具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的描述,本发明的保护范围不局限于以下所述:
实施例1:小分子多肽ZY13的制备
1.称取树脂0.2g放置于干燥洁净的反应管中,加入适量的N,N-二甲基酰胺(DMF),活化30min。称取第一氨基酸残基1mmol,4-二甲氨基吡啶(DMAP)150mg加入到反应管中,DMF做为溶剂反应3h,反应完毕后用DMF洗3-6次,加入适当的吡啶和乙酸酐,体积比为1:1,反应30min,反应完毕后DMF洗3-6次。然后用哌啶洗脱氨基酸的保护基团Fmoc,洗脱两次,每次15min,再用DMF洗4次,甲醇洗2次;
2.称第二个氨基酸3mmol,HBTU3mmol于反应管中,加入DIEA0.5ml,反应40min,用DMF洗3-6次,加入哌啶溶液两次洗脱氨基酸的保护基团Fmoc,每次10min,再用DMF洗4次,甲醇洗2次;
3.重复第二个步骤直到最后一个氨基酸残基;
4.最后一个氨基酸反应完毕后,用三氟乙酸切割2h,反应抽滤,得到多肽的三氟乙酸溶液,用乙醚沉淀,离心,再用乙醚洗3-5遍,得到白色固体,经过HPLC脱盐冻干得到多肽样本。
实施例2:小分子多肽ZY13抗菌实验
1.分别制备大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌菌液,37℃恒温培养18h,备用;
2.配制浓度为0.8~20μg/ml小分子多肽ZY13溶液,将直径为5~7mm的圆形定性滤片消毒烘干后浸入上述不同浓度的小分子多肽ZY13溶液中;
3.制备高柱肉汤琼脂培养基,灭菌,备用;
4.溶化高柱肉汤琼脂培养基,冷却至50℃,分别加入大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌菌液1ml,轻摇均匀,倒入无菌平皿,轻晃使培养基均匀平铺在平皿上;
5.用消毒过的镊子将滤片整齐、有序的放入冷却的平皿内,盖上陶瓦盖,并做标记,置于37℃恒温培养箱内培养24h;
6.用卡尺测量抑菌圈大小,并比较不同浓度小分子多肽ZW13对不同细菌的作用强度,结果如表1、表2。
表1:
微生物 |
最低抑菌浓度(μg/ml) |
大肠杆菌 |
18.75 |
白色念珠菌 |
1.17 |
金黄色葡萄球菌 |
2.34 |
枯草杆菌 |
1.17 |
如表1所示:小分子多肽ZY13对大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为18.75μg/ml、1.17μg/ml、2.34μg/ml、1.17μg/ml。
表2:
微生物 |
最低抑菌浓度(μg/ml) |
金黄色葡萄球菌(09B2499) |
2.34 |
溶血性葡萄球菌(09A4394抗氨苄) |
4.7 |
表皮葡萄球菌(09A3726抗氨苄) |
4.7 |
科氏葡萄球菌(09B2490抗氨苄) |
1.17 |
如表2所示:小分子多肽ZY13对痤疮有关的金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为2.34μg/ml、4.7μg/ml、4.7μg/ml、1.17μg/ml。实验结果表明:小分子多肽ZY13具有显著的抑菌作用。
实施例3:小分子多肽ZY13对小鼠耳痤疮模型的治疗作用
1.用脑心浸液培养基培养痤疮丙酸杆菌ATCC11817,培养至对数期,生理盐水洗涤2次,生理盐水重悬至5×108CFU/ml;
2.选取重量为18g的雄性小鼠,昆明种,随机分为3组,每组6只,分别为治疗组、阳性对照组、阴性对照组,每只腹腔注射120μl、1%的戊巴比妥钠进行麻醉,然后在小鼠左耳皮内注射重悬后的菌液20μl/只;
3.用聚乙二醇、甘油将小分子多肽ZY13、克林霉素分别配制成2mg/ml软膏,其中聚乙二醇与甘油的重量份比为5:1,涂擦小鼠左耳皮肤表面,治疗组涂擦小分子多肽ZY13,阳性对照组涂擦克林霉素,阴性对照组涂擦聚乙二醇,每8h一次,共给药3次,24h后处死小鼠;
4.用干净的酒精棉球消毒小鼠左耳,剪下左耳并剪碎,转移至匀浆器中充分匀浆,1只耳朵加入1ml生理盐水匀浆;
