CN109674772B - 一种胡蜂针贴及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胡蜂针贴及其制备方法,涉及医药用品技术领域,所述胡蜂针贴,由包括以下质量份的组分制备而成:胡蜂毒1~50份、成膜材料5~18份、助溶剂15~28份、保湿剂1~15份、增塑剂1~15份、表面活性剂0.1~2份、透皮吸收促进剂0.1~8份和水30~150份。本发明提供的胡蜂针贴用于抗脑缺血,保护神经损伤;而且,该蜂针贴无过敏、无刺激、使用方便。
Description
技术领域
本发明涉及医药用品技术领域,具体涉及一种胡蜂针贴及其制备方法。
背景技术
随着人类生存环境和生活习惯的改变,心脑血管疾病的发病率呈上升趋势,已成为世界上三大致残、死亡病因之一。脑血管疾病严重威胁着人类的生命,主要以缺血性脑卒中疾病为主,缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)又名脑梗塞/死,是指由于脑部血液供应障碍,缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化。目前临床使用的治疗药物主要分为以下几类:溶栓药物、抗血小板聚集药物、降纤药物、抗凝药物和神经保护药物等,大多以口服和注射为主。而口服易发生胃肠道反应,药物的残留对人体健康也会产生危害。注射给药安全性最低、风险最大,易发生多种副反应。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种蜂针贴剂,该贴剂具有抗菌消炎、低残留、使用方便的特点。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种胡蜂针贴,由包括以下质量份的组分制备而成:胡蜂毒1~50份、成膜材料5~18份、助溶剂15~28份、保湿剂1~15份、增塑剂1~15份、表面活性剂0.1~2份、透皮吸收促进剂0.1~8份和水30~150份。
优选地,所述胡蜂毒包括大胡蜂属中的蜂毒、侧异腹胡蜂属中的蜂毒和马蜂科中的蜂毒中的一种或几种。
优选地,所述成膜材料包括聚乙烯醇、聚乙烯醇缩甲乙醛或聚乙烯醇缩甲丁醛。
优选地,所述助溶剂包括乙醇、丙酮或乙酸乙酯。
优选地,所述保湿剂包括甘油、丙二醇、丁二醇、聚乙二醇、山梨醇、甜菜碱和尿素中的一种或几种。
优选地,所述增塑剂包括甘油、松节油、丙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二乙酯、三乙酸甘油酯和柠檬酸三乙酯中的一种或几种。
优选地,所述表面活性剂包括聚山梨酯或脂肪酸山梨坦。
优选地,所述透皮吸收促进剂包括1,2-丙二醇、冰片和氮酮中的一种或几种。
本发明还提供了一种上述技术方案所述胡峰针贴的制备方法,包括以下步骤:
(1)将所述成膜材料与水混合后,依次进行溶胀和油浴,得到凝胶溶液;所述成膜材料与水的质量比为1~7:25;所述溶胀的时间为20~28h;
(2)将所述助溶剂、保湿剂、增塑剂、表面活性剂和透皮吸收促进剂混合,得到第一预混料;
(3)将所述胡蜂毒与水混合溶解,得到第二预混料;所述胡蜂毒与水的质量比为0.6~1:1;
(4)将所述步骤(2)得到的第一预混料、步骤(3)得到的第二预混料与步骤(1)得到的凝胶溶液混合,得到胡蜂针贴;
所述步骤(1)~(3)之间无时间顺序限定。
优选地,所述步骤(1)油浴的温度为75~95℃。
本发明的胡蜂针贴中含有胡蜂毒,具有治疗脑缺血以及良好的抗氧化效果,使用时涂于患处,形成药膜保护创面,且耐磨性能好,不易脱落。本发明的胡蜂针贴可使血药水平较长时间保持在有效浓度范围内,避免药物在胃肠道及肝的首过效应,改善病人的顺应性。本发明的胡蜂针贴中膜的形成减少了皮肤表面水分的蒸发,促进了水合作用和溶解角质作用,使药物透过角质层逐渐释放药物,更好的发挥治疗作用。本发明的胡蜂针贴可随时终止给药,安全性高,如有副作用,容易及时移去制剂,减少了口服及注射给药不能终止的危险性。本发明中的原料资源来源丰富,制备工艺简单,易于大规模生产,且制备过程中无污染。
附图说明
图1为胡蜂针贴工艺流程图;
图2为皮肤刺激性试验验证图;
图3为TTC染色图,其中,A:假手术组 B:基质模型组 C:依达拉奉组 D:胡蜂针贴剂高剂量组 E:胡蜂针贴剂中剂量组 F:胡蜂针贴剂低剂量组;
图4为胡蜂针贴对大鼠脑缺血再灌注海马CA1区HE染色图,其中,A:假手术组 B:基质模型组 C:依达拉奉组 D:胡蜂针贴高剂量组 E:胡蜂针贴中剂量组 F:胡蜂针贴低剂量组 2.“→”表示神经元,“○”表示小胶质细胞;
图5为胡蜂针贴对大鼠脑缺血再灌注海马CA1区尼氏染色图,其中,A:假手术组 B:基质模型组 C:依达拉奉组 D:胡蜂针贴高剂量组 E:胡蜂针贴中剂量组 F:胡蜂针贴低剂量组“→”表示神经元,“○”表示小胶质细胞。
具体实施方式
