CN115944635A - 氨基噻唑衍生物在制备免疫性炎症药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种氨基噻唑衍生物在制备免疫性炎症药物中的用途。本发明药物是针对表层免疫炎症性皮炎如牛皮癣、神经性皮炎、特异性皮炎湿疹、过敏性皮炎、荨麻疹、脂溢性皮炎及脱发、瘢痕异常形成、病理性色素沉着等方面具有明显的效果，而且安全无毒。还有表层炎症如：慢性鼻炎、结膜炎、干眼症、过敏性哮喘、慢性支气管炎、各种粘膜及表皮损伤引起的免疫性炎症、各种粘膜及表皮的慢性炎症。免疫性炎症疾病还包括其它慢性、难治性、免疫炎症性疾病如自身免疫性疾病(如糖尿病、系统性红斑狼疮)、各种免疫性慢性炎症疾病(如慢性结肠炎、过敏症)、缺血再灌注损伤、神经系统慢性炎症(如神经退行性变、海默综合征、忧郁症等)等等。

Description

氨基噻唑衍生物在制备免疫性炎症药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体指一种氨基噻唑衍生物在制备免疫性炎症药物中的用途。

背景技术

一直以来，医学证明对机体免疫系统的抑制性调控是治疗多种疾病的关键，如治疗器官移植后排斥反应、自身免疫性疾病、炎症性疾病、缺血再灌注损伤等。

慢性难治性炎症疾病能表现在各个器官形成多种炎症疾病，如自身免疫性疾病、各种免疫炎症性疾病、慢性炎症疾病等等。表层炎症是指发生在皮肤或粘膜表层的炎症，包括了感染性炎症和由于免疫紊乱造成的免疫性炎症，免疫性表层炎症常常发展成慢性难治性炎症。免疫性表层炎症是难治性免疫炎症性疾病的一大类，由于表层组织的特点，易于有大量的炎性刺激物和大量的炎性细胞聚集，在细胞焦亡的过程中，炎症不断扩大，和恶性循环，使得表层炎症迁延不愈。免疫表层炎症，包括皮炎及粘膜炎症，如皮炎、鼻炎、结膜炎、粘膜及表皮损伤炎症等等。慢性恶性循环免疫反应被认为是难治性表层炎症发生的关键步骤，在难治性表层皮炎的发生发展的过程中，表层组织富有的各种巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等等免疫细胞的激活会导致各种炎性细胞因子的合成和分泌，吸引更多的炎性细胞聚集于表层组织，引发随后的一系列恶性循环是的慢性免疫反应，是表层炎症迁延不愈的主要原因。因此，抑制炎症，打断恶性循环，成为治疗免疫炎症性表层炎症的关键，但不局限于上述炎症，如自身免疫性疾病、各种免疫炎症性疾病、慢性炎症疾病也存在类似的恶性循环。

焦亡是一个全新的炎症机理，在各种炎症中发挥重要作用，细胞焦亡时细胞膜破损，细胞肿胀破裂，释放大量的炎性因子，导致局部严重的炎症反应，并募集大量炎性细胞在局部聚集，形成炎症的恶性循环。经典焦亡途径认为致病刺激物如LPS、HMGB1等能与RAGE受体结合，通过胞饮作用进入细胞，激活Pro-Caspase-11，导致焦亡(见附图1)。

现有技术中提供了一种氨基噻唑衍生物，其结构和作用公开在中国发明专利CN201110049687.4《2-氨基噻唑衍生物及制备方法和应用》中，该类小分子化合物通过抑制髓样分化蛋白(MYD-88)，进而阻断NF-кB的激活，从而产生的免疫抑制作用，在抗移植排斥、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注损伤和抗慢性炎症反应、抗内毒素血症等方面的治疗作用。

但是我们实验发现其他的NF-кB抑制剂在慢性难治性炎症疾病中并不能起到很好的效果，且目前尚无市售或临床上的以NF-кB为靶点的炎症药物，研究中因此对细胞焦亡过程展开进一步研究，发现了该类氨基噻唑衍生物在抑制细胞焦亡过程中新的起效传导途径。

发明内容

本发明的目的在于提供前述氨基噻唑衍生物在制备免疫性炎症药物中的用途。本发明的氨基噻唑衍生物由于有强烈的抑制焦亡的作用，通过抑制炎性小体的组装激活和先天免疫细胞(主要是巨噬细胞)的焦亡发生，不仅能有效抑制炎症，更能阻断炎症的恶性循环，在一系列免疫炎症性表层炎症的药效学试验中获得良好的治疗效果。

本发明所述的氨基噻唑衍生类小分子化合物的基本分子结构如下：

式中R1为苯基、取代芳香基团；R2为苄基、取代苄基、苯基、取代苯基；n＝0、1、2。

我们的机理研究首次证实了另外一种焦亡激活途径，从经典的TLR/MyD88激活途径，激活NF-кB，再经过NLRP3–Caspase-1–GSDMD-N路径激活焦亡。进一步实验发现此类氨基噻唑衍生物能抑制免疫细胞内NLRP3的表达，经过Caspase-1的继发抑制，导致细胞焦亡受到抑制。还能通过减少细胞内Pro-IL-1b、Pro-IL-18的途径，抑制炎性因子IL-1b和IL-18的释放。(相关实验见实施例2)

因此，此类氨基噻唑衍生物可以作为细胞焦亡抑制剂，NLRP3炎症小体抑制剂，半胱氨酸蛋白酶-1/半胱氨酸蛋白酶-11抑制剂，Gasdermin D(GSDMD-N，the N-terminus ofGSDMD)抑制剂。

