CN110251538B - 瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用。本发明首次公开了瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，通过体外抗菌实验表明，石油菜瑶药提取物具有显著抑制肺炎克雷伯杆菌和肺炎链球菌等细菌生长的作用，通过石油菜对肺炎克雷伯菌感染小鼠的治疗作用试验，测定各炎症因子的含量及肺指数证明，瑶药石油菜提取物对肺炎克雷伯感染小鼠引起的肺炎具有治疗作用；可作为天然的抗菌药物，应用于克雷伯杆菌感染引起的肺炎治疗，从而为由克雷伯杆菌感染引起的肺炎的治疗提供了新途径。

Description

瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药 物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用。
背景技术
瑶药石油菜为荨麻科植物波缘冷水花Pilea cavaleriei H. Lév.的全草，别名石花菜、肥奴奴草,小石芥、冷冻草、疳积草，石苋菜、肥猪菜、打不死、石凉菜、青蛙腿，分布在广西、广东、贵州、湖南等地。生于石山阴处，多见于海拔300-1500米的山坡林下石上。全年均可采收，洗净，鲜用或晒干。微苦，性凉；归肺、脾经。清肺止咳，利水消肿，解毒止痛。主治肺热咳嗽，肺结核，肾炎水肿，烧烫伤，跌打损伤，疮疖肿毒。从瑶医理论的角度上讲，石油菜既具风类药的功能，又具打类药的特性，是风打相兼类的瑶药。
目前，瑶药石油菜的化学成分研究方面有一些文献报道。任恒春等用硅胶、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20等色谱技术分离纯化化合物，并通过理化性质及波谱技术鉴定化合物结构，得到包含以倍半萜及其衍生物、木脂素类化合物在内共计128种化合物。在瑶药石油菜的药理作用研究方面也有文献报道。李丽芬等研究发现石油菜具有相对较强的灭虫（柑桔粉虱、萝卜蚜）活性，多应用于治疗急性呼吸衰竭、肺癌、肺结核、小儿大叶性肺炎等中药复方制剂中。石油菜是广西一味道地药材，是瑶药中一种重要药材，具有清肺止咳，利水消肿，解毒止痛之功效。用于肺热咳嗽，肺结核，肾炎水肿，烧烫伤，跌打损伤，疮疖肿毒，药效好但波动大。目前，人们对瑶药石油菜的化学成分有一定的研究，但还不够深入，特别是针对石油菜的药理药效研究较少，且没有对其化学成分及药理作用的系统性报道，导致对石油菜药用价值被低估。因此，瑶药石油菜在药物开发方面具有很大的研究空间，可进一步深入研究和开发应用，挖掘其有效成分。
肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物所致。肺炎按解剖可分为大叶性肺炎、小叶性肺炎和间质性肺炎；按病因可分为细菌性肺炎、非典型病原体所致肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、其他病原体所致肺炎以及理化因素所致的肺炎；按患病环境分为社区获得性肺炎和医院获得性肺炎。
细菌性肺炎是临床最常见的肺炎，也是常见的感染性疾病之一，发病率非常高，而且不容易治愈，更主要的是该病给患者的身体带来很大伤害，如果不能及时治疗或者治疗不当，不仅会加重病情的发展，还有可能引发其他疾病的发生，甚至引起死亡。细菌性肺炎是肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、军团菌等菌感染所引起的疾病，该病在儿童、老年人和免疫缺陷患者中病死率极高。近年来，抗生素的大量使用导致细菌耐药率增高，使得细菌性肺炎的治疗面临无药可治的局面。
在细菌性肺炎中，克雷伯杆菌肺炎是由于一种常见的病原菌叫克雷伯菌引起的肺部炎症，是肺炎类型中的一种。肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95%以上；存在于正常人的肠道和呼吸道，亦存在于水和谷物中；在免疫低下以及接受手术和侵袭性医源性操作的人群易罹患本属细菌感染，亦是社区获得性肺炎和医院获得性肺炎的常见病原体。肺炎克雷伯菌是最常见的产超广谱β-内酰胺酶( ESBL )细菌，具有较高的交叉耐药和多重耐药性，对一般的抗生素有一定的耐药性。
目前为止，国内外未见采用瑶药石油菜提取物用于治疗由克雷伯杆菌感染引起的肺炎的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种瑶药石油菜提取物的新应用。
