CN110354078B - 一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物及其制备方法,属于微生物制药技术领域。为解决白色念珠菌形成的生物被膜阻碍药物透过、降低药效的问题,本发明提供了一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,所含药物成分包括血链球菌素、胶原短肽、维生素、薄荷脑、冰片和木糖醇。本发明组合物为粘性凝胶敷料,能够长时间粘附于粘膜患处,使更多药物成分穿透白色念珠菌的生物被膜而发挥药效,解决了现有剂型作用时间短的问题。血链球菌素以纳米级脂质体形式均匀分散在粘性凝胶敷料中,更易穿透生物被膜而直接作用于白色念珠菌菌体,药效发挥的更彻底,能够快速达到降低白色念珠菌粘附力,抑制并杀灭白色念珠菌的效果。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药技术领域,尤其涉及一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物及其制备方法。
背景技术
白色念珠菌是一种常见的条件致病菌,在机体各项机能正常的前体条件下,致病菌是不会引起疾病的,但如果口腔菌群平衡遭到破坏或机体免疫力降低,白色念珠菌会在口腔黏膜下甚至是深层部分过度生长,导致机体感染白色念珠菌。近年来,由于免疫抑制剂、广谱抗生素的使用以及严重全身系统性疾病等免疫功能低下的患者数量不断增加,导致条件致病真菌引起的感染病例逐年上升,且致病真菌对现有抗真菌药逐渐产生了耐药性,使得真菌感染易发生而难控制。
口腔念珠菌病是由念珠菌感染所引起的口腔黏膜疾病,按其主要病变部位可分为:念珠菌口炎、念珠菌唇炎与口角炎、慢性黏膜皮肤念珠菌病。急性伪膜型口腔念珠菌病患者口腔黏膜会出现白色伪膜,刮去伪膜后会出现充血发红的创面,患者会有口干、烧灼的感觉。白色伪膜即为白色念珠菌形成的生物被膜,是一个微生物聚集群体,是微生物不可逆地与组织表面接触,由自身产生的细胞外基质包裹着活菌细胞形成的微生态,其具有高度耐药性,是相对于单个分散游离状态真菌细胞而言的另一种独特的微生物生存方式。
典型的白色念珠菌形成的生物被膜为基底数层酵母样细胞黏附于组织表面,其上方由细胞外基质覆盖,内有大量菌丝样细胞生长。细胞外基质形成的机械屏障起到阻碍药物透过生物被膜作用于白色念珠菌的作用,尤其是现有的喷剂、搽剂等剂型,施于患处后不能长时间停留在患处表面,尚未透过生物被膜起到药物作用就被唾液稀释或冲散,不能充分的发挥药效。因此,以生物被膜形式生长并表现出高度耐药性给口腔念珠菌病的临床治疗带来了很大难度。
发明内容
为解决白色念珠菌形成的生物被膜阻碍药物透过、降低药效的问题,本发明提供了一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物及其制备方法。
本发明的技术方案:
一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,该组合物为粘性凝胶敷料,血链球菌素以纳米级脂质体形式均匀分散在所述粘性凝胶敷料中,该组合物主要包括如下质量份的组分:血链球菌素2~3份、PBS缓冲溶液6~9份、吐温800.5~1份、聚乳酸-羟基乙酸共聚物10~15份、胶原短肽1~5份、维生素B51~3份、薄荷脑1~3份、冰片1~2份、木糖醇2~5份、N-羟基琥珀酰亚胺0.5~1份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1~2份、多巴胺1.5~3份和质量浓度为2~5%的透明质酸钠水溶液100份。
进一步的,该组合物主要包括如下质量份的组分:血链球菌素3份、PBS缓冲溶液9份、吐温801份、聚乳酸-羟基乙酸共聚物15份、胶原短肽3份、维生素B52份、薄荷脑2份、冰片1份、木糖醇3份、N-羟基琥珀酰亚胺1份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2份、多巴胺3份和质量浓度为5%的透明质酸钠水溶液100份。
进一步的,所述血链球菌素脂质体的粒径为200~500nm,所述血链球菌素脂质体中血链球菌素的载药量为10~11%。
一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,将培养液置于4℃条件下离心收集、洗涤菌体沉淀;
将所得菌体分散于PBS缓冲溶液中制成菌悬液,冰水浴条件下对菌悬液进行超声细胞破碎,4℃条件下离心收集细胞破碎液上清液;
向所得细胞破碎液上清液中加入硫酸铵使上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度并将其置于4℃盐析,所得第一盐析液于4℃离心,分别获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管,将第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再次加入硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析,所得第二盐析液于4℃离心,收集离心第二盐析沉淀,将所述第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到血链球菌素,于-80℃保存备用;
步骤二、制备血链球菌素脂质体:
将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙酸乙酯按一定体积比混合均匀,形成油相;将步骤一所得血链球菌素、吐温-80加入PBS缓冲溶液中,混合均匀形成水相;按一定体积比将水相滴入油相并经高压乳匀在一定压力下形成微乳液,乙酸乙酯挥发后即得到纳米级血链球菌素脂质体;