本发明的氨基噻唑衍生物的分子极小，结构稳定，可穿透细胞膜，并可同时在体内外应用。该类化合物的其它内用制剂的用途还包括其它慢性、难治性、免疫炎症性疾病如自身免疫性疾病(如糖尿病、系统性红斑狼疮)、各种免疫性慢性炎症疾病(如慢性结肠炎、过敏症)、缺血再灌注损伤、神经系统慢性炎症(如神经退行性变、海默综合征、忧郁症等)等等。

此类氨基噻唑衍生物如N-(4-苯基噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺(应内公司商品编号INNA1605)，N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)乙酰胺(商品编号INNA1602)，N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺(商品编号INNA1608)；N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺(商品编号INNA1609)；N-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)丙酰胺(商品编号INNA1611)；N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺(商品编号INNA1612)是经过发明人验证的具有同样的功效稳定性安全性较好的药物，结构式如下：

通过前期研究发现氨基噻唑衍生物类小分子系列化合物均能抑制炎性因子的合成和分泌，且疗效基本相同，本专利则主要以INNA1605和非感染性表层皮炎为例进行说明。

本发明还公开了上述氨基噻唑衍生物作为外用制剂(软膏剂、搽剂、喷剂、贴剂、滴剂)的具体实例，和内用制剂(口服和静脉制剂)一样用于表层免疫性炎症和其它难治性免疫性疾病。例如应用于多种免疫炎症性皮炎(牛皮癣、神经性皮炎、特异性皮炎湿疹、过敏性皮炎、荨麻疹、和类似皮炎)。

本发明有益效果：在动物实验和病人同情性治疗中充分证实了该药物在用于众多免疫炎症性疾病中的优异疗效，包括：1、表层免疫炎症性皮炎如牛皮癣、神经性皮炎、特异性皮炎湿疹、过敏性皮炎、荨麻疹、脂溢性皮炎及脱发、瘢痕异常形成、病理性色素沉着等方面具有明显的效果，而且安全无毒。还有其它各类免疫性表层炎症如下但不限于：慢性鼻炎、结膜炎、干眼症、过敏性哮喘、慢性支气管炎、各种粘膜及表皮损伤引起的免疫性炎症、各种粘膜及表皮的慢性炎症。2、免疫性炎症疾病还包括其它慢性、难治性、免疫炎症性疾病如自身免疫性疾病(如糖尿病、系统性红斑狼疮)、各种免疫性慢性炎症疾病(如慢性结肠炎、过敏症)、缺血再灌注损伤、神经系统慢性炎症(如神经退行性变、海默综合征、忧郁症等)等等。

附图说明

图1为巨噬细胞激活焦亡的机理图。

图2为氨基噻唑衍生类小分子系列化合物(INNA1602(TJ-2)、INNA1605(TJ-5)、INNA1608(TJ-8)，INNA1609(TJ-9)，INNA1611(TJ-11)，INNA16012(TJ-12))可抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌大量炎性因子，且具有相同的炎性因子抑制效果。

图3为INNA1605(TJ-5)抑制骨髓来源巨噬细胞焦亡。A.各组骨髓来源巨噬细胞的细胞凋亡(PI⁺流式染色)试验。C.各组骨髓来源巨噬细胞上清的LDH浓度。D-F.各组骨髓来源巨噬细胞GSDMD及GSDMD-N蛋白表达情况。

图4为INNA1605(TJ-5)抑制骨髓来源巨噬细胞经典和非经典焦亡途径，并减少多种炎性因子的合成和分泌。A-C.各组骨髓来源巨噬细胞NLRP3炎性小体及其组件蛋白表达情况和非经典焦亡途径相关蛋白表达情况。D.各组骨髓来源巨噬细胞多种炎性因子合成和分泌情况。

图5中，用INNA1605膏剂治疗Balb/c小鼠品系牛皮癣效果图。a.正常对照组，b.IMQ模型组，c.INNA1605治疗组。

图6显示INNA1605治疗后牛皮癣后，皮肤组织病理学改变。

图7显示INNA1605能抑制牛皮癣模型中MAPK信号通路。

图8为INNA1605治疗后牛皮癣的皮肤组织MPO(中性粒细胞)免疫组化和CD86(巨噬细胞)免疫组化结果图。

图9为INNA1605抑制牛皮癣模型肥大细胞浸润和增生。A.小鼠皮肤组织H&E染色高倍镜观测。B.小鼠皮肤组织肥大细胞特异性指标C-kit(CD117)染色结果。

图10为INNA1605明显减低CD80的表达。

图11为INNA1605抑制牛皮癣皮内淋巴因子等(IL-1beta、IL-6、IL-17a、TNF-alpha、MyD88 mRNA、Cxcl2 mRNA)的表达。

图12为INNA1605治疗后牛皮癣后各组脾脏大体观和重量图，各组脾脏来源T细胞及其亚群流式图及流式比例统计。

图13为INNA1605治疗减少牛皮癣小鼠皮肤组织角质形成细胞的过度角化增殖H&E病理图及角化皮肤厚度测量统计。

图14为INNA1605治疗小鼠特应性皮炎(湿疹)病理学改变。

图15为INNA1605治疗小鼠特应性皮炎(湿疹)后皮肤内的炎症因子表达水平。

图16为小鼠特应性皮炎(湿疹)炎症因子不同时间的改变：分别对8天、10天、12天的模型进行检测，IL-4、IL-13第8天均已升高，10-12天达到较高水平(表达水平几乎与内参相同)；TSLP、MyD88的表达水平第8天前已达到最高峰值，10-12天表达出现下降。

