CN109954005B

CN109954005B - 脆弱拟杆菌提取物在制备防治过敏性皮炎的组合物中的应用

Info

Publication number: CN109954005B
Application number: CN201711359935.9A
Authority: CN
Inventors: 智发朝; 刘洋洋; 王晔; 王从峰; 白杨; 郑丽君
Original assignee: Guangzhou Zhiyi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Zhiyi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN109954005A

Abstract

本发明涉及脆弱拟杆菌提取物在制备防治过敏性皮炎的药物或食品中的应用，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。本发明的发明人发现含有荚膜多糖A的脆弱拟杆菌提取物具有预防/治疗过敏性皮炎的功能，为临床提供了一种适合人体服食的防治过敏性皮炎的良品。

Description

脆弱拟杆菌提取物在制备防治过敏性皮炎的组合物中的应用

技术领域

本发明涉及脆弱拟杆菌的应用技术领域，特别是涉及一种脆弱拟杆菌提取物在制备防治过敏性皮炎的组合物中的应用。

背景技术

过敏性皮炎是机体受抗原性物质(也称过敏原)，如花粉、粉尘、食物、药物、寄生虫等刺激皮肤后，引起的皮肤炎症，属于变态反应性疾病。当过敏原首次进入人体，过敏体质的免疫系统对该种过敏原产生记忆，当过敏原再次进入体内，过敏体质的免疫系统认出后发生强烈反应，引起肥大细胞和嗜碱性细胞的细胞膜破裂，释放组胺、5-羟色胺、慢反应物质等过敏反应介质，过敏反应介质与皮肤血管黏膜相结合，导致皮肤出现红斑、皮疹、瘙痒等不适症状。

能引起过敏性皮炎的刺激物种类诸多，主要有动物性、植物性、化学性三种:(1)动物性的过敏原包括各种动物皮毛和毒素，某些动物如蜂类、水母、恙、螨、蝶、蛾等。(2)植物性的过敏原主要指有些植物的叶、茎、花、果或其产物等，如漆树、橡树、芥子、巴豆、大蒜、荨麻、除虫菊等。(3)化学性物质，绝大多数过敏性皮炎均系化学刺激物引起，如药物、染料、洗涤剂、油类、化妆品、化学纤维、塑料制品、化工原料、避孕用具、表带、染甲油等。

在临床上常见的过敏性皮炎可表现为红斑，水肿略隆起或伴有少数米粒大小的红色水肿性丘疹，有的仅表现为局部红斑，水肿不明显，有的还可为湿疹样改变，有糠粃样鳞屑，伴有瘙痒。

在过敏性皮炎的处理中，应首先找到可能的过敏原，去除病因，而后进行治疗。外用药物的选择根据皮损的情况而定。轻度红斑、皮疹而无渗液时，可选用炉甘石洗剂，能起到不错的止痒效果。在局部皮损红肿且伴有明显渗液时，可选用湿敷的方法。当皮炎至亚急性阶段，可使用少量副作用小的皮质类固醇，或非皮质类固醇霜剂，清热解毒的中医药制剂也可应用。内服药物以止痒、脱敏为宗旨，抗组胺类药物能阻滞人嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放炎症介质，因而成为首选。第一代该类药物因有嗜睡、口干、体重增加等副作用而逐渐不被使用，第二代该类药物中个别药物影响心肝肾功能，临床也极为慎用。

脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)是革兰氏阴性厌氧细菌中拟杆菌属的成员，属于拟杆菌门，完全不同于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等。拟杆菌属有25个菌种，仅来自人类的有10个菌种，仅来自动物的有10个菌种，来自人和动物的有5个菌种。脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌，依培养基的不同和生长阶段的不同，菌体形态呈现多形性，一般条件下菌体为杆状、两端钝圆、着色深，中间色浅且不均匀，有荚膜、无芽胞、无动力，有些有空泡，菌体长短不一。依据能否合成、分泌脆弱拟杆菌肠毒素(BFT)可将其分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis，ETBF)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌(Nontoxigenic Bacteroides fragilis，NTBF)。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中。此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。脆弱拟杆菌作为一种条件致病菌，当宿主粘膜受损时，可侵犯粘膜下层，引起感染，也可经血液流动，引起身体其它器官，如肠道、腹腔、肝、肺、脑组织、软组织、骨髓等的化脓性感染并伴发脓肿。