步骤三、制备含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物:
向质量浓度为2~5%的透明质酸钠水溶液加入步骤二所得血链球菌素脂质体、胶原短肽、维生素B5、薄荷脑、冰片、木糖醇,搅拌12h后加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,充分搅拌反应得到透明质酸基质,在惰性气体保护下向所得混合溶液中滴加盐酸多巴胺水溶液,搅拌反应18~24h,得到凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物。
进一步的,步骤一所述离心收集菌体沉淀是以12000g/min离心30min,所述洗涤菌体是将离心收集到的菌体用1×PBS缓冲溶液振荡洗涤,再以12000g/min离心30min收集菌体,重复洗涤三次。
进一步的,步骤一所述菌悬液的菌体浓度为50mg/mL,所述超声破碎的频率为20~25KHz,超声功率为150W,超声时工作时间为4s,间歇时间为8s,共处理30min,所述离心收集细胞破碎上清液的离心条件为15000g/min离心45min。
进一步的,步骤一所述盐析时间均为12h,所述第一盐析液和第二盐析液的离心条件均为15000g/min离心45min,所得血链球菌素的纯度为89.7%。
进一步的,步骤二所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的质量比为1:1,聚乳酸-羟基乙酸共聚物的平均分子量为5000~15000;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙酸乙酯的体积比为1:10~12。
进一步的,步骤二所述水相与油相的体积比为1:10~15,所述水相滴入油相的过程是在300r/min持续搅拌的状态下进行,且滴加完成后继续搅拌3~5h;所述高压乳匀的压力为500bar,处理时间为20min,所述血链球菌素脂质体的粒径为200~500nm,所述血链球菌素脂质体的载药量为10~11%。
进一步的,步骤三所述搅拌转速均为800~1000r/min,所述加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐后的搅拌时间为30min,所述惰性气体为氮气,所得凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物中血链球菌素的载药量为1.5~2.0%。
本发明的有益效果:
本发明提供的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物以血链球菌素为主要抗真菌成分,胶原短肽和微生物B5用于促进患处伤口的愈合、辅助患处黏膜的恢复,薄荷脑和冰片用于缓解患者口干、灼热的的症状,木糖醇作为甜味剂用于改善组合物的味道。
本发明将组合物设计成粘性凝胶敷料,由于多巴胺发生自聚合并与透明质酸相交联所形成的敷料粘性较高,能够长时间的牢固粘附于粘膜患处,使更多分散于凝胶敷料中的药物成分穿透白色念珠菌的生物被膜而发挥药效,因此解决了现有喷剂等剂型易被唾液稀释、冲走而作用时间短的问题。本发明凝胶敷料能够在患处形成保水性薄膜,进一步缓解口干、灼热的症状。本发明所用制备凝胶的材料均为可降解材料,降解产物安全无毒,还可以为口腔黏膜提供一定的营养。
本发明将血链球菌素制备成脂质体,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为囊,将血链球菌素包封于囊内,增加了血链球菌素的活性和稳定性,提高其生物利用度。聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性、可降解且降解产物安全无毒。本发明进一步将血链球菌素制备成纳米级脂质体,使其更容易穿透白色念珠菌的生物被膜,直接作用于被生物被膜所包裹的菌体,使血链球菌素的药效发挥的更彻底,能够快速达到降低白色念珠菌的粘附力,抑制并杀灭白色念珠菌的效果。以此同时,聚乳酸-羟基乙酸共聚物囊层的逐步降解起到缓释作用,可以延长本发明组合物的药效期。
本发明制备方法简单,工艺温和,为口腔念珠菌病的治疗提供了一种全新的给药方式,能够缩短口腔念珠菌病的病程,减轻患者痛苦,为念珠菌感染的治疗开拓了新的思路。
附图说明
图1为动物实验中A组、B组、C组和D组在给药0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h时实验小鼠口腔中白色念珠菌菌落数的变化对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,该组合物为粘性凝胶敷料,血链球菌素以纳米级脂质体形式均匀分散在所述粘性凝胶敷料中,主要包括如下质量份的组分:血链球菌素2~3份、PBS缓冲溶液6~9份、吐温800.5~1份、聚乳酸-羟基乙酸共聚物10~15份、胶原短肽1~5份、维生素B51~3份、薄荷脑1~3份、冰片1~2份、木糖醇2~5份、N-羟基琥珀酰亚胺0.5~1份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1~2份、多巴胺1.5~3份和质量浓度为2~5%的透明质酸钠水溶液100份。
本实施例中血链球菌素与PBS缓冲溶液、吐温80及聚乳酸-羟基乙酸共聚物共同组成血链球菌素脂质体,该脂质体中血链球菌素的载药率为10~11%;血链球菌素脂质体与胶原短肽、维生素B5、薄荷脑、冰片及木糖醇均匀分散在由透明质酸钠水溶液、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及多巴胺制成的凝胶基质中。本实施例组合物为凝胶敷料状,其中血链球菌素的载药量为1.5~2.0%。
实施例2