图17为INNA1605治疗后抑制结肠粘膜炎症和结肠粘膜上皮细胞增殖。A.结肠粘膜H&E病理改变。B.结肠粘膜中性粒细胞浸润情况，即MPO免疫组化病理染色情况。C&D.结肠膜BrdU染色及Ki-67免疫组化病理情况，即反映各组结肠粘膜上皮细胞增殖情况。

图18为INNA1605膏剂治疗蚊虫叮咬过敏性皮炎(同情性治疗临床研究)。

图19为INNA1605膏剂治疗神经性皮炎(同情性治疗临床研究。

图20为INNA1605膏剂治疗湿疹(同情性治疗临床研究)。

图21为INNA1605膏剂治疗荨麻疹(同情性治疗临床研究)。

图22为INNA1605膏剂治疗牛皮癣(同情性治疗临床研究)。

图23为INNA1605膏剂治疗蛋白沉积症皮炎(同情性治疗临床研究)。

图24为INNA1606(TJ-M2010-6)能防止NOD小鼠一型糖尿病的发生，如果在发病初期早期用药，也能治疗已经发作的一型糖尿病。机理是MyD88抑制剂能显著减轻胰岛炎，挽救胰岛细胞。

图25为INNA1605(TJ-M2010-5)显著减轻高脂饮食肥胖症小鼠的体重。

图26为INNA1605(TJ-M2010-5)显著抑制R848诱导的B细胞(红斑狼疮样细胞)的激活和分化成浆细胞。

图27为INNA1605(TJ-M2010-5)显著抑制R848诱导的B细胞(红斑狼疮样细胞)分泌自身免疫性抗体和炎症因子。

图28为INNA1605(TJ-M2010-5)显著减轻急性脑梗塞后继发的缺血再灌注损伤，使急性脑梗塞的脑组织坏死体积减少80％。

图29为INNA1605(TJ-M2010-5)改善APP/PS1小鼠或海默综合征小鼠的认知能力(水迷宫试验)。

图30为INNA1605(TJ-M2010-5)显著减少APP/PS1海默综合征模型小鼠脑内Aβ沉积。9月龄时各组小鼠全脑(A)、皮层(B)、海马(C)区域的代表性免疫组化图像及Aβ斑块的面积百分比(D)。(A bar＝1000μm；B-C bar＝200μm)(###p<0.001vs Control组；*p<0.05vsAPP/PS1组；N＝3control组；N＝5APP/PS1和APP/PS1+INNA1605组)。

图31为INNA1605(TJ-M2010-5)显著抑制APP/PS1小鼠脑小胶质细胞激活，从而减轻脑内神经组织炎症9月龄时各组小鼠全脑(A)、皮层(B)、海马(C)区域的代表性免疫组化图像及Iba-1阳性的小胶质细胞的面积百分比(D)。(Abar＝1000μm；B-C bar＝200μm)(#p<0.05,###p<0.001vs Control组；*p<0.05,**p<0.01vs APP/PS1组；N＝3control组；N＝5APP/PS1和APP/PS1+INNA1605组)。

图32为INNA1605(TJ-M2010-5)防止小鼠忧郁症行为和炎症INNA1605(TJ-M2010-5)防止新冠病毒突刺蛋白(CSDS-/SARS-907COV-2Spike RBD)诱导的忧郁症行为和炎症。

图33为INNA1605(TJ-M2010-5)防止新冠病毒突刺蛋白(CSDS-/SARS-907COV-2Spike RBD)诱导的忧郁症行为和炎症机理图。

图34为INNA1605(TJ-M2010-5)使不能移植成功的皮肤移植成功(Balb/c小鼠皮肤移植给B6小鼠)。

图35为INNA1605(TJ-M2010-5)术后短期用药使小鼠心脏移植产生永久免疫耐受。A.异体心脏移植(Balb/c小鼠心脏移植给B6小鼠)后用药TJ-M2010-5两周，60％心脏移植物不被排斥。B.长期存活受体鼠接受二次同供体鼠心脏移植(Balb/c小鼠心脏移植给B6长期存活小鼠)，100％不排斥，证实产生免疫耐受。

图36为INNA1605(TJ-M2010-5)明显抑制肝癌(H22癌细胞皮下种植)生长。

具体实施方法

以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。实施例中所用的材料可通过市售渠道获得。

实施例1：氨基噻唑衍生类小分子系列化合物[INNA1602(TJ-M2010-2，TJ-2)、INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)、INNA1608(TJ-M2010-8，TJ-8)，INNA1609(TJ-M2010-9，TJ-9)INNA1611(TJ-M2010-11，TJ-11)，INNA16012(TJ-M2010-12，TJ-12)]抑制LPS诱导的巨噬细胞炎性因子的分泌。

体外巨噬细胞分组：

体外培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞。

实验共分为8组，分别为：

Control组(不做任何处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞)、LPS组(500ng/ml LPS刺激巨噬细胞24h)、LPS+TJ-2组(LPS刺激前2h给予30μmol/L TJ-2药物刺激)、LPS+TJ-5组(LPS刺激前2h给予30μmol/L TJ-5药物刺激)、LPS+TJ-8组(LPS刺激前2h给予30μmol/LTJ-8药物刺激)、LPS+TJ-9组(LPS刺激前2h给予30μmol/L TJ-9药物刺激)、LPS+TJ-11组(LPS刺激前2h给予30μmol/L TJ-11药物刺激)和LPS+TJ-12组(LPS刺激前2h给予30μmol/L TJ-12药物刺激)。LPS刺激24h后去细胞培养上清进行ELISA检测上清中各种炎性因子浓度。