发明内容

基于此，本发明提供了一种脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)提取物的新应用。

具体技术方案如下：

脆弱拟杆菌提取物在制备防治过敏性皮炎的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。

所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂。所述药物包括人用药或动物用药，可用于人或动物。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为2-110KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为5-95KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为5-85KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为5-75KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为40-95KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为40-85KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为40KD-75KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为60-80KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为65-75KD。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物中脆弱拟杆菌荚膜多糖A的含量为60-75wt％。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物的制备方法包括以下步骤：

(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心沉淀，收集第一沉淀物，取所述第一沉淀物加入65-72℃的水，溶解后再加入苯酚溶液，保持65-72℃搅拌25-35min，离心，收集第一上清液；

(2)将步骤(1)中收集的第一上清液用乙醚萃取去除苯酚，再去除残留的乙醚，收集水相溶液；

(3)在步骤(2)中收集到的水相溶液中加入无水乙醇至乙醇的终浓度为75-85v/v％，醇沉，离心，收集第二沉淀物；

(4)取所述第二沉淀物，加水配制成混悬液，再调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。

在其中一些实施例中，步骤(1)中在所述第一沉淀物中加入的水、所述苯酚溶液以及所述第一沉淀物的配比为3-5mL：3-5mL：1g；所述苯酚溶液的质量浓度为70-80％；及/或，

步骤(3)所述醇沉为在0-8℃的温度下醇沉8-16小时。

在其中一些实施例中，步骤(4)包括：取所述第二沉淀物，加水配制成质量浓度为8-12％的混悬液，再加入质量浓度为8-12％的冰乙酸水溶液，加热至沸，搅拌反应1.5-2.5小时，调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物的制备方法还包括降解的步骤：将步骤(4)中得到的脆弱拟杆菌提取物通过超声的方法进行降解，所述超声的条件为：180-210kHz，15-25℃。

本发明还提供了一种防治过敏性皮炎的脆弱拟杆菌提取物或者药物。

具体技术方案如下：

一种防治过敏性皮炎的脆弱拟杆菌提取物或者药物，所述药物中含有所述脆弱拟杆菌提取物，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A。

所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂。所述药物包括人用药或动物用药，可用于人或动物。所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A可以作为治疗方法单独或与其它益生菌和/或益生材料或药用辅料制备成药物组合物一起给药。这种组合可以以单一制剂或分开的制剂，同时或不同时，使用相同或不同的给药途径进行给药。优选包含药用可接受载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。所述药用可接受载体或稀释剂是药物领域内公知的。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以考虑预期的给药途径和标准药学实践来做出选择。该药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除它们以外的任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂。

药用可接受载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、单脂肪酸甘油酯和二脂肪酸甘油酯、石化(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

在适当的情况下，所述药物组合物可以通过以下任何一种或多种方式给药：吸入给药、以栓剂或阴道栓剂的形式给药；以洗剂、溶液剂、乳膏剂、软膏剂或喷粉的形式局部给药、通过使用皮肤贴剂给药、以含有诸如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂的形式或者以单独或与赋形剂混合在胶囊或卵状小体中的形式口服给药、或以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或混悬剂形式给药，或者它们可以进行肠胃外注射，例如海绵体内、静脉内、肌内或皮下注射给药。为了肠胃外给药，所述组合物最好可以以无菌水溶液形式使用，其可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖以使得该溶液与血液等渗。为了含服或舌下给药，所述组合物可以以常规方法配制的片剂或锭剂的形式给药。

可能存在取决于不同给药系统的不同的组合物/制剂要求。举例来说，本发明的药物组合物可以配制成使用微型泵或通过诸如鼻腔喷雾剂或吸入型气雾剂或可吸收溶液剂的粘膜途径进行给药，或者将所述组合物配制成可注射形式通过例如静脉内、肌内或皮下途径进行肠胃外给药。或者，所述制剂可以设计成通过两种途径给药。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为5KD-95KD。

在其中一些实施例中，步骤(1)中在所述第一沉淀物中加入的水、所述苯酚溶液以及所述第一沉淀物的配比为3-5mL：3-5mL：1g；所述苯酚溶液的质量浓度为70-80％。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述醇沉为在0-8℃的温度下醇沉8-16小时。