本实施例提供了一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,该组合物为粘性凝胶敷料,血链球菌素以纳米级脂质体形式均匀分散在所述粘性凝胶敷料中,主要包括如下质量份的组分:血链球菌素3份、PBS缓冲溶液9份、吐温801份、聚乳酸-羟基乙酸共聚物15份、胶原短肽3份、维生素B52份、薄荷脑2份、冰片1份、木糖醇3份、N-羟基琥珀酰亚胺1份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2份、多巴胺3份和质量浓度为5%的透明质酸钠水溶液100份。
本实施例中血链球菌素与PBS缓冲溶液、吐温80及聚乳酸-羟基乙酸共聚物共同组成血链球菌素脂质体,该脂质体中血链球菌素的载药率为10.7%;血链球菌素脂质体与胶原短肽、维生素B5、薄荷脑、冰片及木糖醇均匀分散在由透明质酸钠水溶液、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及多巴胺制成的凝胶基质中。本实施例组合物为凝胶敷料状,其中血链球菌素的载药量为2.0%。
实施例3
本实施例提供了一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,将培养液置于4℃条件下离心收集、洗涤菌体沉淀;
将所得菌体分散于PBS缓冲溶液中制成菌悬液,冰水浴条件下对菌悬液进行超声细胞破碎,4℃条件下离心收集细胞破碎液上清液;
向所得细胞破碎液上清液中加入硫酸铵使上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度并将其置于4℃盐析,所得第一盐析液于4℃离心,分别获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管,将第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再次加入硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析,所得第二盐析液于4℃离心,收集离心第二盐析沉淀,将所述第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到血链球菌素,于-80℃保存备用;
步骤二、制备血链球菌素脂质体:
将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙酸乙酯按一定体积比混合均匀,形成油相;将步骤一所得血链球菌素、吐温-80加入PBS缓冲溶液中,混合均匀形成水相;按一定体积比将水相滴入油相并经高压乳匀在一定压力下形成微乳液,乙酸乙酯挥发后即得到纳米级血链球菌素脂质体;
步骤三、制备含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物:
向质量浓度为2~5%的透明质酸钠水溶液加入步骤二所得血链球菌素脂质体、胶原短肽、维生素B5、薄荷脑、冰片、木糖醇,搅拌12h后加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,充分搅拌反应得到透明质酸基质,在惰性气体保护下向所得混合溶液中滴加盐酸多巴胺水溶液,搅拌反应18~24h,得到凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物。
本实施例中胶原短肽、维生素B5、薄荷脑、冰片、木糖醇、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、多巴胺和透明质酸钠等原料使用任意品牌的医用级或食用级市售成品均可。
实施例4
本实施例与实施例3的区别仅在于,本实施例步骤一提取血链球菌素的方法为:
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,采用低温高速离心机在4℃条件下,以12000g/min离心30min后,缓慢取出离心筒并弃除上清液,收集菌体沉淀,用1×PBS缓冲溶液洗涤菌体,再以12000g/min离心30min,重复洗涤三次。
将收集到的菌体沉淀分散于PBS缓冲溶液中,得到菌体浓度为50mg/mL的菌悬液,用超声细胞破碎机在冰水浴中对菌悬液进行细胞破碎,超声波频率为20~25KHz,超声波功率150W,超声波的工作时间4s,间歇时间为8s,共处理30min。将所得细胞破碎液于4℃下,15000g/min低温离心45min,得到细胞破碎液上清液。
在冰水浴条件下,向所得细胞破碎液上清液中加入硫酸铵并将其搅拌溶解,使细胞破碎液上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度,将所得细胞破碎上清液置于4℃条件下盐析12h;得到第一盐析液。
将第一盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管;将第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再加入硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析12h得到第二盐析液。
将第二盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第二盐析上清液和第二盐析沉淀,将第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到纯度为89.5~89.7%的血链球菌素,于-80℃保存备用。血链球菌素中含有一定量的杂质蛋白,不影响血链球菌素的药效。
本实施例利用二次盐析法使血链球菌细胞破碎液中的血链球菌素完全析出,提取效率高、所制备的血链球菌素纯度高。已有研究证实血链球菌素可能通过以下五种方式抑制以白色念珠菌为代表的致病念珠菌:
①血链球菌素可能导致细胞膜结构的破坏、形成孔性通道,释放出菌体内小分子物质和大分子物质。②血链球菌素可能破坏麦角固醇的形成,从而使菌体胞膜框架变得不牢固,加大胞膜的流动性。③血链球菌素可能黏附到菌体的细胞壁并和其中的自溶酶结合,将自溶酶激活并释放,最终使细胞自溶。④念珠菌菌丝的胞壁蛋白1(hyphal wallprotein1,Hwp1)在白色念珠菌黏附以及毒力方面有促进功能,因此血链球菌素可能减少Hwp1的合成。⑤凝集素样序列(agglutinin-like sequence,Als 1p和Als 5p)可能与白色念珠菌黏附力息息相关,血链素可能导致Als 1p和Als 5p的改变,从而降低C.a的黏附性。
实施例5
本实施例与实施例4的区别仅在于,本实施例步骤二制备血链球菌素脂质体的方法为:
将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙酸乙酯按体积比1:10~12混合均匀,即10~15份聚乳酸-羟基乙酸共聚物与100~150份乙酸乙酯形成油相。本实施例使用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的质量比为1:1,聚乳酸-羟基乙酸共聚物的平均分子量为5000~15000。
将步骤一所得血链球菌素2~3份溶解于6~9份PBS缓冲溶液中,再加入0.5~1份吐温80并使之分散于缓冲溶液中形成水相。
在300r/min持续搅拌的状态下按体积比1:10~15将所得水相逐滴滴入油相中,滴加完成后继续搅拌3~5h,将所获得的溶液在500bar条件下高压乳匀处理20min形成微乳液,减压蒸馏使乙酸乙酯挥发干净,得到纳米级血链球菌素脂质体,其粒径为200~500nm,脂质体中血链球菌素的载药量为10~11%。
本实施例以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为囊,将血链球菌素包封于囊内,增加了血链球菌素的活性和稳定性,提高其生物利用度。聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性、可降解且降解产物安全无毒。
将血链球菌素制备成纳米级脂质体,使其更容易穿透白色念珠菌的生物被膜,直接作用于被生物被膜所包裹的菌体,使血链球菌素的药效发挥的更彻底,能够快速达到降低白色念珠菌的粘附力,抑制并杀灭白色念珠菌的效果。以此同时,聚乳酸-羟基乙酸共聚物囊层的逐步降解起到缓释作用,可以延长本发明组合物的药效期。
实施例6
本实施例与实施例5的区别仅在于,本实施例步骤三、制备含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的方法为:
向质量浓度为2~5%的透明质酸钠水溶液100份中加入步骤二制备的血链球菌素脂质体、1~5份胶原短肽、1~3份维生素B5、1~3份薄荷脑、1~2份冰片和2~5份木糖醇,800r/min搅拌12h,向混合体系中加入0.5~1份N-羟基琥珀酰亚胺和1~2份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,800r/min继续搅拌30min得到透明质酸基质,在氮气保护下向所得透明质酸基质中加入1.5~3份盐酸多巴胺水溶液,800r/min搅拌18~24h得到凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,该组合物中血链球菌素的载药量为1.5~2.0%。
本实施例以透明质酸钠为主要原料制备凝胶基质,使药物成分均匀分散于凝胶基质后,利用多巴胺发生自聚合并与透明质酸相交联所形成凝胶敷料,所得凝胶敷料粘性较高,能够长时间的牢固粘附于粘膜患处,使更多分散于凝胶敷料中的药物成分穿透白色念珠菌的生物被膜而发挥药效,因此解决了现有喷剂等剂型易被唾液稀释、冲走而作用时间短的问题。本发明凝胶敷料能够在患处形成保水性薄膜,进一步缓解口干、灼热的症状。本发明所用制备凝胶的材料均为可降解材料,降解产物安全无毒,还可以为口腔黏膜提供一定的营养。
实施例7
本实施例提供了一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
本实施例所用血链球菌(Streptococcus sanguinis)菌株ATCC10556购自四川华西口腔医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
复苏S.s菌种ATCC10556:以三区划线法接种于哥伦比亚培养基上,于37℃厌氧培育48h后取出进行传代。
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,采用低温高速离心机在4℃条件下,以12000g/min离心30min后,缓慢取出离心筒并弃除上清液,收集菌体沉淀,用1×PBS缓冲溶液洗涤菌体,再以12000g/min离心30min,重复洗涤三次。
将收集到的菌体沉淀分散于252mLPBS缓冲溶液中,得到菌体浓度为50mg/mL的菌悬液,用超声细胞破碎机在冰水浴中对菌悬液进行细胞破碎,超声波频率为20~25KHz,超声波功率150W,超声波的工作时间4s,间歇时间为8s,共处理30min。将所得细胞破碎液于4℃下,15000g/min低温离心45min,得到258mL细胞破碎液上清液。
在冰水浴条件下,向所得细胞破碎液上清液中加入96.272g硫酸铵并将其搅拌溶解,使细胞破碎液上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度,将所得细胞破碎上清液置于4℃条件下盐析12h;得到第一盐析液。