所得到实验结果图(见附图2)所示，结果显示所有氨基噻唑衍生类小分子系列化合物[INNA1602(TJ-2)、INNA1605(TJ-5)、INNA1608(TJ-8)，INNA1609(TJ-9)INNA1611(TJ-11)，INNA16012(TJ-12)]均可抑制巨噬细胞中包括IL-1β、Il-6、TNF-α、IL-18、IL-17等在内的多种炎性因子的分泌，并且小分子化合物INNA1602(TJ-2)、INNA1605(TJ-5)、INNA1608(TJ-8)，INNA1609(TJ-9)INNA1611(TJ-11)，INNA16012(TJ-12)具有相同的炎性因子抑制效果。

实施例2：INNA1605(TJ-M2010-5，JT-5)体外抑制骨髓来源巨噬细胞的细胞焦亡。

骨髓来源巨噬细胞焦亡模型制备与分组：

模型制备：LPS(500ng/ml)刺激骨髓来源巨噬细胞6小时后，ATP(5mmol/L)刺激2小时后收细胞及其细胞上清检测。

实验共分为4组，分别为：

Control组(细胞培养基正常培养)，

模型组(培养基中加入LPS和ATP刺激)，

TJ-5(10μmol/L)组(LPS刺激前2h加入TJ-5，10μmol/L)，

TJ-5(30μmol/L)组(LPS刺激前2小时加入TJ-5，30μmol/L)。

实验终点收集细胞及其上清进行检测。

所得到实验结果图(见附图3)所示，结果显示LPS和ATP刺激后骨髓来源巨噬细胞的PI⁺细胞明显增加，细胞培养上清的LDH分泌量也明显上升，INNA1605(TJ-M2010-5，JT-5)则能抑制LPS和ATP诱导的骨髓来源巨噬细胞的凋亡，减少LDH的分泌(附图2)，提示INNA1605可抑制LPS和ATP诱导的骨髓来源巨噬细胞的死亡。INNA1605明显抑制LPS和ATP诱导的骨髓来源巨噬细胞中GSDMD的活化裂解，提示INNA1605可抑制骨髓来源巨噬细胞的焦亡(附图3D，F)。并且，INNA1605可阻断NLRP3炎症小体的组装和激活，抑制包括经典的和非经典的细胞焦亡双路径(附图4A)，进而抑制骨髓来源巨噬细胞中Pro-IL-1b、Pro-IL-18成熟和释放，打断炎症的级联反应，减少多种炎症因子的分泌(附图4B-E)

实施例3：INNA1605(TJ-M2010-5，JT-5)用于治疗小鼠(Balb/c)牛皮癣。

小鼠牛皮癣模型制备与分组：

模型制备：6-8周龄雄性Balb/c小鼠背部皮肤剃毛，涂5％imiquimod(IMQ)霜剂每天一次，连续7天。

实验共分为3组，分别为：

牛皮癣对照组(不做任何治疗，牛皮癣模型组)、TJ-M2010-5全身用药组(腹腔注射)和局部用药组(膏剂组)。具体处理方法如下：

TJ-M2010-5全身用药组：取Balb/c小鼠牛皮癣模型，经腹腔注射TJ-M2010-5，50mg/kg，每天一次，连续2周。

TJ-M2010-5局部用药组：取Balb/c小鼠牛皮癣模型，经皮肤涂抹1％TJ-M2010-5膏剂，每天一次，连续2周。

所得到实验结果图(见附图5)所示，结果显示无论是全身还是局部用药，治疗效果优异，7天时明显好转，14天达到治愈效果。两种治疗能使皮肤内炎性细胞大幅减少(见附图6)，牛皮癣异常增厚的角质层经治疗后能基本恢复正常组织结构(见附图6)。根据实例2的体外研究表明，INNA1605治疗后可能抑制牛皮癣模型中NLRP3炎症小体的组装和激活，抑制Pro-IL-1β和IL-18的成熟和释放，最终减少皮肤组织细胞的焦亡(见实例2)。细胞焦亡的减少直接打断了皮肤炎症的爆发性恶性循环，INN1605同时抑制抑制了MAPK信号通路(见附图7)，二者的直接结果就是减少了包括巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞在内的免疫细胞浸润和活化(见附图8-10)，进一步抑制炎性因子的合成和分泌(见附图11)；固有免疫细胞浸润减少必然导致对适应性免疫细胞的抗原提呈被抑制，因而，INN1605能改善牛皮癣的脾肿大，纠正脾脏T细胞及其亚群比例紊乱(见附图12)；同时INN1605还能抑制皮肤角质形成细胞的过度角化和增殖，皮肤厚度明显变薄。(见附图13)。

实施例4：INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)用于治疗小鼠(C57)特应性皮炎/湿疹。

小鼠牛皮癣模型制备与分组：

模型制备：6-8周龄雄性C57小鼠耳朵涂2％M7309(卡泊三醇)膏剂每天一次，连续10天。

实验共分为3组，分别为：

湿疹对照组(不做任何治疗，湿疹模型组)、TJ-M2010-5全身用药组(腹腔注射)和局部用药组(膏剂组)。具体处理方法如下：

TJ-M2010-5全身用药组：取小鼠湿疹模型，经腹腔注射TJ-M2010-5，50mg/kg，每天一次，连续2周。

TJ-M2010-5局部用药组：取小鼠湿疹模型，经皮肤涂抹1％TJ-M2010-5膏剂，每天一次，连续2周。

所得到实验结果图(见附图14)所示，结果显示局部用药，治疗效果优异，皮炎异常增厚的角质层经治疗后能基本恢复正常组织结构，炎症明显减轻(见附图13)。各种炎症因子减少(见附图15)，并随时间推移，各种炎症因子变化呈现峰值和降低(见附图16)。