本发明提供了一种胡蜂针贴,由包括以下质量份的组分制备而成:胡蜂毒1~50份、成膜材料5~18份、助溶剂15~28份、保湿剂1~15份、增塑剂1~15份、表面活性剂0.1~2份、透皮吸收促进剂0.1~8份和水30~150份。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份数为1~50份的胡蜂毒,优选为10~40份,更优选为20份。本发明对所述胡蜂毒的种类没有特殊限定,所述胡蜂毒包括大胡蜂属Vespaspp.中的蜂毒、侧异腹胡蜂属Parapolybia spp.中的蜂毒和马蜂科Polistidae中的蜂毒中的一种或几种,当所述胡蜂毒优选为两种或以上时,各组分优选以等质量比进行混合。本发明对所述胡蜂毒的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。在本发明实施例中,所述胡蜂毒优选精制的胡蜂毒。所述精制胡蜂毒的制备方法,包括以下步骤:
(1)将胡蜂毒与水混合,得到第一混悬液;
(2)将所述步骤(1)得到的第一混悬液于4℃,4000~6000rpm离心3~8min,得到第一上清液和第一沉淀;
(3)将所述步骤(2)得到的第一沉淀与水混合,得到第二混悬液;
(4)将所述步骤(3)得到的第二混悬液于4℃,4000~6000rpm离心3~8min,得到第二上清液和第二沉淀;
(5)将所述得到的第一上清液和第二上清液混合,过滤,得到澄清液;
(6)将所述步骤(5)中得到的澄清液在-75~-85℃,冷冻5~7h,得到预冻物;
(7)将所述步骤(6)得到的预冻物在温度不高于-80℃,真空度不高于5mTorr的条件下,冻干45~50h,得到冻干粉;
(8)将所述步骤(7)得到的冻干粉,过筛,即得精制胡蜂毒。
本发明将胡蜂毒与水混合,得到第一混悬液。
本发明对所述水的种类没有特殊限定,优选采用超纯水。本发明所述胡蜂毒与水优选以质量体积比为1g:8~25mL进行混合。本发明对所述胡蜂毒与水混合的方式没有特殊限定,优选采用搅拌混合,所述搅拌的转速优选250~350rpm,更优选300rpm;所述搅拌的时间优选20~40min,更优选30min;本发明对所述搅拌混合的温度没有特殊限定,优选在20~30℃下进行。
在本发明中,所述胡蜂毒与水混合,优选将水加入胡蜂毒中。
本发明将得到的第一混悬液于4℃,4000~6000rpm离心3~8min,得到第一上清液和第一沉淀。
本发明所述离心的转速优选4000~6000rpm,更优选5000rpm;所述离心的时间优选3~8min,更优选5min。
本发明将得到的第一沉淀与水混合,得到第二混悬液。
本发明所述第一沉淀与水优选以质量体积比为1g:8~25mL进行混合。本发明对所述第一沉淀与水混合的方式没有特殊限定,优选采用搅拌混合,所述搅拌的转速优选250~350rpm,更优选300rpm;所述搅拌的时间优选20~40min,更优选30min;
本发明对所述搅拌混合的温度没有特殊限定,优选在20~30℃下进行。
本发明将得到的第二混悬液于4℃,4000~6000rpm离心3~8min,得到第二上清液和第二沉淀。
本发明所述离心的转速优选4000~6000rpm,更优选5000rpm;所述离心的时间优选3~8min,更优选5min。
本发明将所述得到的第一上清液和第二上清液混合,过滤,得到澄清液。
本发明所述过滤优选采用0.22μm/0.45um滤膜进行过滤。
本发明将得到的澄清液在-75~-85℃,冷冻5~7h,得到预冻物。
本发明所述冷冻的温度优选为-75~-85℃,更优选-80℃;所述冷冻的时间优选为5~7h,更优选为6h。
本发明将得到的预冻物在温度不高于-80℃,真空度不高于5mTorr的条件下,冻干45~50h,得到冻干粉。
本发明所述冻干的时间优选为45~50h,更优选为48h。
本发明将得到的冻干粉,过筛,即得精制胡蜂毒。
本发明所述冻干粉过筛后,得到的精制胡蜂毒的粒径优选为≦150μm。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份为5~18份的成膜材料,优选为6~17份,更优选为16份。本发明对所述成膜材料的种类没有特殊限定,优选聚乙烯醇、聚乙烯醇缩甲乙醛或聚乙烯醇缩甲丁醛。本发明对所述成膜材料的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份为15~28份的助溶剂,优选为18~26份,更优选为24份。本发明对所述助溶剂的种类没有特殊限定,优选乙醇、丙酮或乙酸乙酯。本发明对所述助溶剂的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份为1~15份的保湿剂,优选为5~12份,更优选为10份。本发明对所述保湿剂的种类没有特殊限定,优选甘油、丙二醇、丁二醇、聚乙二醇、山梨醇、甜菜碱和尿素中的一种或几种;当所述保湿剂优选为两种或以上时,所述各成分以等质量比进行混合。本发明对所述保湿剂的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份为1~15份的增塑剂,优选为5~12份,更优选为10份。