CN103127493B - 多肽Cbf-K16抗肿瘤药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种多肽的用途，即多肽Cbf-K₁₆具有抗肿瘤作用的用途，多肽Cbf-K₁₆的氨基酸序列如SEQ ID：NO.1所示。

Description

多肽Cbf-K16抗肿瘤药物的用途

技术领域：

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种多肽的用途，即多肽Cbf-K₁₆具有抗肿瘤作用的用途。 

背景技术：

抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，广泛存在于生物体内，通常带正电，富含疏水碱基，能形成两亲性结构，具有广谱性、高效性、稳定性等特点。研究证实抗菌肽不仅具有杀菌作用，还具有抑制或杀伤真菌、寄生虫、病毒以及肿瘤细胞等作用。 

Cathelicidin家族，是一类C端含有高度特异的成熟肽段而N端有一段Cathelin结构域的抗菌肽家族，主要发现于哺乳动物，已证实具有广谱抗菌活性。 

多肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽，是金环蛇基因编码的一种N端有α螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点为11.79。发明人前期研究中，针对多肽Cathelicidin-BF将其部分活性氨基酸位点进行突变，采用固相化学合成法获得对耐药性病原菌具有高抑制活性的抗菌多肽，简称多肽Cbf-K₁₆，其分子量3637.63Da，氨基酸序列如SEQ ID：NO.1所示，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。该技术记载于中国专利申请CN2012101719018中。 

发明内容

本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID：NO.1所示的多肽具有抗肿瘤的功效。药效学实验表明，多肽Cbf-K₁₆具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用来制备抗肿瘤药物。所述肿瘤优选肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤。 

下面是本发明的部分药效学实验及结果。 

一、多肽Cbf-K₁₆对不同肿瘤细胞的体外生长抑制作用 

胰酶消化对数生长期的人肺癌H460细胞、鼠肺癌Lewis细胞、人前列腺癌PC-3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、鼠黑色素瘤B16F10细胞、鼠黑色素瘤B16细胞、人黑色素瘤A375 细胞、人肝癌HepG2细胞（人肺癌H460细胞、鼠肺癌Lewis细胞、鼠黑色素瘤B16细胞用含有10%FBS的RPMI-1640培养基，人乳腺癌MCF-7细胞用含有10%FBS的RPMI-1640培养基，人前列腺癌PC-3细胞用含10%FBS的F12培养基，鼠黑色素瘤B16F10细胞用含有10%NBS的RPMI-1640培养基，人肝癌HepG2细胞、人黑色素瘤A375细胞用含10%FBS的DMEM培养基），细胞用各自培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μl，每组设3复孔。置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中继续培养，培养24h待细胞贴壁后，实验组加入用培养基稀释的不同浓度Cbf-K₁₆或多肽Cathelicidin-BF 20μl/孔（终浓度分别为5、10、20、40、80μM）。实验设置含RPMI-1640全培养基对照和未给予药物作用的空白对照。37℃、5%CO₂培养48h后，每孔加入5mg/ml的MTT 15μl，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中继续培养4h，离心，仔细吸去上清，每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡使甲臜完全溶解，在490nm波长处用酶标仪测吸光值并计算。 

结果见附图1和2，图1和图2表明，在40μM浓度范围内多肽Cbf-K₁₆对肿瘤细胞：人肺癌H460细胞、鼠肺癌Lewis细胞、鼠黑色素瘤B16F10细胞、鼠黑色素瘤B16细胞、人前列腺癌PC-3细胞、人肝癌HepG2细胞有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，且量效关系明显。突变后多肽Cbf-K₁₆对肿瘤细胞的抑制作用较多肽Cathelicidin-BF均有所增强作用，特别是针对人肺癌H460细胞，人肝癌HepG2细胞，人乳腺癌MCF7细胞等细胞。多肽Cbf-K₁₆对各细胞株的IC50值如表1所示： 

表1 多肽Cbf-K₁₆对各细胞株的IC50值 

二、多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞、鼠肺癌Lewis细胞体外形态学变化影响 

取对数生长期的Lewis细胞、H460细胞，用含有10%FBS的RPMI-1640培养调整细胞 浓度为5×10⁴个/ml，均匀铺至96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μl，并加入用培养液稀释的不同浓度Cbf-K₁₆20μl/孔（终浓度分别为0、5、10、20、40、80μM），培养液调零，37℃、5%CO₂培养48h，培养结束后，置于倒置显微镜下观察细胞形态变化，并拍照。 