实施例5：INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)用于治疗偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导的小鼠(C57)炎性结肠癌。

小鼠炎性结肠癌模型制备与分组：

模型制备：6-8周龄雄性C57小鼠腹腔注射AOM(10mg/Kg)/DSS(2.5％)诱导炎性结肠癌模型。

实验共分为2组，分别为：

炎性结肠癌模型组(不做任何治疗，即AOM/DSS组)、TJ-M2010-5用药组(腹腔注射)。具体处理方法如下：

TJ-M2010-5用药组：在C57小鼠腹腔注射AOM(10mg/Kg)/DSS(2.5％)诱导炎性结肠癌前2天，经腹腔注射TJ-M2010-5，50mg/kg，每天一次，连续10周。

所得到实验结果图(见附图17)所示，模型组有严重溃疡性结肠炎，100％发生癌变。结果显示TJ-M2010-5用药后，治疗效果优异，结肠粘膜经治疗后小鼠的炎症组织损伤明显减轻(附图17A)，中性粒细胞浸润明显减少(附图17B)，结肠炎消失。并且，TJ-M2010-5治疗后，小鼠结肠粘膜的上皮细胞增殖明显被抑制，粘膜增厚得到改善，100％未见癌变。

实施例6：1％INNA1605膏剂应用于同情性治疗的皮炎病例的临床研究，治疗特应性皮炎/湿疹、神经性皮炎、过敏性皮炎、荨麻疹、蛋白沉积症皮炎等。

安全性评估：临床前期试验结果显示INNA1605对机体毒性较低，直接静脉注射30mg/kg以上时会出现肝酶升高毒性，10mg/kg时无毒性作用。而皮肤膏剂以最大身体面积涂抹，血中仅能测到2-3ng/ml的微量药物浓度，说明经皮肤吸收量微乎其微，可以忽略不计，不会对机体有毒副作用。

同情性治疗：针对一些长期反复发作、无有效治疗、异常痛苦的病人，在他们主动和强烈要求下，经医师安全性评估合格，并在严密观察下，进行同情性治疗。

同情性治疗临床研究：由于这些病例只是基于安全和同情性治疗下的临床研究和观察，不能作为NMPA注册申报之用，只作为研究资料，用于评估药膏疗效的目的。

6.1.1％INNA1605膏剂治疗蚊虫叮咬过敏性皮炎(同情性治疗临床研究)

诊断：蚊虫叮咬引起的过敏性皮炎、溃烂

入组时间：2019年5月12日

治疗经过：某男，34岁，皮炎，蚊虫叮咬引起的皮炎，长期瘙痒溃烂，没有使用其他药物，使用1％INNA1605乳膏半个月后痊愈并停药。

副作用：无

疗效评价：优良，痊愈。

(见附图18)。

6.2.1％INNA1605膏剂治疗神经性皮炎(同情性治疗临床研究)

诊断：神经性皮炎(多发性)

入组时间：2019年10月20日

治疗经过：某女，58岁。后发际线部、颈部及肩胛骨部神经性皮炎，红肿，瘙痒，使用其它药物无效，使用1％INNA1605乳膏3周后，红肿消退，瘙痒消失，恢复至皮肤正常状态，完全痊愈，至今无复发。

副作用：无。

疗效评价：优良，痊愈。

(见附图19)。

6.3.1％INNA1605膏剂治疗湿疹(同情性治疗临床研究)

诊断：特应性皮炎(湿疹)(多发性)

入组时间：2020年5月25日

治疗经过：某女，30岁，双下肢多处皮炎/湿疹，多年不愈，严重骚痒，抓挠不止，破皮结痂。长期使用其它药物包括激素膏药均无效，反复发作。本次入组后病变部位使用INNA1605(1％)乳膏两周后，双腿多个用药部位不再抓痒，沉积色素淡化，基本恢复正常肤质，停药后，至今无复发。

病人自述：止痒效果立竿见影，治愈后瘢痕减少，并有美白作用。

副作用：无。

疗效评价：优良，痊愈。

(见附图20)。

6.4.1％INNA1605膏剂治疗荨麻疹(同情性治疗临床研究)

诊断：荨麻疹(多发性)

入组时间：2020年9月7日

治疗经过：某男，54岁。患者全身多处荨麻疹，反复发作，严重瘙痒，红肿，难禁搔抓直至溃破。长期使用其它各种药物包括激素膏药均无效，反复发作多年不愈，曾用苯烯莫德(苯维莫德)乳膏，不仅无效，反而出现“心区疼痛”副作用。

本次入组后使用1％INNA1605乳膏12天后，用药部位不再瘙痒，已无溃破，红肿明显减退，恢复至正常肤质，完全痊愈，至今无复发。

副作用：无。

疗效评价：优良，痊愈。

(见附图21)。

6.5.1％INNA1605膏剂治疗牛皮癣(银屑病)

诊断：重型银屑病。

入组时间：2019年9月17日

治疗经过：某男，69岁。患重型腿部牛皮癣十余年，长期治疗无效，包括各种激素药膏等治疗，反复发作，无法治愈。入组后使用INNA1605乳膏仅仅两周后，瘙痒消失，表面鳞屑消失，肉眼可见整体上变得光滑，棕红色斑块颜色变浅，红肿消退，患者自觉良好，没有任何副作用。但由于当时配制的膏剂有限，只用了2周后没有膏药了，用药被迫中断(标准疗程应该3个月以上)。后续患者失联，未再继续治疗。