将第一盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管;将275mL第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再加入17.687g硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析12h得到第二盐析液。
将第二盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第二盐析上清液和第二盐析沉淀,将第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到纯度为89.7%的血链球菌素,于-80℃保存备用。
步骤二、制备血链球菌素脂质体:
10份聚乳酸-羟基乙酸共聚物与100份乙酸乙酯形成油相。本实施例使用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的质量比为1:1,聚乳酸-羟基乙酸共聚物的平均分子量为5000~15000。
将步骤一所得血链球菌素2份溶解于6份PBS缓冲溶液中,再加入0.5份吐温80并使之分散于缓冲溶液中形成水相。
在300r/min持续搅拌的状态下将所得水相逐滴滴入油相中,滴加完成后继续搅拌3~5h,将所获得的溶液在500bar条件下高压乳匀处理20min形成微乳液,减压蒸馏使乙酸乙酯挥发干净,得到纳米级血链球菌素脂质体,其粒径为200~500nm,脂质体血链球菌素的载药量为10.8%。
步骤三、制备含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物:
向质量浓度为2%的透明质酸钠水溶液100份中加入步骤二制备的血链球菌素脂质体、1份胶原短肽、1份维生素B5、1份薄荷脑、1份冰片和2份木糖醇,800r/min搅拌12h,向混合体系中加入0.5份N-羟基琥珀酰亚胺和1份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,800r/min继续搅拌30min得到透明质酸基质,在氮气保护下向所得透明质酸基质中加入1.5份盐酸多巴胺水溶液,800r/min搅拌18~24h得到凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,该组合物中血链球菌素的载药量为1.57%。
实施例8
本实施例提供了一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
本实施例所用血链球菌(Streptococcus sanguinis)菌株ATCC10556购自四川华西口腔医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
复苏S.s菌种ATCC10556:以三区划线法接种于哥伦比亚培养基上,于37℃厌氧培育48h后取出进行传代。
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,采用低温高速离心机在4℃条件下,以12000g/min离心30min后,缓慢取出离心筒并弃除上清液,收集菌体沉淀,用1×PBS缓冲溶液洗涤菌体,再以12000g/min离心30min,重复洗涤三次。
将收集到的菌体沉淀分散于252mLPBS缓冲溶液中,得到菌体浓度为50mg/mL的菌悬液,用超声细胞破碎机在冰水浴中对菌悬液进行细胞破碎,超声波频率为20~25KHz,超声波功率150W,超声波的工作时间4s,间歇时间为8s,共处理30min。将所得细胞破碎液于4℃下,15000g/min低温离心45min,得到258mL细胞破碎液上清液。
在冰水浴条件下,向所得细胞破碎液上清液中加入96.272g硫酸铵并将其搅拌溶解,使细胞破碎液上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度,将所得细胞破碎上清液置于4℃条件下盐析12h;得到第一盐析液。
将第一盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管;将275mL第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再加入17.687g硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析12h得到第二盐析液。
将第二盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第二盐析上清液和第二盐析沉淀,将第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到纯度为89.7%的血链球菌素,于-80℃保存备用。
步骤二、制备血链球菌素脂质体:
15份聚乳酸-羟基乙酸共聚物与150份乙酸乙酯形成油相。本实施例使用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的质量比为1:1,聚乳酸-羟基乙酸共聚物的平均分子量为5000~15000。
将步骤一所得血链球菌素3份溶解于9份PBS缓冲溶液中,再加入1份吐温80并使之分散于缓冲溶液中形成水相。
在300r/min持续搅拌的状态下将所得水相逐滴滴入油相中,滴加完成后继续搅拌5h,将所获得的溶液在500bar条件下高压乳匀处理20min形成微乳液,减压蒸馏使乙酸乙酯挥发干净,得到纳米级血链球菌素脂质体,其粒径为200~500nm,脂质体中血链球菌素的载药量为10.7%。
步骤三、制备含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物:
向质量浓度为5%的透明质酸钠水溶液100份中加入步骤二制备的血链球菌素脂质体、5份胶原短肽、3份维生素B5、3份薄荷脑、2份冰片和5份木糖醇,800r/min搅拌12h,向混合体系中加入1份N-羟基琥珀酰亚胺和2份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,800r/min继续搅拌30min得到透明质酸基质,在氮气保护下向所得透明质酸基质中加入3份盐酸多巴胺水溶液,800r/min搅拌18~24h得到凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,该组合物中血链球菌素的载药量为1.97%。
实施例9
本实施例提供了一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
本实施例所用血链球菌(Streptococcus sanguinis)菌株ATCC10556购自四川华西口腔医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
复苏S.s菌种ATCC10556:以三区划线法接种于哥伦比亚培养基上,于37℃厌氧培育48h后取出进行传代。
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,采用低温高速离心机在4℃条件下,以12000g/min离心30min后,缓慢取出离心筒并弃除上清液,收集菌体沉淀,用1×PBS缓冲溶液洗涤菌体,再以12000g/min离心30min,重复洗涤三次。
将收集到的菌体沉淀分散于252mLPBS缓冲溶液中,得到菌体浓度为50mg/mL的菌悬液,用超声细胞破碎机在冰水浴中对菌悬液进行细胞破碎,超声波频率为20~25KHz,超声波功率150W,超声波的工作时间4s,间歇时间为8s,共处理30min。将所得细胞破碎液于4℃下,15000g/min低温离心45min,得到258mL细胞破碎液上清液。
在冰水浴条件下,向所得细胞破碎液上清液中加入96.272g硫酸铵并将其搅拌溶解,使细胞破碎液上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度,将所得细胞破碎上清液置于4℃条件下盐析12h;得到第一盐析液。
将第一盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管;将275mL第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再加入17.687g硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析12h得到第二盐析液。
将第二盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第二盐析上清液和第二盐析沉淀,将第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到纯度为89.7%的血链球菌素,于-80℃保存备用。
步骤二、制备血链球菌素脂质体:
12份聚乳酸-羟基乙酸共聚物与120份乙酸乙酯形成油相。本实施例使用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的质量比为1:1,聚乳酸-羟基乙酸共聚物的平均分子量为5000~15000。
将步骤一所得血链球菌素2.5份溶解于7.5份PBS缓冲溶液中,再加入0.8份吐温80并使之分散于缓冲溶液中形成水相。
在300r/min持续搅拌的状态下将所得水相逐滴滴入油相中,滴加完成后继续搅拌5h,将所获得的溶液在500bar条件下高压乳匀处理20min形成微乳液,减压蒸馏使乙酸乙酯挥发干净,得到纳米级血链球菌素脂质体,其粒径为200~500nm,脂质体中血链球菌素的载药量为10.9%。
步骤三、制备含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物:
向质量浓度为3%的透明质酸钠水溶液100份中加入步骤二制备的血链球菌素脂质体、3份胶原短肽、2份维生素B5、2份薄荷脑、2份冰片和3份木糖醇,800r/min搅拌12h,向混合体系中加入1份N-羟基琥珀酰亚胺和2份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,800r/min继续搅拌30min得到透明质酸基质,在氮气保护下向所得透明质酸基质中加入2份盐酸多巴胺水溶液,800r/min搅拌18~24h得到凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,该组合物中血链球菌素的载药量为1.78%。
对比例1
本对比例制备的一种含有血链球菌素的喷剂,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
本实施例所用血链球菌(Streptococcus sanguinis)菌株ATCC10556购自四川华西口腔医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
复苏S.s菌种ATCC10556:以三区划线法接种于哥伦比亚培养基上,于37℃厌氧培育48h后取出进行传代。
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,采用低温高速离心机在4℃条件下,以12000g/min离心30min后,缓慢取出离心筒并弃除上清液,收集菌体沉淀,用1×PBS缓冲溶液洗涤菌体,再以12000g/min离心30min,重复洗涤三次。
将收集到的菌体沉淀分散于252mLPBS缓冲溶液中,得到菌体浓度为50mg/mL的菌悬液,用超声细胞破碎机在冰水浴中对菌悬液进行细胞破碎,超声波频率为20~25KHz,超声波功率150W,超声波的工作时间4s,间歇时间为8s,共处理30min。将所得细胞破碎液于4℃下,15000g/min低温离心45min,得到258mL细胞破碎液上清液。