具体地，提供一种瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌（Klebsiella Pneumoniae）感染引起的肺炎药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜为荨麻科植物波缘冷水花Pilea cavaleriei H. Lév.的全草。
上述的瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述药物是以瑶药石油菜提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上可接受的剂型。所述药学上可接受的剂型，包括片剂，胶囊剂，颗粒剂，滴丸剂或口服溶液剂。
上述的瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜提取物为瑶药石油菜水提物或水提醇沉物，瑶药石油菜水提物或水提醇沉物的提取方法，包括以下步骤：
（1）取石油菜药材备用，加入药材重量10-12倍的水，浸泡30-35 min后，加热煮沸50-60分钟，200目滤布过滤，得到滤液；
（2）滤渣中加入原药材重量8-10倍的水，再加热煮沸50-60分钟，200目滤布过滤，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，即得到瑶药石油菜水提物；
（3）或者将步骤（2）中合并得到的滤液浓缩至80 ℃下相对密度为 1.08-1.15，然后按1:1的体积比，在滤液中加入体积浓度为80-90%的乙醇，密封、于4℃下冷藏24 h以上，抽滤，滤液挥干至无醇味，浓缩成稠膏，即可得到石油菜瑶药水提醇沉物。
本发明的有益效果为：
本发明首次公开了瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用。经过试验证明，石油菜瑶药提取物具有清热解毒、抑菌止咳等功效，通过体外抗菌实验表明，石油菜瑶药提取物具有显著抑制肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌等细菌生长的作用。通过石油菜对肺炎克雷伯菌感染小鼠的治疗作用试验，测定各炎症因子的含量及肺指数证明，石油菜水提物能显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠肺系数增加、显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠血清中TNF-α增加、IL-1β增加以及IL-10增加；实验表明，瑶药石油菜提取物对肺炎克雷伯菌感染小鼠引起的肺炎具有治疗作用；可作为天然的抗菌药物，应用于克雷伯杆菌感染引起的肺炎治疗，从而为由克雷伯杆菌（Klebsiella Pneumoniae）感染引起的肺炎的治疗提供了新途径。
附图说明
图1为石油菜水提物不同剂量组对对克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠肺系数的影响（
Figure 404108DEST_PATH_IMAGE001
）；
图2为石油菜水提物不同剂量组对克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中 TNF-α的影响（
Figure 253859DEST_PATH_IMAGE001
）；
图3为石油菜水提物不同剂量组对克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中 IL-1β 的影响（
Figure 698747DEST_PATH_IMAGE001
）；
图4为石油菜水提物不同剂量组对克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中 IL-6 的影响（
Figure 426400DEST_PATH_IMAGE001
）；
图5为石油菜水提物不同剂量组对克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中 IL-10 的影响（
Figure 273133DEST_PATH_IMAGE002
）。
具体实施方式
实施例1
