰胺化，增加一个正电荷用以提高抗菌肽的抗菌活性。

2、用固相合成法，通过十二通道半自动多肽合成仪进行合成。反向高效液相色谱C18柱测定合成肽纯度(>90％)，ESI-MS质谱确认衍生肽N6NH₂的分子量(图1)。

实施例2衍生肽N6NH₂的抑菌实验

本实施例中的病原菌均来自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、美国模式培养物集存库(ATCC)及猪场临床分离株系，具体菌株如表1所示。

抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC，minimum inhibitory concentration)的测定参照临床和实验室标准协会(CLSI，Clinical andLaboratory Standards Institute)制定的方法(WIEGAND等，Agar and broth dilution methods to determine the minimalinhibitory concentration(MIC)of antimicrobial substances.Nature protocols,2008,3(2):163-175)，根据具体情况略有改动，操作细节如下：

受试菌株的单菌落挑至MH液体培养基中，37℃250rpm振荡过夜培养活化后，转接至MH液体培养基中培养至对数生长期(OD_600nm＝0.4～0.6)，然后制备成1×10⁵CFU/mL的菌液，加入96孔无菌细胞培养板内，每孔90μL。

用PBS通过2倍倍比稀释法对抗菌肽N6NH₂进行稀释，每孔10μL，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/mL，阴性对照组为PBS代替抗菌肽的受试菌液，空白对照组为无菌MH培养基。每个处理3个平行样。

将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16～18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，能够完全抑制细菌生长的最低浓度即为抗菌肽对受试菌株的MIC值。若出现跳孔或平行样间结果不一致情况，则重新测试。

结果如表1所示，抗菌肽N6NH₂对大肠杆菌、沙门氏菌的MIC值为2～8μg/mL；对铜绿假单胞菌的MIC值为64μg/mL；对金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌的MIC值为8～32μg/mL，表明N6NH₂对革兰氏阴性菌和阳性菌均表现出不同程度的抑菌效果。

表1抗菌肽N6NH₂的MIC值测定

注：a为天津猪场临床分离株系。

实施例3衍生肽N6NH₂的血清稳定性、耐酸性检测

分别将50μL的N6或N6NH₂(50μM)，在pH为2、4、6、8和10处理3h或置于25％血清中37℃孵育4h。测定处理后的肽溶液对E.coli CVCC195的抗菌活性，采用抑菌圈试验进行对比；用标准尺子测量抑菌圈的直径，记录绘图(图2、图3)。

结果显示，N6和N6NH₂在血清或不同pH值溶液中孵育不同时间后的抑菌圈直径几乎无明显变化；在pH＝2时，N6NH₂的耐酸性比N6提高了3.1％。因此N6NH₂具有与N6同样的血清稳定性及更强的耐酸稳定性。

实施例4衍生肽N6NH₂的溶血性测定

通过测定红细胞在破裂后释放的血红素的含量间接判断药物的溶血毒性大小。取6周龄SPF级的ICR雌鼠(购自北京维通利华试验动物有限公司)，肝素钠抗凝管收集眼球取血。将血液离心10min(4℃，1500rpm)，用无菌生理盐水洗涤3次。将肽样品用生理盐水稀释至终浓度为256～0.5μg/mL，加入96孔板，再加入8％红细胞悬浮液，置于37℃孵育1h；4℃，1500rpm离心5min后，吸取上清后使用酶标仪在540nm下检测其紫外吸光值。每个浓度重复3次；生理盐水和0.1％Triton X-100分别作为阴性对照和阳性对照。溶血率计算公式如下：

溶血率(％)＝[(OD_肽-OD_生理盐水)/(OD_阳性对照-OD_生理盐水)]×100％

结果表明，浓度在1～128μg/mL范围时，N6和N6NH₂对血红细胞几乎不产生破坏作用(图4)；N6和N6NH₂在256μg/mL时溶血性分别为1.9％和0.4％，这说明N6NH₂具有比N6更低的溶血性。

实施例5衍生肽N6NH₂的细胞毒性测定

通过MTT法(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴)检测N6NH₂对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。将RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板上(2.5×10⁴个细胞/孔)，在培养箱中培养24h(5％CO₂，37℃)后去除培养基，并用PBS冲洗两次后加入肽溶液(终浓度依次为1～128μg/mL)培养24h，用PBS同样处理后的细胞作为对照组，所有处理组重复6次。按照上述方法去除残余的培养基后加入5mg/mL MTT，继续培养4h后去除MTT液体，加入150μL DMSO后于振荡器振荡至96孔板孔底的结晶完全溶解，使用酶标仪在570nm波长处检测吸光度(OD值)。细胞存活率的计算公式为：

细胞存活率(％)＝OD_肽/OD_{阴性对照组}×100％

通过药物对RAW264.7细胞的存活率的影响来评价它们对哺乳动物正常组织细胞的毒害程度。结果如图5所示，N6和N6NH₂在128μg/mL时的细胞存活率分别为88.2％和94.4％，这说明N6NH₂具有比N6更低的细胞毒性。

实施例6衍生肽N6NH₂对大肠杆菌诱导的小鼠毒血症的治疗效果

选取20g SPF级ICR小鼠，将42只小鼠分为7组，每组6只，腹腔注射半对数期的E.coli CVCC195(0.5×10⁹CFU/mL，1mL/只)。分别在攻毒0.5h、8h注射药物(4μmol/kg体重)，连续7天观察小鼠存活情况，并绘制存活曲线。

小鼠存活率如图6所示，在未治疗对照组中，小鼠的存活率为0％；在肽治疗组中，同剂量下N6NH₂对毒血症小鼠的保护能力明显高于N6。4μmol/kg N6NH₂和N6治疗组的小鼠存活率分别为100％、80％。因此，N6NH₂比N6具有更高的体内活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> N6衍生肽的应用

<130> KHP181118139.3

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Ala Trp Asn Val Cys Val Tyr Arg Asn Gly Val Arg Val Cys

1 5 10 15

His Arg Arg Ala Asn

20

Claims (5)

1.N6衍生肽在制备治疗细菌感染的抗菌药物或组合物中的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阴性菌，包括埃希氏菌属(Escherichia)细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌；

其中，所述N6衍生肽是由序列如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽N6的羧基末端经酰胺化得到的。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌，包括葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)。

5.N6衍生肽在制备抗毒血症药物或组合物中的应用，其中，所述N6衍生肽的定义同权利要求1中所述。