5.稀释匀浆液至1000倍,取50μl稀释液涂脑心浸液培养基平板,37℃厌氧培养72h,计数菌落。结果如图1所示:给予2mg/ml的小分子多肽ZY13治疗后痤疮丙酸杆菌的菌落数为2.4×105,给予2mg/ml克林霉素治疗后痤疮丙酸杆菌的菌落数为5.6×105,给予聚乙二醇治疗后痤疮丙酸杆菌的菌落数为9.44×105,表明:ZY13对小鼠耳痤疮治疗效果明显好于克林霉素。
实施例4:小分子多肽ZY13对小鼠耳痤疮模型炎症的治疗作用
1.用脑心浸液培养基培养痤疮丙酸杆菌ATCC6919,培养至对数期,生理盐水洗涤2次,生理盐水重悬至5×108CFU/ml;
2.选取重量为18g的雄性小鼠,昆明种,随机分为3组,每组9只,分别为治疗组、阳性对照组、阴性对照组,每只腹腔注射50μl的氯胺酮进行麻醉,然后在小鼠左耳皮内注射重悬后的菌液20μl/只;
3.用聚乙二醇将小分子多肽ZY13、克林霉素分别配制成2mg/ml软膏,其中聚乙二醇与甘油的重量份比为5:1,涂擦小鼠左耳皮肤表面,治疗组涂擦小分子多肽ZY13,阳性对照组涂擦克林霉素,阴性对照组涂擦聚乙二醇,每8h一次,共给药3次,24h后处死小鼠;
4.用干净的酒精棉球消毒小鼠左耳,测量小鼠耳朵厚度,结果如图2所示:治疗前的小鼠耳朵厚度均为0.20mm,给予2mg/ml的小分子多肽ZY13治疗1天后小鼠耳朵的厚度0.26mm,给予2mg/ml克林霉素治疗1天后小鼠耳朵厚度为0.33mm,给予聚乙二醇治疗1天后小鼠耳朵的厚度为0.42mm,表明:ZY13消炎效果明显好于克林霉素。
实施例5:小分子多肽ZY13抗肺癌肿瘤细胞A549活性实验
1.收集对数期肺癌肿瘤细胞A549,制成细胞悬液,调整其浓度至5×106~10×106个/ml,每孔加入100μl,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,边缘孔用无菌PBS填充;
2.5%CO2、37℃孵育,至细胞单层铺满96孔平地板孔底,待细胞贴壁2~12h后加入浓度为100μg/ml、200μg/ml的小分子多肽ZY13、浓度为10μg/ml和5μg/ml的紫杉醇,5%CO2、37℃孵育16~48h,倒置显微镜下观察;
3.每孔加入20μl、5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h,吸取孔内培养液;
4.每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值,同时设置调零孔、对照孔,结果如图3所示:200μg/ml的ZY13作用于肺癌细胞A549后OD值为0.3,100μg/ml的ZY13作用于肺癌细胞A549后OD值为0.5;10μg/ml的紫杉醇作用于癌细胞肺癌细胞A549后OD值为0.5,10μg/ml的紫杉醇作用于癌细胞肺癌细胞A549后OD值为0.7,表明:ZY13对肺癌肿瘤细胞A549有明显的抑制作用。
实施例6:小分子多肽ZY13抗乳腺癌细胞MDA-435活性实验
1.收集对数期乳腺癌细胞MDA-435制成细胞悬液,调整其浓度至5×106~10×106个/ml,每孔加入100μl,铺板使待测细胞调密度至1000~10000孔,边缘孔用无菌PBS填充;
2.5%CO2、37℃孵育,至细胞单层铺满96孔平地板孔底,待细胞贴壁2~12h后加入浓度为50~300μg/ml的小分子多肽ZY13、对照为同体积的生理盐水,5%CO2、37℃孵育16~48h,倒置显微镜下观察;
3.每孔加入20μl、5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h,吸取孔内培养液;
4.每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值,同时设置调零孔、对照孔,结果如图4所示:300μg/ml的ZY13作用乳腺癌细胞MDA-435后OD值为0.17,200μg/ml的ZY13作用乳腺癌细胞MDA-435后OD值为0.20,100μg/ml的ZY13作用乳腺癌细胞MDA-435后OD值为0.61,50μg/ml的ZY13作用乳腺癌细胞MDA-435后OD值为0.7,表明:ZY13对乳腺癌细胞MDA-435的抑制具有浓度依赖性。