按照上述方法，结果如附图3所示，多肽Cbf-K₁₆在10μM之后即对细胞形态产生明显的变化。具体表现为：细胞皱缩，边缘不清晰，贴壁细胞数明显减少以及细胞膜裂解。 

三、多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞体外生长抑制的时间和剂量依赖关 

取对数生长期的人肺癌H460细胞，用含有10%FBS的RPMI-1640培养调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，于96孔培养板中加入细胞悬液100μl，并加入用培养液稀释的不同浓度Cbf-K₁₆20_μl/孔（终浓度分别为0、10、20、40、80μM），培养液调零，37℃、5%CO₂培养不同时间（12h、24h、48h），培养结束后，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4h，离心，仔细吸去上清，每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，计算细胞活率。 

结果如附图4所示，表明多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞的抑制作用具有明显的时间和剂量依赖关系。随着时间增加，相同剂量下多肽Cbf-K₁₆对H460细胞的抑制作用加强。在相同时间下，随着剂量增加，多肽Cbf-K₁₆对H460细胞的杀伤作用明显增强。 

四、多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞超微结构的影响 

接种于对数生长期的细胞到75cm²培养瓶中，24h后加入500μl Cbf-K₁₆，多肽终浓为0、20、40μM加入收集对数生长期H460细胞，处理24h，弃去旧培养基，胰酶消化收集细胞，室温1500r/min离心，离心5min。弃去上清，加入2.5%戊二醛固定细胞团，4℃过夜。弃掉固定液，用PBS缓冲液洗涤2次。1%锇酸固定，4℃处理1h。用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗15min三次，1%锇酸固定液固定2-3h。再次漂洗。然后用乙醇梯度脱水。分别为：50%乙醇15-20min，70%乙醇15-20min，90%乙醇15-20min，90%乙醇：90%丙酮（1:1）15-20min，90%丙酮15-20min，低温4℃进行，100%丙酮室温15-20min三次。然后进行包埋，用纯丙酮和包埋液进行包埋，包埋后进行固定，分别在37℃烘箱过夜，45℃烘箱12h，60℃烘箱24h。然后用JEM-1011切片机切片，最后加入醋酸铀-枸橼酸铅双染色。透射电镜观察，拍片。鉴定细胞超微结构的特征。 

结果如附图5所示，图5表明多肽Cbf-K₁₆体外对人肺癌H460细胞杀伤作用明显，且主要是通过破膜发挥抗肿瘤作用。透射电镜结果表明，多肽Cbf-K₁₆在20及40μM浓度范围内，对H460细胞膜破碎明显。且多肽Cbf-K₁₆对细胞线粒体有作用，与空白对照相比，线粒体发生不同程度的肿胀。在电镜照片中，未发现明显的凋亡小体，证明多肽Cbf-K₁₆对肿瘤细 胞抑制作用不是通过凋亡通道发挥作用的。 

五、多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞和原代小鼠脾细胞的LDH释放的影响 

取对数生长期H460细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用含10%FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，将细胞接种至96孔板中，每孔100μl。置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中继续培养，24h后，细胞贴壁。多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞凋亡的影响每孔加入多肽Cbf-K₁₆（0、20、40、80μM）20μl，分别刺激12h、24h、48h。收集细胞培养液上清。 

测定时，分为空白孔，标准孔，测定孔和对照孔4组。按照下表进行操作。 

结果见附图6，图6表明LDH实验结果进一步验证了多肽Cbf-K₁₆对肿瘤细胞是通过破膜作用的结论，在80μM浓度范围内，在24h及48h的时间范围内对H460细胞的LDH的释放作用呈剂量和时间依赖关系明显，与同一时间点的空白对照组相比，有统计学差异（^*P<0.01）。以上结果表明多肽Cbf-K₁₆抗肿瘤机理是通过破膜作用。 

