CN103142995B - 蜂毒抗菌肽Anoplin在食管癌治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蜂毒抗菌肽Anoplin在食管癌治疗中的用途。具体地，本发明涉及：治疗受试者中食管癌、缓解受试者中食管癌症状或抑制食管癌细胞增殖的方法；蜂毒抗菌肽Anoplin在制备用于治疗食管癌、缓解食管癌症症状或抑制食管癌细胞增殖的药物、药剂或药物组合中的用途；以及涉及一种药学产品，其包括作为活性成分的蜂毒抗菌肽Anoplin和包括涉及该药学产品的说明书。

Description

蜂毒抗菌肽Anoplin在食管癌治疗中的用途

技术领域

本发明涉及蜂毒抗菌肽Anoplin的抗肿瘤作用。具体地，本发明涉及：治疗受试者中癌症、缓解受试者中癌症症状或抑制癌细胞增殖的方法；蜂毒抗菌肽Anoplin在制备用于治疗癌症、缓解癌症症状或抑制癌细胞增殖的药物、药剂或药物组合中的用途；以及涉及一种药学产品，其包括作为活性成分的蜂毒抗菌肽Anoplin和包括涉及该药学产品的说明书。

背景技术

癌症是一类严重危害人类健康的疾病，目前全球癌症死亡人数高于艾滋病、结核病和疟疾死亡人数的总和，已成为全球头号杀手^[1]。全世界每年死于恶性肿瘤的人数超过700万，其中中国约有160多万人。美国癌症学会负责人约翰·塞弗林说，如今全球每8名死者中就有1人死于癌症。而白血病是一类造血系统的恶性疾病，是国内十大高发恶性肿瘤之一，占肿瘤发病率的第六位，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中分别占男性的第6位和女性的第8位，在儿童及35岁以下的死亡率中占第1位。WHO预计，在全球范围内，新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年1%的速度递增，而在中国、俄罗斯和印度这些国家增长速度会更快，估计到2030年全球将可能有7500万人遭受癌症的折磨，将新增2700万癌症病例，死于癌症的人数将达到1700万人，这一数字对许多国家的健康护理体系来说是难以承受的。

近年来，随着临床上多种抗生素的大量应用，已经导致了多药耐药问题的出现。青霉素、大环内酯类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、四环素类、氟奎诺酮、氯霉素、万古霉素等抗生素的耐药及多药耐药的致病菌的感染也逐年呈上升趋势，严重的威胁人类的健康。因此常规抗生素的抗性增加问题已经成为全球公共卫生问题，对新的抗生素的需求激励了人类治疗学对发展抗菌肽的兴趣^[2-4]。

抗菌肽是生物防御系统中产生的一类对抗外源性病原体的肽类物质，是生物天生的、非特异性防御系统的重要组成部分。目前研究者已经从细菌、昆虫、无脊椎动物、脊椎动物、人体和植物体中分离得到了上千种抗菌肽^[3-5]。大多数天然分离的抗菌肽及数千种由它们改造而来的抗菌肽都具有广谱的抗菌活性。它们大多能够杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，令人振奋的是有一小部分的抗菌肽已被证明具有抗肿瘤、抗病毒的活性^[4-11]，一些抗菌肽也被证明具有中和脂多糖以及恢复适当免疫应答的能力^[5]。越来越多的研究提出了一些阳离子抗菌肽，这些抗菌肽对细菌有毒性作用但是对哺乳动物的正常细胞无毒性作用。这些研究相当大程度上提高了阳离子抗菌肽的重要性，无论是人工合成的还是从天然物中提取的抗菌肽对于增强免疫系统的免疫力和作为临床上使用的抗生素都具有非常大的潜力。目前，一些抗菌肽已经参与临床前和临床试验包括促进伤口愈合，治疗囊性纤维病，输尿管感染，痤疮，以及参与干细胞移植^[12-15]。

Anoplin是最近从独居黄蜂毒液中分离得到的一种迄今发现的最短的具有线性α-螺旋结构的抗菌肽^[16]，仅由10个氨基酸组成，其序列为：Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-NH₂。研究发现Anoplin具有明显的对抗革兰氏阴性和阳性菌生长的作用，而对人类的红血球无溶血作用^[17]。但是到目前为止还未见文献报道该迄今发现的自然界存在的最小的线性多肽是否具有抗肿瘤的作用。因此，本发明成果将来若能市场化，市场空间将比较庞大，发展前景也十分可观。