本发明对所述增塑剂的种类没有特殊限定,优选甘油、松节油、丙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二乙酯、三乙酸甘油酯和柠檬酸三乙酯中的一种或几种;当所述增塑剂优选为两种或以上时,所述各成分以等质量比进行混合。本发明对所述增塑剂的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份为0.1~2份的表面活性剂,优选为1.2~1.8份,更优选为1.5份。本发明对所述表面活性剂的种类没有特殊限定,优选聚山梨酯或脂肪酸山梨坦。本发明对所述表面活性剂的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份为0.1~8份的透皮吸收促进剂,优选为2~6份,更优选为5份。本发明对所述透皮吸收促进剂的种类没有特殊限定,优选1,2-丙二醇、冰片和氮酮中的一种或几种,当所述透皮吸收促进剂优选为两种或以上时,所述各成分以等质量比进行混合。本发明对所述透皮吸收促进剂的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
本发明提供的胡蜂针贴包括质量份为30~150份的水,优选为40~130份,更优选为100份。本发明对所述水的种类没有特殊限定,优选超纯水。
本发明还提供了一种上述技术方案所述胡峰针贴的制备方法,包括以下步骤:
(1)将所述成膜材料与水混合后,依次进行溶胀和油浴,得到凝胶溶液;所述成膜材料与水的质量比为1~7:25;所述溶胀的时间为20~28h;
(2)将所述助溶剂、保湿剂、增塑剂、表面活性剂和透皮吸收促进剂混合,得到第一预混料;
(3)将所述胡蜂毒与水混合溶解,得到第二预混料;所述胡蜂毒与水的质量比为0.6~1:1;
(4)将所述步骤(2)得到的第一预混料、步骤(3)得到的第二预混料与步骤(1)得到的凝胶溶液混合,得到胡蜂针贴;
所述步骤(1)~(3)之间无时间顺序限定。
本发明将所述成膜材料与水混合后,依次进行溶胀和油浴,得到凝胶溶液;所述成膜材料与水的质量比为1~7:25;所述溶胀的时间为20~28h。
本发明所述油浴的温度优选为75~95℃,更优选为80~90℃,最优选为85℃;所述油浴的时间优选为1~3h,更优选为2h。本发明所述溶胀的时间为20~28h,优选为22~26h,更优选为24h。本发明对所述成膜材料与水混合的方式没有特殊限定,优选采用搅拌混合,所述搅拌的速度为75~85r/min,优选为80r/min。
本发明将所述助溶剂、保湿剂、增塑剂、表面活性剂和透皮吸收促进剂混合,得到第一预混料。
本发明对上述混合的方式没有特殊限定,优选采用搅拌混合,所述搅拌的速度为75~85r/min,优选为80r/min;所述搅拌的时间优选为0.3~1.5h,更优选为0.4~1.0h,最优选为0.4h。
本发明将所述胡蜂毒与水混合溶解,得到第二预混料;所述胡蜂毒与水的质量比为0.6~1:1。
本发明将得到的第一预混料、第二预混料与凝胶溶液混合,得到胡蜂针贴。
本发明对上述混合的方式没有特殊限定,优选采用搅拌混合,所述搅拌的速度为75~85r/min,优选为80r/min;所述搅拌的时间优选为1~3h,更优选为1.5~2.5h,最优选为2.0h。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
精制胡蜂毒的制备:
(1)将200g大胡蜂毒与2L超纯水(质量/体积比为1g:10mL)混合加入搅拌罐中,先加蜂毒再加水,于20℃下搅拌,300rpm,30分钟,得到第一混悬液;
(2)将(1)中的第一混悬液于4℃、5000rpm离心5分钟,分别合并得到的上清液和沉淀,上清液暂时存放在4℃冷藏层析柜;
(3)将(2)中的沉淀与2L超纯水(质量/体积比为1g:10mL)混合加入搅拌罐中,于20℃下搅拌30分钟(20℃,300rpm),得到第二混悬液;
(4)将(3)所得混悬液于4℃、5000rpm离心5分钟,分别合并得到的上清液和沉淀;
(5)过滤:合并(2)、(4)中所得的上清液,使用0.22μm/0.45um滤膜过滤得到澄清液;
(6)预冻:将(5)所得澄清液均匀放置于10个500ml不锈钢冻干盘中,在-80℃冰箱中冷冻6小时,得到预冻物;
(7)冻干:将(6)得到的预冻物分层放入冷冻机中,在冷阱温度-80℃、真空度5mTorr条件下,冻干48小时;
(8)过筛:将所得冻干粉过100目筛混合均匀,即得精制胡蜂毒。
抗脑缺血蜂针贴的制备:
(1)称取聚乙烯醇8.0g,加入纯化水50.0g,称重,室温溶胀24h,溶胀至于提取罐中,80r/min,搅拌桨暂不安装;
(2)将(1)步得到的溶胀后的聚乙烯醇溶液,安装上搅拌桨,油浴加热至85℃,维持2h,使之溶胀成凝胶状,加热时不断搅拌(80r/min)使之混合均匀;
(3)冷却:将夹套中的热油放掉,加冷却水辅助冷却至室温,冷却过程搅拌桨保持搅拌;
(4)称取95%乙醇15.0g置于烧杯中,再依次加入5.0g甘油、1.0g丙二醇、0.02g聚山梨酯80、0.02g氮酮,磁力搅拌器80r/min20℃搅拌0.5h,得到第一预混料;