副作用：无。

疗效评价：优良。

(见附图22)。

6.6.1％INNA1605膏剂治疗蛋白沉积症皮炎

诊断：蛋白沉积症皮炎。

入组时间：2021年3月20日

治疗经过：某男，60岁。蛋白沉积症皮炎数十年，瘙痒、增生、极度难看，无任何药物治疗。

本次入组后使用INNA1605(1％)乳膏能很快止痒，皮炎减退，治疗1个月后已经明显减轻，目前还在继续治疗，按要求需治疗3个月以上。

副作用：无。

疗效评价：优良。

(见附图23)。

以上实验结果直接说明，氨基噻唑类小分子化合物INNA1605膏剂在用于治疗牛皮癣、特应性皮炎(湿疹)、过敏性皮炎、神经性皮炎、荨麻疹等等免疫炎症性皮炎有明显的疗效，能达到彻底治愈的效果。将是一种广谱、特效的免疫炎症性皮炎膏剂，对很多难治性皮肤病，几乎可以说起到填补市场空白的作用。

实施例7：2-氨基噻唑衍生物乳膏制剂的制备

以1％INNA1605乳膏为例1.1基质制备：

油相制备：将10ml(8.7g)液体石蜡、7.0g硬脂酸、4.0g白凡士林和3.0g十八醇加入烧杯，搅拌下加热至70℃左右至溶得油相，保温放置备用。

水相制备：：将羟苯乙酯0.1g、十二烷基磺酸钠0.2g、三乙醇胺0.40ml(0.4g)、水10.0ml、VE1.0ml(1.0g)加入烧杯，加热至70℃，搅拌至溶得水相，保温放置备用。

香精相制备：甘油12ml(15.2g)、香精0.2ml、氮酮0.5ml(0.4g)，混合搅拌均匀得香精相。

基质制备过程：搅拌下将水相加入到49.8毫升50℃左右的水中，搅拌下将油相缓慢加入到上述水溶液中，继续搅拌乳化3小时，冷却至室温后将香精相加入，继续搅拌30分钟-1小时，至混合均匀的乳白色半凝固体，凝固得基质备用。

1.2 1％INNA1605乳膏制备(研磨法)

将1.0g的研细(过100目筛)的INNA1605号化合物置于研钵中，以等量递加法分次加入上述制备好的基质研磨均匀即得。其它含量不等的INNA1605乳膏制剂制备方法同上，只是药物含量加以改变即可(如2％的INNA1605乳膏制剂取2g INNA1605化合物按上法加入到相应的基质中即可)。

实施例8：2-氨基噻唑衍生物软膏制剂的制备。

以1％INNA1602软膏制备为例

制法：将药物研细过100目筛备用；将羊毛脂(9.0％)，凡士林(85.0％)，硬脂酸(4.5％)加热融化，降温至50℃，加入氮酮(透皮吸收促进剂，1.5％)，搅拌均匀，冷却至室温备用。再以等量递加法分次加入到药物糊状物中，边加边研磨，直至冷却至室温为止。

其它2-氨基噻唑类化合物如INNA1605；INNA1608；INNA1609；INNA1611；INNA1612等的软膏制剂的制备方法同上。

实施例9：INNA1606(TJ-M2010-6，TJ-6)用于治疗小鼠I型糖尿病。

小鼠I型糖尿病模型制备与分组：

模型制备：于北京维通利华生物技术有限公司购买NOD小鼠，NOD小鼠会自发自身免疫性糖尿病(I型糖尿病)。

实验分为2组，分别为：

NOD对照组(不做任何治疗，模型组)；

INNA1606(TJ-M2010-6，TJ-6)预防用药组(灌胃口服)：每天给NOD小鼠灌胃TJ-M2010-6(50mg/kg)。从8周龄到30周龄，或直到糖尿病发作。对照组小鼠同时给予相同剂量的药物溶剂；

INNA1606(TJ-M2010-6，TJ-6)即刻用药组(灌胃口服)：在NOD小鼠被诊断为糖尿病的第一天立即给药两次，然后在接下来的四周观察中每天给药TJ-M2010-6两次(50mg/kg)；NOD对照组也给予等量的药物溶剂；

INNA1606(TJ-M2010-6，TJ-6)延迟用药组(灌胃口服)：治疗剂量和持续时间与即刻治疗组相同，而NOD小鼠在糖尿病发病一周后给予TJ-M2010-6治疗，NOD对照组也给予即刻治疗组和延迟治疗组于糖尿病发病后4周观察所有NOD小鼠。

所得到实验结果图(见附图24)所示，结果显示INNA1606(TJ-M2010-6，TJ-6)治疗后明显减少实验终点仍然被诊断为I型糖尿病的小鼠比例(附图24A)，而且，即刻治疗和延迟治疗对小鼠I型糖尿病均有效果(附图24C)，INNA1606则是通过抑制胰岛炎症发挥I型糖尿病的治疗作用(附图24D，E)。同时INNA1606可显著减轻高脂饮食肥胖症小鼠的体重(附图25)，也提示其治疗糖尿病的潜力。

实施例10：INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)能纠正R848诱导的狼疮样B细胞的免疫紊乱。

体外狼疮样B细胞免疫紊乱模型制作与分组：

模型制备：于小鼠脾脏用磁珠分选试剂盒将小鼠脾脏来源B细胞提纯后进行体外培养，添加刺激因子CD40L维持B细胞的体外长期存活，用R848(500ng/ml)刺激B细胞48小时诱导出狼疮样B细胞免疫紊乱。