附：抗菌肽Anoplin的一级结构序列：

Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-NH₂

发明内容

为了向肿瘤患者提供治疗肿瘤或肿瘤相关症状的新途径或提供更广泛的选择，本发明的发明人研究发现抗菌肽Anoplin具有显著的抗肿瘤或肿瘤相关症状的作用。

因此，本发明一方面提供了一种治疗或缓解受试者中肿瘤或肿瘤相关症状或抑制肿瘤细胞的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的抗菌肽Anoplin。

本发明的另一方面提供了抗菌肽Anoplin在制备用于治疗肿瘤的药物、药剂或药物组合物中的用途。

本发明的再一方面提供了一种药学产品，其包括作为活性成分的抗菌肽Anoplin；以及包括该涉及药学产品的说明书。

附图说明

图1为Anoplin对肿瘤细胞作用24h，48h，72h和96h的MTT实验结果，其中：（A）MEL细胞；（B）K562细胞；（C）TE-1细胞；（D）Bel-7404细胞；

图2为Anoplin对MEL细胞在24h（A）,48h（B）,72h（C）和96h（D）四个时间点作用的可见光显微镜图片；

图3为PI染色实验检测Anoplin对肿瘤细胞细胞膜通透性的影响，其中：（A）MEL细胞对照组和不同剂量Anoplin处理组的PI荧光染色照片；（B）K562细胞对照组和不同剂量Anoplin处理组的PI荧光染色照片；

图4为扫描电镜技术检测Anoplin处理前后对肿瘤细胞的细胞膜表面形态的影响。(A)未经加药处理的MEL细胞，细胞膜结构完整，有大量的微绒毛。(B)加入162μM的Anoplin处理的MEL细胞，细胞膜结构破坏，出现大量孔洞，细胞内容物大量外泄。(C)加入100μM Anoplin处理的MEL细胞，细胞膜结构部分破坏，细胞内容物渗出。(D)未经加药处理的K562细胞，细胞膜结构完整，细胞膜表面光滑。（E）加入300μM Anoplin处理的K562细胞，细胞膜结构破坏，出现断裂和缝隙。（F）加入225μM Anoplin处理的K562细胞，细胞膜结构部分破坏，出现孔洞，细胞内容物渗出。

具体实施方式

本发明的发明人选用人慢性粒性白血病细胞K562，小鼠红白血病细胞MEL，人食管癌细胞TE-1和人肝癌细胞Bel-7404为肿瘤细胞。研究发现抗菌肽Anoplin具有抗肿瘤作用。

因此，本发明一方面提供了一种治疗或缓解受试者中肿瘤或肿瘤相关症状的方法，其中包括向所述受试者施用有效量的抗菌肽Anoplin。本发明也提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括将所述肿瘤细胞与抗菌肽Anoplin接触的步骤。本发明的另一方面提供了抗菌肽Anoplin在制备用于治疗或缓解受试者中肿瘤或肿瘤相关症状或抑制肿瘤细胞增殖的药物或药剂或药物组合物中的用途。本发明的再一方面提供了一种药学产品（例如药物或药剂）或药物组合物，其包括作为活性成分的抗菌肽Anoplin；以及包括该涉及药学产品的说明书。

对于本发明所述的受试者，其优选为哺乳动物，更优选为人。虽然本发明以肿瘤细胞进行了举例说明，但术语“肿瘤”可包括血癌及其他癌症，以及相关症状。

对于本发明的抗菌肽Anoplin，其可为任何能够治疗或缓解受试者中肿瘤或肿瘤症状的抗菌肽Anoplin。当然，本领域技术人员可对抗菌肽Anoplin进行各种修饰以提高其抗肿瘤功效。这类修改的抗菌肽Anoplin也是在本发明的范围之内的。

本发明的作为活性成分的抗菌肽Anoplin可以连同药学上可接受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可以包含合适的药学上可接受的载体，包括促进活性化合物加工成制剂的赋形剂和助剂。