(5)称取精制胡蜂毒10.0g置于烧杯中,加入11.96g纯化水,溶解,得到第二预混料;
(6)依次将(4)、(5)溶液缓慢加入(1)中,80r/min、20℃搅拌2h,即得胡蜂针贴。
实施例2
精制胡蜂毒的制备:
(1)将40g侧异腹胡蜂毒与800mL超纯水(质量/体积比为1g:20mL)混合加入搅拌罐中,先加蜂毒再加水,于25℃下搅拌,300rpm,20分钟,得到第一混悬液;
(2)将(1)中的第一混悬液于4℃、4000rpm离心8分钟,分别合并得到的上清液和沉淀,上清液暂时存放在4℃冷藏层析柜;
(3)将(2)中的沉淀与800mL超纯水(质量/体积比为1g:20mL)混合加入搅拌罐中,于25℃下搅拌20分钟(25℃,300rpm),得到第二混悬液;
(4)将(3)所得混悬液于4℃、4000rpm离心8分钟,分别合并得到的上清液和沉淀;
(5)过滤:合并(2)、(4)中所得的上清液,使用0.22μm/0.45um滤膜过滤得到澄清液;
(6)预冻:将(5)所得澄清液均匀放置于10个500ml不锈钢冻干盘中,在-80℃冰箱中冷冻8小时,得到预冻物;
(7)冻干:将(6)得到的预冻物分层放入冷冻机中,在冷阱温度-80℃;真空度5mTorr条件下,冻干48小时;
(8)过筛:将所得冻干粉过100目筛混合均匀,得到胡蜂蜂毒精制品。
抗脑缺血蜂针贴的制备:
(1)称取聚乙烯醇12.0g,加入纯化水100.0g,称重,25℃溶胀24h,溶胀至于提取罐中,80r/min搅拌桨暂不安装;
(2)将(1)步得到的溶胀后的聚乙烯醇溶液,安装上搅拌桨,油浴加热加热到85℃,维持2h,使之溶胀成凝胶状,加热时不断搅拌(80r/min)使之混合均匀;
(3)冷却:将夹套中的热油放掉,80r/min搅拌并自然冷却至25℃,加冷却水辅助冷却至室温,冷却过程搅拌桨保持搅拌;
(4)称取95%乙醇48.0g置于烧杯中,再依次加入2.0g甘油、2.0g聚乙二醇、2.5g丙二醇、2.5g山梨醇、0.4g司盘40、0.4g冰片,磁力搅拌器80r/min、25℃搅拌0.5h,得到第一预混料;
(5)称取精制胡蜂毒2.0g置于烧杯中,加入28.2g纯化水,溶解,得到第二预混料;
(6)依次将(4)、(5)溶液缓慢加入(1)中,80r/min、25℃搅拌2h,即得胡蜂针贴。
实施例3
精制胡蜂毒的制备:
(1)将300g马蜂毒与4.5L超纯水(质量/体积比为1g:15mL)混合加入搅拌罐中,先加蜂毒再加水,于22℃下搅拌,300rpm,30分钟,得到第一混悬液;
(2)将(1)中的第一混悬液于4℃、6000rpm离心3分钟,分别合并得到的上清液和沉淀,上清液暂时存放在4℃冷藏层析柜;
(3)将(2)中的沉淀与4.5L超纯水(质量/体积比为1g:15mL)混合加入搅拌罐中,于22℃下搅拌30分钟(室温,300rpm),得到第二混悬液;
(4)将(3)所得混悬液于4℃、6000rpm离心3分钟,分别合并得到的上清液和沉淀;
(5)过滤:合并(2)、(4)中所得的上清液,使用0.22μm/0.45um滤膜过滤得到澄清液;
(6)预冻:将(5)所得澄清液均匀放置于10个500ml不锈钢冻干盘中,在-80℃冰箱中冷冻7小时,得到预冻物;
(7)冻干:将(6)得到的预冻物分层放入冷冻机中,在冷阱温度-80℃;真空度5mTorr条件下,冻干60小时;
(8)过筛:将所得冻干粉过100目筛混合均匀,得到胡蜂蜂毒精制品。
1.3抗脑缺血蜂针贴的制备:
(1)称取聚乙烯醇7.0g,加入纯化水40.0g,称重,22℃溶胀24h,溶胀至于提取罐中,80r/min搅拌桨暂不安装;
(2)将(1)步得到的溶胀后的聚乙烯醇溶液,安装上搅拌桨,油浴加热加热到85℃,维持3h,使之溶胀成凝胶状,加热时不断搅拌(80r/min)使之混合均匀;
(3)冷却:将夹套中的热油放掉,80r/min搅拌并自然冷却至22℃,加冷却水辅助冷却至室温,冷却过程搅拌桨保持搅拌;
(4)称取95%乙醇16.0g置于烧杯中,再依次加入2.0g甘油、2.0g柠檬酸三乙酯、0.2g司盘20、0.2g氮酮,磁力搅拌器80r/min、22℃搅拌0.5h,得到第一预混料;
(5)称取精制胡蜂毒16.0g置于烧杯中,加入16.6g纯化水,溶解,得到第二预混料;
(6)依次将(4)、(5)溶液缓慢加入(1)中,80r/min、22℃搅拌2h,即得胡蜂针贴。
实施例4
精制胡蜂毒的制备:
(1)将500g马蜂毒与5L超纯水(质量/体积比为1g:10mL)混合加入搅拌罐中,先加蜂毒再加水,于30℃下搅拌,300rpm,40分钟,得到第一混悬液;
(2)将(1)中的第一混悬液于4℃、5000rpm离心7分钟,分别合并得到的上清液和沉淀,上清液暂时存放在4℃冷藏层析柜;
(3)将(2)中的沉淀与5L超纯水(质量/体积比为1g:10mL)混合加入搅拌罐中,于30℃下搅拌40分钟(室温,300rpm),得到第二混悬液;
(4)将(3)所得混悬液于4℃、5000rpm离心7分钟,分别合并得到的上清液和沉淀;
(5)过滤:合并(2)、(4)中所得的上清液,使用0.22μm/0.45um滤膜过滤得到澄清液;
