CN105770008A - 丁香叶提取物在制备抗耐药菌感染疾病药物中的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种天然药物的新用途，具体涉及丁香叶提取物在制备抗耐药菌感染疾病药物中的新用途，所述的丁香叶提取物，由以下重量分数的成分组成：丁香苦苷19.91‑30.39%、丁香总黄酮及总酚酸 32.60‑43.18%，丁香苦苷和丁香总黄酮及总酚酸的总重量分数为52.51‑72.99%。该提取物对耐药菌感染具有良好治疗作用，在开发成为抗耐药菌的药物中具有新用途。

Description

丁香叶提取物在制备抗耐药菌感染疾病药物中的新用途

技术领域

本发明涉及丁香叶提取物新的药理用途，尤其涉及丁香叶提取物在制备抑制耐药菌药物方面的用途。本发明还涉及用作抗耐药菌感染药物的丁香叶提取物及其主要成分，包含它们的药物组合物及其体内外抗耐药菌活性及使用方法。

背景技术

细菌感染性疾病是危害人类健康的常见多发病，自青霉素发明后，各种抗生素在细菌性感染疾病中发挥了重要的作用，投入使用仅几十年，便成了对抗细菌感染的最有效武器，但是随着抗生素的频繁使用，其用药局限性也日益凸显，过去一个病人用几十单位的青霉素就能活命，而相同病情，现在用几百万单位的青霉素也没有效果。随着全世界对抗生素滥用逐渐达成共识，抗生素的地位和作用受到怀疑的同时，也遭到了严格的管理。失去抗生素这个曾经有力的武器，人们致力寻求一种战胜耐药菌的新药物，转而从过去原生态的治病方式重新寻找对抗疾病灵感。

中医药学有着悠久的历史，是我国人民赖以生存的重要医疗保健措施之一，即使是现代医药学高度发展普及的今天，中医药学在防病治病中仍占有举足轻重的地位。传统中医药学虽无细菌感染和抗细菌感染一类现代医药学的文字记载，但有关寒、热、火、湿、毒、戾气等外邪引起的伤寒、时病和散寒、清热、解毒等治法实已包含有现代医药学细菌感染和抗细菌感染的内容，无疑蕴藏着抗细菌感染药物的开发潜力。中药的化学成分复杂，多成分的共同作用，作用机制多样性，在对抗细菌性感染和耐药性方面正逐渐表现出自己独特的优势。

丁香叶来源于木樨科丁香属植物紫丁香，洋丁香，朝鲜丁香的干燥叶，为东北地区道地药材，具有清热解毒，消炎止痢之功效。以丁香叶水提物为原料制剂炎立消，具有广谱抗菌和抗病毒作用，是临床上常用的、受到患者欢迎的物美价廉的抗菌药物。丁香叶中所含化合物的结构类型与市售的抗生素截然不同，其抗菌作用是由直接抗菌和提高机体免疫共同作用的结果，是我们寻找抵抗细菌耐药性候选化合物的理想药材。现代药理研究证明丁香叶具有清热解毒、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、祛痰镇咳等功效。但丁香叶抑制耐药菌方面的研究，特别是其 经口服给药后相关活性尚未见报道。

基于对丁香叶抗菌活性部位的追踪，本课题组发现其主要的活性成分为黄酮，酚酸及丁香苦苷，通过醇提水沉，大孔吸附树脂柱色谱等多种手段，获得丁香叶的抗菌活性提取物，其重量组成为丁香苦苷和丁香总黄酮及总酚酸52.51-72.99％，本发明公开了该丁香叶提取物在治疗耐药菌感染疾病方面的新用途。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供丁香叶提取物在制备抗耐药菌感染疾病药物中的新用途。

本发明通过如下技术方案实现：

本发明所述的丁香叶提取物通过如下方法制备得到：

(1)将丁香叶粉碎，用体积百分比浓度为50-95％的醇提取，然后将提取液过滤并浓缩；

(2)向浓缩液中加蒸馏水，放置，离心，取上清液浓缩；

(3)将浓缩后的上清液通过大孔吸附树脂柱处理，先后用0-50％和50-90％的醇洗脱，收集50-90％的醇洗脱液，浓缩后得到丁香叶提取物。

其中所述的制备方法中：

所述的丁香来源于木樨科丁香属植物紫丁香、洋丁香或朝鲜丁香的干燥叶。

步骤(1)中，按照每1kg丁香叶加入8-15L醇的比例，向丁香叶中加入醇浸泡10-60分钟，然后在95-105℃条件下加热回流提取或超声提取，提取次数为1-3次，每次0.5-2h，将提取物合并，浓缩至相对密度为1.01-1.10g/mL。