在冰水浴条件下,向所得细胞破碎液上清液中加入96.272g硫酸铵并将其搅拌溶解,使细胞破碎液上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度,将所得细胞破碎上清液置于4℃条件下盐析12h;得到第一盐析液。
将第一盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管;将275mL第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再加入17.687g硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析12h得到第二盐析液。
将第二盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第二盐析上清液和第二盐析沉淀,将第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到纯度为89.7%的血链球菌素,于-80℃保存备用。
步骤二、制备含有血链球菌素的喷剂
将2g血链球菌素溶于98mL无菌水中,震荡混匀制成载药量为2%的喷剂。
动物实验
(一)实验材料
白色念珠菌:C.glabrata菌株ATCC15126,购自上海复祥生物科技有限公司,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
昆明小鼠60只,雌雄各半,6~8周,重量20±2g,由东北农业大学提供。
(二)实验方法
将60只昆明小鼠随机分成4组,每组15只,即实施例7制备的载药量为1.57%的凝胶敷料-A组,实施例8制备的载药量为1.97%的凝胶敷料-B组,对比例1制备的载药量为2%的喷剂-C组和空白对照-D组。
在4组小鼠的饮用水中加入阿莫西林使其浓度达到1%,两周后水中阿莫西林浓度姜维0.1%直至实验结束。由于小鼠单侧颊部黏膜面积较小,约为4mm×4mm,因此以小鼠整个右侧颊部黏膜为观察对象。每天腹腔注射5%水合氯醛用以麻醉小鼠,随后用无菌小油画笔蘸取浓度为1×109CFU/mL的白色念珠菌菌悬液50μL,在小鼠口腔右侧颊部黏膜涂抹三下,每隔3天用无菌探针轻划小鼠口腔右侧颊部黏膜3下,以不划破黏膜为基准,持续4周,至小鼠右侧颊部黏膜形成白色斑片状生物被膜。
每组各任意选出一只完成建模的小鼠,临床观测到小鼠口腔右侧颊部黏膜上出现白色的斑片状损害,用棉签使劲擦掉后能看到充血严重的红色溃烂面。杀死后取右侧颊部涂菌处黏膜固定、脱水、包埋和切片,常规的进行HE染色和PAS染色。在病变严重处取其分泌物涂片,经过革兰氏染色,光镜下看到酵母样孢子。取病变处做病理学探查发现,PAS染色可见基底层上方有大量菌丝和孢子,固有层中有为数不多的慢性炎症细胞浸润,建模成功。
在建模成功的小鼠中,通过腹腔注射5%水合氯醛用以麻醉小鼠,将实施例7制备的载药量为1.57%的凝胶敷料,实施例8制备的载药量为1.97%的凝胶敷料分别涂抹至A组、B组小鼠的右侧颊部黏膜,覆盖住右侧颊部黏膜即可,将对比例1制备的载药量为2%的喷剂至C组小鼠的右侧颊部黏膜,将0.9%的生理盐水涂抹至D组小鼠的右侧颊部黏膜,1次/d,持续三天,每12h取样检测小鼠口腔白色念珠菌菌落数。
(三)实验结果
四组给药处理小鼠口腔白色念珠菌菌落数变化情况如图1所示:由图1可以看出,A组血链球菌素载药量为1.57%的凝胶敷料处理的小鼠和B组血链球菌素载药量为1.97%的凝胶敷料处理的小鼠口腔内的白色念珠菌数量下降较快,24小时内菌落数量分别下降了44%和70%,这说明凝胶敷料中的纳米级血链球菌素脂质体能够快速穿透白色念珠菌形成的生物被膜,脂质体囊层降解后将血链球菌素直接释放至生物被膜下的白色念珠菌处,给药72h后A组、B组小鼠口腔内的白色念珠菌数量分别下降了96%和98%。
而C组小鼠在喷施对比例1制备的喷剂72h后口腔内的白色念珠菌数量下降了42%,不及实施例7、8凝胶敷料药效的一半。这是由于凝胶敷料中的多巴胺发生自聚合并与透明质酸相交联所形成的敷料粘性较高,能够长时间的牢固粘附于粘膜患处,使更多分散于凝胶敷料中的药物成分穿透白色念珠菌的生物被膜而发挥药效。
同时,三次给药后穿透白色念珠菌生物被膜的血链球菌素脂质体积累在粘膜患处,通过缓释作用不断释放出血链球菌素;而对比文件1的血链球菌素喷施在患处受白色念珠菌生物被膜的屏障作用而不易穿透生物被膜层,因而尚未到达病灶就被小鼠唾液稀释冲淡了,能够起到药效的血链球菌素有限,因此治疗效果不及凝胶敷料显著。
由此可见,本发明凝胶敷料中的血链球菌素更容易穿透白色念珠菌的生物被膜,直接作用于被生物被膜所包裹的白色念珠菌菌体,使血链球菌素的药效发挥的更彻底,能够快速达到降低白色念珠菌的粘附力,抑制并杀灭白色念珠菌的效果。
Claims (9)
1.一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,其特征在于,该组合物为粘性凝胶敷料,血链球菌素以纳米级脂质体形式均匀分散在所述粘性凝胶敷料中,血链球菌素脂质体的粒径为200~500nm,所述血链球菌素脂质体中血链球菌素的载药量为10~11%;该组合物主要包括如下质量份的组分:血链球菌素2~3份、PBS缓冲溶液6~9份、吐温80 0.5~1份、聚乳酸-羟基乙酸共聚物10~15份、胶原短肽1~5份、维生素B51~3份、薄荷脑1~3份、冰片1~2份、木糖醇2~5份、N-羟基琥珀酰亚胺0.5~1份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1~2份、多巴胺1.5~3份和质量浓度为2~5%的透明质酸钠水溶液100份。