(6)预冻:将(5)所得澄清液均匀放置于10个500ml不锈钢冻干盘中,在-80℃冰箱中冷冻8小时,得到预冻物;
(7)冻干:将(6)得到的预冻物分层放入冷冻机中,在冷阱温度-80℃、真空度5mTorr条件下,冻干48小时;
(8)过筛:将所得冻干粉过100目筛混合均匀,得到胡蜂蜂毒精制品。
抗脑缺血蜂针贴的制备:
(1)称取聚乙烯醇10.0g,加入纯化水50.0g,称重,30℃溶胀24h,溶胀至于提取罐中,80r/min搅拌桨暂不安装;
(2)将(1)步得到的溶胀后的聚乙烯醇溶液,安装上搅拌桨,油浴加热加热到85℃,维持2h,使之溶胀成凝胶状,加热时不断搅拌(80r/min)使之混合均匀;
(3)冷却:将夹套中的热油放掉,80r/min搅拌并自然冷却至30℃,加冷却水辅助冷却至室温,冷却过程搅拌桨保持搅拌;
(4)称取95%乙醇48.0g置于烧杯中,再依次加入2.5g聚乙二醇、2.5g山梨醇、2.0g松节油、2.0g三乙酸甘油酯、0.4g聚山梨酯、0.4g冰片,磁力搅拌器80r/min、30℃搅拌0.5h,得到第一预混料;
(5)称取精制胡蜂毒50.0g置于烧杯中,加入50.2g纯化水,溶解,得到第二预混料;
(6)依次将(4)、(5)溶液缓慢加入(1)中,80r/min、30℃搅拌2h,即得胡蜂针贴。
实施例5
发明实施例1~4的胡蜂针贴的稳定性评价:
1.1加速试验:
将实施例1~4的胡蜂针贴装入具塞试管内,置于温度为35~40℃,相对湿度为75%±5%的条件下进行试验,在试验期间在0、1、2、3个月月末,取样检查,根据《药典》透皮制剂的相关规定进行检测,结果显示,样品的外观、pH值范围、装量差异、含量均一性、微生物限度等各项指标均符合规定。
1.2适应性试验:
将实施例1~4的胡蜂针贴在强光照射下放置1d,取样观察;将样品在高温下放置1d,取样观察;再将样品在高湿度下放置1d,取样观察,结果表明该蜂针贴在高温下不稳定,在强光照射和高湿度下基本稳定。
实施例6
本发明实施例4的胡蜂针贴的安全性评价:
1急性毒性试验验证
1.1试验动物:大鼠(200±20g),雄性,实施例4制备的胡蜂针贴,制剂浓度为每mL相当于原料药200mg、100mg及50mg(分别为临床用药剂量的8/4/2倍)。
1.2试验方法:于给药前24小时将受试大鼠背部采用剪、剃及脱毛剂的方式在给药部位进行脱毛。去毛后24h剔除因去毛而受伤的大鼠,随机分为正常组、基质对照组、胡蜂针贴高剂量组(48mg/kg)、胡蜂针贴中剂量组(24mg/kg)、胡蜂针贴低剂量组(12mg/kg),每组12只,涂上胡蜂针贴或等量空白赋形剂基质。涂药24h后,用37℃无菌蒸馏水除去残留药物,每天2次观察动物皮肤局部变化及全身中毒反应,包括活动、精神、皮肤、毛发、体重、眼睛和粘膜的变化;呼吸、循环、神经系统等变化,连续观察14天,处死,尸检内部脏器有无病变。
1.3试验结果:每一组的大鼠精神状态良好,也未见中毒和死亡情况,试验说明该胡蜂针贴无急性皮肤毒性。
2长期毒性试验验证
1.1试验动物:SD大鼠64只,雄性,按体重随机分为4组,分别为空白基质组、实施例4制备的胡蜂针贴给药组(设三个剂量:高剂量组24mg/kg、中剂量组12mg/kg、低剂量组6mg/kg),每组16只。
1.2试验方法:于实验前24h禁食并对两侧太阳穴部位进行脱毛处理,涂上等量胡蜂针贴或空白基质。每次涂药之前,需用37℃无菌蒸馏水除去残留供试品。连续给药30d。给药期间观察大鼠一般情况。隔天记录大鼠体重,并在末次给药后24h,处死动物10只/组,剩余动物继续恢复性观察2周,恢复期结束后分两天处死剩余的6只/组动物,并进行上述指标检测。观察血液学指标及血液生化指标的变化,并进行大体解剖和组织病理学检查。对脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、肺脏、睾丸及附睾10个脏器称重并计算脏器系数。
1.3试验结果:
1)给药前,各组受试动物发育正常,被毛光泽,反应机敏,呼吸平稳,饮食正常,无稀便,无异常分泌物,活动正常,表明本试验所选大鼠符合长期毒性的要求。
2)在给药期间,基质对照组动物各项反应均未见异常;给药第一天,胡蜂针贴高、中、低剂量组药后3~5min内会出现不同程度的皮肤肿胀现象,以高剂量组最为明显,且明显可见动物自发活动减少,持续约6h左右恢复,给药约5天后肿胀仅可见于部分自发活动减少的试验动物,且症状持续时间逐日缩短,同时伴随着腹式呼吸的现象。基质对照组动物体重平稳增长,胡蜂针贴各剂量组与基质对照组的体重增长相比,无显著性差异;
3)在停药恢复期内,胡蜂针贴高、中、低剂量组腹式呼吸的现象逐渐消失,其各项反应与基质组相比,均无明显异常。胡蜂针贴各剂量组与空白对照组比较,动物体重均无明显差异,且未见与药物毒性相关的动物死亡。
3皮肤刺激性试验验证
1.1试验动物处理:取体重相近的家兔8只,雌雄各半,随即分成2组,试验前24小时将家兔背部两侧毛剪短后,用手术刀片剃毛(勿将皮肤刮破或出血)。将其中一组家兔皮肤消毒后,用灭菌6号针头呈“#”字形划破两侧皮肤,使皮肤出现渗血为度,破损区面积4cm×5cm,划痕间距0.5cm,作为破损皮肤试验区。另一组家兔皮肤完整无破损。