例如适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的（冻干）条件，在立即使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。

本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，且任选地磨碎所得到的混合物，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

本发明的活性成分的有效量可为治疗或缓解肿瘤或肿瘤症状或抑制肿瘤细胞的任何量，其可以是相当于约0.1-15mg抗菌肽Anoplin，优选0.2-12mg抗菌肽Anoplin的剂量单位。更优选地，剂量单位包括约2-5mg的抗菌肽Anoplin。最优选地，剂量单位包括约3-4mg的抗菌肽Anoplin。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。

根据本发明，本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射。

应当理解本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症（例如肿瘤）、施用剂量（例如上述所示例性说明的）以及可能产生的副作用等等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例

1．材料和方法

1.1材料、仪器和试剂

1.1.1细胞株及多肽

人慢性粒性白血病细胞K562、小鼠红白血病MEL细胞、人食管癌TE-1细胞和人肝癌Bel-7404细胞均购自中国医学科学院肿瘤细胞库。抗菌肽Anoplin由杭州中肽公司采用固相多肽合成方法合成。

1.1.2主要试剂

DMEM培养基          Gibco公司

FBS                 Hyclone公司

台盼蓝              Sigma公司

MTT                 Sigma公司

DMSO(二甲基亚砜)    Sigma-Aldrich公司

PI                  联科生物有限公司

Hoechst33342        碧云天生物科技有限公司

细胞周期检测试剂盒  凯基生物有限公司

细胞凋亡检测试剂盒  贝博生物有限公司

1.1.3试剂配制

磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline,PBS）：8g氯化钠，0.2g氯化钾，2.9g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，1L去离子水，4℃保存。

Anoplin用PBS配成3×10^-3M的母液。配成的母液经0.22μm滤膜过滤除菌后分装至1.5mL的EP管中，-20℃分别保存。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

MEL，K562，TE-1和Bel-7404细胞分别培养于含10%FBS（Fetal bovineserum）的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基中（含谷氨酰胺、10mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，每3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2MTT比色法检测抗菌肽Anoplin对细胞活力的影响

（1）收集对数生长期的细胞，1000转离心3分钟，弃掉旧培养基，加适量新鲜培养基进行细胞计数。

（2）将细胞浓度均调整为3×10⁴/ml接种于96孔板中，每孔100μl,则为3000个细胞每孔。小鼠骨髓细胞调至10000个细胞每孔。

（3）悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽20μl，对照组细胞则加入20μl培养基。

（4）药物加完后加入80μl DMEM培养基将体系补充至200μl。

（5）将细胞培养在37℃、5%CO₂及饱和湿度环境下，在24h，48h，72h和96h四个时间点培养结束前4h每孔加入10μl(5mg/ml)MTT，培养4小时后离心并吸掉上层液体，向每孔加入150μl DMSO溶解紫色结晶，最后用酶标仪检测570nm的光吸收值。根据下面公式计算药物的抑制率：抑制率=（加药组OD值-对照组OD值）/对照组OD值*100%

1.2.3普通光学显微镜观察抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞形态和数量的影响

（1）收集对数生长期的细胞，1000转离心3分钟，弃掉旧培养基，加适量新鲜培养基进行细胞计数。

（2）将细胞浓度均调整为3×10⁴/ml接种于96孔板中，每孔100μl,则为3000个细胞每孔。

（3）悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽20μl，并且加入不同浓度的紫杉醇20μl作为阳性药物对照，对照组细胞则加入20μl培养基。

（4）药物加完后加入80μl DMEM培养基将体系补充至200μl.

（5）将细胞培养在37℃、5%CO₂及饱和湿度环境下，在24h，48h，72h和96h四个时间点在普通光学显微镜下观察细胞形态变化并拍照。

1.2.4小分子PI荧光染色实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜通透性的影响

PI是一种小分子荧光染料，可以通过破损的细胞膜进入细胞核中与核内染色物质结合,但是完整的细胞膜不能摄入PI.