一种瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜为荨麻科植物波缘冷水花Pilea cavaleriei H. Lév.的全草；所述药物是以瑶药石油菜提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上可接受的剂型；所述药学上可接受的剂型，包括片剂，胶囊剂，颗粒剂，滴丸剂或口服溶液剂。
上述的瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜提取物为瑶药石油菜水提物或水提醇沉物，瑶药石油菜水提物或水提醇沉物的提取方法，包括以下步骤：
（1）取石油菜药材备用，加入药材重量10倍的水，浸泡30 min后，加热煮沸60分钟，200目滤布过滤，得到滤液；
（2）滤渣中加入原药材重量8倍的水，再加热煮沸50分钟，200目滤布过滤，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，即得到瑶药石油菜水提物；
（3）或者将步骤（2）中合并得到的滤液浓缩至80 ℃下相对密度为 1.08-1.15，然后按1:1的体积比，在滤液中加入体积浓度为80%的乙醇，密封、于4℃下冷藏24 h以上，抽滤，滤液挥干至无醇味，浓缩成稠膏，即可得到石油菜瑶药水提醇沉物。
实施例2
一种瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜为荨麻科植物波缘冷水花Pilea cavaleriei H. Lév.的全草；所述药物是以瑶药石油菜提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上可接受的剂型；所述药学上可接受的剂型，包括片剂，胶囊剂，颗粒剂，滴丸剂或口服溶液剂。
上述的瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜提取物为瑶药石油菜水提物或水提醇沉物，瑶药石油菜水提物或水提醇沉物的提取方法，包括以下步骤：
（1）取石油菜药材备用，加入药材重量11倍的水，浸泡32min后，加热煮沸55分钟，200目滤布过滤，得到滤液；
（2）滤渣中加入原药材重量9倍的水，再加热煮沸55分钟，200目滤布过滤，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，即得到瑶药石油菜水提物；
（3）或者将步骤（2）中合并得到的滤液浓缩至80 ℃下相对密度为 1.08-1.15，然后按1:1的体积比，在滤液中加入体积浓度为85%的乙醇，密封、于4℃下冷藏24 h以上，抽滤，滤液挥干至无醇味，浓缩成稠膏，即可得到石油菜瑶药水提醇沉物。
实施例3
一种瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜为荨麻科植物波缘冷水花Pilea cavaleriei H. Lév.的全草；所述药物是以瑶药石油菜提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上可接受的剂型；所述药学上可接受的剂型，包括片剂，胶囊剂，颗粒剂，滴丸剂或口服溶液剂。
上述的瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜提取物为瑶药石油菜水提物或水提醇沉物，瑶药石油菜水提物或水提醇沉物的提取方法，包括以下步骤：
（1）取石油菜药材备用，加入药材重量12倍的水，浸泡35 min后，加热煮沸50分钟，200目滤布过滤，得到滤液；
（2）滤渣中加入原药材重量10倍的水，再加热煮沸60分钟，200目滤布过滤，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，即得到瑶药石油菜水提物；
（3）或者将步骤（2）中合并得到的滤液浓缩至80 ℃下相对密度为 1.08-1.15，然后按1:1的体积比，在滤液中加入体积浓度为90%的乙醇，密封、于4℃下冷藏24 h以上，抽滤，滤液挥干至无醇味，浓缩成稠膏，即可得到石油菜瑶药水提醇沉物。
实施例4
1 瑶药石油菜提取物的急性毒性实验
1.1 实验材料
1.1.1 动物
昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄兼半，（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SCVK（湘）2016-0002）。
实验药物
石油菜药材（SYC-5）
1.2 实验方法
1.2.1 供试品的制备