1.2给药方法:实施例4制备的胡蜂针贴,第1组涂抹完整皮肤组,1次/d,连续7d;第2组涂抹破损皮肤组,1次/d,连续7d。每组左侧都涂胡蜂针贴,右侧涂空白基质且每次给药容量均为1g/kg。各组均于最后1次涂抹24h后除去受试物,再用温水洗净,去除受试物后24、48、72h观察涂抹部位皮肤有无红斑及水肿等变化,以及上述变化的恢复情况。
1.3试验结果:皮肤完整的实验组皮肤从未出现红斑和水肿,皮肤破损的实验组家兔皮肤未出现水肿,充血现象在24小时迅速消失,见图2。
4皮肤过敏性试验验证
1.1试验动物:白色豚鼠24只,体重250-300g,雌雄各半,于给受试物前24h,采用脱毛器将豚鼠背部脊柱两侧去毛,去毛区范围每侧约3cm×3cm。
1.2试验方法:受试豚鼠随机分为三组,分别为涂膜剂空白基质对照组、胡蜂针贴组和2,4-二硝基氯苯阳性药对照组。
致敏接触:分别将三组动物左侧脱毛区涂敷空白涂膜剂基质、胡蜂针贴120mL(每mL相当于原料药100mg)和2,4-二硝基氯苯1%丙酮溶液0.2mL。接触时间持续6h后用温水洗净给药部位药物,并于给药后7,14天以同样的方法重复上述给药过程。
激发接触:于末次给药后第14天重复上述给药过程,给药部位为右侧脱毛区,阳性致敏物浓度为0.1%。激发6h后洗净药物,即刻观察,然后于24h,48h,72h再次观察皮肤过敏反应。
1.3试验结果:于接触激发6h后去掉受试物,0h、24h、48h、72h观察涂抹部位红斑、水肿等皮肤变态反应情况,结果见表1。此外,3组豚鼠均未出现哮喘、站立不稳或休克等严重的全身变态反应。
表1胡蜂针贴对豚鼠皮肤致敏率的影响
实施例7
本发明实施例4的胡蜂针贴的抗脑缺血药效验证:
本试验使用了经典的线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注MCAO/R模型来评价胡蜂针贴的治疗作用效果。通过受试药对MCAO/R大鼠的脑梗死面积、神经功能评分、行为学测试和脑保护作用的影响,探讨其在脑缺血治疗中的作用。
1.1试验动物:成年健康雄性SD大鼠,体重250~280g,SPF级,随机分为6组,分别为假手术组、空白基质组、阳性药物依达拉奉组(6mg/kg.BW,ip)受试药物组:胡蜂针贴高剂量组(6.67mg/kg)、中剂量组(3.33mg/kg)、低剂量组(1.67mg/kg);
1.2试验方法:所有大鼠于试验前一天使用人用脱毛膏进行脱毛,脱毛位置为:大鼠颞部,眉梢与目外眦之间,向后约1横指的凹陷处,两侧均脱毛,每侧用直尺量取1×1cm2;胸锁乳突肌与斜方肌上端之间的凹陷中及正坐,头微前倾,后正中线上,入后发际上l寸2,用直尺量取2×2cm2,之后用生理盐水擦拭。受试药物组按照按照低中高剂量分别于眉梢与目外眦一侧取1×1cm2涂抹30μL;眉梢与目外眦两侧取1×1cm2分别涂抹30μL,眉梢与目外眦两侧1×1cm2分别涂抹30μL并在胸锁乳突肌与斜方肌上端之间的凹陷中取2×2cm2涂抹60μL;每组大鼠在缺血1.5h,再灌注1h、22.5h、46.5h进行治疗给药。除假手术组不做线栓处理外,其余各组均复制SD大鼠MCAO/R模型。复制方法如下:
大鼠用10%水合氯醛(300mg/kg,ip)麻醉,仰卧固定在手术台上,用智能恒温仪使大鼠在手术过程中,肛温维持在37℃,颈部剃毛并进行常规消毒后颈正中偏左0.5cm处切口约1.5cm,分离右颈总动脉(Common carotid artery,CCA)至分叉处,分离颈外动脉(External carotid artery,ECA)和颈内动脉(Internal carotid artery,ICA)。结扎CCA近心端,用一个微动脉夹夹闭CCA远心端,在CCA上用缝合线扎一活结,眼科剪在距离分叉约1cm处剪一“V”形缺口,将线栓经缺口插入,松开CCA上动脉夹,调整线栓进入角度(向左侧倾斜约20°角),使线栓进入ICA再次调整进线角度(向右侧倾斜约15°角)并轻轻拉CCA,使栓线进入大脑,线栓插入深度为18~20mm。微遇阻力时停止,使线栓头端通过大脑中动脉起始处,到达较细的大脑前动脉,即此时完成一侧MCAO,记录此时的缺血时间,然后缝合皮肤,在缺血时,注意保持室温在25~30℃。
1.3指标检测:
A.脑含水量和脑梗死率测定
各组试验动物在缺血48h麻醉后,立即取脑,取大脑经电子天平精确称重得脑湿重后,放入110℃恒温干燥箱烘烤24h至恒重后,用同一电子天平再精确称脑组织干重(脑干重),并计算脑组织含水量,以百分率表示。
TTC染色:大鼠断颈处死后迅速取脑(10min内),称重,置于-20℃冰箱冰冻10min,此后将脑组织从前至后切为2mm厚冠状切片共5片。迅速将脑片置于5mL含2%TTC的0.01MPBS溶液中,37℃恒温避光孵育20min,正常组织呈玫瑰红色,梗死组织未被染色而呈白色。取出脑片放入4%多聚甲醛中固定,拍照保存,称大脑全重(全脑组织重量),再切出脑组织白色梗死部分,称其重量(脑组织梗死重量)。再在110℃烘箱,24h,烘干大脑,称干重。脑梗死率计算公式如下:
B.神经行为学评价
①神经行为学评分:再灌注24h、48h后进行神经行为学评分。采Longa评分法,0分:正常,无神经功能缺损;1分:左侧前爪不能完全伸展,轻度神经功能缺损;2分:行走时,大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈,中度神经功能缺损;3分:行走时,大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒。重度神经功能缺损;4分:不能自发行走,有意识丧失。
②转棒试验:大鼠在手术前三天,放置于Havard电动转棒仪进行适应性训练,将大鼠置于转棒上适应10s,启动转棒,速度设置为5min内匀速加速至40rpm,记录大鼠掉落时间作为指标。分别于再灌注24小时,48小时进行测试。
③抓力试验:使用TheDFE Digital Force Gauge力量测试系统检测大鼠抓力。将大鼠前肢放置于测试网格上,待动物抓牢后轻轻拉动大鼠,记录动物松爪时的力值,即为抓力值。动物在正式试验前需提前训练3天。
④平衡木试验:平衡木长80cm,宽2.5cm的方木棒,平放在距离地面l0cm处,让大鼠在其上行走。评分标准为6个等级。0分:能跳上平衡木,在上面行走不会跌倒;1分:能跳上平衡木,在上面行走跌倒机会小于50%;2分:能跳上平衡木,在上面行走跌倒机会大于50%;3分:在健侧后肢帮助下能跳上平衡木,但受累瘫痪侧后肢不能帮助向前移动;4分:在平衡木上不能行走,但可坐在上面;5分:将大鼠放在平衡木上会掉下来。该试验的目的在于测试动物的前庭运动功能和小脑功能。
C.脑缺血神经保护作用
脑组织炎症因子检测:再灌注48h后,取血后断头取脑,去除嗅球及小脑,滤纸吸去脑表面水分,冰上快速将脑组织沿正中线分离双侧大脑半球(缺血侧和对侧),将损伤侧大脑称重后放入匀浆器中进行匀浆,使用0.9%NS作为匀浆介质,制备10%的脑组织匀浆,3500r/min,离心10min,取上清液,分装于EP管中,采用ELISA试剂盒检测脑组织中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α。
检测海马CA1区神经元密度:通过HE染色和尼氏染色观察海马CA1区神经元密度,HE染色法会使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色,细胞质和细胞外基质中的成分着红色;而尼氏染色可使尼氏体清晰可辨,细胞的颜色主要表现为蓝色或绿蓝色,核仁也非常清晰,很容易区分轴突和树突,可明显观察细胞质特殊结构。在光镜下观察海马CA1区的病理学变化及在40×10倍镜下计数1mm长度细胞条带内细胞膜和核膜完整的神经元数目,取两侧海马区神经元数目之和的平均数为CA1区正常神经元数,通过神经元密度评价胡蜂针贴对大鼠脑缺血再灌注神经细胞损伤的影响。
脑组织相关凋亡因子检测:脑组织取材,同上,取材,脱水,包埋,切片,进行免疫组化染色,在光镜下观察海马CA1区的病理学变化及在40×10倍镜下计数1mm长度细胞条带内阳性细胞数,每侧海马CA1区各计数3个区段,取两侧海马区神经元数目之和的平均数为阳性细胞数。CA1区阳性细胞密度计算公式如下:
1.4试验结果:
A.降低脑含水量和脑梗死率:TTC染色显示,与基质模型组比较,依达拉奉组和胡蜂针贴各组白色梗死区相对较小,脑含水量均明显下降(见表2、图3)。提示胡蜂贴剂有降低局灶性脑缺血损伤脑梗死率和改善脑水肿的作用。
表2胡蜂针贴对MCAO/R大鼠脑含水量及脑梗死率的影响
注:与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01;与基质模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01。
B.降低神经行为学评分
24h评分和48h评分均显示,与模型组相比,胡蜂针贴各剂量组均可降低神经行为学评分,提升抓力,增加转棒时间,降低平衡木评分,改善大鼠神经功能缺损情况(见表3~6)。
表3胡蜂针贴对MCAO/R大鼠神经行为学评分的影响
表4胡蜂针贴对MCAO/R大鼠抓力测试的影响
表5胡蜂针贴对MCAO/R大鼠转棒测试的影响
表6胡蜂针贴对MCAO/R大鼠平衡木测试的影响
C.脑缺血神经保护作用
ELISA试剂盒结果显示,与模型组比较,胡蜂针贴各剂量组对IL-10的作用不明显,但能显著下调脑缺血再灌注损伤的脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8的表达(见表7)。提示胡蜂针贴可明显抑制脑组织中炎症因子的表达。
免疫组化结果显示,与基质模型组比较,依达拉奉组和胡蜂针贴各剂量组c-Fos、Bax、Caspase-3阳性细胞密度均显著减少。提示胡蜂针贴各剂量组能下调脑缺血再灌注脑组织海马CA1区c-Fos、Bax、Caspase-3的表达,保护脑组织损伤。(见表8)