本发明的脆弱拟杆菌ZY-312，已于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的发明人经过长期经验积累以及大量创造性实验研究，发掘了脆弱拟杆菌新的用途，开拓了一个新的应用领域。发明人通过大量实验研究获得了脆弱拟杆菌提取物(主要成分为荚膜多糖A)，并且意想不到地发现含有荚膜多糖A的脆弱拟杆菌提取物具有很好防治过敏性皮炎的功效。

进一步地，发明人通过对脆弱拟杆菌荚膜多糖A进行降解，获得了一系列不同分子量的脆弱拟杆菌荚膜多糖A。并且通过进一步的实验研究意外地发现分子量为5～95KD(尤其是70KD)的荚膜多糖A具有更好的防治过敏性皮炎的功效。

本发明提供的脆弱拟杆菌提取物，对机体没有副作用，可以进行预防性给药，或者作为治疗方法单独或与其它益生菌和/或益生材料一起给药，本发明提供的脆弱拟杆菌提取物具有很好的食用和药用前景，为临床提供了一种适合人体服食的防治过敏性皮炎的良品。

附图说明

图1为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；

图2为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；

图3为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的1H谱；

图4为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的13C谱；

图5为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的COSY谱；

图6为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的HSQC谱；

图7为实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的HMBC谱图；

图8为实施例1制备得到的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的化学结构式。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

以下实施例中所用的脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY-312(bacteroides fragilisZY-312)，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1脆弱拟杆菌提取物的制备

(1)脆弱拟杆菌的发酵培养

将菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。

菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm之间，参见图1。

显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。

选取单个菌落接种于胰蛋白胨肉汤中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物。

(2)脆弱拟杆菌提取物的制备

脆弱拟杆菌提取物的制备，包括以下步骤：

1)取脆弱拟杆菌菌泥(上述步骤(1)获得的沉淀物)200g，加入68℃超纯水750mL，溶解后，再加入体积分数为75％苯酚溶液750mL，混合均匀，保持68℃搅拌萃取30min，15000g离心20min，取得上层液体。

2)上层液体用等体积乙醚(1.5L)萃取去除苯酚，收集上层液体，重复萃取至无苯酚残留。水浴加热去除乙醚，收集水相。

3)水相15000g离心20min后测定体积，加入无水乙醇，至乙醇终浓度为80％(体积分数)，4℃醇沉过夜(12小时)，15000g离心20min，取沉淀。

4)称量步骤3)中获得的沉淀的质量，加入一定体积的去离子水将沉淀配制成质量浓度为10％的混悬液，搅拌混合均匀，加入质量浓度为10％的冰乙酸水溶液，加热至沸，持续搅拌反应2h后，调节pH至7.0，15000g离心20min，收集沉淀。将所得上清液透析除盐(10KD透析袋)，冷冻干燥，得到脆弱拟杆菌提取物。

5)称量30mg步骤4)所述的脆弱拟杆菌提取物，溶于0.5mL D2O，加入1μl丙酮(1H，2.22；13C，30.89)定标。采用500MHz Bruker核磁共振波谱仪分析1H、13C、COSY、HSQC、HMBC谱(图3-图7)，确证步骤4)收集的脆弱拟杆菌提取物为荚膜多糖A，纯度约为70％。通过GPC(凝胶渗透色谱)分析，结果显示上述荚膜多糖A的重复单元分子量为781，单元重复数目n值为89，分子量约为70KD，分子式为-[C₃₁N₃O₂₀H₄₇]₉₁-，化学结构见图8。

(3)不同分子量大小荚膜多糖A的制备

本实施例通过对(2)中制备的荚膜多糖进行降解，所述的降解方法包括但不限于化学降解法、物理降解法和生物降解法。本实施例采用超声的方法得到不同分子量大小的荚膜多糖A，所述超声方法为将荚膜多糖A于195kHz，20℃的条件分别处理3小时、2小时、0.5小时和0小时，分别收集得到分子量大小为2KD、5KD、40KD、70KD的荚膜多糖A。

