CN111920833A - 茶藨子叶状层菌发酵液在制备治疗免疫因子风暴药物上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及茶藨子叶状层菌发酵液在制备治疗免疫因子风暴药物上的应用。培养基:黄芪麦麸水100g,蛋白胨0.3%,葡萄糖1%,蔗糖1%,玉米浆0.5%,在培养基上培养得到茶藨子叶状层菌发酵液;经非大样本临床试验证明,配合其他综合治疗方法,服用茶藨子叶状层菌发酵液具有抗流感病毒和抗新冠病毒的作用;服用茶藨子叶状层菌发酵液后,增强机体免疫力,抑制体内免疫因子风暴的产生;对于疑似病例,可采用服用茶藨子叶状层菌发酵液对的办法进行预防,做到防患于未然。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及茶藨子叶状层菌发酵液在制备治疗免疫因子风暴药物上的应用。
背景技术
新冠病毒肺炎患者之所以死亡率高于一般的流感患者,原因在于患者体内发生了“炎症因子风暴”,也就是“免疫因子风暴”。免疫因子风暴本来是机体受到外来的某种强大物质侵害时发出的一种求助信号,目的是让免疫系统霎时间火力全开,为了消灭入侵的敌人(如:病毒等病原体)不惜牺牲患者自己的脏腑器官为代价,但往往两败俱伤,即使有部分患者侥幸活下来,也存有不可想象的严重后遗症。现代研究发现:人体面对严重感染时,病原体已经突破了人体的两道免疫防线了,当人体正常的这两道防卫系统仍然无法完成抵御任务时,体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量产生,相当于对机体免疫系统发出紧急的救援信号,于是免疫系统被过度激活,失去控制并强势攻击宿主细胞在内的所有它误认为的外来细胞,大量的免疫因子形成了无序的战争状态,自身免疫系统可以命令免疫细胞冲到感染部位、吞噬遭到损伤的细胞,甚至还没有受伤的组织细胞,当然也能穿透血管壁,引发炎症,令被破坏的机体肿胀、发热以及疼痛。这种近似于自杀式的攻击,即所谓的“免疫因子风暴” (cytokine storm)。一旦发生这种免疫风暴,既能够杀伤病毒,同时也会留下难以挽回的连带伤害,如肺脏、肾脏、心脏等都会受到致命的损伤。经专家统计分析,发生这种情况的,往往是免疫力低下的患者,素来就有这样或那样的疾病。
在没有西药、没有疫苗的情况下,寻找一种安全无毒的中药,能够减缓新冠肺炎病症的同时,抑制免疫风暴因子的发生,避免免疫系统对自己身体细胞的攻击是当务之急。茶藨子叶状层菌是一种药用真菌,最初的药用记载来源于山东省临沂的平邑县金银花基地,1959年县志记载由平邑县药材公司收购入药。2000年山东中医药大学持该标本由中国科学院微生物所鉴定为茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis (Schumach.:Fr.)Ryvarden,生长于当地的金银花植株茎干部位的真菌,当地人称之为“银花莪子”,多用之煮水喝治疗咽炎、流感等。2002年《山东省中药材标准》中以“金芝”的名称收载了茶藨子叶状层菌,成为一种合法的中药。2012年《山东省中药材标准》修订后再次出版,仍然保持“金芝”为茶藨子叶状层菌的唯一来源。 2013年该菌发酵菌丝体被国家卫生部批准为新资源食品(卫生部2013年第1号文),成为我国第一个食品级也是我国唯一一个食品级原料的药用真菌发酵菌丝体。
发明内容
针对现阶段免疫因子风暴的治疗现状,研发茶藨子叶状层菌的发酵液,发现茶藨子叶状层菌发酵液同样具有良好的免疫调节、消炎抑菌、抗肿瘤、抗流感等作用,能够清肺化痰、健脾养胃,特别适用于免疫力低下人群、老年性便秘患者、肺结节患者、长期抽烟人群、饮酒过量人群。
同时考察了茶藨子叶状层菌发酵液干预“免疫因子风暴”的实验,实验结果证明茶藨子叶状层菌发酵液具有明显的对抗“免疫因子风暴”的作用。
茶藨子叶状层菌发酵液在制备治疗免疫因子风暴药物上的应用。
上述的发酵液的制备方法为:
(1)斜面茶藨子叶状层菌菌种培养;
(2)瓶液体种子培养;
(3)发酵培养:将步骤(2)的种子加入到培养基中发酵;(4)菌丝过滤;滤液即为茶藨子叶状层菌发酵液;
所述茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis(Schumach. :Fr.)Ryvarden,保藏号为:CGMCC No1195。
所述的发酵液的制备方法的步骤(2)中所述的培养基配方为黄芪麦麸水100g,蛋白胨0.3%,葡萄糖1%,蔗糖1%,玉米浆0.5%;所述的黄芪麦麸水为5-6%的黄芪,10%的麦麸,其余为水,加热煮沸得到的液体。
上述应用中,发酵液在无菌环境下灌装,加盖密封,高温蒸汽灭菌即可。
茶藨子叶状层菌发酵液在制备治疗儿童免疫因子风暴药物上的应用。
上述的发酵液的制备方法为:
(1)试管斜面茶藨子叶状层菌菌种培养;
(2)三角瓶液体种子培养;
(3)发酵培养:将步骤(2)的种子加入到培养基中发酵;(4)菌丝过滤;滤液即为茶藨子叶状层菌发酵液;
所述茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis(Schumach. :Fr.)Ryvarden,保藏号为:CGMCC No1195。
所述的发酵液的制备方法的步骤(2)中所述的培养基配方为黄芪麦麸水100g,蛋白胨0.3%,葡萄糖1%,蔗糖1%,玉米浆0.5%;所述的黄芪麦麸水为5-6%的黄芪,10%的麦麸,其余为水,加热煮沸得到的液体。
上述应用中,发酵液中加入鲜牛乳、蔗糖,高压灭菌,无菌操作下加入保加利亚乳杆菌,厌氧发酵,灌装,加盖密封,高温蒸汽灭菌30分钟即可。
本发明的有益效果
经非大样本临床试验证明,配合其他综合治疗方法,服用茶藨子叶状层菌发酵液具有抗流感病毒和抗新冠病毒的作用,一般患者服用后3天内明显起效,改善咽痛、头痛、咳嗽、气喘、纳呆、乏力、肠胃不适等症状。服用量为每日3次,每次50ml,饭前饭后均可服用。
经非大样本临床试验证明,服用茶藨子叶状层菌发酵液后,增强机体免疫力,抑制体内免疫因子风暴的产生。
对于疑似病例,不适宜采用新冠治疗方案的患者,以及未确诊、无病症者,均可采用服用茶藨子叶状层菌发酵液对的办法进行预防,做到防患于未然,定会收到良好效果。
具体实施方式
实施例1 产品稳定性实验
本发明内容的茶藨子叶状层菌发酵液的制备方法,包括以下步骤:
(1)试管斜面茶藨子叶状层菌菌种培养:将分离到的纯菌种调取少许,转移到PDA 培养基上,30℃培养3 天,菌落具放射状沟纹,直径2.7-3.2cm。显微镜下观察菌丝无色,细长,具横隔,纵横交错,多分枝,直径2-2.5μm ;
(2)三角瓶液体种子培养:葡萄糖60 克、磷酸二氢钾6 克、硫酸镁1.5 克、尿素1.2 克,与马铃薯水(600g马铃薯、3000mL水煮沸30min,纱布过滤)混合,定容至3000ml,得到培养液;取三角瓶,洗净烘干放冷后,每瓶加入上述培养液150ml,注意不要使液体粘附到瓶壁上,上盖棉塞,最后用牛皮纸、橡皮筋封口。在接种菌种之前,将包装好的三角瓶整体置于紫外灯下消毒40 分钟。取三角瓶中固体培养生长情况较好的金银花菌菌丝进行接种,注意剔除底部含有琼脂的固体培养基,菌丝团的直径大约为1 ~ 2mm,置于恒温振荡器上进行培养,保持温度27℃,振荡速率为160rpm,摇瓶培养的时间为96 小时,得到液体种子;
(3)发酵培养: 将步骤(2)的种子加入到培养基中27℃发酵培养96 小时;所述的培养基配方为黄芪麦麸水100g,蛋白胨0.3%,葡萄糖1%,蔗糖1%,玉米浆0.5%;所述的黄芪麦麸水为5%的黄芪,10%的麦麸,其余为水,加热煮沸2h过滤后得到的液体;
(4)菌丝过滤;滤液即为茶藨子叶状层菌发酵液;
所述茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis(Schumach. :Fr.)Ryvarden,保藏号为:CGMCC No1195。
稳定性试验:
室温放置18个月,共做3批样品,分别在第3个月、第6个月、第9个月、第12个月和第18个月座澄明度、色泽、异味等项目检测。经检验均未出现异常浑浊、也无变馊变味的现象,说明本发明的实验工艺可行,产品稳定性良好。
实施例2 动物实验
1.1实验概述:通过大鼠人为造模免疫因子风暴,证明茶藨子叶状层菌对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤( ALI)的治疗作用并进行作用机制的研究。采用科学界公认的以 LPS按5mg/kg对 SD大鼠气管内滴注制备 ALI实验模型,观察茶藨子叶状层菌发酵液 3个剂量(12.00、6.00、3.00g/kg)组和阳性对照药地塞米松注射液(0.5 mg/kg)iv给药后对大鼠肺组织匀浆白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、核转录因子-κB(NF-κB)水平及肺组织形态学的影响。实验结果显示茶藨子叶状层菌发酵液能够降低 ALI模型大鼠肺脏 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κB水平,改善大鼠肺组织形态学变化。因此证明茶藨子叶状层菌发酵液可改善肺组织病理变化,减轻 LPS致 ALI模型大鼠实验过程炎性介质的生成和释放,从而明显减少“免疫因子风暴”发生的几率,为其临床用于防治呼吸系统疾病治疗,特别是针对免疫力低下的新冠病毒患者预防和治疗“免疫因子风暴”提供了新思路和新制剂。
1.2 实验内容:
1.2.1实验仪器与材料: Drew全自动生化分析仪(美国,型号TRI-9002-002);冷冻离心机(湖南湘仪集团离心机仪器有限公司,TGL-20M);醋酸地塞米松磷酸钠注射剂(山东鲁抗辰欣药业有限公司,规格5 mg/mL);生理盐水注射液(青州尧王制药有限公司,规格250ml/瓶);脂多糖(Sigma LPS,上海慧颖生物科技有限公司); IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、核转录因子-κB(NF-κβ)放免试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。
1.2.2实验动物: SD大鼠,雄性,体质量 180~200 g,SPF级,北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2016-0006;使用许可证SYXK(鲁)20170022。
1.3 实验方法
1.3.1分组
取雄性 SD大鼠 60只,将大鼠随机分成 6组,每组 10只,即对照组、模型组、阳性对照组(地塞米松磷酸钠 0.5mg/kg,)及茶藨子叶状层菌发酵液高、中、低剂量(12.0、6.0、3.0ml/kg)治疗组。实验前动物禁食 12 h,自由饮水。
1.3.2 ALI模型制备
采用 LPS气管滴注法制备ALI模型,LPS以无菌生理盐水配制成 5 mg/mL。大鼠腹腔注射(ip )10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉,颈部正中切口 2 cm,分离气管,微量注射器由气管向肺方向滴注 LPS(5 mg/kg)复制ALI模型,对照组滴注等体积生理盐水。造模 30min后各组大鼠静脉注射(iv)给予相应药物治疗,注射LPS后16h,大鼠 ip 10%水合氯醛 0.35 g/kg麻醉,取材。
1.3.3 检测指标
细胞因子测定各组动物处死后,迅速打开胸腔,取出右肺中叶放入液氮中待处理。肺组织称质量,以 0.1 g肺组织加生理盐水 1 mL,用玻璃匀浆器匀浆,4℃低温离心(3000 r/min),取上清液 -20℃冻存,按试剂盒说明方法检测。
1.3.4 统计方法
数据以x±s表示,资料统计方法采用单因素方差分析检验法,统计软件 SPSS 18.0。
1.4 实验结果
1.4.1对ALI大鼠肺组织 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6的影响:模型组与对照组相比,大鼠肺组织 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6水平明显升高( P<0.01)。茶藨子叶状层菌发酵液高、中剂量组和地塞米松组明显降低大鼠肺组织中 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6水平( P<0.05、0.01),茶藨子叶状层菌低剂量组明显降低大鼠肺组织中 IL-1β和 TNF-α水平(P<0.05),结果见表 1。
表1 茶藨子叶状层菌发酵液对 LPS致ALI大鼠肺组织 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6的影响 ( x±s, n= 10)
与对照组比较:△△P<0.01;与模型组比较: *P<0.05 **P<0.01。
1.4.2 对 ALI大鼠肺组织 IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κβ的影响
表2 茶藨子叶状层菌发酵液对LPS致ALI大鼠肺组织IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κβ的影响( x±s, n=10)
与对照组比较:△P<0.05 △△P<0.01;与模型组比较: *P<0.05 **P<0.01。
表 2 结果表明,模型组与对照组相比,大鼠肺组织 IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κβ水平明显升高(P<0.05、0.01)。
茶藨子叶状层菌发酵液高、中剂量组和地塞米松组明显降低大鼠肺组织中 IL-8、IL-10、ICAM-1、 NF-κβ水平,减少炎症因子风暴发生的几率( P<0.05、0.01)。
1.5 重复性实验说明:按照上述实验重复一次,所得实验结果、结论与第一次基本一致,故不再叙述。
实施例3临床试验:验证茶藨子叶状层菌发酵液对新冠病毒的预防和治疗作用。
山东病例3例,2例确诊,住院于山东ΧΧ县ΧΧ医院治疗,住院前有发热、干咳症状,治疗期间服用茶藨子叶状层菌发酵液,每日3次,每次50ml,高于普通人正常用量,连续服用30日,同时配合医院治疗,无症状后,确认治愈,出院。另1例,未确诊,无症状,采用居家隔离观察,每日上报的方式,同样服用茶藨子叶状层菌发酵液,每日3次,每次50ml,高于普通人正常用量,连续服用15日,未有任何症状,解除隔离,经落实反馈信息,该病例原有的咽炎症状完全消失。
浙江病例4例,确诊2例,住温州市ΧΧ医院治疗。疑似1例,被隔离观察,经辗转熟人联系到负责医生,分别赠予茶藨子叶状层菌发酵液,每日3次,每次50ml,高于普通人正常用量,同时配合医院综合治疗,连续服用15日后,入院前的两例确诊病例明显症状减轻,第1例在先有憋气症状者明显好转,继续服用;第2例咳嗽同时,伴有肠胃不适症状者,已无肠胃不适症状,继续服用;第3例疑似病例,15天后经核酸检验,确认无感染,为一般流感患者,已经痊愈不再隔离观察,不再服用;第4例为未确诊、无症状归来者,采用居家隔离观察并每日上报社区的方式,服用茶藨子叶状层菌发酵液,每日3次,每次50ml,高于普通人正常用量,连续服用30天,未发生任何症状。
实施例4
将实施例1的茶藨子叶状层菌发酵液在无菌环境下灌装成500ml瓶中,加盖密封,121℃高温蒸汽灭菌30分钟,即可制得本专利产品。本产品对于防止新冠肺炎有效,抑制“免疫因子风暴”的发生。
实施例5
将实施例1的茶藨子叶状层菌发酵液在无菌环境下灌装成50ml的瓶中,加盖密封, 121℃高温蒸汽灭菌30分钟,即可制得本专利产品另一种规格,该规格的产品服用更方便,携带更便利。本产品对于防止新冠肺炎有效,抑制“免疫因子风暴”的发生。
实施例6
将实施例1的茶藨子叶状层菌发酵液加入10.0 %的鲜牛乳,5.0 %的蔗糖,高压灭菌,冷却至38~40℃,无菌操作下加入0.05 %的保加利亚乳杆菌,厌氧发酵14小时,灌装成50ml的瓶中,加盖密封, 121℃高温蒸汽灭菌30分钟,即可制得本专利产品另一种适合儿童服用的抗新冠肺炎产品,该规格的产品具有酸甜适中的口感,有利于儿童饮用,对于帮助少年儿童抗击疫情发挥重要的作用。
Claims (8)
1.茶藨子叶状层菌发酵液在制备治疗免疫因子风暴药物上的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的发酵液的制备方法为:
(1)斜面茶藨子叶状层菌菌种培养;
(2)液体种子培养;
(3)发酵培养:将步骤(2)的种子加入到培养基中发酵;
(4)菌丝过滤;滤液即为茶藨子叶状层菌发酵液;
所述茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis(Schumach. :Fr.)Ryvarden,保藏号为:CGMCC No1195。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的发酵液的制备方法的步骤(2)中所述的培养基配方为黄芪麦麸水100g,蛋白胨0.3%,葡萄糖1%,蔗糖1%,玉米浆0.5%;所述的黄芪麦麸水为5-6%的黄芪,10%的麦麸,其余为水,加热煮沸得到的液体。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,发酵液在无菌环境下灌装,加盖密封,高温蒸汽灭菌即可。
5.茶藨子叶状层菌发酵液在制备治疗儿童免疫因子风暴药物上的应用。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的发酵液的制备方法为:
(1)斜面茶藨子叶状层菌菌种培养;
(2)液体种子培养;
(3)发酵培养:将步骤(2)的种子加入到培养基中发酵;
(4)菌丝过滤;滤液即为茶藨子叶状层菌发酵液;
所述茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis(Schumach. :Fr.)Ryvarden,保藏号为:CGMCC No1195。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的发酵液的制备方法的步骤(2)中所述的培养基配方为黄芪麦麸水100g,蛋白胨0.3%,葡萄糖1%,蔗糖1%,玉米浆0.5%;所述的黄芪麦麸水为5-6%的黄芪,10%的麦麸,其余为水,加热煮沸得到的液体。
8.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,发酵液中加入鲜牛乳、蔗糖,高压灭菌,无菌操作下加入保加利亚乳杆菌,厌氧发酵,灌装,加盖密封,高温蒸汽灭菌30分钟即可。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN115677869A (zh) * | 2022-09-14 | 2023-02-03 | 临沂大学 | 一种金芝多糖的制备方法及其用途 |
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