步骤(2)中，加入蒸馏水的体积为浓缩液体积的0.5-10倍，放置10-60分钟，离心10-60分钟，将上清液浓缩至相对密度为1.01-1.10g/mL。

步骤(3)中，上清液在大孔吸附树脂柱中的吸附速率为1-10BV/h，上清液干重与大孔树脂的重量比为1：4-1：12，大孔吸附树脂柱的径高比为1：3-1：10。

所述的醇为甲醇或乙醇，所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型树脂，包括非极性大孔吸附树脂、极性大孔吸附树脂、中等极性大孔吸附树脂，包括D101、D201、HPD600、HPD200、DM130或AB-8。

本发明所述的提取物中，包含如下重量组成成分：丁香苦苷 19.91-30.39％，丁香总黄酮及总酚酸32.60-43.18％，丁香苦苷和丁香总黄酮及总酚酸的总重量分数为52.51-72.99％。

本发明所述的抗耐药菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌，耐万古霉素的肠球菌、多重耐药鲍曼不动杆菌或多重耐药铜绿单胞菌。

所述的抗耐药菌感染疾病为急性化脓性扁桃体炎、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、肺炎、肠炎、细菌性痢疾、急性腹膜炎、急性膀胱炎、肾盂肾炎或术后创面感染。

通过体外抑菌实验，急性腹膜炎模型，急性肺炎模型，对丁香叶提取物的体内活性进行研究，结果发现其具有良好的抗耐药菌作用，强于临床丁香叶制剂炎立消。

附图说明

图1为丁香叶提取物抗耐金黄色葡萄球菌感染的急性腹膜炎作用观察。

具体实施方式：

实施例1：

将丁香叶100g粉碎至10-20目，加8倍体积百分比浓度为70％的乙醇，浸泡30分钟，加热回流提3次，每次1.5h，过滤，合并提取液，浓缩至浓度为1.06g/ml(50℃)，加2倍体积的蒸馏水，放置30分钟，离心30分钟(4000转/分钟)，取上清液浓缩至相对密度1.05g/ml得到上柱溶液，上柱溶液以4BV/h的流速通过D101大孔吸附树脂层析柱，上柱溶液干重与大孔吸附树脂的比例1:10，大孔吸附树脂柱的径高比为1：5，然后用5BV的15％的乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用60％的乙醇洗脱5BV，洗脱速度4BV/h，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.15g/ml，减压干燥即得丁香叶有效部位(提取物1)。有效部位含量72.99％，其中丁香苦苷含量30.39％，丁香总黄酮及总酚酸43.18％。

实施例2：

将丁香叶100g粉碎至粗粉，加15倍体积百分比浓度为90％的乙醇，浸泡60分钟，加热回流提2次，每次1h，过滤，合并提取液，浓缩至浓度为1.10g/ml(50℃)，加10倍体积的蒸馏水，放置60分钟，离心45分钟(3000转/分钟)，取上清液浓缩至相对密度1.10g/ml得到上柱溶液，上柱溶液以3BV/h的流速通过DM130 大孔吸附树脂层析柱，上柱溶液干重与大孔吸附树脂的比例1:12，大孔吸附树脂柱的径高比为1：7，然后用7BV的30％的乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用80％的乙醇洗脱6BV，洗脱速度5BV/h，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.20g/ml，喷雾干燥即得丁香叶有效部位(提取物2)。有效部位含量52.51％，其中丁香苦苷含量19.91％，丁香总黄酮及总酚酸32.60％。

实施例3：

取丁香叶100g，加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25(80℃)的清膏，加入丁香叶细粉10g,混匀，于60～80℃干燥，粉碎成细粉，用75～85％乙醇制粒，低温干燥，加入辅料适量，混匀，压制成片，即得炎立消(即丁香叶片)。

实施例4：

丁香叶提取物的体外抗耐药菌的作用研究

供试菌株：金黄色葡萄球菌(MSSA)

耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)

耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)

耐万古霉素肠球菌的肠球菌(VRE)由解放军第463医院检验科临床分离得到。

药物与试剂：注射用盐酸万古霉素(VH，Eli Lilly Japan K.K)；生理盐水(山东禹王实业有限公司)。牛肉膏；蛋白胨；NaCl；NaOH(天津市博迪化工有限公司)；水(无菌水)。