(4)分子量为110KD荚膜多糖A的制备

使用(2)的方法从脆弱拟杆菌NCTC 9343(购自美国ATCC)中提取得到。

实施例2脆弱拟杆菌提取物对过敏性皮炎BALB/c小鼠模型的影响

一、实验设计

本实施例用于证实实施例1提供的脆弱拟杆菌提取物(荚膜多糖A的分子量为70KD)预防/治疗过敏性皮炎的作用。

实验动物及分组：本实施例60只BALB/c小鼠，雌雄各半，每只实验用小鼠均分配有一个唯一编号。在对动物进行分组之前，应在鼠笼的标签上标注项目编号、种属/品系、性别、笼号及动物号。使用BioBook软件根据BALB/c小鼠的初始体重进行随机分组6组，即正常组(Group1)，模型组(Group2)，地塞米松组(Group3)，脆弱拟杆菌提取物低(Group4)、中(Group5)、高(Group6)剂量组，每组BALB/c小鼠10只。

BALB/c小鼠过敏性皮炎模型构建：

参照《药理实验方法学》，用DNFB丙酮橄榄油溶液(丙酮-橄榄油4∶1)致敏和激发小鼠皮肤建立小鼠过敏性接触性皮炎(ACD)模型。BALB/c小鼠正常饲养于SPF屏障系统内1周，于实验前1天腹部脱毛,范围约3cm×3cm,模型组(Group2)、地塞米松组(Group3)、脆弱拟杆菌提取物低(Group4)、中(Group5)、高(Group6)剂量组小鼠于实验第1天脱毛部位均匀涂以1％DNFB丙酮橄榄油溶液50μL致敏,实验第2天重复强化致敏1次。实验第5天,小鼠双耳各均匀涂1％DNFB丙酮橄榄油溶液10μL进行激发。正常组(Group1)小鼠在相同部位仅涂以丙酮橄榄油溶液(丙酮-橄榄油4∶1)作对照。

于激发当日开始给药，Group3给于地塞米松、Group4给于低剂量的脆弱拟杆菌提取物、Group5给于中剂量的脆弱拟杆菌提取物，Group6给于高剂量的脆弱拟杆菌提取物，正常组与模型组在相同部位仅涂以丙酮橄榄油溶液(丙酮-橄榄油4∶1)。具体实验分组和给药方案见表1：

表1实验分组和给药方案

观察指标及判定：

小鼠耳肿胀度：在激发前及激发后24h以游标卡尺测量测定小鼠双侧厚度耳肿胀度＝激发后厚度-激发前厚度。对激发后耳水肿红斑程度进行评分,无红斑0分,轻微可见红斑1分,中度红斑2分,严重红斑3分,水肿性红斑4分；无水肿0分,轻度水肿1分,中度水肿2分,严重水肿3分。小鼠经30mg/kg的舒泰麻醉后，取直径为5mm的小鼠耳朵称量。

数据以

表示,用SPSS 13.0软件进行统计分析,组间比较采用ANOVA One-way检验和SNK-q检验。

二、结果与分析

脆弱拟杆菌提取物对过敏性皮炎小鼠的影响结果见表2。

表2脆弱拟杆菌提取物对过敏性皮炎小鼠的影响

注:与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。

通过观察发现，小鼠耳部经1％DNFB丙酮橄榄油溶液激发后，整个耳部逐渐出现充血肿胀，小鼠搔抓明显，与对照组Group1比较，模型Group2中真皮层明显水肿增厚，血管扩张，表现出典型过敏性皮炎症状，说明造模成功。

从表2可以看出，脆弱拟杆菌提取物高、中剂量组耳肿胀度、肿胀度评分、红斑评分以及耳重等症状均明显低于模型组(P＜0.01)，与地塞米松组(Group3)对照组相当；脆弱拟杆菌提取物低剂量组症状积分低于模型组(P＜0.05)。说明本发明提供的脆弱拟杆菌提取物可有效减轻过敏性皮炎的症状，对过敏性皮炎具有良好的预防/治疗效果。

实施例3不同分子量的脆弱拟杆菌荚膜多糖A对过敏性皮炎的疗效

本实施例参考实施例2的方法制备小鼠过敏性皮炎动物模型，然后分别使用本发明实施例1制备得到的2KD、5KD、40KD、70KD、110KD的脆弱拟杆菌荚膜多糖A对1％DNFB丙酮橄榄油诱导的小鼠过敏性皮炎进行预防/治疗，检测不同分子量的脆弱拟杆菌荚膜多糖A对过敏性皮炎的治疗效果。本实施例以高剂量的2KD、5KD、40KD、70KD和110KD的脆弱拟杆菌荚膜多糖A为例。