实验分为4组，分别为：

Control组(不做任何处理，正常培养的B细胞)；

R848组(模型组)：用R848(500ng/ml)刺激B细胞48小时；

TJ-5(10μM)组：先用TJ-5(10μmol/L)预刺激B细胞3小时，再用R848(500ng/ml)刺激B细胞48小时；

TJ-5(20μM)组：先用TJ-5(20μmol/L)预刺激B细胞3小时，再用R848(500ng/ml)刺激B细胞48小时。

R848刺激结束后收集细胞和细胞培养上清进行检测。

所得到实验结果图(见附图26/27)所示，结果显示R848刺激B细胞后会引起B细胞活化并向浆细胞分化，产生大量自身免疫性抗体，合成和分泌大量炎性因子；INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)则能抑制B细胞的异常活化和分化(见附图26)，并抑制B细胞自身抗体和炎性因子的分泌(见附图27)，INNA1605能纠正R848诱导的狼疮样B细胞的一系列免疫紊乱，具有治疗系统性红斑狼疮的潜力。

实施例11：INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)对急性脑梗塞后再灌注损伤具有显著的治疗作用。

急性脑梗塞后再灌注损伤小鼠模型制作与分组：

模型制备：成年雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄，体重22-25g)，术前禁食8小时，自由饮水。用1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉。大脑中动脉栓塞(MCAO)模型：仰卧位固定小鼠，保持小鼠头偏向其左侧，消毒酒精喷撒颈部正中区域，用刀片刮除颈部毛发，竖向切开颈部中间偏右的位置，钝性分离皮肤和甲状腺，注意不要损伤迷走神经及甲状旁腺，仔细分离暴露颈总动脉(CCA)，逐渐向上方分离暴露右侧颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，动脉夹夹闭CCA和ICA，丝线结扎ECA远心端，ECA近心端带线，用精密眼科剪在ECA开一小切口，缓慢插入头端有硅胶包被的线栓到ICA，丝线结扎固定，松开动脉夹，继续缓慢插入线栓，有一定阻力后停止插入，同时多普勒血流仪监测缺血侧大脑中动脉(MCA)区脑血流量明显下降，缺血1小时后缓慢抽出栓线，结扎ECA,缝合颈部皮肤，放入32℃温箱，小鼠清醒后，腹腔注射1ml生理盐水补液。假手术组(Sham组)的手术步骤与模型组基本一致，但不阻塞MCA。动物清醒后回笼，自由进食。

实验分为4组，分别为：

假手术组(Sham组)：手术步骤及术后处理同模型组，但不阻塞MCA；

模型组(I/R组)：建立MCAO模型，操作如上述，无特殊处理；

溶剂对照组(Vehicle组)：拔除线栓后，立即静脉注射等量生理盐水

用药组(I/R+INNA1605 15mg/kg组)：拔除线栓后，立即静脉注射150ul 2.5mg/ml的INNA1605溶液(15mg/kg)。

小鼠缺血1h再灌注24h后去小鼠脑组织进行病理检测和后续的分子生物学分析。

所得到实验结果图(见附图28)所示，结果显示INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)明显减少小鼠急性脑梗塞的梗死体积，其减少程度能达到惊人的80％，可以说基本达到治愈急性脑梗塞后再灌注损伤的程度，可见，INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)对治疗急性脑梗死具有巨大的潜力。

实施例12：INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)对阿尔兹海默病的治疗作用。

阿尔兹海默病小鼠模型制作与分组：

模型制备：APP/PS1转基因小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，该转基因小鼠在培育至8至9个月龄时自发阿尔兹海默病，无需进行而外处理。

实验分为3组，分别为：

用药组(APP/PS1+INNA1605组)：APP/PS1转基因小鼠，给予50mg/Kg/day的INNA1605药物(每天2次，每次25mg/Kg，腹腔注射1次，灌胃1次)；

模型组(APP/PS1组)：APP/PS1转基因小鼠，给予等剂量的溶剂(ddH2O)；

对照组(Control组)：C57BL/6小鼠，给予等剂量的溶剂(ddH2O)。

在小鼠9个月龄时，进行Morris水迷宫测试，以评估APP/PS1小鼠的空间学习和记忆能力。行为学试验结束后，经腹腔注射戊巴比妥钠(100mg/kg)深度麻醉后，一部分小鼠经开胸充分暴露心脏和主动脉后，20ml注射器接输液针头从心尖插至主动脉内，固定针头，剪开右心房，经主动脉灌注4℃的生理盐水30ml至血液大部分流出后，小心快速分离取出海马和皮层组织，保存于-80℃进行后续生化分析。余下小鼠先灌注4℃生理盐水30ml，再灌注预冷的4％多聚甲醛30ml，然后取出全脑，4％多聚甲醛继续固定48h，经脱水透明、石蜡包埋、切片后进行免疫组织化学分析。

所得到实验结果图(见附图29/30/31)所示，结果显示INNA1605(TJ-M2010-5，TJ-5)治疗后的APP/PS1转基因小鼠其记忆力比只给ddH₂Od的APP/PS1转基因小鼠要好，虽然还未达到正常小鼠(即Control组)的记忆水(见附图29)；通过免疫组化我们也发现，INNA1605治疗后的APP/PS1转基因小鼠其在小鼠全脑(见附图30A)、皮层(见附图30B)、海马(见附图30C)区域脑Aβ沉积明显比模型组少，而且，NNA1605治疗后小鼠全脑(见附图31A)、皮层(见附图31B)、海马(见附图31C)区域Iba-1阳性的小胶质细胞的面积较模型组也明显减少，提示无论是在疗效上还是在机理上，INNA1605均可作为治疗阿尔兹海默病的新型药物。

以上实验结果直接说明，氨基噻唑类小分子化合物INNA1605膏剂在用于治疗牛皮癣、特应性皮炎(湿疹)、过敏性皮炎、神经性皮炎、荨麻疹等等免疫炎症性皮炎有明显的疗效，能达到彻底治愈的效果。将是一种广谱、特效的免疫炎症性皮炎膏剂，对很多难治性皮肤病，几乎可以说起到填补市场空白的作用。