六、多肽Cbf-K₁₆与人肺癌H460细胞基因组DNA的作用 

取对数生长期H460细胞，离心收集，然后用1ml PBS重悬，调整细胞浓度约为1×10⁶个/ml，用4℃预冷PBS洗涤两遍，离心收集。加入0.5ml含100μg/ml蛋白酶K和20μg/ml RNase A的DNA提取缓冲液，宽口移液器缓慢混匀，50℃水浴3h，期间不时缓慢颠倒混匀。 冷却至室温后加等体积的酚氯仿异戊醇溶液（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1），缓慢颠倒混匀5min。8000r/min离心10min，取上清。用等体积的氯仿异戊醇溶液（氯仿:异戊醇=24:1）抽提，取上清。若蛋白多可重复抽提1-2次。加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）与2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。-20℃放置30min。12000r/min室温离心10min，弃上清。用1ml 70%的乙醇洗沉淀2次，12000rpm离心3min，室温下干燥10min。溶于50μl TE中。将提取后DNA与不同浓度多肽Cbf-K₁₆（0、5、10、20μM），37℃恒温孵育30min。将样品进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，100v恒压电泳30min，利用凝胶成像仪观察实验结果。 

结果见如图7，图7表明多肽Cbf-K₁₆可以与肿瘤细胞DNA结合。与对照相比，低浓度的多肽Cbf-K₁₆部分与基因组DNA结合，可轻微阻滞DNA在琼脂糖凝胶中迁移，而高浓度的多肽Cbf-K₁₆可显著阻滞DNA在琼脂糖凝胶中迁移，与空白DNA对照有明显区别。 

七、多肽Cbf-K₁₆对绵羊红细胞溶血的影响 

将绵羊全血（脱纤维）经离心（3000r/min，10min），离心后，自上而下第2层(乳白色细胞层)为单核细胞，最底层为红细胞；沉积的红细胞0.3ml置于10ml的PBS悬液中，制成体积分数为3%的血红细胞悬取。将血红细胞悬浮液加入96孔细胞培养板中，每孔50μl，再向各孔中加入50μl经倍比稀释的多肽Cbf-K₁₆，各孔中抗菌肽的终浓度分别为0、5、10、20、40、80μM。阳性对照为Triton X-100，阴性对照为生理盐水。培养板置于37℃培养4h，经离心，取上清液进行酶标仪，波长为576nm。以阳性对照组为标准，计算多肽Cbf-K₁₆对绵羊血红细胞的溶血作用。 

溶血率（%）=（A实验组-A阴性对照组）/A阳性对照组×100% 

结果见附图8，图8表明多肽Cbf-K₁₆对新鲜的绵羊血红细胞的溶血性很低，在80μM以后才表现出轻微的溶血特性，在低浓度时，无明显的溶血性，多肽Cbf-K₁₆可作为制备抗肿瘤药物。 

八、多肽Cbf-K₁₆对原代小鼠脾细胞的影响 

取ICR雄性小鼠一只，颈部脱臼处死，无菌制备脾淋巴细胞悬液，用含有10%FBS的RPMI-1640培养液重悬，置细胞瓶中培养过夜，于24h后，取上层悬浮细胞，离心后调整细胞浓度为5×10⁶个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl细胞悬液，然后加入各浓度梯度药物，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中继续培养，48h后每孔加入5mg/ml的MTT 15_μl，继续培养4h，离心弃上清，每孔加入150μl DMSO，酶标仪490nm处测吸光值。 

结果见附图9，图9表明低浓度多肽Cbf-K₁₆对原代小鼠脾细胞无明显毒性，甚至略有诱导脾细胞增殖的活性。在高浓度时，多肽Cbf-K₁₆对原代小鼠脾细胞才表现出杀伤作用。 

附图说明

图1是多肽Cbf-K₁₆对不同肿瘤细胞的体外生长抑制作用 

图2是多肽Cbf-K₁₆与多肽Cathelicidin-BF IC50的比值变化 

图3是多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞及鼠肺癌Lewis细胞形态的影响 

图4是多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞抑制作用的量效和时效关系 

图5是多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞超微结构的影响 

图6是多肽Cbf-K₁₆对人肺癌H460细胞LDH释放的影响 

图7是多肽Cbf-K₁₆与人肺癌H460细胞基因组DNA的作用 

图8是多肽Cbf-K₁₆对原代小鼠脾细胞的毒性 

图9是多肽Cbf-K₁₆对绵羊红细胞溶血的影响 

Claims (2)

1.氨基酸序列如SEQ ID：NO.1所示的多肽用于制备治疗肿瘤疾病的药物的用途。

2.权利要求1的用途，其中肿瘤疾病是肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤。