实施例
1.材料和方法
1.1材料、仪器和试剂
1.1.1细胞株及多肽
人慢性粒性白血病细胞K562、小鼠红白血病MEL细胞、人食管癌TE-1细胞和人肝癌Bel-7404细胞均购自中国医学科学院肿瘤细胞库。抗菌肽Anoplin由杭州中肽公司采用固相多肽合成方法合成。
1.1.2主要试剂
1.1.3试剂配制
磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS):8g氯化钠,0.2g氯化钾,2.9g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾,1L去离子水,4℃保存。
Anoplin用PBS配成3×10-3M的母液。配成的母液经0.22μm滤膜过滤除菌后分装至1.5mL的EP管中,-20℃分别保存。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养
MEL,K562,TE-1和Bel-7404细胞分别培养于含10%FBS(Fetal bovineserum)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基中(含谷氨酰胺、10mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素),于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养,每3天传代一次,取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2MTT比色法检测抗菌肽Anoplin对细胞活力的影响
(1)收集对数生长期的细胞,1000转离心3分钟,弃掉旧培养基,加适量新鲜培养基进行细胞计数。
(2)将细胞浓度均调整为3×104/ml接种于96孔板中,每孔100μl,则为3000个细胞每孔。小鼠骨髓细胞调至10000个细胞每孔。
(3)悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽20μl,对照组细胞则加入20μl培养基。
(4)药物加完后加入80μl DMEM培养基将体系补充至200μl。
(5)将细胞培养在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下,在24h,48h,72h和96h四个时间点培养结束前4h每孔加入10μl(5mg/ml)MTT,培养4小时后离心并吸掉上层液体,向每孔加入150μl DMSO溶解紫色结晶,最后用酶标仪检测570nm的光吸收值。根据下面公式计算药物的抑制率:抑制率=(加药组OD值-对照组OD值)/对照组OD值*100%
1.2.3普通光学显微镜观察抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞形态和数量的影响
(1)收集对数生长期的细胞,1000转离心3分钟,弃掉旧培养基,加适量新鲜培养基进行细胞计数。
(2)将细胞浓度均调整为3×104/ml接种于96孔板中,每孔100μl,则为3000个细胞每孔。
(3)悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽20μl,并且加入不同浓度的紫杉醇20μl作为阳性药物对照,对照组细胞则加入20μl培养基。
(4)药物加完后加入80μl DMEM培养基将体系补充至200μl.
(5)将细胞培养在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下,在24h,48h,72h和96h四个时间点在普通光学显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
1.2.4小分子PI荧光染色实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜通透性的影响
PI是一种小分子荧光染料,可以通过破损的细胞膜进入细胞核中与核内染色物质结合,但是完整的细胞膜不能摄入PI.
(1)收集对数生长期的MEL细胞,1000转离心3分钟,弃掉旧培养基,加适量新鲜培养基进行细胞计数。
(2)将细胞浓度均调整为3×104/ml接种于96孔板中,每孔100μl,则为3000个细胞每孔。
(3)悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽20μl,对照组细胞则加入20μl培养基。
(4)药物加完后加入80μl DMEM培养基将体系补充至200μl.
(5)将细胞培养在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下,在12h时吸掉培养基,加入稀释后的PI染液50μl,37℃、5%CO2及饱和湿度环境下培养10分钟后于荧光显微镜下观察。
(6)在GREEN滤光片下观察细胞内荧光变化情况。
1.2.5扫描电镜实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜的作用
(1)用多聚赖氨酸包被玻片,备用。
(2)收集对数生长期的细胞,1000转离心3分钟,弃掉旧培养基,加适量新鲜培养基进行细胞计数。
(3)先把包被好的玻片置于24孔板中,再将细胞浓度均调整为3×104/ml接种于24孔板中,每孔400μl,则为12000个细胞每孔。
(4)悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽80μl,对照组细胞则加入80μl培养基。
(5)药物加完后加入520μl DMEM培养基将体系补充至1000μl.
(6)将细胞培养在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下24h.
(7)加入1ml PBS漂洗5分钟,洗两次,洗掉培养基。
(8)每孔加入1ml3%戊二醛溶液,4度固定2小时。吸掉戊二醛,PBS洗两次。
(9)每孔加入1ml2%四氧化锇溶液,4度固定2小时。吸掉2%四氧化锇溶液,PBS洗两次。
(10)乙醇梯度脱水:50%-70%-80%-90%-100%每次5分钟。
(11)乙腈置换:50%-70%-80%-90%-100%每次15分钟至纯乙腈时将乙腈吸干,保鲜膜封口,扎小洞。
(12)在冻干机里干燥大约45分钟,样品达到完全干燥。
(13)镀金膜。
(14)Hitachi S-4800扫描电子显微镜检测细胞膜变化。
2.实验结果
2.1MTT法检测抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞生长的抑制作用
MTT实验结果显示抗菌肽Anoplin在24h,48h,72h和96h能剂量和时间依赖的抑制肿瘤细胞MEL(图1A),K562(图1B),TE-1(图1C)和Bel-7404(图1D)的增殖。
2.2普通光学显微镜观察抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞形态和数量的影响
通过普通光学显微镜实时观察能更直观的显示出抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞增殖的抑制作用,见图2。
2.3小分子PI荧光染色实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜通透性的影响
通过PI摄取实验发现,抗菌肽Anoplin处理后肿瘤细胞的细胞膜的通透性发生了明显变化。Anoplin未处理的对照细胞在荧光显微镜下看不到荧光,而加了Anoplin处理的肿瘤细胞除了了明显的红色荧光,且红色荧光的数量随着药物浓度的增加而加强,见图3。
2.4扫描电镜实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜的作用
进一步用扫描电镜实验研究发现,抗菌肽Anoplin处理肿瘤细胞后,细胞膜发生了明显变化。未处理的对照细胞细胞膜表面光滑,可见大量微绒毛,而抗菌肽Anoplin处理后的肿瘤细胞的细胞膜出现了孔洞,断裂,形态不规则等变化,见图4。可见抗菌肽抑制肿瘤细胞的增殖主要是通过破坏肿瘤细胞的细胞膜而起作用的。
综上可见,抗菌肽Anoplin对所测试的四种肿瘤细胞都具有抑制其生长的作用。且其抑制机理可能是通过破坏肿瘤细胞的细胞膜结构而实验的。
本领域普通技术人员应当理解,可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解,可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各种变动和修饰,且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。
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