水提液：称取武鸣石油菜药材500g，加入12倍纯水，浸泡30min后，煎煮1小时，200目滤布过滤，药渣加入10倍量纯水煎煮1小时，滤布过滤，合并滤液，浓缩成稠膏。
水提醇沉液：称取武鸣石油菜药材500 g，加入12倍水，浸泡30min后，煎煮1小时，200目滤布过滤，药渣加入10倍水煎煮1小时，滤布过滤，合并滤液，滤液浓缩至80℃下相对密度为 1.08-1.15，按1:1的比例加入25mL乙醇，密封、4℃冷藏24h，抽滤，滤液挥干至无醇味，浓缩成稠膏。
预实验
取小鼠36只，雌雄各半，分别灌胃给药石油菜水提液和石油菜水提醇沉液，每种药液随机分为6组，每组6只动物，每组组间剂量比值为1：0.5，分别为mg/L。小鼠禁食12小时，分别灌胃给药石油菜水提液和石油菜水提醇沉液，给药容量0.4mL/10g，观察14天，观察指标为死亡数、死亡时间、死亡前症状表现、尸检记录所有病变，给药后4小时内严密观察动物对供试品的反应。
1.2.3 正式实验
1.2.3.1 石油菜水提醇沉液的急性毒性试验
取70只昆明种小鼠，雌雄各半，灌胃给药，随机分为7组，每组10只动物，根据预实验结果，最大给药浓度226.8g（药粉）/kg，按1:0.85依次向下稀释6个浓度。小鼠禁食12小时，一天一次给药容量40mL/kg，观察7天，详细记录动物毒性反应情况，观察指标为死亡数、死亡时间、死亡前症状表现、尸检记录所有病变，给药后4小时内严密观察动物对供试品的反应。
1.2.3.2 石油菜水提液的急性毒性试验
取60只昆明种小鼠，雌雄各半，灌胃给药，随机分为6组，每组10只动物，根据预实验结果，最大给药浓度120.0g（药粉）/kg，按1:0.85依次向下稀释5个浓度。小鼠禁食12小时，一天一次给药容量40 mL/kg，观察14天，详细记录动物毒性反应情况，观察指标为死亡数、死亡时间、死亡前症状表现、尸检记录所有病变，给药后4小时内严密观察动物对供试品的反应。
1.2.4 LD50 计算
用SPSS20.0 软件计算。
1.3 结果
1.3.1 预实验结果
确定石油菜水提液0%及100%动物死亡剂量，即Dn及Dm，分别为120.00g（药粉）/mL及53.24g（药粉）/mL；和石油菜水提醇沉液Dn及Dm分别为266.80g（药粉）/mL及100.62g（药粉）/mL。
1.3.2 石油菜水提醇沉液的急性毒性试验
灌胃给药石油菜水提醇沉液后，动物表现出少动，身体卷缩等反应。动物死亡时间集中在给药后2-5 天，死亡动物及时剖检，主要脏器未发现异常，观察期结束后对存活小鼠剖检，检查肝脏、肾脏、脾、心脏、肺及胃肠等脏器，除肝略暗红外，未见异常。未见异常。结果见表1。
Figure 77141DEST_PATH_IMAGE003
由SPSS20.0 软件计算得：
LD50= 163.257 g（药粉）/kg
LD50 的95%可信限= 147.868-180.595g（药粉）/kg
1.3.3 石油菜水提液的急性毒性试验
灌胃给药石油菜水提液后，动物表现出少动，身体卷缩等反应。动物死亡时间集中在给药后24 h内，死亡动物及时剖检，肝脏显暗红主要脏器未发现异常，观察期结束后对存活小鼠剖检，检查肝脏、肾脏、脾、心脏、肺及胃肠等脏器，除肝略暗红外，未见异常。结果见表2。
Figure 760058DEST_PATH_IMAGE004
由SPSS20.0 软件计算得：
LD50= 73.582g（药粉）/kg
LD50 的95%可信限= 65.055-81.680g（药粉）/kg
1.4 小结与讨论
上述对石油菜的水提液和水提醇沉液，两种提取工艺进行急性毒性实验，发现：石油菜水提液的最小致死量，即MLD为62.64g（药粉）/kg，最大安全量，即MNL为53.24 g（药粉）/kg，半数致死量，即LD50为73.582g（药粉）/kg，动物死亡后解剖发现肝脏暗红；石油菜水提醇沉液的最小致死量，即MLD为118.38g（药粉）/kg，最大安全量，即MNL为100.62g（药粉）/kg，半数致死量，即LD50为163.257g（药粉）/kg，动物死亡后解剖发现大部分肝暗红，其余主要脏器无影响。由此我们得知，石油菜水提醇沉液的毒性比石油菜的水提液的毒性要小得多，由此可见，经过水提醇沉处理的提取液，除了除去等杂质外，还有有可能除去了有毒的水溶性成分。
石油菜体外抑菌实验研究
2.1 材料、试剂及设备
2.1.1 受试菌株