HE染色和尼氏染色结果显示,基质模型组海马CA1区神经元体积缩小呈现固缩,有2~3层神经元,细胞紫色较浅,细胞膜皱缩内陷,形成泡状小体,有大量小胶质细胞浸润。依达拉奉组和胡蜂针贴各剂量组海马CA1区锥体神经元排列较为紧密,有2~3层神经元,细胞紫色较浅,细胞形态完整,边界清晰,无小胶质细胞浸润(见图4~5)。提示依达拉奉和胡蜂针贴对脑缺血再灌注神经元有保护作用。
连续给药3次和7次结果均显示,与模型组相比,胡蜂针贴组神经元密度显著增加,提示胡蜂针贴具有保护大鼠脑缺血再灌注海马CA1区神经元的作用。(见表9)
注:与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01;与基质模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01。
注:与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01;与基质模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01。
注:与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01;与基质模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01。
由以上实施例的结果可知:本发明的胡蜂针贴不仅具有治疗脑缺血,保护神经损伤的作用,而且无过敏、无刺激。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种胡蜂针贴在制备发挥脑缺血神经保护作用的药物中的应用,其特征在于,所述胡蜂针贴由以下质量份的组分制备而成:胡蜂毒1~50份、成膜材料5~18份、助溶剂15~28份、保湿剂1~15份、增塑剂1~15份、表面活性剂0.1~2份、透皮吸收促进剂0.1~8份和水30~150份;
所述胡蜂毒为精制胡蜂毒;所述精制胡蜂毒的制备方法,包括以下步骤:
(1)将胡蜂毒与水混合,得到第一混悬液;
(2)将所述步骤(1)得到的第一混悬液于4℃,4000~6000rpm离心3~8min,得到第一上清液和第一沉淀;
(3)将所述步骤(2)得到的第一沉淀与水混合,得到第二混悬液;
(4)将所述步骤(3)得到的第二混悬液于4℃,4000~6000rpm离心3~8min,得到第二上清液和第二沉淀;
(5)将所述得到的第一上清液和第二上清液混合,过滤,得到澄清液;
(6)将所述步骤(5)中得到的澄清液在-75~-85℃,冷冻5~7h,得到预冻物;
(7)将所述步骤(6)得到的预冻物在温度不高于-80℃,真空度不高于5mTorr的条件下,冻干45~50h,得到冻干粉;
(8)将所述步骤(7)得到的冻干粉,过筛,即得精制胡蜂毒;
所述胡蜂毒为马蜂毒;
所述成膜材料为聚乙烯醇;
所述助溶剂为乙醇;
所述发挥脑缺血神经保护作用为抑制脑组织中炎症因子的表达、下调脑缺血再灌注脑组织海马CA1区c-Fos、Bax、Caspase-3的表达和保护脑缺血再灌注海马CA1区神经元的作用。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述保湿剂包括甘油、丙二醇、丁二醇、聚乙二醇、山梨醇、甜菜碱和尿素中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述增塑剂包括甘油、松节油、丙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二乙酯、三乙酸甘油酯和柠檬酸三乙酯中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述表面活性剂包括聚山梨酯或脂肪酸山梨坦。
5.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述透皮吸收促进剂包括1,2-丙二醇、冰片和氮酮中的一种或几种。
6.根据权利要求1~5任意一项所述应用,其特征在于,所述胡蜂针贴的制备方法,包括以下步骤:
(1)将所述成膜材料与水混合后,依次进行溶胀和油浴,得到凝胶溶液;所述成膜材料与水的质量比为(1~7):25;所述溶胀的时间为20~28h;
(2)将所述助溶剂、保湿剂、增塑剂、表面活性剂和透皮吸收促进剂混合,得到第一预混料;
(3)将所述胡蜂毒与水混合溶解,得到第二预混料;所述胡蜂毒与水的质量比为(0.6~1):1;
(4)将所述步骤(2)得到的第一预混料、步骤(3)得到的第二预混料与步骤(1)得到的凝胶溶液混合,得到胡蜂针贴;
所述步骤(1)~(3)之间无时间顺序限定。
7.根据权利要求6所述应用,其特征在于,所述步骤(1)油浴的温度为75~95℃。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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