（1）收集对数生长期的MEL细胞，1000转离心3分钟，弃掉旧培养基，加适量新鲜培养基进行细胞计数。

（2）将细胞浓度均调整为3×10⁴/ml接种于96孔板中，每孔100μl,则为3000个细胞每孔。

（3）悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽20μl，对照组细胞则加入20μl培养基。

（4）药物加完后加入80μl DMEM培养基将体系补充至200μl.

（5）将细胞培养在37℃、5%CO₂及饱和湿度环境下，在12h时吸掉培养基，加入稀释后的PI染液50μl，37℃、5%CO₂及饱和湿度环境下培养10分钟后于荧光显微镜下观察。

（6）在GREEN滤光片下观察细胞内荧光变化情况。

1.2.5扫描电镜实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜的作用

（1）用多聚赖氨酸包被玻片，备用。

（2）收集对数生长期的细胞，1000转离心3分钟，弃掉旧培养基，加适量新鲜培养基进行细胞计数。

（3）先把包被好的玻片置于24孔板中，再将细胞浓度均调整为3×10⁴/ml接种于24孔板中，每孔400μl,则为12000个细胞每孔。

（4）悬浮细胞铺完后立即加入稀释为不同浓度的两种抗菌肽80μl，对照组细胞则加入80μl培养基。

（5）药物加完后加入520μl DMEM培养基将体系补充至1000μl.

（6）将细胞培养在37℃、5%CO₂及饱和湿度环境下24h.

（7）加入1ml PBS漂洗5分钟，洗两次，洗掉培养基。

（8）每孔加入1ml3%戊二醛溶液，4度固定2小时。吸掉戊二醛，PBS洗两次。

（9）每孔加入1ml2%四氧化锇溶液，4度固定2小时。吸掉2%四氧化锇溶液，PBS洗两次。

（10）乙醇梯度脱水：50%-70%-80%-90%-100%每次5分钟。

（11）乙腈置换：50%-70%-80%-90%-100%每次15分钟至纯乙腈时将乙腈吸干，保鲜膜封口，扎小洞。

（12）在冻干机里干燥大约45分钟，样品达到完全干燥。

（13）镀金膜。

（14）Hitachi S-4800扫描电子显微镜检测细胞膜变化。

2.实验结果

2.1MTT法检测抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞生长的抑制作用

MTT实验结果显示抗菌肽Anoplin在24h，48h，72h和96h能剂量和时间依赖的抑制肿瘤细胞MEL（图1A），K562（图1B），TE-1（图1C）和Bel-7404（图1D）的增殖。

2.2普通光学显微镜观察抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞形态和数量的影响

通过普通光学显微镜实时观察能更直观的显示出抗菌肽Anoplin对肿瘤细胞增殖的抑制作用，见图2。

2.3小分子PI荧光染色实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜通透性的影响

通过PI摄取实验发现，抗菌肽Anoplin处理后肿瘤细胞的细胞膜的通透性发生了明显变化。Anoplin未处理的对照细胞在荧光显微镜下看不到荧光，而加了Anoplin处理的肿瘤细胞除了了明显的红色荧光，且红色荧光的数量随着药物浓度的增加而加强，见图3。

2.4扫描电镜实验观察抗菌肽Anoplin对细胞膜的作用

进一步用扫描电镜实验研究发现，抗菌肽Anoplin处理肿瘤细胞后，细胞膜发生了明显变化。未处理的对照细胞细胞膜表面光滑，可见大量微绒毛，而抗菌肽Anoplin处理后的肿瘤细胞的细胞膜出现了孔洞，断裂，形态不规则等变化，见图4。可见抗菌肽抑制肿瘤细胞的增殖主要是通过破坏肿瘤细胞的细胞膜而起作用的。

综上可见，抗菌肽Anoplin对所测试的四种肿瘤细胞都具有抑制其生长的作用。且其抑制机理可能是通过破坏肿瘤细胞的细胞膜结构而实验的。

本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。

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Claims (4)

1.蜂毒抗菌肽Anoplin在制备用于治疗受试者中食管癌症、缓解受试者中食管癌症状或抑制食管癌细胞增殖的药物中的用途。

2.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的受试者为哺乳动物。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的哺乳动物为人。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述的蜂毒抗菌肽Anoplin是PEG化的。