金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌CMCC44102、腐生葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株、金黄色葡萄球菌209、金黄色葡萄球菌26003、伤寒杆菌53075、变形杆菌OX19、大肠埃希氏菌44102、产气荚膜杆菌、白色葡萄球菌、志贺氏菌、变形杆菌49027、克雷伯杆菌ATCC700603，均由微生物免疫学教研室XX老师提供。肺炎链球菌CMCC31001，购买于药检所。
实验药物
同第二部分“1.1.1”项下实验药材
2.1.3 主要仪器及设备
BSA223S型电子天平，SW-CJ-1D型单人净化工作台，UPK-1-10T型超纯水器，TGL-1GM型医用离心机，722型紫外可见光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，LRH-250-S型恒温恒湿生化培养箱，DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱，ZWY-240型恒温培养振荡器，GL-88B型旋涡混合器，HHS型电热恒温水浴锅。
试剂
水解酪蛋白胨（MH）肉汤（广东环凯微生物科技有限公司，3104445），营养琼脂（Nutrient Agar）（广东环凯微生物科技有限公司，1070351），红四氮唑（TTC）（中国华东师范大学化工厂，20130228），生理盐水（辰欣药业股份有限公司，1708290723）；丙三醇（天津市大茂化学试剂厂20170301）。
方法
2.2.1 96孔板微量肉汤稀释法测定水提液及水提醇沉液的3株菌的MIC
2.2.1.1 供试品溶液的制备
水提液：称取武鸣石油菜药材25g，加入12倍纯水，浸泡30min后，煎煮1小时，200目滤布过滤，药渣加入250mL纯水煎煮1小时，滤布过滤，合并滤液，浓缩至50到100mL，转移至蒸发皿中过水浴浓缩至小于25mL，转移至已灭菌的25mL容量瓶中，定容，即得。
水提醇沉液：称取武鸣石油菜药材25g，加入12倍纯水，浸泡30min后，煎煮1小时，200目滤布过滤，药渣加入250mL纯水煎煮1小时，滤布过滤，合并滤液，浓缩至25mL，按1：1的比例加入25mL乙醇，密封、4℃冷藏24h，抽滤，滤液挥干至无醇味，蒸馏水定容至25mL，即得。
培养基的配制
（1）营养琼脂的配置
称取营养琼脂33 g，按比例定容到1000.0 mL，加热溶解，灭菌，备用。
（2）MH肉汤的配置
称取水解酪蛋白胨21g，按比例定容到1000.0 mL，加热溶解，灭菌，备用。
菌株的培养
肺炎链球菌哥伦比亚血平板上挑取单菌落于10mL含10％胎牛血清的MH肉汤，37℃，150r/min振荡培养16h。菌液1500r/min，离心5min，弃去溶液，沉淀加生理盐水配制成４号麦氏浓度，各取配置好的菌液1 mL，加MH肉汤11 mL（肺炎链球菌加到含10％胎牛血清的MH肉汤11 mL），使其菌液浓度为1×108CFU。
的测定
取100μL菌液加入到96孔板中，最终接种量为1.5×105cfu/孔。接种完成后置于振荡器上振荡1min，使各孔细菌分布均匀。然后依次加入各药物100μL，同时设空白孔（100μL生理盐水、100μL MH肉汤），细菌对照孔（100μL菌液、100μL MH肉汤）以及药物对照孔（100μL最低浓度药液、100μL MH肉汤）。按要求往96孔板中加入菌液和药物，然后置于振荡器上振荡1min混匀，用封口膜封边防止孵育过程中水分蒸发，置于37℃恒温箱中孵育18h。每孔加入10mg/mL（1%）氯化三苯四氮唑（TTC）5µL，37℃孵育4h后观察，有细菌生长孔呈红色，不显红色的最低药物浓度为药物对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。
结果
2.3.1 96孔板微量肉汤稀释法测定水提液及水提醇沉液的3株菌的MIC
结果见表3。
Figure 307714DEST_PATH_IMAGE005
2.4 小结与讨论
水提醇沉是有效的去除水提液中淀粉、多糖等杂质的技术手段。通过对比水提液与水提醇沉液对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克雷伯杆菌这四种常见的菌株的MIC，发现醇沉处理的石油菜水提液能达到更好的抑制金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的细菌生长的作用，其中石油菜的水提液对金黄色葡萄球菌的MIC为1000mg/mL，经过醇沉处理后，达到500mg/mL也能达到相同的抑菌效果；石油菜水提液对肺炎练球的MIC为500mg/mL，经过醇沉处理后，在125mg/mL的浓度下也能达到相同的抑菌效果。