实施例13：氨基噻唑衍生物INNA1605用于防治忧郁症。

模型小鼠雄性C57BL/6J(6-7周大,18-20g重)和雄性CD-1(6-8大)，制作模型挫败性抑郁症(CSDS)模型：C57BL/6J小鼠每天被不同的CD-1大鼠攻击10分钟，连续10天，晚上两种鼠关在同一个有孔的透明玻璃隔开的笼子里，保持被攻击的压力。实验证实INNA1605(TJ-M2010-5)明显改善诱导的忧郁症行为和脑部神经炎症(见图32、33)。

实施例14：氨基噻唑衍生物INNA1605用于防治移植排斥。

移植配对小鼠为：供体鼠balb/c小鼠；受体鼠为B6小鼠。供体的皮肤或心脏分别移植给受体。皮肤移植后连续用药INNA1605(TJ-M2010-5)2周，然后停药，约38％移植皮肤永久不排斥。异体心脏移植后用药TJ-M2010-5两周，60％心脏移植物永久不被排斥，在这些长期不排斥的存活受体鼠，移植第二次同供体鼠心脏，移植后不用任何治疗，结果100％心脏不排斥，证实产生了针对同种抗原的免疫耐受(见图34、35)。

实施例15：氨基噻唑衍生物INNA1605用于防治肝癌。

在balb/c小鼠皮下种植H22肝细胞癌细胞，让其自由生长，动物分成2组，用INNA1605(TJ-M2010-5)组，和不用药对照组，检测肿瘤大小，结果发现，应用INNA1605(TJ-M2010-5)组的肿瘤明显小于对照组(见图36)。

Claims (12)

1.一种氨基噻唑衍生物在制备细胞焦亡抑制剂中的用途，所述氨基噻唑衍生物具有以下分子结构式：

式中R1为苯基、取代芳香基团；R2为苄基、取代苄基、苯基、取代苯基；n＝0、1、2。

2.根据权利要求1所述氨基噻唑衍生物在制备细胞焦亡抑制剂中的用途，其特征在于，所述氨基噻唑衍生物的具体结构选自：

2-氨基噻唑衍生物如N-(4-苯基噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺，

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)乙酰胺，

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺；

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺。

3.一种氨基噻唑衍生物在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的用途，所述氨基噻唑衍生物具有以下分子结构式：

式中R1为苯基、取代芳香基团；R2为苄基、取代苄基、苯基、取代苯基；n＝0、1、2。

4.根据权利要求3所述氨基噻唑衍生物在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的用途，其特征在于，所述氨基噻唑衍生物的具体结构选自：

2-氨基噻唑衍生物如N-(4-苯基噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺，

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)乙酰胺，

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺；

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺。

5.一种氨基噻唑衍生物在制备半胱氨酸蛋白酶-11抑制剂中的用途，所述氨基噻唑衍生物具有以下分子结构式：

式中R1为苯基、取代芳香基团；R2为苄基、取代苄基、苯基、取代苯基；n＝0、1、2。

6.根据权利要求5所述氨基噻唑衍生物在制备半胱氨酸蛋白酶-11抑制剂中的用途，其特征在于，所述氨基噻唑衍生物的具体结构选自：

2-氨基噻唑衍生物如N-(4-苯基噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺，

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)乙酰胺，

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺；

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺。

7.一种氨基噻唑衍生物在制备半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂中的用途，所述氨基噻唑衍生物具有以下分子结构式：

式中R1为苯基、取代芳香基团；R2为苄基、取代苄基、苯基、取代苯基；n＝0、1、2。

8.根据权利要求7所述氨基噻唑衍生物在制备半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂中的用途，其特征在于，所述氨基噻唑衍生物的具体结构选自：

2-氨基噻唑衍生物如N-(4-苯基噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺，

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)乙酰胺，

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺；

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺。

9.一种氨基噻唑衍生物在制备Gasdermin D抑制剂中的用途，所述氨基噻唑衍生物具有以下分子结构式：

式中R1为苯基、取代芳香基团；R2为苄基、取代苄基、苯基、取代苯基；n＝0、1、2。

10.根据权利要求9所述氨基噻唑衍生物在制备Gasdermin D抑制剂中的用途，其特征在于，所述氨基噻唑衍生物的具体结构选自：

2-氨基噻唑衍生物如N-(4-苯基噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺，

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)乙酰胺，

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺；

N-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-(4-(4-甲基苯基)哌嗪-1-基)丙酰胺；

N-(4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰胺。

11.一种慢性难治性表层炎症用膏剂,所述慢性难治性表层炎症是发生在皮肤或粘膜表层的表现有细胞焦亡症状的炎症，其特征在于，所述膏剂的成分如下：

乳膏基质组成包括：

油相：液体石蜡，硬脂酸，白凡士林，十八醇；

水相：羟苯乙酯，十二烷基磺酸钠，三乙醇胺，水，VE；

香精相：甘油，香精,氮酮；

药物相：含量为0.1～5％wt的氨基噻唑衍生物，DMSO，甘油，水；

所述氨基噻唑衍生物具有以下分子结构式：

式中R1为苯基、取代芳香基团；R2为苄基、取代苄基、苯基、取代苯基；n＝0、1、2。

12.根据权利要求11所述慢性难治性表层炎症用膏剂，其特征在于，所述氨基噻唑衍生物为N-(4-苯基噻唑-2-基)-3-(4-苄基哌嗪-1-基)丙酰胺，具有以下分子结构式：

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