培养基：Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基(g/L)：

准确称量各种成分，搅拌混匀后加入NaOH调节pH 7.2-7.4。在0.1MPa下高压蒸汽灭菌30min。

供试化合物：提取物1和提取物2，制备方法见实施例1和2。丁香叶片实施例3。

试验操作及结果判定按照美国临床实验室国家标准委员会(NCCLS)推荐的 标准微量稀释法进行测定丁香叶提取物对4种细菌的最低抑菌浓度(MIC)。

用无菌移液管精密吸取菌液1ml加入100ml新鲜灭菌的肉汤培养基中，震荡使之混匀制成混菌培养基。用微量进样器将混菌培养基加入96孔圆底培养板中，每孔0.2mL。第1列分别依次加入培养基、空白溶剂、受试化合物溶液，每孔各0.1mL，而后用微量进样器作3倍递减浓度稀释，即再第1行孔中吸取0.1ml至第二行孔，混匀后在从第二行孔中吸取0.1ml至第3行孔，以此类推。最后1孔取出0.1mL弃去。其中留一列孔作为溶液对照，一列为阳性对照，一列为菌液对照。混匀后置37℃恒温箱培养约24小时，观察菌的生长情况。菌生长孔呈现混浊，未见混浊则无菌生长，以无菌生长的药物最低浓度作为该药对该试验菌的最小抑菌浓度(MIC)。“-”表示澄清，即没有细菌生长；“±”表示略见轻微浑浊；“+”表示混浊，即有细菌生长；“++”表示相当混浊，即有很多细菌生长。

通过微量稀释法分别测定了丁香叶提取物对各种菌的最低抑菌浓度，测定结果见表1。

表1：丁香叶提取物对4种细菌的最低抑菌浓度

实施例5：

丁香叶提取物的抗耐药菌引起的腹膜炎作用研究

选择昆明种小白鼠40只，随机分成5组，每组8只，依次标记为空白组(K)、阳性组(VH)、炎立消(DXY)、提取物1组，提取物2组。经灌胃给药，于第7、9日各腹腔注射耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(10⁹CFU/ml)2次，第一次0.1ml/10g，第二次0.15ml/10g。继续给药，并于7天后观察各组死亡数。

分组及给药情况如下：

空白组：生理盐水

VH组(阳性组)：盐酸万古霉素(300mg/kg,临床剂量)

DXY组(丁香叶片组)：丁香叶片(82.2mg/kg,以片芯计)

提取物1组：有效部位(82.2mg/kg,以干浸膏计)

提取物2组：有效部位(82.2mg/kg,以干浸膏计)

实验例6：丁香叶提取物的抗耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)引起的肺炎活性测定

选择昆明种小鼠按体重随机分5组，每组24只，在0、1、2d滴鼻感染耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)，考察7天小鼠存活率的影响。结果见表2。

表2 丁香叶提取物对肺部感染小鼠存活率的影响。

Claims (10)

1.丁香叶提取物在制备抗耐药菌感染疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的丁香叶提取物包含以下重量分数的成分：丁香苦苷19.91-30.39%，丁香总黄酮及总酚酸32.60-43.18%。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的丁香叶提取物中，丁香苦苷和丁香总黄酮及总酚酸的总重量分数为52.51-72.99%。

4.如权利要求1-3任何一项所述的应用，其特征在于，所述的丁香叶提取物通过如下方法制备：

（1）将丁香叶粉碎，用体积百分比浓度的50-95%的醇提取，然后将提取液过滤并浓缩；

（2）向浓缩液中加蒸馏水，放置，离心，取上清液浓缩；

（3）将浓缩后的上清液通过大孔吸附树脂柱处理，先后用0-50%和50-90%的醇洗脱，收集50-90%的醇洗脱液，浓缩后得到丁香叶提取物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的丁香叶来源于木樨科丁香属植物紫丁香、洋丁香或朝鲜丁香的干燥叶。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，按照每1kg丁香叶加入8-15L醇的比例，向丁香叶中加入醇浸泡，然后加热回流提取或超声提取，提取次数为1-3次，每次0.5-2h，将提取物合并，浓缩。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，加入蒸馏水的体积为浓缩液体积的0.5-10倍。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，上清液在大孔吸附树脂柱中的吸附速率为1-10BV/h，上清液干重与大孔树脂的重量比为1：4-1：12，大孔吸附树脂柱的径高比为1：3-1：10。

9.如权利要求1-8任何一项所述的应用，其特征在于，所述的抗耐药菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌，耐万古霉素的肠球菌、多重耐药鲍曼不动杆菌或多重耐药铜绿单胞菌。

10.权利要求1-8任何一项所述的应用，其特征在于，所述的抗耐药菌感染疾病为急性化脓性扁桃体炎、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、肺炎、肠炎、细菌性痢疾、急性腹膜炎、急性膀胱炎、肾盂肾炎或术后创面感染。