结合急性毒性的实验结果，石油菜水提液经过纯化处理，可能具有增加抑菌作用并减毒的作用，为后期深入研究及研究方向提供参考和依据。
石油菜对肺炎克雷伯菌感染小鼠的治疗作用
3.1 材料、试剂及设备
3.1.1 受试菌株
克雷伯杆菌ATCC700603
3.1.2 实验药物
武鸣产地石油菜药材（SYC-5）、左氧氟沙星（广州白云山医药集团股份有限公司，1180029）
3.1.3 主要仪器及设备
同第三部分“2.1.3”项仪器与设备。
试剂
同第三部分“2.1.4”项试剂
3.1.5 实验动物
清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22g。
方法
3.2.1 菌液的制备
培养克雷伯杆菌，用生理盐水调节浓度使其浓度为1×108CFU，备用。
小鼠肺部肺炎克雷伯菌感染模型建立及分组治疗
取72只KM种小鼠，以12只每组的量随机分为空白组、模型组、阳性组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。适应性喂养3天后，开始造模。造模前12h禁食。
小鼠经10%水合氯醛麻醉后，经鼻腔滴入临用临配的克雷伯杆菌菌液50μL，接种后使小鼠保持与桌面垂直的体位30s，以保证菌液因重力作用流入肺组织，接种后置于笼中。4h后，分别按0.2mL/10g的给药溶剂给予空白组生理盐水，给与阳性组1.90mg/mL的左氧氟沙星片溶液，给予高剂量组0.37g/mL石油菜水提液，给予中剂量组0.18g/mL石油菜水提液，给予低剂量组0.12g/mL水提液。
连续给药5天。末次给药后0.5h，处死。取肺组织计算肺系数；眼球取血、分离血清，-20℃冷藏，备用。
实验指标检测
3.2.3.1 肺指数的测定
肺指数=小鼠肺脏湿重（g）/小鼠体重（g）×100%
3.2.3.2 炎症因子的测定
ELISA法测定小鼠染菌后体内IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β炎症因子的水平，按照试剂盒说明书进行测定。
数据处理
数据用
Figure 8954DEST_PATH_IMAGE006
表示，SPSS 20.0统计软件进行方差分析。
实验结果
3.3.1 肺系数
实验结果表明，与空白组比较，模型组肺系数显著增大（p<0.05），表明滴鼻克雷伯杆菌感染小鼠造模成功；高剂量的石油菜水提物能非常显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠肺系数增加（p<0.01），中、低剂量的石油菜水提物均能显著降低肺指数（p<0.05）。结果见表4，图1。
Figure 498710DEST_PATH_IMAGE007
炎症因子测定结果
（1）克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中TNF-α的含量
实验结果表明，与空白组比较，模型组血清中TNF-α显著增大（p<0.05），表明滴鼻克雷伯杆菌感染小鼠造模成功；与模型组比较，高、中、低剂量的石油菜水提物能非常显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠血清中TNF-α增加（p<0.01）。结果见表5，图2。
Figure 652610DEST_PATH_IMAGE008
（2）克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中IL-1β的含量
实验结果表明，与空白组比较，模型组血清中IL-1β显著增大（p<0.05），表明滴鼻克雷伯杆菌感染小鼠造模成功；高剂量的石油菜水提物能非常显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠血清中IL-1β增加（p<0.05）。结果见表6，图3。
Figure 3957DEST_PATH_IMAGE009
（3）克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中IL-6的含量