参照实施例2的实验组分组方法，将小鼠分为Group1(正常对照组)、Group2(模型组)、Group3(地塞米松组，即阳性对照组)、2KD组、5KD组、40KD组、70KD组以及110KD组。

给药方案参照实施例2

表3实验分组和给药方案

参考实施例2的方法观察小鼠的耳肿胀度、肿胀度评分、红斑评分、耳重，具体结果见表4：

表4不同分子量脆弱拟杆菌提取物对过敏性皮炎小鼠的影响

从上表可以看出本发明提供的分子量为5KD、40KD、70KD、110KD的脆弱拟杆菌荚膜多糖A表现出了显著的抑制1％DNFB丙酮橄榄油诱导的小鼠过敏性皮炎的药效,具体表现在其显著地降低了过敏性皮炎导致的耳肿胀、红斑评分及耳重，详见表4。与2KD组、5KD组和110KD组相比，40KD组、70KD组在降低过敏性皮炎导致耳肿胀评分、红斑评分及耳重表现出更好的活性，P＜0.05，统计学差异显著。

实施例4脆弱拟杆菌提取物对炎症因子的影响

本实施例分别检测实施例2中各组小鼠耳组织裂解物中炎症因子IFN-γ和TNF-α和Ig E。取每只小鼠50μg的鼠耳组织进行裂解，通过流式细胞小球阵列试剂盒(美国BD公司，生产批号：557800)标记后，用流式细胞仪测定裂解物中细胞因子IFN-γ和TNF-α和Ig E的含量。具体检测结果见表3：

表3脆弱拟杆菌提取物对炎症因子的影响

注:与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。

从表3结果可以看出，模型组Group2小鼠耳组织经1％DNFB丙酮橄榄油溶液激发后，炎症因子IFN-γ和TNF-α和Ig E水平明显高于正常组Group1(P＜0.01)；脆弱拟杆菌提取物低剂量组Group 4小鼠炎症因子IFN-γ和TNF-α和Ig E水平明比模型组Group2的低(P＜0.05)，差异显著，具有统计学意义。而经脆弱拟杆菌提取物中(Group5)、高(Group6)剂量处理后，小鼠炎症因子IFN-γ和TNF-α和Ig E水平均明显低于模型组(P＜0.01)，具有统计学意义。

由上述结果可知，本发明提供的脆弱拟杆菌提取物可以有效减轻过敏性皮炎的症状，同时能有效抑制组织炎症因子IFN-γ和TNF-α和Ig E的释放，对过敏性皮炎具有很好的预防/治疗效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.脆弱拟杆菌提取物在制备防治过敏性皮炎的药物中的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物中含有脆弱拟杆菌荚膜多糖A，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，所述脆弱拟杆菌ZY-312于2015 年4 月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的分子量为65-75KD。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A，其分子式为-[C₃₁N₃O₂₀H₄₇]₉₁-。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物中脆弱拟杆菌荚膜多糖A的含量为60-75wt%。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌ZY-312 在血平皿上培养48h 后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm。

6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心沉淀，收集第一沉淀物，取所述第一沉淀物加入65-72℃的水，溶解后再加入苯酚溶液，保持65-72℃搅拌25-35min，离心，收集第一上清液；

（2）将步骤（1）中收集的第一上清液用乙醚萃取去除苯酚，再去除残留的乙醚，收集水相溶液；

（3）在步骤（2）中收集到的水相溶液中加入无水乙醇至乙醇的终浓度为75-85v/v%，醇沉，离心，收集第二沉淀物；

（4）取所述第二沉淀物，加水配制成混悬液，再调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1）中在所述第一沉淀物中加入的水、所述苯酚溶液以及所述第一沉淀物的配比为3-5mL：3-5mL：1g；所述苯酚溶液的质量浓度为70-80%；及/或，

步骤（3）所述醇沉为在0-8℃的温度下醇沉8-16小时。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（4）包括：取所述第二沉淀物，加水配制成质量浓度为8-12%的混悬液，再加入质量浓度为8-12%的冰乙酸水溶液，加热至沸，搅拌反应1.5-2.5小时，调节pH为6.5-7.5，离心，收集第二上清液，透析除盐，冷冻干燥，即得所述脆弱拟杆菌提取物。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物的制备方法还包括降解的步骤：将步骤（4）中得到的脆弱拟杆菌提取物通过超声的方法进行降解，所述超声的条件为：180-210kHz，15-25℃。