2.根据权利要求1所述一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物,其特征在于,该组合物主要包括如下质量份的组分:血链球菌素3份、PBS缓冲溶液9份、吐温80 1份、聚乳酸-羟基乙酸共聚物15份、胶原短肽3份、维生素B52份、薄荷脑2份、冰片1份、木糖醇3份、N-羟基琥珀酰亚胺1份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2份、多巴胺3份和质量浓度为5%的透明质酸钠水溶液100份。
3.一种如权利要求1或2所述含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,将培养液置于4℃条件下离心收集、洗涤菌体沉淀;
将所得菌体分散于PBS缓冲溶液中制成菌悬液,冰水浴条件下对菌悬液进行超声细胞破碎,4℃条件下离心收集细胞破碎液上清液;
向所得细胞破碎液上清液中加入硫酸铵使上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度并将其置于4℃盐析,所得第一盐析液于4℃离心,分别获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管,将第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再次加入硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析,所得第二盐析液于4℃离心,收集离心第二盐析沉淀,将所述第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到血链球菌素,于-80℃保存备用;
步骤二、制备血链球菌素脂质体:
将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙酸乙酯按一定体积比混合均匀,形成油相;将步骤一所得血链球菌素、吐温-80加入PBS缓冲溶液中,混合均匀形成水相;按一定体积比将水相滴入油相并经高压乳匀在一定压力下形成微乳液,乙酸乙酯挥发后即得到纳米级血链球菌素脂质体;
步骤三、制备含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物:
向透明质酸钠水溶液加入步骤二所得血链球菌素脂质体、胶原短肽、维生素B5、薄荷脑、冰片、木糖醇,搅拌12h后加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,充分搅拌反应得到透明质酸基质,在惰性气体保护下向所得混合溶液中滴加盐酸多巴胺水溶液,搅拌反应18~24h,得到凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物。
4.根据权利要求3所述一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,其特征在于,步骤一所述离心收集菌体沉淀是以12000g/min离心30min,所述洗涤菌体是将离心收集到的菌体用1×PBS缓冲溶液振荡洗涤,再以12000g/min离心30min收集菌体,重复洗涤三次。
5.根据权利要求3或4所述一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,其特征在于,步骤一所述菌悬液的菌体浓度为50mg/mL,所述超声破碎的频率为20~25KHz,超声功率为300W,超声时工作时间为4s,间歇时间为8s,共处理30min,所述离心收集细胞破碎上清液的离心条件为15000g/min离心45min。
6.根据权利要求5所述一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,其特征在于,步骤一所述盐析时间均为12h,所述第一盐析液和第二盐析液的离心条件均为15000g/min离心45min。
7.根据权利要求6所述一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,其特征在于,步骤二所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的质量比为1:1,聚乳酸-羟基乙酸共聚物的平均分子量为5000~15000;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与乙酸乙酯的体积比为1:10~12。
8.根据权利要求7所述一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,其特征在于,步骤二所述水相与油相的体积比为1:10~15,所述水相滴入油相的过程是在300r/min持续搅拌的状态下进行,且滴加完成后继续搅拌3~5h;所述高压乳匀的压力为500bar,处理时间为20min。
9.根据权利要求8所述一种含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物的制备方法,其特征在于,步骤三所述搅拌转速均为800~1000r/min,所述加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐后的搅拌时间为30min,所述惰性气体为氮气,所得凝胶敷料状的含有血链球菌素的抗白色念珠菌组合物中血链球菌素的载药量为1.5~2.0%。
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CN110354078A (zh) | 2019-10-22 |
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PB01 | Publication | ||
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