实验结果表明，与空白组比较，模型组血清中IL-6显著增大（p<0.05），表明滴鼻克雷伯杆菌感染小鼠造模成功；高、中剂量的石油菜水提物能非常显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠血清中IL-6增加（p<0.05）；低剂量的石油菜水提物能非常显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠血清中IL-6增加（p<0.01）。结果见表7，图4。
Figure 330944DEST_PATH_IMAGE010
（4）克雷伯杆菌滴鼻感染小鼠血清中IL-10的含量
实验结果表明，与空白组比较，模型组血清中IL-10显著增大（p<0.05），表明滴鼻克雷伯杆菌感染小鼠造模成功；高、中剂量的石油菜水提物能非常显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠血清中IL-10增加（p<0.05）；
低剂量的石油菜水提物能非常显著降低滴鼻克雷伯杆菌所导致的小鼠血清中IL-10增加（p<0.01）。结果见表8，图5。
Figure 742334DEST_PATH_IMAGE011
小结与讨论
石油菜干品的用量是15-30 g/天，换算成人体（60 kg）给药量为0.25-0.5 g/kg，并且根据体表面积换算可知，相当于小鼠给药量为2.28-4.45 g/kg。由实验结果可知，水提液的LD50为73.582g/kg，《中药药理实验方法学》中针对药效给药剂量的确定主要依据LD50的测定结果，并设定高、中、低剂量为LD50的1/10、1/20、1/30，即2.4527、3.6791、7.3582 g/kg，与换算得的小鼠日常给药量0.25～0.5 g/kg差异不大，因此将高、中、低的剂量设定为2.4527、3.6791、7.3582 g/kg合情合理。
肺炎杆菌是临床上细菌性肺炎感染的主要来源之一，临床有研究显示, 肺炎克雷白杆菌肺炎作为典型肺炎的一种, 在营养不良、慢性支气管肺部疾病患者中比较常见。结合体外抑菌实验结果，石油菜对肺炎克雷伯杆菌的MIC为500mg/mL，与水提醇沉液的MIC无差，且临床及民间的使用以水煎液服用，因此选用水煎液进行动物实验，以期初步探讨石油菜的药效。
TNF-α可以与多种细胞因子相互作用，可与IL-1发生协同作用，激活肺部炎性细胞的核因子kB，诱导产生细胞因子IL-6等；而IL-1β可以刺激多种趋化因子的产生，还有参与修复损伤的肺泡上皮的功能，但主要以促炎作用为主；IL-6是机体创伤和修复过程中的一种重要的急性期反应介质，具有致炎和促炎的作用；IL-10能抑制某些促炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等）的产生。
通过测定各炎症因子的含量及肺指数，石油菜水提液对肺炎肺炎克雷伯菌感染小鼠引起的肺炎具有治疗作用。但部分指标显示不呈量效关系，可能与石油菜的药效物质的含量大小有关。

Claims (3)

1.瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，所述的瑶药石油菜为荨麻科植物波缘冷水花Pilea cavaleriei H. Lév.的全草；
所述的瑶药石油菜提取物为瑶药石油菜水提物或水提醇沉物，瑶药石油菜水提物或水提醇沉物的提取方法，包括以下步骤：
（1）取石油菜药材备用，加入药材重量10-12倍的水，浸泡30-35 min后，加热煮沸50-60分钟，200目滤布过滤，得到滤液；
（2）滤渣中加入原药材重量8-10倍的水，再加热煮沸50-60分钟，200目滤布过滤，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，即得到瑶药石油菜水提物；
（3）或者将步骤（2）中合并得到的滤液浓缩至80 ℃下相对密度为 1.08-1.15，然后按1:1的体积比，在滤液中加入体积浓度为80-90%的乙醇，密封、于4℃下冷藏24 h以上，抽滤，滤液挥干至无醇味，浓缩成稠膏，即可得到石油菜瑶药水提醇沉物。
2.根据权利要求1所述的瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，其特征在于，所述药物是以瑶药石油菜提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上可接受的剂型。
3.根据权利要求2所述的瑶药石油菜提取物在制备治疗克雷伯杆菌感染引起的肺炎药物中的应用，其特征在于，所述药学上可接受的剂型，包括片剂，胶囊剂，颗粒剂，滴丸剂或口服溶液剂。
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