实施例7:小分子多肽ZY13抗黑色素瘤细胞A357活性实验
1.收集对数期黑色素瘤细胞A357,制成细胞悬液,调整其浓度至5×106~10×106个/ml,每孔加入100μl,铺板使待测细胞调密度至1000~10000孔,边缘孔用无菌PBS填充;
2.5%CO2、37℃孵育,至细胞单层铺满96孔平地板孔底,待细胞贴壁2~12h后加入浓度为100μg/ml、200μg/ml的小分子多肽ZY13、对照为同体积的生理盐水,5%CO2、37℃孵育16~48h,倒置显微镜下观察;
3.每孔加入20μl、5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h,吸取孔内培养液;
4.每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值,同时设置调零孔、对照孔,结果如图5所示:100μg/ml的ZY13作用黑色素瘤细胞A357后OD值为1.0,200μg/ml的ZY13作用黑色素瘤细胞后OD值为0.72,生理盐水作用黑色素瘤细胞后OD值为1.0。表明:200μg/ml的ZY13对黑色素瘤有明显抑制作用。
实施例8:小分子多肽ZY13抗肝癌细胞HepG2活性实验
1.收集对数期肝癌细胞HepG2,制成细胞悬液,调整其浓度至5×106~10×106个/ml,每孔加入100μl,铺板使待测细胞调密度至1000~10000孔,边缘孔用无菌PBS填充;
2.5%CO2、37℃孵育,至细胞单层铺满96孔平地板孔底,待细胞贴壁2~12h后加入浓度为100μg/ml、200μg/ml的小分子多肽ZY13、对照为同体积的生理盐水,5%CO2、37℃孵育16~48h,倒置显微镜下观察;
3.每孔加入20μl、5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h,吸取孔内培养液;
4.每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值,同时设置调零孔、对照孔,结果如图6所示:100μg/ml的ZY13作用肝癌细胞HepG2后OD值为0.89,200μg/ml的ZY13作用肝癌细胞HepG2后OD值为0.6,生理盐水作用肝癌细胞HepG2后OD值为1.0,表明:200μg/ml和100μg/ml的ZY13对肝癌细胞HepG2有明显的抑制作用。
实施例9:小分子多肽ZY13抗胃癌细胞SGC7901活性实验
1.收集对数期胃癌细胞SGC7901,制成细胞悬液,调整其浓度至5×106~10×106个/ml,每孔加入100μl,铺板使待测细胞调密度至1000~10000孔,边缘孔用无菌PBS填充;
2.5%CO2、37℃孵育,至细胞单层铺满96孔平地板孔底,待细胞贴壁2~12h后加入浓度为50~300μg/ml的小分子多肽ZY13、对照为同体积的生理盐水,5%CO2、37℃孵育16~48h,倒置显微镜下观察;
3.每孔加入20μl、5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h,吸取孔内培养液;
4.每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值,同时设置调零孔、对照孔,结果如图7所示:50μg/ml的ZY13作用胃癌细胞SGC7901后OD值为0.65,100μg/ml的ZY13作用胃癌细胞SGC7901后OD值为0.57,200μg/ml的ZY13作用胃癌细胞SGC7901后OD值为0.2,300μg/ml的ZY13作用胃癌细胞SGC7901后OD值为0.09,表明:ZY13对肝癌细胞胃癌细胞SGC7901有明显的抑制作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川科伦新光生物科技开发有限公司 中国科学院昆明动物研究所
<120> 一种小分子多肽ZY13及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Lys Arg Trp Lys Lys Trp Arg Trp Lys Trp Lys Lys Trp Val
1 5 10 15